Xét nghiệm miễn dịch sử dụng một hoặc nhiều kháng thể được lựa chọn để phát hiện ra kháng nguyên cần tìm. Các kháng nguyên này có thể sẵn có trong cơ thể từ trước (ví dụ như hooc môn tuyến giáp) hoặc do cơ thể sản sinh ra để phản ứng lại sự xâm nhập của chất lạ (như kháng nguyên ung thư) hoặc không phải xuất hiện tự nhiên trong cơ thể (do sự lạm dụng thuốc).
Kháng thể có tính đặc hiệu cao và ái lực mạnh với một kháng nguyên cụ thể. Đó là sự liên kết đặc biệt của một kháng thể với một kháng nguyên để cho phép phát hiện các chất phân tích bằng nhiều phương pháp xét nghiệm miễn dịch khác nhau.
Thuốc thử kháng thểđược phát triển từ các kháng thểđơn dòng hoặc đa dòng.
Huyết thanh miễn dịch đa dòng được tạo ra từđộng vật, thường là từ cừu, thỏ hoặc
dê. Các động vật này tạo ra huyết thanh miễn dịch có cơ chế phản ứng khi tiếp xúc với kháng nguyên giống như người. Huyết thanh miễn dịch chứa hỗn hợp các kháng thể, mỗi kháng thể trong đó gắn kết với các vùng liên kết khác nhau của kháng nguyên.
Quá trình tạo ra huyết thanh miễn dịch bắt đầu bằng cách tiêm dung dịch chứa kháng nguyên cần nghiên cứu vào động vật. Kháng nguyên này còn được gọi là chất kháng nguyên vì nó kích thích đáp ứng miễn dịch. Sau một thời gian, có thể
phải tiêm thêm vài lần, hệ thống miễn dịch của động vật thí nghiệm này sản sinh ra
các kháng thể chống lại các kháng nguyên đã được tiêm vào cơ thể. Máu của nó
được trích ra rồi được tách lấy huyết thanh. Huyết thanh này rất giàu các kháng thể
nhận dạng kháng nguyên, và được gọi là huyết thanh miễn dịch. Huyết thanh miễn
dịch thường chứa hỗn hợp các kháng thể nhận dạng và liên kết với kháng nguyên tương ứng nhưng chúng có thể gắn ở các vị trí khác nhau.
Một kháng nguyên có nhiều mặt liên kết với các kháng thểđược gọi là kháng nguyên đa trị. Các kháng thể loại này thường có trong hỗn hợp nhiều loại kháng thể được gọi là kháng thểđa dòng.
Hình 2.1. Kháng nguyên đa trị đặc hiệu cho kháng thể đa dòng
Kháng thể đơn dòng khác với kháng thể đa dòng ở điểm chúng có tính đặc
hiệu cao với một vị trí cụ thể trên một kháng nguyên đa trị. Chúng được tạo ra từ dòng tế bào đơn sử dụng kỹ thuật tế bào lai và các dòng tế bào u tủy chuột. Tế bào lai là các tế bào khối u tạo ra kháng thể, chúng có thể tạo ra nhiều bản sao của cùng một kháng thể và phát triển dễ dàng trong môi trường nuôi cấy tế bào phòng thí nghiệm.
Ưu điểm của các kháng thểđơn dòng là dòng tế bào lai có thể tạo ra chúng dễ dàng và tạo ra các kháng thể tương tự một cách nhất quán và vô hạn. Huyết thanh miễn dịch đa dòng được tạo bởi phản ứng miễn dịch của động vật và có thể thay đổi từ động vật sang động vật. Huyết thanh đa dòng tạo ra bởi hệ miễn dịch của các động vật khác nhau là không giống nhau.
Hình 2.2. Mặt đặc hiệu của kháng nguyên cho kháng thể đơn dòng
Các kháng thể đơn dòng được tạo ra theo một quy trình gồm có nhiều bước như minh họa trong hình 2.3.
