Phương pháp xử lý số liệu

4. Nội dung nghiên cứu

2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm R (R Development Core Team, 2010). Phân tích phương sai 1 yếu tố (ANOVA) được áp dụng để đánh giá sự sai khác có ý nghĩa giữa các nghiệm thức, giá trị p <0,05 được xác định là có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%.

CHƯƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface method - RSM) sử dụng các kỹ thuật thống kê, đồ họa và toán học khác nhau nhằm nghiên cứu, cải thiện hoặc tối ưu hóa một quy trình trong trường hợp biến đáp ứng chịu ảnh hưởng bởi nhiều hơn một biến độc lập. Ưu điểm của phương pháp này là khảo sát được không chỉ những ảnh hưởng đơn lẻ mà còn cả tác động tổng hợp của các biến độc lập lên biến đáp ứng và biểu thị kết quả dưới dạng một mô hình toán học cũng như các biểu đồ trực quan. RSM cũng cho phép cải thiện quá trình thực nghiệm bằng cách đề xuất những bộ thí nghiệm mới (Aydar, 2018).

Trong thí nghiệm này, Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được áp dụng để tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi tảo H.lacustris. Giá trị của các yếu tố ảnh hưởng trong mỗi nghiệm thức và kết quả về tốc độ sinh trưởng được trình bày ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1 Tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris ở các nghiệm thức thí nghiệm

Mã thí nghiệm Điều kiện thực tế

Tốc độ sinh trưởng x1 x2 N (g/L) P (g/L) -1 -1 0.4 0.02 0.19 0 0 0.8 0.04 0.21 1 -1 1.2 0.02 0.17 0 0 0.8 0.04 0.24 -1 1 0.4 0.06 0.19

1 1 1.2 0.06 0.20 0 0 0.8 0.04 0.34 1,5 0 1.4 0.04 0.23 -1,5 0 0.2 0.04 0.25 0 1,5 0.8 0.07 0.18 0 0 0.8 0.04 0.23 0 0 0.8 0.04 0.21 0 -1,5 0.8 0.01 0.22

Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris

cao nhất là 0,34 (d-1), thấp nhất là 0,17 (d-1) và trung bình là 0,22 ± 0,04 (d-1) (Bảng 3.1).

Từ kết quả thí nghiệm trên, mô hình hồi quy bậc 2 đầy đủ dự đoán tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris dựa vào hai yếu tố N và P đã được xây dựng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt. Các thông số của mô hình và giá trị kiểm định của mô hình được thể hiện ở bảng 3.2.

Y = 0,24 - 0,005x1 - 0,002x2 + 0,008 x1x2 - 0,011x21 - 0,027x2 2

Bảng 3.2. Các hệ số hồi quy ước tính cho mô hình đa thức bậc hai của tốc độ sinh trưởng ở vi tảo H. lacustris

Các thông số của mô hình

Biến hồi quy Hằng số hồi quy p - value

β 0,24 0.02 *

N (x1 ) - 0,005 0,07 .

P (x2) - 0,002 0,12

N2 (x1)2 - 0,011 0,02 *

P2 (x2)2 - 0,027 0,05 *

Adjusted R-squared p-value Lack of fit

0,58 0,015* 0,62

*Giá trị có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy (.): 90%; (*): 95%; (**): 99%; (***): 99.99%

Kết quả phân tích cho thấy 0,58% sự biến động về tốc độ sinh trưởng được giải thích bằng sự thay đổi của tố hợp hai yếu tố thí nghiệm N và P với độ tin cậy 90% (p = 0,015). Giá trị Lack of fit = 0,62 > 0,05 chứng tỏ rằng sự chênh lệch giữa tốc độ sinh trưởng theo mô hình và tốc độ sinh trưởng theo thực nghiệm không có sự khác biệt đáng kể. Điều này đồng nghĩa việc có thể sử dụng mô hình này để đánh giá, dự đoán tốc độ sinh trưởng khi thay đổi hàm lượng dinh dưỡng.

