Ứng dụng chỉ thị phân tử để nhận diện các gen kháng bệnh bạc lá, bệnh đạo ôn và chất lượng gạo nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa (oryza sativa l ) ở việt nam nghiên cứu khoa học

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng, được trồng bởi 250 triệu nông dân trên toàn thế giới, cung cấp 180-200 kg gạo/người/năm ở châu Á và 10 kg/người/năm ở châu Mỹ Theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, khoảng 156,1 triệu ha đất được sử dụng để trồng lúa, với sản lượng đạt 697,9 triệu tấn, trong đó 90% diện tích và 92% sản lượng thuộc về các nước châu Á Tại Việt Nam, với dân số hơn 80 triệu người, lúa gạo là thực phẩm chính và khí hậu nhiệt đới tạo điều kiện cho nhiều loại sâu bệnh phát triển, đặc biệt là bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây ra Năm 2012, diện tích nhiễm bệnh tăng 35%-70% so với các năm trước, gây hại cho cây lúa ở tất cả các giai đoạn, đặc biệt là giai đoạn đồng-trổ-chín sữa, với năng suất giảm từ 25%-50%, thậm chí có thể mất trắng Bệnh bạc lá đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành trồng lúa tại nhiều quốc gia trong khu vực.

[53] Bệnh đạo ôn là một loại bệnh do nấm Pyricularia grisea hoặc P.oryzae

Bệnh đạo ôn do nấm Magnaporthe grisea gây ra đã được ghi nhận ở hơn 80 quốc gia trồng lúa, bao gồm Nhật Bản, Philippines, Ấn Độ, Italia và Việt Nam Theo Trung tâm BVTV phía Nam, vào cuối tháng 1 năm 2013, khu vực phía Nam có 56.818 ha lúa bị nhiễm bệnh đạo ôn lá và 4.675 ha nhiễm bệnh đạo ôn cổ bông, với tỷ lệ bệnh phổ biến từ 5 đến 15% Thời tiết phức tạp trong năm đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát sinh và phát triển của dịch hại trên cây trồng.

Hàm lượng amylose (AC) là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng xuất khẩu gạo Gạo có hàm lượng amylose cao (>25%) thường nấu lâu chín, cơm khô và cứng, trong khi gạo có hàm lượng amylose thấp (27%) và trung bình (20-24%) Để hỗ trợ công tác chọn tạo giống lúa chất lượng tốt và kháng bệnh, chúng tôi đã thực hiện đề tài ứng dụng chỉ thị phân tử nhằm xác định các gen kháng bệnh bạc lá và đạo ôn, đồng thời đảm bảo chất lượng gạo, phục vụ cho thị trường trong nước và xuất khẩu.

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Mục tiêu chính của đề tài là ứng dụng chỉ thị phân để nhận diện các giống lúa có phẩm chất gạo tốt và khả năng kháng bệnh đạo ôn, bạc lá, nhằm hỗ trợ công tác chọn tạo giống lúa năng suất cao tại Việt Nam Nghiên cứu khoa học này được thực hiện bởi sinh viên năm cuối của khoa Công nghệ sinh học, Đại học Mở TP HCM Các mục tiêu cụ thể của đề tài sẽ được xác định rõ ràng để đạt được hiệu quả cao nhất trong việc phát triển giống lúa.

- Xác định được gen kháng bạc lá Xa7 và Xa21 bằng chỉ thị DNA

- Nhận diện được gen kháng bạc đạo ôn Pib, Piz, Pi37, Pikh, Pi40, Pi41, Pi39 bằng chỉ thị DNA

- Xác định được gen Wx qui định hàm lượng amylose trung bình ở lúa bằng chỉ thị DNA

Áp dụng các quy trình đánh giá giúp xác định các dòng giống lúa tiềm năng có khả năng kháng bệnh bạc lá, bệnh đạo ôn và hàm lượng amylose, từ đó hỗ trợ hiệu quả cho công tác chọn tạo giống lúa.

ĐỐI TƯỢNG – PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tượng

Thí nghiệm thực hiện trên 85mẫu/giống lúa trong tập đoàn nguyên liệu lúa của công ty cổ phần Giống cây trồng miền Nam (SSC).

Phạm vi nghiên cứu

Thí nghiệm này nhằm đánh giá mối quan hệ giữa kiểu gen và kiểu hình trong việc phát hiện đặc tính kháng bệnh bạc lá trên cây lúa, sử dụng chỉ thị phân tử STS/SSR Nghiên cứu tập trung vào việc xác định các gen liên quan đến khả năng kháng bệnh, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho việc chọn giống lúa có khả năng chống chịu tốt hơn Việc ứng dụng các chỉ thị phân tử sẽ giúp cải thiện hiệu quả trong công tác phát triển giống lúa kháng bệnh, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản.

Thí nghiệm đánh giá tương quan kiểu gen và kiểu hình trong việc phát hiện đặc tính kháng bệnh đạo ôntrên lúa bằng chỉ thị phân tử SSR

Thí nghiệm đánh giá tương quan kiểu gen và kiểu hình trong việc phát hiện gen qui định hàm lượng amylose trên lúa bằng chỉ thị phân tử SSR

Nghiên cứu này tập trung vào việc phát hiện gen kháng bạc lá và đạo ôn, cũng như gen quy định hàm lượng amylose trên các giống lúa tiềm năng hiện có trên thị trường Phương pháp được sử dụng là chỉ thị phân tử STS/SSR, nhằm đánh giá mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của các giống lúa này.

NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học và sự ra đời của nhiều loại chỉ thị phân tử đã nâng cao hiệu quả trong việc đánh giá, bảo tồn và khai thác tài nguyên Chỉ thị DNA được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật, bao gồm phân tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểm soát tính trạng và chọn giống phân tử.

Kỹ thuật RFLP cho phép phát hiện gen mục tiêu trong hệ gen, phân tích sự đa dạng DNA giữa các cá thể, xác định đột biến và các thể lai soma Phương pháp này cũng giúp lập bản đồ giới hạn của gen và chỉ thị đồng trội Tuy nhiên, RFLP ngày nay ít được sử dụng do yêu cầu khối lượng lớn DNA, số lượng băng đa hình hạn chế và tốn thời gian, công sức Chỉ thị Microsatellite, nhóm chỉ thị dựa trên trình tự lặp lại đặc trưng cho loài Eukaryote, bao gồm nhiều loại khác nhau.

- SSLP: Single Sequence Length Polymorphisms

Kỹ thuật này mang lại kết quả nhanh chóng với chỉ một lượng nhỏ ADN tổng số, đồng thời đảm bảo tính nghiêm ngặt và độ đa hình cao Nó cho phép chỉ thị đồng trội và có khả năng tự động hóa Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng có những hạn chế như tính đặc trưng loài và yêu cầu kỹ thuật cao.

Chỉ thị STS, phát triển từ các chỉ thị RFLP và AFLP, cho phép xác định các vị trí đánh dấu bằng cách sử dụng trình tự nucleotit đã biết của ADN chỉ thị Trong cây lúa, các STS được xem như mốc chuẩn, giúp việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan đến tính kháng đạo ôn trở nên dễ dàng hơn thông qua phân tích di truyền trên quần thể con lai.