‐ Tiêm kháng nguyên xác định vào động vật chủ (thường là chuột)
‐ Cách ly các tế bào tạo kháng thể (tế bào B) từ tuyến tụy của chuột
‐ Pha trộn các tế bào B này với một loại tế bào mô có thể phát triển dễ dàng
trong môi trường nuôi cấy và tạo ra kháng thể
‐ Cách ly các tế bào lai thành công là nguồn tạo kháng thể đặc hiệu cho kháng
Hình 2.3. Quy trình tạo kháng thể đơn dòng 2.3. Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch
Xét nghiệm miễn dịch có bốn phương pháp cơ bản là xét nghiệm miễn dịch
cạnh tranh và không cạnh tranh, xét nghiệm miễn dịch đồng nhất và không đồng
nhất. Tất cả các xét nghiệm này đều yêu cầu sử dụng chất đánh dấu (nhãn) để đo lường số lượng kháng nguyên hoặc kháng thể có trong mẫu xét nghiệm. Chất đánh dấu là phân tử có phản ứng với kháng nguyên hoặc kháng thể làm thay đổi tín hiệu
đo được trong hỗn hợp dung dịch thuốc thử:máu. Ví dụ như chất đánh dấu là hỗn hợp chất phóng xạ, một enzym có thể gây nên sự thay đổi màu sắc của dung dịch hoặc một chất tạo ra ánh sáng. Chất đánh dấu có thể được đưa vào kháng nguyên (Ag*) hoặc kháng thể (Ab*) trong quá trình sản xuất thuốc thử. Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch thực hiện dưới nhiều thể thức khác nhau để phân biệt phức hợp liên kết kháng nguyên-kháng thể với nhãn tự do không liên kết.
Hình 2.4. Kháng thể được đánh dấu cho phép phát hiện phức hợp kháng nguyên/kháng thể trong xét nghiệm miễn dịch.
Hình 2.5. Kháng nguyên được đánh dấu cho phép phát hiện phức hợp kháng nguyên/kháng thể trong xét nghiệm miễn dịch.
2.3.1. Xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh và không cạnh tranh 2.3.1.1.Thể thức cạnh tranh 2.3.1.1.Thể thức cạnh tranh
Trong thể thức xét nghiệm này, chất phân tích chưa được đánh dấu (thường là kháng nguyên) được đo lường bằng khả năng cạnh tranh của nó với kháng nguyên đã được đánh dấu. Kháng nguyên không đánh dấu ngăn chặn khả năng gắn kết của kháng nguyên đánh dấu bằng cách chiếm giữ vùng gắn của kháng thể. Như vậy,
trong xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh càng ít chất đánh dấu đo được có nghĩa là
nguyên trong mẫu xét nghiệm tỉ lệ nghịch với lượng nhãn đo được trong thể thức xét nghiệm cạnh tranh.
Hình 2.6. Số lượng kháng thể tỉ lệ nghịch với số thuốc thử trong thể thức xét nghiệm cạnh tranh
Trong thể thức xét nghiệm cạnh tranh một bước, cả thuốc thử kháng nguyên đánh dấu (Ag*) và chất phân tích không đánh dấu cạnh tranh nhau vì một số hữu hạn kháng thể.
Hình 2.7. Xét nghiệm cạnh tranh một bước.
Trong thể thức xét nghiệm cạnh tranh một bước mật độ kháng thể trong dung dịch phản ứng lớn hơn rất nhiều lần mật độ kháng nguyên. Thuốc thử kháng thể đầu tiên được ủ với mẫu chứa kháng nguyên cần tìm hiểu. bước thứ hai, kháng nguyên đánh dấu được đưa vào hỗn hợp. Phương pháp này nhạy hơn nhiều lần hơn so với thể thức cạnh tranh một bước.
