CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký
Khi phát triển một phương pháp HPLC, ta muốn đạt được một mức độ tách có thể chấp nhận được tất cả các cấu tử ta quan tâm trong mẫu với một thời gian vừa phải và độ phân giải vừa đủ xác định. Một số mẫu ta chỉ cần phân tích một hoặc vài cấu tử có trong mẫu.
Ở một mức độ nào đó, sự tách có thể chịu ảnh hưởng bởi các thông số như nhiệt độ, cột tách, tốc độ dòng của pha động, đầu dò, thể tích tiêm mẫu và một trong những yếu tố quan trọng nhất trong việc kiểm soát tách là thành phần của pha động [7].
Trong nghiên cứu định lượng flurbiprofen bằng phương pháp HPLC – DAD, chúng tôi sử dụng dung dịch chuẩn flurbiprofen nồng độ 20 μg/ml để khảo sát và đã xác định được các điều kiện sắc ký tối ưu như sau [2]:
- Pha tĩnh cột silica gel C8 5 μm, 120 Å trong cột 4,6 mm x 150 mm - Pha động ACN : H2O : CH3COOH tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v) - Thể tích tiêm mẫu 10 μl
- Tốc độ dòng 1 ml/phút
- Đầu dò ghi nhận tín hiệu tại bước sóng 247 nm - Thời gian sắc ký 8 phút
Trong nghiên cứu này, các thông số ban đầu được thiết lập tương tự.
Các yếu tố cần được xác định thêm là nhiệt độ buồng đo, độ nhạy của đầu dò, nồng độ dung dịch khảo sát, bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu. Phương pháp được tiến hành như sau:
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Nhiệt độ buồng đo
Nhiệt độ của mẫu ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang của nó. Do đó, sự biến đổi của nhiệt độ môi trường ảnh hưởng nhiều đến tín hiệu thu nhận được từ đầu dò huỳnh quang. Đầu dò huỳnh quang mà nghiên cứu sử dụng cho phép nâng nhiệt độ của buồng đo và kiểm soát nhiệt độ trong buồng đo ở mức nhiệt độ ổn định để đảm bảo buồng đo ổn định ngay cả khi nhiệt độ môi trường thay đổi. Cài đặt nhiệt độ của buồng đo cao hơn nhiệt độ môi trường khoảng 15˚C – như hướng dẫn của nhà sản xuất.
Độ nhạy của đầu dò
Ống quang tử đo cường độ của ánh sáng phát xạ sau khi đi qua bộ tán xạ đơn sắc. Độ nhạy của ống quang tử được sử dụng để tối ưu tỉ lệ S/N trong sắc ký. Độ nhạy được điều chỉnh trong quá trình sắc ký và tối ưu theo 8 mức dựa trên cường độ của quang phổ phát xạ huỳnh quang. Mức 8 ứng với độ bão hòa của ống quang tử ≥ 100%. Mỗi mức của độ nhạy tăng lên tương ứng với sự tăng xấp xỉ 2 lần của cường độ quang phổ phát xạ huỳnh quang.
- Nếu lựa chọn độ nhạy quá nhỏ, chiều cao pic giảm xuống và tỉ lệ S/N không tối ưu.
- Nếu lựa chọn độ nhạy quá lớn, tín hiệu của ống quang tử bão hòa.
Trong trường hợp này đầu dò tự động giảm độ nhạy đã cài đặt. Khi cài đặt độ nhạy quá lớn, sắc ký đồ có hình dạng như mức 8 ở hình 5, sau đó hệ thống tự động cài lại độ nhạy trước đó.
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Nồng độ dung dịch khảo sát
Trong nghiên cứu định lượng flurbiprofen trong chế phẩm dược phẩm bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang của Bilal Yilmaz và cộng sự (2015), khoảng tuyến tính được sử dụng là 50 – 350 ng/ml, bước sóng kích thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm = 308nm [11].
Từ đó, chúng tôi tiến hành sắc ký dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 400 ng/ml với bước sóng kích thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm = 308nm để đánh giá hình dạng pic trên sắc ký đồ. Dựa vào tín hiệu thu được và độ bão hòa lớn nhất của ống quang tử trên phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex, điều chỉnh nồng độ khảo sát phù hợp để giá trị độ bão hòa lớn nhất của ống quang tử đạt tối ưu (30 – 80%) theo bảng 4:
Bảng 4. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký theo giá trị độ bão hòa lớn nhất của ống quang tử
Giá trị độ bão hòa lớn
nhất của ống quang tử Giải pháp
< 30%
- < 30%: Tăng độ nhạy lên 1 mức - < 15%: Tăng độ nhạy lên 2 mức.
30% – 80% Giá trị độ nhạy là tối ưu.
80% – 99%
Giảm độ nhạy đi 1 mức để tránh độ bão hòa của ống quang tử không mong muốn khi nồng độ thay đổi.
≥ 100% Giảm độ nhạy đi ít nhất 1 mức.
Bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu
Với hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 – Dionex tập đoàn Thermo Scientific Hoa Kỳ sử dụng đầu dò FLD – 3100, cặp một bước sóng kích thích và một bước sóng phát xạ tối ưu sau khi được xác định sẽ cho tỉ lệ S/N tốt nhất ngay cả với những mẫu có nồng độ nhỏ. Phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1 có những chế độ dò bước sóng như sau:
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
- Chế độ Zero Order
Trong chế độ Zero Order, bộ tán xạ đơn sắc cho toàn bộ quang phổ đi qua thay vì chỉ có một bước sóng nhất định. Bước sóng kích thích được đặt trước thành 1 giá trị như bình thường. Đầu dò FLD – 3400RS có thêm chức năng lọc vùng bước sóng không mong muốn. Sau đó, cài đặt thuộc tính của bước sóng phát xạ và bắt đầu quét.
Chế độ Zero Order phù hợp với các mẫu có nhiều chất phát xạ huỳnh quang với phổ phát xạ của mẫu rộng. Cường độ của ánh sáng phát xạ trong chế độ Zero Order cao hơn so với khi hệ thống hoạt động bình thường. Điều này cho phép hệ thống xác định được chất ở những nồng độ rất thấp.
- Chế độ quét 2D
Với đầu dò FLD – 3100, hệ thống có thể ghi lại một số loại phổ 2D.
Các bước sóng kích thích hoặc bước sóng phát xạ (hoặc đồng thời cả hai) được quét trên một dải bước sóng được cài đặt. Cường độ của các tín hiệu huỳnh quang sẽ được tính toán và ghi lại liên tiếp với mỗi bước sóng. Qua đó, chế độ quét 2D ghi lại phổ 2D, từ đó xác định được bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu.
Có 3 chế độ quét 2D như sau:
Quét đồng thời
Khi bước sóng kích thích đã được quét trong phạm vi bước sóng được cài đặt, bước sóng phát xạ được quét đồng thời với một khoảng cách chênh lệch cố định so với bước sóng kích thích. Chức năng quét đồng thời cho phép xác định sơ bộ bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ. Tuy nhiên để xác định chính xác cặp bước sóng tối ưu, cần sử dụng chức năng quét riêng biệt hai bước sóng.
Quét bước sóng kích thích
Bước sóng phát xạ được giữ cố định trong khi bước sóng kích thích được quét trên một dải bước sóng được cài đặt. Kết quả là phổ kích thích của mẫu.
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Quét bước sóng phát xạ
Bước sóng phát xạ được giữ cố định trong khi bước sóng kích thích được quét trên một dải bước sóng được cài đặt. Kết quả là phổ kích thích của mẫu.
- Chế độ quét 3D
Từ phiên bản Chromeleon 7.1 trở đi, chức năng quét 3D được hỗ trợ cho đầu dò huỳnh quang để xác định các thời gian lưu giữ và mức hấp thụ tối đa của hỗn hợp chất trong dung dịch. Trái ngược với chế độ quét 2D, chế độ quét 3D không cần chọn trước phạm vi bước sóng để quét mà quét liên tục trên toàn bộ dải phổ, chế độ này tương tự như chế độ quét phổ 3D của đầu dò DAD.
Cũng như chế độ quét 2D, chế độ quét 3D bao gồm 3 chế độ Quét bước sóng kích thích, quét bước sóng phát xạ và quét đồng thời.
Quá trình tối ưu hóa bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ có các tiêu chí chính sau:
- Tốt nhất là lựa chọn bước sóng kích thích là bước sóng hấp thụ tối đa của thành phần trong mẫu.
- Pha động nên có các thành phần không hoặc ít hấp thụ bước sóng kích thích được lựa chọn. Do đó bước sóng kích thích lựa chọn phải trên giới hạn cực tím của dung môi.
- Chọn bước sóng phát xạ cao hơn ít nhất 20nm so với bước sóng kích thích.
Trong điều kiện cụ thể của nghiên cứu, chúng tôi cần xác định bước sóng kích thích tối ưu và bước sóng phát xạ tối ưu của một chất là flurbiprofen, do vậy việc sử dụng chế độ Zero Order là không cần thiết. Qua đó, nghiên cứu này lựa chọn chế độ quét 3D – lần lượt quét đồng thời để sơ bộ xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu, xác định bước sóng phát xạ tối ưu, xác định bước sóng kích thích tối ưu.
- Sơ bộ xác định bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu:
Quét phổ đồng thời bước sóng kích thích trong dải 200 – 400nm và bước sóng
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
phát xạ trong dải 275 – 475nm (luôn chênh so với bước sóng kích thích một khoảng 75nm cố định).
- Xác định bước sóng phát xạ tối ưu: Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã xác định được flurbiprofen có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 247nm [2]. Cài bước sóng kích thích λEx = 247nm và quét phổ bước sóng phát xạ trong dải phát xạ xác định được.
- Xác định bước sóng kích thích tối ưu: Cài bước sóng phát xạ λEm tối ưu để quét phổ bước sóng kích thích trong dải 200 – 300nm chứa bước sóng hấp thu cực đại 247nm.