Cụ thể hơn, ảnh hưởng của 2 biến N và P đến tốc độ sinh trưởng đã được đánh giá. Kết quả thể hiện ở Hình 3.1

Hàm lượng N có ảnh hưởng lớn hơn đến tốc độ sinh trưởng của vi tảo H. lacustris với hệ số ảnh hưởng lần lượt là 0,005 theo hàm bậc 1 và 0,011 theo hàm bậc hai. Điều này tương tự với công bố của nhiều tác giả trên thế giới cho rằng nồng độ N được coi là thông số quan trọng để tăng tốc độ sinh trưởng của H. lacustris [62]. Ở điều kiện không đổi hàm lượng P=0,04 g/L thì tốc độ sinh trưởng tăng từ 0,20 đến 0,22 (day-1) khi tăng nồng độ N từ 0,2 g/L lên 0,7 g/L. Tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng của H. lacustris giảm xuống dần và chỉ đạt 0,19 (day-1) khi tăng nồng độ N tới 1,4 (g/L) (hình 3.1).

Tương tự, hàm lượng P có ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của vi tảo

hàm bậc hai. Trong điều kiện cố định hàm lượng N = 0,8 mg/L thì tốc độ tăng trưởng của vi tảo H. lacustris tăng trưởng từ 0,20 đến 0,22 (day-1) khi tăng nồng độ P từ 0,01 g/L đến 0,035 g/L, sau đó tốc độ sinh trưởng giảm xuống chỉ đạt 0,19 (day-1) khi tiếp tục tăng nồng độ P tới 0,07 mg/L (hình 3.1).

Một bộ điều kiện nồng độ dinh dưỡng tối ưu cũng đã được đề xuất từ mô hình, cụ thể là với N= 0.7 (g/L) và P= 0,038 (g/L). Với các giá trị này, tốc độ sinh trưởng đạt tối đa dự đoán đạt theo mô hình đạt 0,236 (day-1).

Hình 3.1. Mô hình phản ứng bề mặt 2D và 3D của tốc độ sinh trưởng bị ảnh hưởng bởi các biến độc lập: Nồng độ N và P bằng phương pháp đáp ứng bề

3.2. Ảnh hưởng của sự thiếu hụt dinh dưỡng đến vi tảo H.lacustris trong pha tích lũy astaxanthin

Đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra giới hạn về các yếu tố dinh dưỡng như nguồn nitrat và phosphat là yếu tố chìa khóa cho tổng hợp và tích lũy astaxanthin [26].

3.1.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo H.lacustris.

Vi tảo H.lacustris khi được nuôi ở trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau có mật độ khác nhau ở thời điểm kết thúc thí nghiệm. Nhìn chung, mật độ đều có sự tăng lên ở các nghiệm thức thiếu hụt dinh dưỡng so với ban đầu, trừ ở môi trường dinh dưỡng BBM. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2.

Hình 3.2. Mật độ tế bào ở các nghiệm thức dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Cụ thể, sau 8 ngày nuôi vi tảo đạt mật độ cao nhất ở môi trường không chứa nitrate(0N) với mật độ đạt 16855 ± 3930 tb/ml, cao hơn đáng kể so với mật độ ban đầu (6636 ± 1256 tb/ml), với giá trị p=0,0007 < 0,05. Tương tự, ở

nghiệm thức 0P cũng ghi nhận sự tăng mật độ từ 7673 ± 144 tb/ml lên 14182 ± 2805 tb/ml (p=0,05). Sự thay đổi mật độ tế bào ở các nghiệm thức còn lại là không có ý nghĩa thống kê, với giá trị mật độ chỉ tăng từ 10566 ± 1409 tb/ml lên 14465 ± 3077 tb/ml ở nghiệm thức 0P, tăng từ 9654 ± 2499 tb/ml đến 11485 ± 1776 tb/ml ở nghiệm thức N/2 và giảm từ 9758 ± 2028 tb/ml xuống còn 6918 ± 1462 tb/ml trong nghiệm thức BBM (các giá trị p-value < 0,05).

Hình 3.3. Đường kính tế bào ở các nghiệm thức dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Về kích thước, đường kính của các tế bào quan sát được có sự sụt giảm ở các nghiệm thức hoàn toàn không có nitrate (0N và 0N0P), ngược lại tăng lên ở các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên, sự dao động kích thước này lại không có ý nghĩa về mặt thống kê (p>0,05). Đường kính trung bình của tế bào ở các nghiệm thức đều nằm trong khoảng từ 17,5 - 21 μm.

Có thể nhận thấy rằng, trong pha tích lũy, khi tảo được chuyển từ môi trường BBM sang môi trường thiếu hụt dinh dưỡng, sự sinh trưởng của tảo vẫn được duy trì sau 8 ngày. Kết quả nghiên cứu này so với nghiên cứu của Harker.M năm 1996 về ảnh hưởng của hàm lượng nitrate đến sinh trưởng và tích lũy thì có sự khác biệt. Harker báo cáo rằng hàm lượng nitrate cao nhất

tương ứng với mức tăng mật độ tăng cao nhất trong khi ở nghiệm thức không bổ sung nitrate mật độ tảo giảm đáng kể [18]. Sự khác biệt này có thể được giải thích bởi thí nghiệm của Harker được tiếng hành ở một pha, có nghĩa rằng ngay ban đầu ông đã tiến hành nuôi vi trảo trong những môi tường với hàm lượng khác nhau đểu theo dõi cả về tốc độ sinh trưởng và tích lũy. Còn nghiên cứu này được tiến hành thành hai pha tách biệt, vi tảo được nhân sinh khối trong môi trường đầy đủ sau đó mới chuyển sang môi trường bị thiếu hụt dinh dưỡng khác nhau, vậy nên kết quả của hai nghiên cứu mới khác biệt. Bên cạnh đó, điều kiện chiếu sáng ở hai nghiên cứu không giống nhau, ở nghiên cứu ông Harker,.M chiếu sáng ở cường độ 35 µmol.m-2.s-1 còn nghiên cứu này được thức hiện trong điều kiện chiếu sáng 100 µmol.m-2.s-1. Vậy nên khi chiếu sáng cao kết hợp với thiếu hụt dinh dưỡng thì vi tảo sẽ được bảo vệ bởi cơ chế hình thành lớp thành tế bào dày bởi những hạt lipit để bảo vệ tế bào trước những điều kiện bất lợi [53]. Hơn nữa, khi môi trường không được bổ sung nitrate thì nitrate nội bào sẽ được kích ứng sản sinh để hỗ trợ sự sống của tế bào thậm chí còn sử dụng để sinh trường bình thường trong một vài giờ [13]. Vì vậy, quá trình sinh trưởng phát triển, điều này đã làm cho mật độ ở nghiệm thức này tăng lên. Còn ở nghiệm thước bổ sung nitrate chỉ chiếu sáng ở cường độ ánh sáng cao dinh dưỡng vẫn đầy đủ thì chưa kích ứng được tế bào diễn ra cơ chế chống lại với điều kiện chiếu sáng trong thời gian đầu, do vậy một số tế bào đã bị mất diệp lục khi không hình thành được cơ chế bảo vệ tế bào điều này khiến cho tốc độ sinh trưởng thấp hơn so với nghiệm thức 0N.

3.1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến hàm lượng sắc tố trong tảo H.lacustris.

Vi tảo H.lacustris khi nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng khác nhau thì hàm lượng sắc tố tổng hợp được sẽ khác nhau (hình 3.4).