Hình 2.8. Xét nghiệm cạnh tranh hai bước 2.3.1.2. Thể thức không cạnh tranh (phương pháp sandwich)
Thể thức không cạnh tranh có độ nhạy và tính đặc hiệu cao nhất và thường được ứng dụng để đo lường chất phân tích quan trọng để phát hiện dấu hiệu các
bệnh tim mạch hoặc viêm gan.Thể thức này được gọi là phương pháp xét nghiệm
sandwich vì chất phân tích được gắn giữa hai thuốc thử kháng thể có tính đặc hiệu cao.
Hình 2.9. Phương pháp xét nghiệm phi cạnh tranh sandwich
Thể thức xét nghiệm này cũng có thể thực hiện một bước hoặc hai bước như trong thể thức cạnh tranh. Thể thức hai bước có thêm một số khâu rửa khi phức hợp gắn sandwich bị cô lập để loại bỏ đi kháng nguyên đánh dấu không liên kết dư thừa và các tạp chất khác.
Thể thức phi cạnh tranh hai bước này thường có độ chính xác và có tính đặc hiệu cao nhất trong số bốn phương pháp đề cập ở đây.
Hình 2.10. Lượng kháng nguyên tỉ lệ thuận với chất đánh dấu (tín hiệu) trong các thể thức cạnh tranh
Trong các xét nghiệm phi cạnh tranh, việc đo lường các chất phân tích được
đánh dấu, thường là kháng thể, tỉ lệ thuận với lượng kháng nguyên có trong mẫu. 2.3.2. Phương pháp xét nghiệm miễn dịch đồng nhất và không đồng nhất
Xét nghiệm miễn dịch không đồng nhất cần có phức hợp kháng thể - kháng nguyên đánh dấu được tách riêng. Xét nghiệm miễn dịch đồng nhất thì ngược lại.
Hình 2.11. Xét nghiệm miễn dịch đồng nhất và không đồng nhất
Thể thức đồng nhất đã được ứng dụng trong đo lường các chất phân tích nhỏ như các thuốc điều trị hay thuốc bị lạm dụng. Vì thể thức này không yêu cầu tách
rời gắn kết Ab-Ag* từ các Ag* tự do nên quá trình thực hiện nhanh chóng và dễ dàng hơn.
2.4. Các kỹ thuật phát hiện trong xét nghiệm miễn dịch 2.4.1. Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch ban đầu 2.4.1. Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch ban đầu 2.4.1.1. Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch RIA
Xét nghiệm miễn dịch bắt đầu được phát triển vào những năm 1960 với
phương pháp xét nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA). Phương pháp này sử dụng các đồng vị phóng xạ làm chất đánh dấu và lượng phóng xạ đo được sẽ cho biết lượng chất phân tích có trong mẫu. Lưu ý rằng trong thể thức sandwich phi cạnh tranh,
chất đánh dấu tỉ lệ thuận với kháng nguyên có trong mẫu. Trong khi đó, thể thức
cạnh tranh lại có số lượng kháng nguyên tỉ lệ nghịch với chất đánh dấu.
Hình 2.12. Xét nghiệm miễn dịch phóng xạ RIA sử dụng chất đánh dấu là đồng vị phóng xạ
Ngày nay phương pháp RIA vẫn được sử dụng, đặc biệt để phát hiện chất
phân tích có nồng độ rất thấp. Các bước cơ bản của RIA bao gồm:
(1) Đánh dấu phóng xạ cho mẫu chuẩn (kháng nguyên chuẩn). Thành phần phóng xạ thường được sử dụng là đồng vị gamma của iod được gắn với tyrosine.
(2) Thêm kháng thể với hàm lượng đã biết trước và đặc hiệu cho kháng nguyên
chuẩn đã được đánh dấu phòng xạ nói trên. Phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ xảy ra.
