Bố trí thí nghiệm

4. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Bố trí thí nghiệm

a. Thí nghiệm 1: Thí nghiệm tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

- Mục tiêu thí nghiệm: Tìm ra môi trường dinh dưỡng tối ưu bằng cách tối ưu hóa được các yếu tố đa lượng trong môi trường BBM (N, P) dùng để nuôi vi tảo H. lacustris.

- Mô tả thí nghiệm: Thí nghiệm tối ưu hoá được thiết kế thử nghiệm dựa trên cấu trúc của mô hình bố trí thí nghiệm trung tâm (CCD-Central composite design) đối với 2 yếu tố dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy BBM: Hàm lượng Nitơ và Photpho được gọi là các biến độc lập. Các điểm trung tâm và bước nhảy của mỗi yếu tố được xác định lần lượt là N = 0,8 ± 0,4 và P = 0,04 ± 0,02 dựa trên các thí nghiệm sàng lọc và nghiên cứu tài liệu. Biến đáp ứng được chọn là tốc độ sinh trưởng.

Mô hình dự đoán được biểu diễn bằng phương trình bậc 2 đầy đủ: Y = β + β1x1 + β2x2 + β12x1x2 + β11x21 + β22x2

Trong đó, Y là tốc độ tăng trưởng (d); x1, x2 lần lượt là Nitơ và Photpho; β1, β2 là các hệ số bậc 1 tương ứng; β12 là hệ số tương tác của cặp yếu tố tương ứng; β11, β22 là các hệ số bậc 2 tương ứng.

- Thông số theo dõi: Mật độ tế bào vi tảo H. lacustris.

b. Thí nghiệm 2: Thí nghiệm ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng tới khả năng tổng hợp astaxanthin ở vi tảo H. lacustris trong mô hình nuôi hai pha.

Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng tới khả năng kích ứng tổng hợp astaxanthin ở vi tảo H. lacustris trong mô hình nuôi hai pha.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. NT1: môi trường không có Nitrat (0N), NT2: môi trường không có Nitrat Phosphat (0N0P), NT3: môi trường không chứa Phosphat (0P), NT4: môi trường BBM, NT5: môi trường chứa ½ nitrat (1/2N).

Mô tả thí nghiệm: Vi tảo H. lacustris được nuôi trong môi trường BBM ở điều kiện chiếu sáng 35 µmol.m-2.s-1 và 250C đến khi tế bào H. lacustris ở trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) sẽ được chuyển sang các NT1, NT2, NT3, NT4, NT5 kết hợp với ánh sáng trắng ở cường độ ánh sáng 100 µmol.m-2.s-1.

c. Thí nghiệm 3: Thí nghiệm ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến vi tảo H. lacustris trong pha tích lũy astaxanthin.

Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của cường độ và các phổ ánh sáng đến sự tích lũy astaxanthin của H. lacustris.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. NT1: Ánh sáng trắng, NT2: Ánh sáng xanh, NT 3: Ánh sáng đỏ

Mô tả thí nghiệm: Vi tảo H. lacustris được nuôi trong môi trường BBM ở điều kiện chiếu sáng 35 µmol.m-2.s-1 và 250C đến khi tế bào H. lacustris ở

trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) sẽ được chuyển sang các NT1, NT2, NT3 ở cường độ 100 µmol.m-2.s-1.

d. Thí nghiệm 4: Thí nghiệm ảnh hưởng của axetat và sắt đến vi tảo H. lacustris trong pha tích lũy astaxanthin.

Mục tiêu thí nghiệm: Đánh giá khả năng sử dụng acetat và sắt để kích ứng tích lũy astaxanthin ở vi tảo H. lacustris.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. NT1 (DC): Nước cất, NT2 (Ac): Nước cất có bổ sung acetat 30mM, NT3: (axetat+Fe2+): Nước cất có bổ sung axetat 30mM + Fe2+ 300uM, NT4 (Fe): Nước cất có bổ sung Fe2+ 300uM

Mô tả thí nghiệm: Vi tảo H. lacustris được nuôi trong môi trường BBM ở điều kiện chiếu sáng 35 µmol.m-2.s-1 và 250C đến khi tế bào H. lacustris ở trạng thái sinh dưỡng (80 – 90% tổng số tế bào) sẽ được chuyển sang các NT1, NT2, NT3, NT4. Thí nghiệm được tiến hành dưới điều kiện cường độ ánh sáng trắng đèn LED 7000 lux, chế độ chiếu sáng liên tục. Mật độ (tb/ml) và đường kính tế bào (μm) được theo dõi sau 2h, 24h và 54h tính từ lúc bắt đầu thí nghiệm.

2.2.3. Phương pháp xác định khối lượng

Sự phát triển của tế bào được theo dõi bằng cách đo độ hấp thụ khác nhau ở hai bước sóng 680 nm và 750 nm với máy quang phổ UV/VIS (UV- 2802PC UNIC), khối lượng của tế bào được tính theo công thức:

Khối lượng = [-4.2 × {(OD680 - OD750)/OD680} + 1.4] × OD680

Tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris được tính dựa trên kết quả khối lượng tế bào thu được ở các nghiệm thức thí nghiệm. Tốc độ sinh trưởng được tính theo công thức của Han Shun và cộng sự (2016):

Trong đó:

Nt là khối lượng tế bào tại t ngày nuôi (g/L) N0 là khối lượng tế bào lúc bắt đầu nuôi cấy (g/L)

2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng sắc tố

5ml tảo H. lacustris được mang đi li tâm ở 10.000 vòng/ phút trong vòng 5 phút, sau đó loại bỏ dịch nổi thu lấy cặn tế bào. Cặn sau đó được tái hòa tan trong 2 ml methanol 96%, vortex trong vòng 30 giây để hòa tan hoàn toàn cặn tế bào. Mẫu được li tâm 10000 vòng/ phút trong vòng 5 phút và thu phần dịch nổi. Tiếp tục lặp lại bước li tâm thu dịch cho đến khi phần dịch nổi trở nên trong suốt. Phần dịch nổi thu được sẽ được sử dụng để xác định hàm lượng sắc tố bằng máy đo quang phổ UV-VIS.

Đo OD ở các bước sóng 470, 653, 666 nm (Máy Jasco V750). Hàm lượng các sắc tố được tính theo công thức được nêu ra bởi Lichtenthaler & Wellburn [32].

Hàm lượng sắc tố quang hợp P = Cx1000/TB

Trong đó: P là hàm lượng sắc tố trong 1 tế bào (µg/tb), TB là số tế bào trong thể tích tảo đem đi ly tâm để tách chiết, C là giá trị nhận từ các công thức sau:

Sắc tố Giá trị C

Chlorophyll a C = 15,65 x E666 - 7,34 x E653 Chlorophyll b C = 27,05 x E653 - 11,21 x E666

Carotenoid C = (1000 x E470 - 2,86 x Ca - 129,2 x Cb)/221 Với Ex là giá trị OD đo được ở bước song x.

Nhiều công trình cho thấy hàm lượng carotenoids tổng số được xem chủ yếu là astaxanthin. Hàm lượng astaxanthin chiếm 85 – 88% carotenoids tổng số [57]. Do vậy với giới hạn của điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi sử

dụng thông số carotenoid tổng số như đặc trưng cho hàm lượng astaxanthin trong vi tảo H. lacustris.

2.4.5. Phương pháp đếm tế bào và đo kích thước tự động

Dùng pippete trộn đều mẫu cần đếm, pha loãng mẫu (nếu cần thiết) và nhỏ một lượng cần thiết (10µl) chia đều vào mỗi buồng đếm, đậy lamen sao cho lamen không lệch ra khỏi buồng đếm, không có bọt khí, sau đó đặt buồng đếm lên kính hiển vi. Điều chỉnh tiêu cự của kính hiển vi quang học và tiến hành quan sát ở vật kính 10X để tìm được buồng đếm trên thị trường, điều chỉnh ốc vi cấp để quan sát tế bào rõ hơn. Tiến hành chụp hình và xác định mật độ, kích thước tế bào bằng phầm mềm IMAGEJ.

2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm R (R Development Core Team, 2010). Phân tích phương sai 1 yếu tố (ANOVA) được áp dụng để đánh giá sự sai khác có ý nghĩa giữa các nghiệm thức, giá trị p <0,05 được xác định là có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%.

CHƯƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface method - RSM) sử dụng các kỹ thuật thống kê, đồ họa và toán học khác nhau nhằm nghiên cứu, cải thiện hoặc tối ưu hóa một quy trình trong trường hợp biến đáp ứng chịu ảnh hưởng bởi nhiều hơn một biến độc lập. Ưu điểm của phương pháp này là khảo sát được không chỉ những ảnh hưởng đơn lẻ mà còn cả tác động tổng hợp của các biến độc lập lên biến đáp ứng và biểu thị kết quả dưới dạng một mô hình toán học cũng như các biểu đồ trực quan. RSM cũng cho phép cải thiện quá trình thực nghiệm bằng cách đề xuất những bộ thí nghiệm mới (Aydar, 2018).

Trong thí nghiệm này, Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được áp dụng để tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi tảo H.lacustris. Giá trị của các yếu tố ảnh hưởng trong mỗi nghiệm thức và kết quả về tốc độ sinh trưởng được trình bày ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1 Tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris ở các nghiệm thức thí nghiệm

Mã thí nghiệm Điều kiện thực tế

Tốc độ sinh trưởng x1 x2 N (g/L) P (g/L) -1 -1 0.4 0.02 0.19 0 0 0.8 0.04 0.21 1 -1 1.2 0.02 0.17 0 0 0.8 0.04 0.24 -1 1 0.4 0.06 0.19

1 1 1.2 0.06 0.20 0 0 0.8 0.04 0.34 1,5 0 1.4 0.04 0.23 -1,5 0 0.2 0.04 0.25 0 1,5 0.8 0.07 0.18 0 0 0.8 0.04 0.23 0 0 0.8 0.04 0.21 0 -1,5 0.8 0.01 0.22

Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris

cao nhất là 0,34 (d-1), thấp nhất là 0,17 (d-1) và trung bình là 0,22 ± 0,04 (d-1) (Bảng 3.1).

Từ kết quả thí nghiệm trên, mô hình hồi quy bậc 2 đầy đủ dự đoán tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris dựa vào hai yếu tố N và P đã được xây dựng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt. Các thông số của mô hình và giá trị kiểm định của mô hình được thể hiện ở bảng 3.2.

Y = 0,24 - 0,005x1 - 0,002x2 + 0,008 x1x2 - 0,011x21 - 0,027x2 2

Bảng 3.2. Các hệ số hồi quy ước tính cho mô hình đa thức bậc hai của tốc độ sinh trưởng ở vi tảo H. lacustris

Các thông số của mô hình

Biến hồi quy Hằng số hồi quy p - value

β 0,24 0.02 *

N (x1 ) - 0,005 0,07 .

P (x2) - 0,002 0,12

N2 (x1)2 - 0,011 0,02 *

P2 (x2)2 - 0,027 0,05 *

Adjusted R-squared p-value Lack of fit

0,58 0,015* 0,62

*Giá trị có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy (.): 90%; (*): 95%; (**): 99%; (***): 99.99%

Kết quả phân tích cho thấy 0,58% sự biến động về tốc độ sinh trưởng được giải thích bằng sự thay đổi của tố hợp hai yếu tố thí nghiệm N và P với độ tin cậy 90% (p = 0,015). Giá trị Lack of fit = 0,62 > 0,05 chứng tỏ rằng sự chênh lệch giữa tốc độ sinh trưởng theo mô hình và tốc độ sinh trưởng theo thực nghiệm không có sự khác biệt đáng kể. Điều này đồng nghĩa việc có thể sử dụng mô hình này để đánh giá, dự đoán tốc độ sinh trưởng khi thay đổi hàm lượng dinh dưỡng.

Cụ thể hơn, ảnh hưởng của 2 biến N và P đến tốc độ sinh trưởng đã được đánh giá. Kết quả thể hiện ở Hình 3.1

Hàm lượng N có ảnh hưởng lớn hơn đến tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris với hệ số ảnh hưởng lần lượt là 0,005 theo hàm bậc 1 và 0,011 theo hàm bậc hai. Điều này tương tự với công bố của nhiều tác giả trên thế giới cho rằng nồng độ N được coi là thông số quan trọng để tăng tốc độ sinh trưởng của H. lacustris [62]. Ở điều kiện không đổi hàm lượng P=0,04 g/L thì tốc độ sinh trưởng tăng từ 0,20 đến 0,22 (day-1) khi tăng nồng độ N từ 0,2 g/L lên 0,7 g/L. Tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng của H. lacustris giảm xuống dần và chỉ đạt 0,19 (day-1) khi tăng nồng độ N tới 1,4 (g/L) (hình 3.1).

Tương tự, hàm lượng P có ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của vi tảo

hàm bậc hai. Trong điều kiện cố định hàm lượng N = 0,8 mg/L thì tốc độ tăng trưởng của vi tảo H. lacustris tăng trưởng từ 0,20 đến 0,22 (day-1) khi tăng nồng độ P từ 0,01 g/L đến 0,035 g/L, sau đó tốc độ sinh trưởng giảm xuống chỉ đạt 0,19 (day-1) khi tiếp tục tăng nồng độ P tới 0,07 mg/L (hình 3.1).

Một bộ điều kiện nồng độ dinh dưỡng tối ưu cũng đã được đề xuất từ mô hình, cụ thể là với N= 0.7 (g/L) và P= 0,038 (g/L). Với các giá trị này, tốc độ sinh trưởng đạt tối đa dự đoán đạt theo mô hình đạt 0,236 (day-1).

Hình 3.1. Mô hình phản ứng bề mặt 2D và 3D của tốc độ sinh trưởng bị ảnh hưởng bởi các biến độc lập: Nồng độ N và P bằng phương pháp đáp ứng bề

3.2. Ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng đến vi tảo H.lacustris trong pha tích lũy astaxanthin

Đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra giới hạn về các yếu tố dinh dưỡng như nguồn nitrat và phosphat là yếu tố chìa khóa cho tổng hợp và tích lũy astaxanthin [26].