Hình 3.4. Sự thay đổi về hàm lượng chlorophyll a,b; carotenoids trong 1ml (mg/ml) ở các nghiệm thức dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Hàm lượng carotenoids đa số ở các nghiệm thức đều tăng mạnh trừ nghiệm thức BBM. Sự tăng lên của hàm lượng carotenoid trung bình ghi nhận được trong 1 ml dịch nuôi tảo sau 8 ngày tích lũy xấp xỉ bằng 4 mg/ml ở 2 nghiệm thức 0N và 0N0P. Ở nghiệm thức 0P, hàm lượng carotenoid tăng trung bình 2 ± 0,5 mg/ml trong khi lượng tăng ở nghiệm thức N/2 là thấp hơn (1,2 ± 0,4 mg/ml). Khi được cho tích lũy trong môi trường BBM, sự thay đổi của carotenoid là không đáng kể (p=0,99). Đối với chlorophyll a, hàm lượng của sắc tố này trong nghiệm thức 0P và N/2 được ghi nhận cao hơn đáng kể sau 8 ngày tích lũy (p<0.05) trong khi ở các nghiệm thức còn lại có xu hướng giảm xuống với mức độ không lớn (p>0.05). Sắc tố Chlorophyll b không thay

đổi nhiều sau thời gian tích lũy ở hầu hết các nghiệm thức, riêng ở môi trường 0P, hàm lượng cao hơn 2 mg/ml so với ban đầu.

Sự gia tăng hàm lượng carotenoid, phần lớn là astaxanthin, của vi tảo H. lacustris khi ở trong môi trường thiếu hụt dinh dưỡng đã được quan sát và báo cáo trong nhiều nghiên cứu. Kết quả từ nghiên cứu của Harker và cs., 1996 chỉ ra rằng sự thiếu hụt nitratevà phosphate trong môi trường nuôi cấy tiến làm hạn chế sự sinh trưởng của H. pluvialis nhưng lại thúc đẩy quá trình tổng hợp carotenoid trong loài tảo này [18]. Recht và cs (2014) báo cáo rằng hàm lượng carotenoid tổng số trong vi tảo H. lacustris tăng khoảng 0,07 mg/ml sau 48h kể từ khi được chuyển từ môi trường đầy đủ dinh dưỡng sang môi trường không có nitơ trong điều kiện ánh sáng cao [49]. Tương tự, Zhang et al., 2018 cũng đã khảo sát ảnh hưởng của nitơ lên sự tích lũy astaxanthin ở H. lacustris, kết quả cho thấy trong hàm lượng astaxanthin trong lô thí nghiệm cao hơn 1,64 lần (đạt 81,19 ± 3,26 với cường độ ánh sáng 400 μmol photons.m-2.s-1) so với lô đối chứng tại ngày thứ 11 của thí nghiệm [63].

Cường độ ánh sáng cũng có thể giúp giải thích cho sự thay đổi tỉ lệ sắc tố trong vi tảo trong thí nghiệm trên, bởi toàn bộ các nghiệm thức được chuyển sang điều kiện nuôi cấy có ánh sáng mạnh hơn trong pha tích lũy (100 μmol photons.m-2.s-1). Hàm lượng carotenoids đều tăng ở hầu hết các nghiệm thức do cơ chế bảo vệ tế bào bằng các hợp chất thứ cấp sẽ được kích thích hoạt động để thích nghi với điều kiện cường độ chiếu sáng lớn. Ngoài ra, trong điều kiện có nitrate trong môi trường nuôi (nghiệm thức 0P, N/2), cường độ ánh sáng cao kích thích sự tổng hợp chlorophyll a phục vụ cho việc quang hợp [38]. Hàm lượng chlorophyll a tăng mạnh hơn ở nghiệm thức 0P so với N/2 có thể được giải thích bởi mật độ trong 0P là cao hơn và lượng nito trong môi trường là nhiều hơn. Đối với tảo được nuôi trong môi trường BBM, sự thay đổi các sắc tố là không đáng kể.