(3) Thêm mẫu huyết thanh cần xác định nồng độ kháng nguyên. Kháng nguyên
trong huyết thanh (chưa được đánh dấu phóng xạ và được gọi là “kháng nguyên
lạnh”) sẽ cạnh tranh với kháng nguyên đã được gắn chất phóng xạ để kết hợp với kháng thể.
(4) Kháng nguyên có nồng độ càng cao, lượng kháng nguyên kết hợp với kháng thể sẽ càng lớn và có khả năng cạnh tranh để kết hợp với kháng thể càng cao dẫn đến làm giảm tỷ lệ kháng nguyên chuẩn (đã được đánh dấu) kết hợp với kháng thể. Như vậy, một lượng kháng nguyên chuẩn được giải phóng.
(5) Kháng nguyên ở trạng thái kết hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ được tách khỏi kháng nguyên tự do. Đây là bước quan trọng có tính quyết định mức độ chính xác của phép đo. Để thực hiện, một kháng kháng thể được thêm vào để tạo kết tủa với kháng nguyên chuẩn thứ nhất. Phần "cặn" sẽ được tách bằng phương pháp ly tâm. (6) Đo nồng độ của kháng nguyên chuẩn được giải phóng ở bước (4) thông qua tín hiệu phóng xạ đã được gắn với kháng nguyên chuẩn ở bước (1).
(7) Dựng đường biểu diễn nồng độ kết hợp kháng nguyên-kháng thể qua đó xác
định nồng độ kháng nguyên trong mẫu cần chẩn đoán.
RIA là phương pháp có độ nhạy cao nhưng nhược điểm của nó là yêu cầu thiết
bị hiện đại và chi phí lớn. Đặc biệt, RIA có sử dụng chất phóng xạ nên yêu cầu
nghiêm ngặt về an toàn trong quá trình xét nghiệm. Chính vì vậy RIA dần được
thay thế bằng ELISA, trong đó chất phóng xạ được thay bằng chất phát quang. 2.4.1.2. Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch men EIA
Trong kỹ thuật này, chất đánh dấu được sử dụng là enzym thay thế cho chất
phóng xạ. Các enzym thường được sử dụng là alkaline phosphatase ALP (Enzyme này hoạt động trong môi trường kiềm. ALP trong cơ thể được sản sinh ở bất kì tế
bào nào. Tuy nhiên, nó tiết ra nhiều nhất ở gan, thành ống mật, xương, rau thai),
horseradish peroxidase HRP, và B galactosidase. Nếu như RIA sử dụng chất phóng xạ để xác định mật độ chất phân tích thì EIA xác định theo sự thay đổi của màu sắc,
cường độ sáng hay tín hiệu khác. Thiết bị chuyên dụng đo lường những thay đổi đặc trưng để định lượng enzyme có trong mẫu.
2.4.2. Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
ELISA là xét nghiệm miễn dịch kiểu sandwich không đồng nhất được ứng
dụng để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Phương pháp này kết hợp thuốc thử với chất đánh dấu emzyme-kháng thể với một kháng thể gắn kết pha rắn. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học . ELISA là một loại của phương pháp EIA.
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên chưa biết được gắn trên vi phiếm;
(2) Kháng thể biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme;
(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên- kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên-kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm.
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm.
- Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa;
- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra Kháng thể đặc hiệu được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng thể-kháng nguyên có thể xảy ra.
Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng thể-kháng nguyên. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ xảy ra.
Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày
nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Phương pháp ELISA thường được ứng dụng để xác định nồng độ của kháng thể trong huyết thanh; kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên; phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm; xác định sự có mặt của dược phẩm; xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học.
2.4.2.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) Kỹ thuật này gồm các bước chính sau đây: Kỹ thuật này gồm các bước chính sau đây:
- Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.
- Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn.
Hình 2. 13. Kỹ thuật ELISA gián tiếp
- Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
- Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh.
- Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme).
- Rửa đĩa, các kháng thể gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.
- Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang