Đặc tính của cây mía
Cây mía, có tên khoa học là Saccharum officinarum L., thuộc ngành thực vật hạt kín, lớp một lá mầm, bộ lúa và họ hòa thảo Được thuần hóa từ 8000 năm trước công nguyên ở đảo Tân Ghi Nê, cây mía đã lan rộng đến Trung Quốc, Ấn Độ và các đảo Thái Bình Dương Người Ấn đã biết sử dụng mía để chế biến đường từ 3000 năm trước công nguyên Trong thế kỷ 16, đường mía trở thành mặt hàng quan trọng trong thương mại giữa Nam Mỹ và châu Âu Hiện nay, cây mía được trồng rộng rãi ở 70 quốc gia, chủ yếu từ vĩ độ 30 độ Nam đến 30 độ Bắc.
Cách đây khoảng 4000 – 3000 năm, cây mía đã được phổ biến ở nhiều vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, trong đó có Việt Nam Với điều kiện tự nhiên lý tưởng như ánh nắng, nhiệt độ, độ ẩm và lượng mưa phong phú, cây mía phát triển mạnh mẽ tại đây Việt Nam, nằm trong khoảng 8 đến 23 độ vĩ Bắc, là nơi lý tưởng cho việc trồng mía Kể từ năm 1975, nhiều vùng trồng mía đường đã được hình thành để sản xuất đường, bao gồm các tỉnh miền Bắc như Sơn Tây, Vĩnh Yên, Bắc Giang, Hà Nội, Nam Định, Thái Bình, miền Trung với Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, và miền Nam với Tây Ninh, Thủ Dầu Một, Biên Hòa, Tân An, Bến Tre (theo Hiệp Hội Mía Đường Việt Nam).
Đặc điểm thực vật học
Rễ mía được chia thành hai loại: rễ hom và rễ cây Rễ hom nhỏ, phân nhánh nhiều và chỉ hoạt động trong thời gian ngắn từ 1-3 tháng sau khi trồng, thường được gọi là rễ tạm hay rễ sơ sinh Trong khi đó, rễ cây lớn hơn, phân nhánh ít và có khả năng sống lâu hơn, thực hiện hai nhiệm vụ chính là hút nước và chất dinh dưỡng Rễ cây bao gồm ba loại: rễ mặt, rễ giữ và rễ thừng, đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây mía.
Thân mía có vai trò quan trọng trong việc mang lá và vận chuyển chất dinh dưỡng cùng nước, với đường được tích trữ trong các tế bào vách mỏng Đây là sản phẩm cuối cùng mà người trồng mía thu hoạch.
Thân mía có cấu trúc gồm nhiều đốt và lóng, với phần gốc có đốt và lóng ngắn, dần dài ra ở giữa và ngắn lại ở ngọn Cây mía thường có từ 20 – 30 lóng, mỗi lóng dài từ 10 – 20 cm, chiều cao trung bình đạt 2 – 3 m, đường kính từ 2 – 4 cm và trọng lượng từ 500 g – 2 kg Hình dạng và màu sắc lóng khác nhau tùy thuộc vào giống, với các dạng như hình trụ, ống chỉ, trống, chóp cụt và màu sắc có thể là vàng, đỏ, xanh, tím Lóng bao gồm vòng sinh trưởng, vòng rễ, nốt rễ, sẹo lá và mầm.
Mầm (hoặc mắt) nằm trong vòng rễ, gần hoặc xa sẹo lá, có hình dạng đa dạng như hình trứng, bầu dục, tròn, tam giác, ngũ giác hay chữ nhật Hình dạng của mầm là một đặc trưng quan trọng để phân biệt các giống cây Để nhận dạng giống, cần chọn mầm sinh trưởng.
10 tháng tuổi mới biểu hiện rõ đặc tính giống (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi,
Thân mía thường mọc thành từng bụi, mỗi bụi có từ 5 đến 20 cây với kích thước, tuổi tác và đường kính khác nhau Hàm lượng đường trong các cây mía cũng có sự khác biệt, trong đó hàm lượng đường ở gốc cây thường cao hơn so với phần ngọn.
Lá mía có cấu trúc đặc trưng với mỗi đốt mang một lá, bao gồm phiến lá, bẹ lá, thân lá và gối lá (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi, 1997).
Phiến lá là bộ phận quan trọng nhất trong việc tiếp xúc với môi trường, chịu trách nhiệm cho quá trình quang hợp và tổng hợp vật chất hữu cơ Sự khác biệt về màu sắc, kích thước và tư thế của phiến lá tùy thuộc vào từng giống cây, giúp phân biệt các giống cây khác nhau.
Bẹ lá ôm chặt thân mía, có màu sắc đa dạng như xanh và tím, với độ dày của lớp sáp bên ngoài thay đổi tùy theo giống Sự khác biệt trong việc bẹ lá khô tự rụng cũng phụ thuộc vào từng giống mía.
Gối lá là phần kết nối giữa bẹ lá và phiến lá, bao gồm hai mảnh ghép lại với nhau Hình dạng và màu sắc của gối lá có sự khác biệt tùy thuộc vào từng giống cây.
Hoa mía, hay còn gọi là cờ mía, có cấu trúc gồm một trục thẳng đứng với nhiều nhánh phân bố dày đặc Kích thước, hình dạng và màu sắc của hoa mía thay đổi tùy theo từng giống khác nhau (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi, 1997).
Hạt mía có kích thước nhỏ, thuộc loại quả thóc, với chiều dài từ 1 đến 1,5 mm và chiều rộng 0,5 mm, trọng lượng từ 0,15 đến 0,25 mg Tỷ lệ kết hạt và nảy mầm của hạt mía thấp, và sức sống ngắn, vì vậy cần gieo ngay sau khi thu hoạch Đặc tính trổ cờ là yếu tố quan trọng trong công tác lai tạo giống và sản xuất mía nguyên liệu.
2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN
Endomycetaceae Saccharomycetaceae Cryptoccaceae Rhodotorulaceae Họ
Endomyces Saccharomyces Crytococus Rhodotorula Giống Schizosaccharomyces Zygosaccharomyces Kloeskera
Sơ lược nấm men
Nấm men, hay còn gọi là yeast, là một nhóm vi nấm đơn bào, thường sinh sản bằng phương pháp nẩy chồi Chúng không thuộc về một phân loại taxon cụ thể nào, mà có thể nằm trong ngành nấm túi hoặc ngành nấm đảm, theo nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2010).
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt là ở những môi trường có chứa đường và pH thấp Chúng thường xuất hiện trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, mật ong, cũng như trong đất ruộng mía và đất vườn cây ăn quả Ngoài ra, nấm men còn tồn tại trong các loại đất bị nhiễm dầu mỏ (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2010).
Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men
Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thực Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn
Tùy thuộc vào từng loài nấm men, tế bào có thể có nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình chanh, hình elip, và nhiều hình dạng khác như hình mũ phớt, hình mụn cơm, và hình sao thổ Một số loài nấm men có khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả, trong đó khuẩn ti giả chưa hình thành sợi rõ rệt mà chỉ là chuỗi dài của nhiều tế bào nối với nhau Ngoài ra, một số loài nấm men còn có khả năng tạo thành váng khi được nuôi cấy trong môi trường dịch thể (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2010).
Thành tế bào nấm men dày khoảng 25 nm, chiếm 25% khối lượng khô của tế bào Đa số nấm men có thành tế bào được cấu tạo chủ yếu từ glucan và mannan, trong khi một số loại khác chứa kitin và mannan Thành tế bào nấm men đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và chức năng của tế bào.
Trong tế bào, protein chiếm 10% khối lượng khô, bao gồm một phần enzym Ngoài ra, trên thành tế bào còn có một lượng nhỏ lipit (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2010) Dưới lớp thành tế bào, màng tế bào chất có cấu trúc gồm 3 tầng khác nhau, chủ yếu là protein (50% khối lượng khô), tiếp theo là lipit (40%) và một ít polysaccarit (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2010).
Nhân tế bào nấm men được bao bọc bởi một màng nhân có cấu trúc hai lớp, tương tự như ở các sinh vật có nhân thực khác Màng nhân này có nhiều lỗ thủng, cho phép trao đổi chất giữa nhân và môi trường xung quanh (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2010).
Ti thể của nấm men có cấu trúc tương tự như nấm sợi và các sinh vật có nhân khác ADN của ti thể nấm men là một phân tử dạng vòng với khối lượng phân tử lên đến 50 × 10^6 Da, gấp 5 lần so với ADN ti thể của động vật bậc cao Đặc biệt, ADN của ti thể nấm men chiếm 15% tổng số ADN trong tế bào.
Khoảng 23% tổng lượng ADN trong tế bào nấm men (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2010) Khi tế bào nấm men già đi, chúng sẽ hình thành các không bào, bên trong chứa nhiều thành phần quan trọng như enzym thủy phân, polyphosphate, lipid, ion kim loại và các sản phẩm trao đổi chất.
Không bào không chỉ đóng vai trò là kho dự trữ mà còn có chức năng điều hòa áp suất thẩm thấu của tế bào, góp phần quan trọng trong việc duy trì sự ổn định nội môi.