Lưu ý rằng sự thay đổi hàm lượng sắc tố trong 1ml dịch tảo có thể là do sự thay đổi trong thành phần tế bào và/hoặc do sự thay đổi về mật độ. Để đánh giá được sự tích lũy sắc tố của tế bào tảo, sự thay đổi hàm lượng của carotenoids, chlorophyll a và b trong 1 tế bào đã được khảo sát.

Hình 3.5. Sự thay đổi về hàm lượng chlorophyll a,b; carotenoids trong một tế bào (μg/tb) ở các nghiệm thức dinh dưỡng vào lúc bắt đầu và kết thúc thí

nghiệm

Sự biến động hàm lượng sắc tố ở mỗi tế bào H. lacustris trong sau 8 ngày kích thích tích lũy hầu hết là không có ý nghĩa thống kê, ngoại trừ nghiệm thức môi trường không chứa nito (0N, 0N0P). Ở hai nghiệm thức này, lượng carotenoids trung bình trong một tế bào tăng lên rõ rêt (p-values < 0.05), lần lượt là tăng 0,19 ± 0,06 μg/tb và 0,27 ± 0,04 μg/tb. Đồng thời sự suy giảm của chlorophyll a và chlorophyll b cũng được ghi nhận, với mức độ giảm mạnh hơn và có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức 0N.

Kết quả này tương tự với kết quả trong nghiên cứu của Fabregas,. năm 2003, với hàm lượng chlorophyll giảm từ 25 pg/tb xuống còn 0.8 pg/tb trong

khi hàm lượng astaxanthin đạt cao nhất (340 pg/tb) trong điều kiện chiếu sáng cao kết hợp với không bổ sung nitrate [12]. Một xu hướng tương tự cũng được báo cáo bởi [42].

Kết quả này có thể được giải thích theo cơ chế sinh tổng hợp của các nhóm sắc tố. Nitrate là thành phần tham gia vào việc tổng hợp các hợp chất chlorophyll trong tế bào vi tảo, cho nên ở trong các nghiệm thức không chứa nitrate thì hàm lượng chlorophyll a giảm. Đồng thời, cường độ ánh sáng mạnh kích thích sự quang hợp của vi tảo khiến vi tảo cần nhiều hơn nito để thực hiện quá trình tăng sinh và sinh sản, do đó khi lượng nito ở môi trường không đủ, chlorophyll sẽ được sử dụng như là một nguồn nito dự trữ để duy trì sự sinh trưởng [38].

Đáng chú ý, sự suy giảm chlorophyll ở các tế bào tảo trong nghiệm thức 0N là mạnh hơn so với nghiệm thức 0N0P. Harker và cs (1996) đã nhấn mạnh rằng sự thiếu hụt về nitrate và phosphate đều gây ra sự tích lũy astaxanthin và suy giảm sinh trưởng ở vi tảo, tuy nhiên mức độ hạn chế lên tốc độ sinh trưởng do phosphate tạo ra là thấp hơn nhiều so với nitrate [18]. Phosphate được tế bào sử dụng để tổng hợp năng lượng ATP (Adenosine triphosphate) và các vật chất di truyền của vi tảo, là yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển bình thường của các tế bào tảo [56]. Trong nghiên cứu này, ở nghiệm thức 0N vẫn có sự tăng lên đáng kể về mật độ trong khi môi trường thiếu cả nitratevà phosphate (0N0P), mật độ dường như không đổi. Do đó, Chlorophyll trong nghiệm thức 0N giảm mạnh là do (1) không có sự tổng hợp thêm, (2) mất đi để duy trì sinh trưởng và (3) do sự phân chia tế bào, còn trong nghiệm thức 0N0P, lý do chính chỉ là (1) và (2).

3.3. Ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến vi tảo H. lacustris trong pha tích

lũy

3.3.1. Ảnh hưởng của phổ ánh sáng đến mật độ và kích thước của vi tảo H.lacustris

Vi tảo khi được nuôi cấy dưới phổ ánh sáng khác nhau: trắng, xanh, đỏ