3.1.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo H.lacustris.

Vi tảo H.lacustris khi được nuôi ở trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau có mật độ khác nhau ở thời điểm kết thúc thí nghiệm. Nhìn chung, mật độ đều có sự tăng lên ở các nghiệm thức thiếu hụt dinh dưỡng so với ban đầu, trừ ở môi trường dinh dưỡng BBM. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2.

Hình 3.2. Mật độ tế bào ở các nghiệm thức dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Cụ thể, sau 8 ngày nuôi vi tảo đạt mật độ cao nhất ở môi trường không chứa nitrate(0N) với mật độ đạt 16855 ± 3930 tb/ml, cao hơn đáng kể so với mật độ ban đầu (6636 ± 1256 tb/ml), với giá trị p=0,0007 < 0,05. Tương tự, ở

nghiệm thức 0P cũng ghi nhận sự tăng mật độ từ 7673 ± 144 tb/ml lên 14182 ± 2805 tb/ml (p=0,05). Sự thay đổi mật độ tế bào ở các nghiệm thức còn lại là không có ý nghĩa thống kê, với giá trị mật độ chỉ tăng từ 10566 ± 1409 tb/ml lên 14465 ± 3077 tb/ml ở nghiệm thức 0P, tăng từ 9654 ± 2499 tb/ml đến 11485 ± 1776 tb/ml ở nghiệm thức N/2 và giảm từ 9758 ± 2028 tb/ml xuống còn 6918 ± 1462 tb/ml trong nghiệm thức BBM (các giá trị p-value < 0,05).

Hình 3.3. Đường kính tế bào ở các nghiệm thức dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Về kích thước, đường kính của các tế bào quan sát được có sự sụt giảm ở các nghiệm thức hoàn toàn không có nitrate (0N và 0N0P), ngược lại tăng lên ở các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên, sự dao động kích thước này lại không có ý nghĩa về mặt thống kê (p>0,05). Đường kính trung bình của tế bào ở các nghiệm thức đều nằm trong khoảng từ 17,5 - 21 μm.

Có thể nhận thấy rằng, trong pha tích lũy, khi tảo được chuyển từ môi trường BBM sang môi trường thiếu hụt dinh dưỡng, sự sinh trưởng của tảo vẫn được duy trì sau 8 ngày. Kết quả nghiên cứu này so với nghiên cứu của Harker.M năm 1996 về ảnh hưởng của hàm lượng nitrate đến sinh trưởng và tích lũy thì có sự khác biệt. Harker báo cáo rằng hàm lượng nitrate cao nhất

tương ứng với mức tăng mật độ tăng cao nhất trong khi ở nghiệm thức không bổ sung nitrate mật độ tảo giảm đáng kể [18]. Sự khác biệt này có thể được giải thích bởi thí nghiệm của Harker được tiếng hành ở một pha, có nghĩa rằng ngay ban đầu ông đã tiến hành nuôi vi trảo trong những môi tường với hàm lượng khác nhau đểu theo dõi cả về tốc độ sinh trưởng và tích lũy. Còn nghiên cứu này được tiến hành thành hai pha tách biệt, vi tảo được nhân sinh khối trong môi trường đầy đủ sau đó mới chuyển sang môi trường bị thiếu hụt dinh dưỡng khác nhau, vậy nên kết quả của hai nghiên cứu mới khác biệt. Bên cạnh đó, điều kiện chiếu sáng ở hai nghiên cứu không giống nhau, ở nghiên cứu ông Harker,.M chiếu sáng ở cường độ 35 µmol.m-2.s-1 còn nghiên cứu này được thức hiện trong điều kiện chiếu sáng 100 µmol.m-2.s-1. Vậy nên khi chiếu sáng cao kết hợp với thiếu hụt dinh dưỡng thì vi tảo sẽ được bảo vệ bởi cơ chế hình thành lớp thành tế bào dày bởi những hạt lipit để bảo vệ tế bào trước những điều kiện bất lợi [53]. Hơn nữa, khi môi trường không được bổ sung nitrate thì nitrate nội bào sẽ được kích ứng sản sinh để hỗ trợ sự sống của tế bào thậm chí còn sử dụng để sinh trường bình thường trong một vài giờ [13]. Vì vậy, quá trình sinh trưởng phát triển, điều này đã làm cho mật độ ở nghiệm thức này tăng lên. Còn ở nghiệm thước bổ sung nitrate chỉ chiếu sáng ở cường độ ánh sáng cao dinh dưỡng vẫn đầy đủ thì chưa kích ứng được tế bào diễn ra cơ chế chống lại với điều kiện chiếu sáng trong thời gian đầu, do