Kỹ thuật SSR, được phát triển bởi Liit và Luty vào năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR, liên quan đến các trình tự nucleotide lặp lại trong hệ gen của sinh vật nhân chuẩn Các trình tự này, thường gồm từ 2 đến 5 nucleotide lặp lại nhiều lần (ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n), đặc trưng cho từng loài và phân bố rải rác trong hệ gen của thực vật bậc cao Những trình tự lặp lại này thường xuất hiện ở vùng dị nhiễm sắc trên mỗi nhiễm sắc thể.

SSR đóng vai trò điều hòa hoạt động của các gen, giúp tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào Mức độ đa hình của SSR được xác định thông qua điện di sản phẩm trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide Đây là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng nhờ vào chỉ thị đồng trội với tính đa hình cao.

Nghiên cứu của Olufowote (1997) về biến động di truyền của 171 giống lúa sử dụng cả chỉ thị SSR và RFLP cho thấy rằng các giống lúa địa phương có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn so với các giống lúa cải tiến Đặc biệt, chỉ thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi và cho thấy số lượng allele cao hơn so với chỉ thị RFLP.

Tác giả Yu và cộng sự (2003) đã sử dụng 101 chỉ thị SSR để đánh giá sự đa dạng của 193 giống lúa từ 26 quốc gia Kết quả phân tích cho thấy 193 giống lúa được phân chia thành 3 nhóm chính và 9 phân nhóm, trong đó Nhóm I bao gồm các giống lúa Indica, còn Nhóm II và III thuộc loài phụ Japonica Các locus trên nhiễm sắc thể 9 và 12 đã thể hiện sự khác biệt rõ rệt giữa hai nhóm giống Indica và Japonica.

Việt Nam được xem là cái nôi của cây lúa với nguồn tài nguyên di truyền phong phú về cả số lượng lẫn chất lượng Mặc dù nghiên cứu về đa dạng di truyền và phân loại hệ thống lúa trồng tại Việt Nam còn hạn chế, nhưng trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã chú trọng ứng dụng chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng tài nguyên lúa của đất nước.

Chọn giống bằng chỉ thị phân tử đã được áp dụng từ năm 1995, sử dụng các phương pháp PCR như RAPD, AFLP, STS và microsatellite để kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong bố mẹ và con lai Viện Công nghệ Sinh học Quốc gia đã tập trung vào chiến lược này và đạt được thành công trong việc phát hiện gen kháng rầy nâu (Lang và cộng sự, 2003; Oanh và cộng sự, 1999; Huyền và cộng sự, 1999) cũng như bệnh đạo ôn (Lang và Bửu, 2002; Nghĩa và cộng sự).

1999, Quang và ctv.1999, Huyền và ctv.1999), bệnh bạc lá với gen xa-5, xa-13, Xa-4, Xa-

7, Xa-21 (Lan và ctv 2003, Bửu và Lang 1998) [4].

TỔNG QUAN VỀ LÚA

Định nghĩa và tầm quan trọng

Lúa gạo là cây trồng chủ lực tại Việt Nam, đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế và đời sống người dân Với lịch sử sản xuất lâu đời, Việt Nam hiện có khoảng 9,3 triệu ha đất nông nghiệp, trong đó 4,3 triệu ha (chiếm 46%) được sử dụng cho trồng lúa.

So với năm 2000, lượng gạo xuất khẩu của Việt Nam đã tăng 1,81 triệu tấn (34,81%) vào năm 2005, với giá trị xuất khẩu gần gấp đôi (51,86%) Đây là năm thứ 17 liên tiếp Việt Nam xuất khẩu gạo và là năm thứ 3 đạt hơn 4 triệu tấn Sản lượng gạo xuất khẩu không ngừng gia tăng, mang lại ngoại tệ và giá trị cao hơn trong những năm tiếp theo Dự kiến đến năm 2012, Việt Nam có thể đạt mốc xuất khẩu gạo khoảng 7,5 triệu tấn và ngành sản xuất lúa gạo sẽ đóng góp hơn 3 tỷ USD cho nền kinh tế.

Bảng 1.1 Tổng giá trị gạo xuất khẩu ở Việt Nam

Nguồn: Niên giám thống kê 2011, NXB thống kê

Nguồn gốc và vị trí phát sinh

Nghiên cứu cho thấy vết tích cây lúa cổ xưa nhất được phát hiện tại các di chỉ ở vùng Punjab, Ấn Độ, có thể thuộc về các bộ lạc sinh sống ở khu vực này khoảng hàng ngàn năm trước.

Trong nghiên cứu nổi tiếng của Vavilov (1926) về sự phân bố đa dạng di truyền của cây trồng, ông cho rằng lúa trồng có nguồn gốc phát triển từ Ấn Độ.

Năm 1931, các loài thuộc chi Oryza được phân loại thành 4 nhóm: Sativa, Granulata, Coarctata và Rhynchoryza Nghiên cứu cũng khẳng định rằng Oryza sativa có nguồn gốc từ nhóm Sativa, có thể là Oryza sativa f spontanea, xuất phát từ Ấn Độ, Đông Dương hoặc Trung Quốc.

Theo Quốc, Chowdhury và Ghosh, những hạt thóc hóa thạch cổ nhất thế giới được phát hiện tại Hasthinapur, bang Uttar Pradesh, Ấn Độ, có niên đại khoảng từ năm 1000 đến 750 trước Công Nguyên, tức là hơn 2500 năm trước.

Theo Chang (1976), nhà di truyền học cây lúa của Viện Nghiên Cứu Lúa Quốc Tế (IRRI), việc thuần hóa lúa trồng có thể đã diễn ra độc lập ở nhiều khu vực khác nhau Quá trình này trải dài từ đồng bằng sông Ganges dưới chân dãy núi Himalayas (Ấn Độ), qua Bắc Miến Điện, Bắc Thái Lan, Lào, Việt Nam, cho đến Tây Nam và Nam Trung Quốc.

Phân loại

1.5.3.1 Theo đặc tính thực vật học:

Lúa là cây hằng niên với tổng số nhiễm sắc thể 2n = 24, thuộc họ Gramineae (hòa thảo), tộc Oryzeae, chi Oryza Chi Oryza có khoảng 20 loài, chủ yếu phân bố tại các vùng nhiệt đới ẩm của Châu Phi, Nam và Đông Nam Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung Mỹ, cùng một phần ở Úc.

Trong số các loài lúa, chỉ có hai loại là lúa trồng, trong khi phần còn lại bao gồm lúa hoang hằng niên và đa niên Loài lúa trồng chủ yếu và quan trọng nhất, có khả năng thích nghi rộng rãi và chiếm phần lớn diện tích lúa trên toàn cầu, là Oryza sativa L.

Oryza sativa L là loài lúa trồng quan trọng nhất, có khả năng thích nghi rộng rãi và chiếm phần lớn diện tích lúa trên toàn thế giới Loài này xuất hiện ở nhiều nơi, từ đầm lầy đến sườn núi, trải dài từ vùng xích đạo, nhiệt đới đến ôn đới, và từ vùng phù sa nước ngọt đến các khu vực đất cát sỏi ven biển nhiễm mặn phèn Bên cạnh đó, Oryza glaberrima Steud là một loài lúa khác, nhưng chỉ được trồng giới hạn ở một số quốc gia Tây Phi và hiện đang dần bị thay thế bởi Oryza sativa.

Bảng 1.2 Nguồn gốc phân loài [13]

Nhóm/loài 2n Kiểu gien Phân bố địa lý

Sativa L 24 AA Khắp thế giới, lúa trồng

RufipogonGriff (=perennis Moench) 24 AA Châu Á, Châu

BarthiiA Chev (=longistaminata) 24 AA Châu Phi glaberrimaSteud 24 AA Châu Phi, lúa trồng breviligulata A Chev et Roehr (rthii theo

Bảng nguồn gốc phân loài lúa cho thấy các giống lúa như AA Châu Phi, EE Châu Úc, và CC Châu Á, nhưng trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu chỉ tập trung vào giống Sativa L, là nhóm lúa chính được sử dụng trong nghiên cứu.

1.5.3.2 Theo sinh thái địa lý

Từ 200 năm trước công nguyên, các giống lúa ở Trung Quốc được phân thành ba nhóm chính: “Hsien”, “Keng” và nếp Đến năm 1928 – 1930, các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã phân chia lúa trồng thành hai phân loài phụ là “indica” và “japonica” dựa trên các yếu tố như phân bố địa lý, hình thái cây và hạt, độ bất dục khi lai tạo, cùng với phản ứng huyết thanh.

1.5.3.3 Theo đặc tính sinh lý:

Lúa là loại cây ngày ngắn, có khả năng ra hoa khi điều kiện ánh sáng ngắn Ở Bắc bán cầu, độ dài ngày thay đổi theo mùa do vị trí của trái đất so với mặt trời Sự chuyển đổi độ dài chiếu sáng trong ngày có thể được xác định qua bốn thời điểm quan trọng trong năm.

Phản ứng của các giống lúa đối với quang kỳ, tức là độ dài chiếu sáng trong ngày, có sự khác biệt rõ rệt Dựa vào mức độ cảm ứng với quang kỳ, lúa được chia thành hai nhóm chính: nhóm quang cảm và nhóm không quang cảm.

Nhóm lúa quang cảm là giống lúa có khả năng ra hoa dựa trên điều kiện ánh sáng ngày ngắn, được gọi là lúa mùa Loại lúa này chỉ trổ và chín theo mùa, và được phân loại thành lúa mùa sớm, mùa lỡ hoặc mùa muộn tùy thuộc vào mức độ mẫn cảm với quang kỳ Hầu hết các giống lúa cổ truyền tại Việt Nam đều thuộc nhóm lúa quang cảm.

1.5.3.4 Theo đặc tính sinh hóa hạt gạo:

Tùy thuộc vào hàm lượng amylose trong tinh bột hạt gạo, người ta phân biệt giữa lúa nếp và lúa tẻ Tinh bột có hai dạng chính là amylose và amylopectin, trong đó, gạo có hàm lượng amylopectin cao sẽ có hàm lượng amylose thấp, dẫn đến tính chất dẻo của gạo Chang (1980) đã phân loại gạo dựa trên hàm lượng amylose.

Bảng 1.3 Đặt tính sinh hóa

Cấp Hàm lượng Amylose (%) Loại gạo

Nếp Rất thấp (gạo dẻo) Thấp (dẻo)

Trung Bình (hơi dẻo) Cao – Trung bình Cao

Theo Viện Lúa IRRI và tiêu chuẩn đánh giá hàm lượng amylose tại Việt Nam, hàm lượng amylose được phân loại như sau: thấp từ 10 – 20%, trung bình từ 20 – 25%, và cao từ 25 – 30%.

1.5.3.5 Theo đặc tính của hình thái:

Dựa vào đặc tính hình thái của cây lúa, người ta còn phân biệt theo:

- Cây: cao (>120 cm) – trung bình (100 – 120 cm) – thấp (dưới 100 cm)

- Lá: thẳng hoặc cong rũ, bản lá to hoặc nhỏ, dày hoặc mỏng

Bông lúa có nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm bông nở bụi mạnh hoặc to bông với nhiều hạt Hình dạng của bông có thể là bông túm hoặc xòe, với cổ bông có thể hở hoặc cổ kính tùy thuộc vào độ trổ của cổ bông so với cổ lá cờ Ngoài ra, bông còn có thể khoe hoặc giấu tùy thuộc vào chiều dài và góc độ của lá cờ hay lá đồng, cũng như độ trổ của bông ra khỏi bẹ lá cờ Đặc điểm dày nách hay thưa nách của bông cũng phụ thuộc vào độ đóng hạt trên các nhánh gié của bông lúa.

- Hạt lúa: dài, trung bình hoặc tròn (dựa vào chiều dài và tỉ lệ dài/ngang của hạt lúa)

Hạt gạo có nhiều loại khác nhau, bao gồm gạo trắng, gạo đỏ, gạo nâu và gạo tím, tùy thuộc vào màu sắc của lớp vỏ ngoài Ngoài ra, gạo còn có thể có bạc bụng hay không, và có dạng hạt dài hoặc tròn Những đặc tính này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định giá trị thương phẩm của gạo trên thị trường trong và ngoài nước.

BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA

Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa

Năm 1960, Goto đã chỉ ra rằng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae là nguyên nhân gây ra ba triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa ở vùng nhiệt đới, bao gồm bạc lá, héo xanh (Kresek hay Wilt) và vàng nhợt.

Theo Lê Lương Tề, bệnh bạc lá lúa tại Việt Nam gây hại từ giai đoạn mạ cho đến khi lúa chín, nhưng triệu chứng điển hình xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn lúa trên ruộng, từ sau khi đẻ nhánh đến khi lúa chín sữa.

Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa

1.6.2.1 Nguồn gốc của bệnh bạc lá lúa

Khi bệnh xuất hiện lần đầu tại Nhật Bản, nhiều người cho rằng nguyên nhân là do đất chua gây ra Tuy nhiên, vào năm 1908 và 1911, Takaishi và Boukara đã phát hiện ra vi khuẩn trong giọt dịch và xác định rằng bệnh có thể lây lan sang cây, từ đó làm sáng tỏ nguyên nhân gây bệnh.

Vi khuẩn gây bệnh bạc lá đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đã từng được đặt nhiều cái tên khác nhau [23]:

Pseudomonas oryzae Uyeda et Ishiyama hoặc Phytomanas oryzae Magrou

Hiện nay vi khuẩn này được biết đến với cái tên Xanthomonas oryzae Pv.oryzae (Ishiyama)

Nguồn bệnh bạc lá chủ yếu tồn tại trên một số loại cỏ dại thuộc họ Hoà thảo, với các cỏ dại này là ký chủ phụ của vi khuẩn X oryzae Tại Việt Nam, vi khuẩn này đã được phát hiện trên cây lúa và các ký chủ cỏ dại, cũng như trong tàn dư rơm rạ của cây bệnh, bao gồm lúa chét, cỏ môi, cỏ lồng vực và cỏ gừng bò.

Về nguyên nhân gây bệnh có thể kể đến một số nguyên nhân chính sau:

- Một số giống mẫn cảm với bệnh bạc lá như một số giống tạp giao và một số giống chất lượng

- Do thời tiết nóng ẩm, mưa to gió lớn xảy ra trong thời kỳ lúa cần quang hợp cao

- Do biện pháp canh tác làm đất

Bệnh thường xuất hiện ở những ruộng lúa có lượng đạm dư thừa, đặc biệt là những ruộng bón đạm nhiều, bón muộn, bón không đồng đều, hoặc bón không cân đối giữa đạm, lân và kali Ngoài ra, các ruộng trũng hẩu có hiện tượng dồn đạm vào cuối vụ cũng dễ bị bệnh do các biện pháp thâm canh, gieo cấy và chăm sóc không đúng kỹ thuật.

Theo Viện Bảo vệ thực vật, để phòng chống bệnh bạc lá lúa, cần cải tiến chế độ canh tác bằng cách sử dụng phân bón hợp lý, đảm bảo thời vụ gieo cấy, áp dụng chế độ tưới nước hợp lý và đặc biệt là sử dụng giống chống chịu Trong số các biện pháp này, việc sử dụng giống chống chịu được xem là phương pháp hàng đầu và hiệu quả nhất.

Di truyền tính kháng bệnh bạc lá lúa

1.6.3.1 Nghiên cứu về gen kháng bệnh bạc lá

Tính kháng của cây trồng được chia thành hai loại: kháng dọc (kháng chuyên nòi) do đơn gen kiểm soát và kháng ngang (kháng nhiều nòi) do một hoặc nhiều gen quyết định Theo thuyết “gen đối gen” của Flor (1956), mỗi gen quy định tính kháng của ký chủ tương ứng với một gen gây bệnh của ký sinh, dẫn đến sự tiến hóa liên tục của cây trồng Nghiên cứu về bệnh bạc lá cho thấy, mặc dù một giống cây có thể biểu hiện tính kháng tốt ban đầu, nhưng sau vài năm, giống này có thể trở nên nhiễm bệnh do sự xuất hiện của chủng vi khuẩn mới có độc tính cao hơn, hiện tượng này được gọi là sự phá vỡ tính kháng Để kiểm soát vấn đề này, một số chiến lược chọn tạo giống đã được đề xuất, trong đó có đề xuất của Ezuka và Sakaguchi (1978).

Sử dụng giống chứa gen có tính kháng ngang

Để tổ hợp tính kháng ngang từ tính kháng dọc, cần sử dụng nhiều dòng giống (multiline) với hỗn hợp các dòng đẳng gen, mỗi dòng mang một gen kháng dọc khác nhau nhưng đồng nhất về thời gian sinh trưởng và các thuộc tính khác Việc luân chuyển các giống có gen kháng dọc khác nhau có thể thực hiện theo không gian hoặc thời gian Ngoài ra, cần tập hợp đủ lượng gen kháng dọc trong một giống đơn Để thực hiện chiến lược này, nhà chọn giống cần thông tin chính xác về nguồn bệnh và sự di truyền tính kháng của vật liệu tạo giống.

Tính đến tháng 6/2005, các nhà khoa học đã phát hiện ra 30 gen kháng bệnh bạc lá, được ký hiệu từ Xa1 đến Xa26 và xa5, xa8, xa13, xa28 Những gen này có thể quy định tính kháng bệnh thông qua một gen đơn trội hoặc đơn lặn, hoặc do sự kết hợp của hai gen như Xa1/Xa4 và Xa4/Xa7.

Hiện nay, nghiên cứu đã sử dụng 10 dòng đồng đẳng (homologues) là IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB10, IRBB11, IRBB14 và IRBB21, chứa các gen đơn chống bệnh như Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa11, Xa14, Xa21 Các gen kháng này nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau: gen Xa1, Xa2, Xa12 trên NST số 4; gen lặn xa5 trên NST số 5; và gen Xa7 trên NST số 7.

NST số 6, gen Xa15 nằm trên NST số 8, gen Xa9 nằm trên NST số 10 và các gen Xa10,

Xa21,Xa23, Xa3, Xa4 nằm trên NST số 11 [65, 79]

Tại Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), các nhà khoa học đã phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa21 ở loài lúa dại Oryzae longistaminata (Khush et al 1989) Gen trội Xa21 cho thấy khả năng kháng toàn bộ các chủng bệnh bạc lá tại Ấn Độ và Philippines, khác với những gen khác, khi được kiểm tra tính kháng bệnh (Ikeda et al 1990).

Nghiên cứu của Khush và Kinoshita (1991), Kinoshita (1995), Lin et al (1996) đã xác định được 14 gen trội và 6 gen lặn liên quan đến khả năng kháng bệnh bạc lá ở lúa Các gen trội bao gồm Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, Xa7, Xa10, Xa11, Xa12, Xa14, Xa16, Xa17, Xa18, Xa21 và Xa22, trong khi các gen lặn là xa5, xa8, xa15, xa18, xa19 và xa20 Ở Trung Quốc, các nhà khoa học đã chuyển gen kháng Xa21 vào dòng bố có khả năng phối hợp tốt, điển hình là dòng bố Minghui 63 mang gen kháng bệnh bạc lá.

1.6.3.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng gen kháng bệnh bạc lá trong chọn tạo giống lúa ở Việt Nam

Nghiên cứu của Bùi Trọng Thuỷ (2004) chỉ ra rằng các gen đơn trội Xa7, Xa21 và gen lặn xa5 có khả năng kháng (R) và kháng vừa (M) đối với tất cả 10 chủng vi khuẩn X oryzae gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam, cho thấy tầm quan trọng của chúng trong việc lai tạo và chọn lọc giống lúa chống bệnh Ngoài ra, gen Xa4 kháng được các chủng Y3, Y4, Y5 và Y7, trong khi gen Xa3 có phản ứng kháng (R) với chủng Y1 Gen Xa10 cũng cho thấy khả năng kháng chủng Y2 và kháng vừa (M) với chủng Y3.

Các nhóm gen kháng như IRBB7, IRBB5, IRBB4 và IRBB21 có sự khác biệt lớn, trong đó IRBB7 kháng lại các chủng nổi bật và IRBB5 kháng hầu hết các chủng đại diện Nghiên cứu cho thấy các dòng chứa gen Xa7 và xa5 có khả năng kháng hầu hết các chủng phân lập, tiếp theo là Xa21 và Xa4 Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sử dụng các gen này trong chương trình chọn giống lúa chống bệnh bạc lá tại miền Bắc Việt Nam Việc sử dụng gen trội Xa7 và Xa21 trong dòng bố hoặc mẹ sẽ giúp con lai F1 thừa hưởng tính kháng bệnh 100%, trong khi gen lặn xa5 sẽ được áp dụng trong việc tạo giống lúa thuần Để lựa chọn cá thể mang gen kháng một cách chính xác và nhanh chóng, cần sử dụng chỉ thị phân tử để xác định sự có mặt của gen kháng và kiểm tra hệ gen trong con lai.

Nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát 166 giống lúa mùa và 25 dòng cha mẹ của lúa ưu thế lai bằng cách sử dụng các cặp primers từ RG556, RG136 và pTA248 để tìm kiếm các gen kháng xa-5, xa-13 và Xa-21 Kết quả nghiên cứu đã xác định được 5 giống lúa mùa có khả năng kháng bệnh.

Ba dòng cha mẹ của lúa ưu thế lai mang gen kháng xa-13 đã cho thấy khả năng kháng bệnh bạc lá, tương tự như giống đối chứng IRBB13, khi so sánh với thí nghiệm kiểu hình Kết quả phân tích đa hình cho thấy gen kháng xa-13 có thể được chuyển giao từ giống lúa địa phương Nàng Sớm sang giống lúa chuẩn nhiễm IR24 Điều này mở ra cơ hội phát triển các quần thể lai ngược IR24/Nàng Sớm nhằm chuyển gen kháng xa-13 và lựa chọn các cá thể con lai thông qua marker thiết kế từ RG136.

1.6.3.3 Đặc điểm gen kháng Xa7 và gen kháng Xa21 và các chỉ thị phân tử liên kết gen kháng bạc lá:

Gen kháng Xa7 thể hiện tính kháng lâu bền với bệnh bạc lá (BB) bằng cách làm bất hoạt động lực mầm bệnh thông qua gen AvrXa7 Các marker từ cơ sở dữ liệu "gramene" cho thấy vị trí gen Xa7 trên bản đồ nhiễm sắc thể số 6 Để định vị gen Xa7, bản đồ quần thể F2 với 721 cá thể mẫn cảm cao đã được xây dựng Phân tích với 11 marker đa hình cho thấy Xa7 nằm ở khu vực khoảng 0,28 cM, gần với gen mục tiêu Các cá thể tái tổ hợp F2 được thử nghiệm bằng marker mới STM, và cuối cùng, gen Xa7 được xác định ở vị trí 0,21 cM giữa hai marker GDSSR02 và RM20593, với marker liên kết tham chiếu trên trình tự của giống Nipponbare qua phân tích tin sinh.

Hình 1.1 Bản đồ vật lý gen Xa7 dựa trên sự mô tả của Shen Chen và cộng sự (2007) [78]

Phân tích vùng 100kb gần gũi với gen kháng bạc lá Xa21 (3,57 kb) đã được thực hiện trên hai phân loài Oryza sativa L ssp Japonica cv Nipponbare và Oryza sativa.

L ssp Indica cv 93-11, để hiểu sự chuyển hóa và phân ly của locus Xa21 Tổng cộng có

Trong nghiên cứu, đã xác định 12 gen trong japonica và 14 gen trong indica ở vùng nghiên cứu Các ghi chú cho thấy sự hiện diện của 4 gen và 8 gen trong japonica và indica, có khả năng kết hợp với locus Xa21 kháng bệnh ở vùng 100kp Tổng cộng, 109 SSR đã được xác định trong vùng quan tâm trên cả hai phân loài japonica và indica.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen kháng Xa7 và Xa21 có khả năng kháng rộng đối với nhiều nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá, cụ thể là Xanthomonas oryzae pv oryzae Qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo với ba nòi vi khuẩn HAU 01043, HAU 02009-2 và HAU 02034-6, các nhà khoa học đã tiến hành đánh giá kiểu hình và so sánh với kiểu gen thông qua chỉ thị liên kết chặt chẽ với các gen kháng.

Xa21, Xa7:pTA248, RM5509 qua các nghiên cứu trên giống lúa ở Việt Nam [21, 50].

BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA

Triệu chứng bệnh đạo ôn

Bệnh đạo ôn có thể ảnh hưởng đến tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa Theo nghiên cứu của Peresipkin V.Ph (1974), triệu chứng bệnh được phân loại thành ba dạng chính: đạo ôn lá, đạo ôn đốt thân và đạo ôn cổ bông Ngoài ra, căn cứ vào tính chất và vị trí của bộ phận nhiễm, bệnh còn được chia thành bốn dạng: đạo ôn lá, đạo ôn cổ lá, đạo ôn đốt thân và đạo ôn cổ bông.

Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn

1.7.2.1 Nguồn gốc bệnh đạo ôn

Bệnh đạo ôn, lần đầu tiên được phát hiện ở Ý vào năm 1560, sau đó đã lan rộng sang các nước châu Á như Trung Quốc vào năm 1637, Nhật Bản năm 1760 và Ấn Độ năm 1913 Theo nghiên cứu của Jim Correll, nhà khoa học từ Đại học Arkansas, bệnh này có nguồn gốc từ châu Á, nơi xuất xứ của gạo, và đã phát tán ra toàn cầu thông qua việc trao đổi hạt giống.

Các tên gọi khác nhau của nấm gây đạo ôn qua các nghiên cứu:

Nấm gây bệnh đạo ôn có tên khoa học là Pyricularia oryzae Cav hay P grisea (Cook)

Nấm có giai đoạn hữu tính và được gọi tên là Magnaporthe grisea (T T Hebert; Yaegashi

Bệnh đạo ôn thường phát sinh mạnh trong điều kiện thời tiết ẩm ướt, với trời nhiều mây, mưa phùn, sương đêm, độ ẩm không khí trên 90% và nhiệt độ từ 18 – 20 độ C Bệnh này thường xảy ra trong giai đoạn đẻ nhánh và làm đồng, đặc biệt đối với các giống lúa nhạy cảm Một số biện pháp canh tác không phù hợp như sạ quá dày hoặc bón thừa đạm cũng góp phần làm bệnh phát triển, khiến cây lúa yếu ớt và dễ bị tấn công Ở miền Bắc, bệnh bùng phát mạnh trong giai đoạn trổ - chín của trà lúa mùa muộn và vụ lúa Đông Xuân, trong khi ở miền Nam, bệnh xảy ra quanh năm nhưng gây hại nặng nhất trong vụ Đông Xuân.

Nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 25 – 28 0 C và ẩm độ không khí là 93% trở lên (Abe, 1911; Konishi, 1933) Phạm vi nhiệt độ nấm sinh sản bào tử từ 10 – 30 0 C Ở

Nhiệt độ 28°C thúc đẩy quá trình sinh bào tử mạnh mẽ nhưng sức sinh sản giảm sau 9 ngày, trong khi ở 16°C, 20°C và 24°C, sự sinh sản bào tử kéo dài tới 15 ngày trước khi giảm Điều kiện ánh sáng âm u cũng kích thích quá trình sinh sản bào tử của nấm Bào tử nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ từ 24-28°C và cần có độ ẩm Nguồn nấm gây bệnh chủ yếu tồn tại trong rơm, gốc rạ, hạt lúa bị bệnh và các loại cỏ dại trên ruộng như cỏ chỉ, cỏ mần trầu, cỏ cú.

Đặc điểm di truyền về tính kháng bệnh đạo ôn lúa

Pattama Sirithunya và các cộng sự (2002) đã phát triển các dòng lai tái tổ hợp từ giống KhaoDawkMali105, dễ bị đạo ôn, và giống có gen kháng đạo ôn CT9.993-5-10-M (CT) để lập bản đồ kiểm soát gen kháng đạo ôn Bản đồ liên kết bao gồm 2112cM được xây dựng từ 141 dòng lai tái tổ hợp (RILs) với 90 marker RFLP và 31 marker SSR Nghiên cứu đã phân lập 15 chủng nấm đạo ôn để lây nhiễm trên lá và đánh giá đạo ôn cổ bông trong điều kiện tự nhiên Các QTL cho kháng phổ rộng (BRS) đối với đạo ôn lá được xác định trên nhiễm sắc thể 7 và 9, trong đó QTLch9 gần với locus Pi5(t) và QTLch7 gần với một QTL kháng đã được lập bản đồ trước đó Cả hai locus cho thấy sự tương tác alen có ý nghĩa, với các kiểu gen có alen CT ở cả QTLch7 và QTLch9 cho khả năng kháng cao nhất Hai QTL đạo ôn cổ bông nằm trên nhiễm sắc thể 5 và 6 Sự trùng hợp ngẫu nhiên của BRS và các QTL kháng đồng ruộng trên nhiễm sắc thể 7 cho thấy BRS có thể phản ánh phổ kháng rộng đối với đạo ôn lá lúa, từ đó đặt nền móng cho chương trình chọn giống dựa trên dấu chuẩn (MAS) nhằm cải thiện giống Dawk Mali Khoa 105 và nhiều giống gạo thơm khác dễ bị nhiễm đạo ôn.

Năm 2011, Hossein Sabouri và cộng sự đã sử dụng marker phân tử để xác định và lập bản đồ gen kháng đạo ôn, bao gồm cả gen kháng hoàn toàn và kháng một phần Một số gen kháng chất lượng đã được nghiên cứu và lập bản đồ trong hệ gen của lúa, trong đó có bốn gen Pi-14 (t), Pi-16 (t), Pi-d (t) và Pi-25 (t) được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 2 Các tác giả cũng chỉ ra rằng khả năng kháng đạo ôn ở lá được kiểm soát bởi hai gen, và sự hiện diện của các alen kháng tại bất kỳ locus nào đều tạo ra tính kháng.

Pi24(t) và Pi25(t) được xác định lần lượt trên nhiễm sắc thể 12 và 6 Mặt khác, Zhuang và

Cs (2002) đã lập bản đồ di truyền tính kháng trên bộ gen lúa, liên kết hầu hết các gen này với các gen chất lượng đã được báo cáo Fuluoka và Okuno (2001) phát hiện 5 QTLs cho FBR trên nhiễm sắc thể 2, 4, 9 và 12, liên kết QTL với marker RFLP, G271, ở giữa nhiễm sắc thể 4 Ballini và Cs (2009) đã đưa ra 1.000 gen kháng, trong đó 88 gen đã được lập bản đồ, cung cấp thông tin cập nhật về các gen kháng đạo ôn và giúp xây dựng giả thuyết về chức năng phân tử của QTL Mặc dù có sự đa dạng tốt trong phân tích QTL về FBR cho các giống lúa ở Iran, nhưng thông tin về xác định QTL và sự liên kết của chúng với tính kháng đạo ôn còn hạn chế Nghiên cứu này chọn lọc hai giống lúa địa phương Khazar và TaromMahalli, trong đó Khazar có đặc điểm thấp cây, đẻ nhánh tốt và kháng đạo ôn, còn TaromMahalli là giống cao cây hơn và nhạy cảm với đạo ôn Một bản đồ liên kết SSR với 1231.50cM đã được xây dựng sử dụng 74 marker đa hình SSR, phát hiện 7 QTLs độc lập trên các nhiễm sắc thể 1, 3, 4, 5 và 11, có thể hỗ trợ chương trình chọn giống dựa trên dấu chuẩn (MAS) để cải thiện tính kháng đạo ôn ở các giống lúa chất lượng.

Hiện nay, các nhà nghiên cứu đã xác định được 96 gen kháng đạo ôn, phân bố trên hầu hết các nhiễm sắc thể, ngoại trừ nhiễm sắc thể số 3 và số 10 Đặc biệt, nhiều gen kháng bệnh đạo ôn chủ yếu tập trung trên các nhiễm sắc thể số 6, 11 và 12.

Các nhà khoa học đã xác định có bảy gen kháng nằm trên nhiễm sắc thể số 1 là Pit,

Pi27(t), Pi24(t), Pitp(t), Pi35(t), Pi37 và Pish

Trên nhiễm sắc thể số 2 có chín gen kháng gồm Pidl(t), Pig(t), Pitq5, Piy1(t), Piy2(t), Pib, Pi25(t), Pi14(t) và Pi16(t)

Bốn gen kháng Pi21, Pikur1, Pi39(t) và Pi(t) nằm trên nhiễm sắc thể số 4

Ba gen kháng trên nhiễm sắc thể số 5 là Pi26(t), Pi23(t) và Pi10

Trên nhiễm sắc thể số 6 có 15 gen kháng gồm Pi22(t), Pi26(t), Pi27(t), Pi40(t), Piz-

5, Piz, Piz-t, Pi9, Pi25(t), Pid2, Pigm(t), Pitq1, Pi8, Pi13(t) và Pi13

Trên nhiễm sắc thể số 7 hiện mới chỉ xác định có một gen kháng là Pi17(t)

Nhiễm sắc thể số 8 chứa 5 gen kháng là Pi36, Pi33, Pizh, Pi29(t) và PiGD-1(t) Trong khi đó, nhiễm sắc thể số 9 cũng có 5 gen kháng, bao gồm Pii2(t), Pi5(t), Pi3(t), Pi15 và Pii.

Trong đó, gen Pi5(t) nằm trên nhiễm sắc thể số 9 liên kết chặt với các chỉ thị phân tử

Trong nghiên cứu về các giống lúa JJ80-T3, JJ81-T3 và JJ113-T3, đã xác định được 17 gen kháng trên nhiễm sắc thể số 11, bao gồm các gen Pia, PiCO39(t), Pilm2, Pi30(t), Pi7(t), Pi34, Pi38, PBR, Pb1, Pi44(t), Pi1, Pi18(t), Pise1, Pif, và Mpiz.

Pikur2, Piisi và 6 alen tại locus Pik bao gồm Pik, Pik-s, Pik-p, Pik-m, Pik-h và Pik-g Gen Pi1 được xác định trên nhiễm sắc thể số 11 và có sự liên kết chặt chẽ với các chỉ thị phân tử RM1233, RM5926 và RM224.

Trên nhiễm sắc thể số 12 có 17 gen kháng gồm Pita, Pita-, Pitq6, Pi6(t), Pi12(t), Pi19(t), Pi20(t), Pi21(t), Pi24(t), Pi31(t), Pi32(t), Pi39(t), Pi62(t), Pi157, IPi(t), IPi3(t) và PiGD-3(t) [55]

Bản đồ của các gen Pi1, Pita (Pi-4t) Pi5(t), Piz và Pik-m đã được thiết lập và công bố trên trang web: http://www.gramene.org.[93]

Bảng 1.4 Một số gen kháng đạo ôn quan trọng [85 , 84 , 88 , 73]

Gen Nhiễm sắc thể Giống lúa cho gen(Donor) Dạng lúa Nguồn tham khảo

Pi37 Số 1 St No 1 Japonica Lin và cs, 2007

Pib Số 2 Tohoku IL9 Japonica Wang và cs, 1999;

Goto và cs, 1981, Hashimoto và cs, 1988, Hayashi và cs, 2006

Piz-t Số 6 Toride 1 Japonica Zhou và cs, 2006

Piz-5(Pi2) Số 6 Tadukan Indica Zhou và cs, 2006

Pi9 Số 6 75-1-127(101141) Oryza minuta Qu và cs, 2006

Pi40(t)) Số 6 IR65482-4-236-2-2(Acc100882) Oryza australiensis Jeung và cs, 2007

Pid2 Số 6 Digu Indica Chen và cs, 2006

Pi33 Số 6 IR64 Indica Berruyer và cs, 2003

Pi36 Số 8 Q61 Indica Liu và cs, 2003

Pi5(t) Số 9 RIL260(Moroberekan) Japonica Jeon và cs, 2003

PiCO39(T) Số 11 CO39 Indica Chauhan và cs, 2002

Pi44(t) Số 11 RIL29(Moroberekan) - Chen và cs, 1999

Pik-h(Pi54) Số 11 Tetep Indica Sharma và cs, 2005

Cở sở di truyền tính kháng đạo ôn đã được nghiên cứu rộng rãi từ rất lâu Năm

Năm 1967, IRRI đã thiết lập hệ thống phân biệt các chủng sinh lý race/pathotype của nấm dựa trên 8 giống chỉ thị: Raminad, Zenith, Np-125, Usen, Dular, Kanto 51, Sha-tiao-tsao và Caloro Mặc dù hệ thống này hữu ích, nhưng bộ giống chỉ thị này lại chứa ít gen kháng.

Đánh giá mức độ đa dạng của quần thể nấm hiện nay gặp khó khăn do sự phát triển của các bộ giống chỉ thị riêng, sử dụng các dòng đẳng gen (NILs) chứa một hoặc một vài gen kháng Nhờ kỹ thuật sinh học phân tử như RFLP, AFLP, CAP, RGA, và SSR, các nhà khoa học đã xác định khoảng 40 gen kháng chính Những gen này được tích hợp vào các dòng/giống lúa khác nhau để phát triển giống lúa kháng Tuy nhiên, tính kháng của các gen đơn thường chỉ hiệu quả trong một số chủng địa lý nhất định và có thể bị mất hiệu lực sau 1-5 năm do sự xuất hiện của các chủng mới Năm 2005, Padmavathi và cộng sự đã tiến hành lai giữa các giống lúa như Zenith, Dular, Tetep, và Tadukan để tạo ra giống lúa Co39 mang gen kháng hiệu quả với các chủng nấm đạo ôn.

Tình hình nghiên cứu sử dụng gen kháng đạo ôn trong chọn tạo giống lúa ở Việt Nam

giống lúa ở Việt Nam

Phạm Văn Dư và cộng sự đã thu thập 158 mẫu nấm gây bệnh đạo ôn thuộc 3 nhóm chính (L1, L2 và L4) tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), trên 31 giống lúa đơn gen với 24 gen kháng bệnh đạo ôn, bao gồm các gen như Pia, Pii, Pik-s, Pik, Pik-p, Pik-h và Piz.

Các loại Piz như Piz5, Piz-t, Pita, Pib, Pit, Pish, cùng với các biến thể Pi1, Pi3, Pi5(t), Pi7(t), Pi9(t), Pi12(t), Pi19(t), Pik-m, Pi20(t), Pita-2 và Pi11(t) cho thấy tỷ lệ isolates thuộc nhóm này.

Nhóm L1 tấn công các gen kháng với tỷ lệ biến động từ 0% đến 98%, nhưng không tác động đến một số gen kháng như Pik-s, Pik-p, Pik-h, Piz, Pita, Pi5(t), và Pi19(t), với tỷ lệ tương ứng là 73%, 100%, 95%, 98%, 100%, 93%, và 93% Trong khi đó, nhóm L2 không tấn công được các gen kháng Pik, Pik-p, Pik-h, Pi1, Pi7(t), và Pik-m, với tỷ lệ không tấn công là 100%, 97%, 94%, 94%, 97%.

97% các mẫu vi khuẩn thuộc nhóm L4 có khả năng tấn công tất cả các gen kháng, với tỷ lệ biến động từ 46% đến 100% Đánh giá cho thấy, trong số 24 gen kháng được thử nghiệm, không có gen nào còn hiệu lực hoàn toàn tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long Tuy nhiên, hai gen Piz vẫn giữ được một phần hiệu lực.

Pik-m có tỷ lệ isolates nấm gây bệnh đạo ôn tấn công thấp nhất là 25%, cho thấy tiềm năng của hai gen này trong chương trình lai tạo giống kháng bệnh đạo ôn Để chọn lọc cá thể mang gen kháng một cách chính xác và nhanh chóng, cần sử dụng chỉ thị phân tử để xác định sự có mặt của gen kháng và kiểm tra hệ gen trong con lai.

Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự (2009) đã thực hiện thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo để xác định các gen kháng, sử dụng bộ giống chỉ thị từ IRRI và các dòng lúa thuần của Việt Nam Kết quả cho thấy hai gen Pi-1 và Pi-5 có khả năng kháng tốt nhất với các nòi nấm ở miền Bắc, với tỷ lệ kháng lần lượt là 82% và 78% Các gen kháng này sẽ được tích hợp vào giống lúa nhằm cải thiện tính kháng.

CÁC YẾU TỐ CẤU THÀNH CHẤT LƯỢNG GẠO TRÊN CÂY LÚA

Gia tăng phẩm chất lúa gạo

Gia tăng phẩm chất lúa gạo bao gồm hai khía cạnh chính: phẩm chất thương mại và phẩm chất dinh dưỡng, cần được thực hiện trong khuôn khổ chiến lược kinh doanh và an ninh lương thực quốc gia Trước năm 1990, 80% giống lúa Việt Nam có hàm lượng amylose cao (>25%), nhưng tỷ lệ này đã giảm dần, với các giống lúa chủ lực có hạt dài và hàm lượng amylose thấp đến trung bình, đủ sức cạnh tranh với gạo trắng Thái Lan Tuy nhiên, chúng ta vẫn thua kém so với gạo thơm Thái Lan do họ sử dụng giống truyền thống Việc cải tiến hàm lượng amylose (AC) là một thách thức lớn, liên quan đến gen waxy trên nhiễm sắc thể số 6.

Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học và tin học đã giúp chúng ta tiếp cận các yếu tố quyết định chất lượng lúa gạo ở mức phân tử, đặc biệt là hàm lượng amylose Hiểu rõ cấu trúc chức năng của các yếu tố này sẽ hỗ trợ các nhà khoa học và nhà chọn giống trong việc nghiên cứu và phát triển các giống lúa mới với năng suất và chất lượng tối ưu cùng hàm lượng amylose hợp lý.

Phân tích đặc tính hóa học cấu thành nên amylose

Amylose là một polysaccharide mạch thẳng được hình thành từ các phân tử α-D-glucose thông qua các liên kết α-1,4-glucoside, trong đó mỗi liên kết glucoside sẽ loại bỏ một phân tử H2O Amylose có thể được cấu tạo từ 250 đến 5000 phân tử α-D-glucose Các chuỗi glucose xoắn lại với nhau theo hình dạng xoắn lò xo, nhờ vào sự hình thành các liên kết hydro giữa các phân tử glucose Mỗi vòng xoắn của amylose tạo ra một cấu trúc đặc biệt, góp phần vào tính chất của polysaccharide này.

Amylose là một polysaccharide được cấu tạo từ 6 đơn vị glucose, liên kết với nhau thông qua các liên kết hydro giữa các vòng xoắn Khoảng không gian giữa các vòng xoắn đủ lớn để cho phép một số phân tử khác, như iodine, liên kết vào Sự kết hợp của iodine với amylose làm thay đổi vị trí của các phân tử glucose, tạo ra phức màu xanh thẫm đặc trưng Độ ái lực của amylose với iodine tỉ lệ thuận với chiều dài của mạch polymer.

Amylose có dạng xoắn chỉ hình thành trong dung dịch ở nhiệt độ thường Khi nhiệt độ tăng cao, chuỗi xoắn của amylose sẽ duỗi thẳng ra, dẫn đến việc không còn khả năng liên kết với các phân tử khác.

Vùng gen qui đinh amylose

Tinh bột, một chất trùng hợp của glucose, là thành phần chính trong gạo, chiếm khoảng 90% trọng lượng khô Nó tồn tại dưới dạng các hạt đa diện phức tạp với kích thước từ 3 đến 9μm Tinh bột bao gồm hai thành phần chính: mạch nhánh (amylopectin) chiếm ưu thế và mạch thẳng (amylose) Dựa vào hàm lượng amylose, gạo được phân loại thành các nhóm khác nhau.

Bảng 1.5 Hệ thống đánh giá hàm lượng amylose theo tiêu chuẩn viện lúa IRRI

Hàm lượng amylose trong gạo thường dao động từ 15% đến 35% Gạo có hàm lượng amylose cao sẽ làm cơm nở nhiều và dễ bị tách, nhưng lại khô và cứng khi nguội Ngược lại, gạo với hàm lượng amylose thấp nấu sẽ ít nở, tạo ra cơm mềm và dẻo Hầu hết các quốc gia trồng lúa ưa chuộng loại gạo có hàm lượng amylose trung bình, ngoại trừ các giống japonica thường có hàm lượng amylose thấp.

Thời gian tồn trữ ảnh hưởng tích cực đến năng suất gạo nguyên và gạo nói chung, giúp tăng khả năng hấp thụ nước và độ nở, đồng thời giảm thiểu sự mất mát tính rắn chắc khi nấu Kết quả là cơm có độ bở và độ cứng cao hơn.

1.8.3 Vùng gen qui định amylose

1.8.3.1 Nghiên cứu về gen qui định amylose:

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số enzyme quan trọng tham gia vào quá trình tổng hợp tinh bột bao gồm ADP glucophosphate synthetase (AGPase), enzyme này hoạt hóa glucose 1 phosphate thành ADP glucose (Pressis et al 1991) Granule-bound starch synthase (GBSS) gắn các ADP-glucose vào đoạn mồi bắt đầu từ đầu không khử thông qua liên kết 1-4 glycosid Enzyme SBE cắt chuỗi liên kết 1-4 glucan và tạo ra liên kết α-(1-6) glucan, từ đó hình thành các phân tử amylopectin.

Granule-bound starch synthase (GBSS) is encoded by the Wx gene located on chromosome 6 (Okagaki & Wessler, 1988) Soluble starch synthase (SSS) also influences branching, but starch branching enzyme (SBE) plays a crucial role in the synthesis of amylopectin The gene sequence is essential for understanding these processes.

The Wx gene, similar to O Sativa (Japonica Heng-feng), spans 5499 base pairs and consists of 14 exons and 13 introns (Wang et al., 1990) Based on the GBSS content in non-Waxy species, two Waxy alleles, Wx a and Wx b, have been identified in the Indica and Japonica subspecies, respectively, while the glutinous rice variety possesses the recessive allele wx (Sano).

Nghiên cứu cho thấy trên locus Wx có ít nhất ba alen với chức năng khác nhau, bao gồm Wx a, Wx b và wx, tương ứng với các loài lúa Indica, Japonica và lúa nếp.

Nghiên cứu của Sano và M Kasumata (1986) cho thấy khi so sánh hai alen Wx a và Wx b, Wx a có khả năng tăng cường hoạt động của GBSS, dẫn đến hàm lượng amylose trong nội nhũ hạt cao hơn so với Wx b Phân tích trình tự cho thấy sự thay thế nu G bằng T tại vị trí cắt nối intron 1 giữa Wx a và Wx b, với trình tự cắt nối của Wx a là AGGTATA và của Wx b là AGTTATA Sự thay đổi này làm giảm hàm lượng mRNA thành thục, từ đó giảm sản xuất GBSS và giảm hàm lượng amylose.

Hiro-Yuki Hirano và cộng sự (1998) đã sử dụng tế bào trần để nghiên cứu chức năng của gen waxy thông qua sự biểu hiện của gen gus, kết hợp với phân tích Northern blot Kết quả cho thấy rằng loài mang gen Wx a có quá trình sao mã cao và gen GUS hoạt động mạnh, trong khi loài mang gene khác lại không có sự biểu hiện tương tự.

Mức hoàn thành quá trình sao mã giảm và hoạt động yếu của gen GUS đã được ghi nhận ở Wx b Dựa trên những kết quả này, tác giả đã phân loại các loài lúa theo mức độ tiến hóa, như thể hiện trong hình 1.3, trong đó hai loài O.barthii được đề cập.

O.Rufipogon đều có kiểu gene Wx a , hàm lượng amylose cao, được hình thành từ tổ tiên hoang dại của chúng cũng mang gen Wx a và cho hàm lượng amylase cao Loài phụ O.glaberrima mang gen Wx a được tiến hóa từ O.barthii Hai loài phụ O.sativa indica và O.sativa japonica

Nhóm gen quy định amylose có tổ tiên là O Rufipogon, trong đó giống indica mang gen Wx a với hàm lượng amylose cao, trong khi loài japonica có kiểu gen chứa đột biến Wx b, dẫn đến hàm lượng amylase trung bình.

Hirano và cộng sự đã xác định trình tự lặp TC (TC repeats) bằng cách sử dụng SSR và nhân lên trình tự microsatellite DNA, trong đó có chứa vùng nu đột biến ở đầu 5’ của intron 1.

Hình 1.4 Trình tự SSR vùng nu đột biến, thao khảo từ Hirano và cộng sự

Gen Waxy có mối liên hệ chặt chẽ với hàm lượng amylose trong hạt lúa, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định chất lượng giống lúa Đặc biệt, gen Wx quy định hàm lượng amylose trung bình, đã được ứng dụng hiệu quả trong các nghiên cứu về giống lúa tại Việt Nam.

Giống lúa OM576, hay còn gọi là giống Hàm Châu, được lai tạo từ tổ hợp giữa giống IR48 và giống Hungary, được nông dân ưa chuộng nhờ thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh và thích nghi tốt Tuy nhiên, giống này có nhược điểm là hàm lượng amylose cao từ 25-26%, làm cơm cứng Nghiên cứu cho thấy hàm lượng amylose được kiểm soát bởi locus Wx trên nhiễm sắc thể số 6, do đó, hàm lượng amylose của OM576 có thể được cải thiện bằng cách du nhập gene có hàm lượng amylose thấp từ giống lúa VD20 qua phương pháp lai hồi giao Hai chỉ thị RM190 và RM510 được sử dụng để chọn lọc những con lai mang alen của VD20 và OM576, với độ chính xác giữa kiểu gen và kiểu hình của chỉ thị RM190 đạt 81,63% cho gen Aa và 64,58% cho gen AA; trong khi đó, chỉ thị RM510 có độ chính xác là 76,07%.

59,18% Kết quả này tạo tiền đề cho công tác chọn tạo giống lúa có hàm lượng amylose thấp và trung bình bằng chỉ thị phân tử [20]

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR-SSR & STS