Trong một số tế bào nấm men, ti thể có hình dạng cầu hoặc hình trứng, với đường kính khoảng 3 âm và được bao bọc bởi một lớp màng dày khoảng 7 nm Ti thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa methanol (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2010).
Sinh sản và các chu kỳ sống của nấm men
Sinh sản vô tính
- Nảy chồi: ở tất cả các chi nấm men
Bào tử đốt: ở chi Geochitrum
Bào tử bắn: ở chi Sporobolomyces
Bào tử áo: ởCandida albicans
Nảy chồi là phương pháp sinh sản vô tính đặc trưng của nấm men, trong đó thành tế bào mở ra để tạo ra chồi Chồi này phát triển thành tế bào con, có thể tách ra khỏi tế bào mẹ khi còn nhỏ hoặc giữ lại liên kết cho đến khi lớn bằng tế bào mẹ Chồi có thể mọc ra theo nhiều hướng khác nhau, hoặc chỉ nảy chồi ở hai cực hoặc một cực nhất định Khi tế bào chồi tách rời, nó để lại một vết sẹo trên tế bào mẹ và tế bào con cũng mang vết sẹo tương tự.
Nấm men có khả năng sinh sản bằng cách phân cắt tương tự như vi khuẩn, trong đó tế bào kéo dài và hình thành vách ngăn ở giữa, chia tế bào thành hai phần bằng nhau Mỗi tế bào con sẽ mang một nhân, minh chứng cho phương thức sinh sản này là các nấm men thuộc chi.
Bào tử bắn thường gặp ở chi nấm men Sporobolomyces, Sporidiobolus, Bullera,
Aessosporon là loại bào tử có hình dạng như quả thận, được hình thành trên một cuống nhỏ từ các tế bào dinh dưỡng hình trứng Khi bào tử trưởng thành, nó sẽ được phóng ra theo một cơ chế đặc biệt về phía đối diện.
Bào tử màng dày hay bào tử áo thường mọc ở đỉnh của các khuẩn ti giả
(Pseudomycelium)ở một số nấm men (Candida albicans) (Nguyễn Lân Dũng và cs.,
Sinh sản hữu tính
Bào tử túi là sản phẩm sinh ra từ các túi, có thể hình thành qua sự tiếp hợp giữa hai tế bào nấm men tách rời hoặc giữa tế bào mẹ và chồi Ngoài ra, còn có sự biến nạp trực tiếp trong một tế bào sinh trưởng mà không cần tiếp hợp Mỗi túi thường chứa 4 đến 8 bào tử túi, nhưng cũng có trường hợp chỉ có 1-2 bào tử Bề mặt bào tử túi có thể nhẵn, xù xì hoặc có gai Bảo tử màng dày, hay bao tử áo, giúp nấm men vượt qua điều kiện khắc nghiệt mà không phải là hình thức sinh sản Một số nấm men cũng có khả năng sinh vỏ nhầy Bào tử túi xuất hiện ở các chi như Saccharomyces, Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ Endomycetales.
Chu kỳ sống của nấm men
Được chia làm 3 loại hình:
Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) có khả năng kết hợp để hình thành tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n) Quá trình giảm phân sau đó sẽ tạo ra các bào tử túi Khi không tiến hành sinh sản hữu tính, các tế bào này vẫn tiếp tục nảy chồi Chu kỳ sống này thường được quan sát ở nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae.
Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) sinh sản bằng cách phân cắt Hai tế bào gần nhau sẽ tiếp hợp và trải qua ba lần phân cắt, trong đó lần đầu giảm nhiễm tạo ra 8 bào tử túi Những tế bào này sẽ hình thành túi và khi túi vỡ, các bào tử thoát ra ngoài Dưới điều kiện thích hợp, các bào tử này sẽ phát triển trở lại thành các tế bào dinh dưỡng.
Thể dinh dưỡng chỉ tồn tại dưới dạng lưỡng bội (2n) và sinh sản qua phương thức nẩy chồi Bào tử túi đơn bội kết hợp với nhau ngay cả khi còn trong túi, trong khi giai đoạn đơn bội tồn tại dưới dạng bào tử túi trong túi và không thể sống độc lập.
Nấm men nội sinh
Nấm men nội sinh là một nhóm vi sinh vật quan trọng trong thực vật, sống tách biệt với vi khuẩn và nấm sợi Chúng sản xuất hormone thực vật và các yếu tố khác, góp phần thúc đẩy sự tăng trưởng của cây ký chủ Nghiên cứu về nấm men nội sinh đang mở ra một lĩnh vực mới, cung cấp kiến thức quý giá về vi sinh vật thực vật và có ứng dụng thiết thực trong nông nghiệp và công nghiệp Tuy nhiên, việc phân lập nấm men nội sinh từ thực vật vẫn còn gặp nhiều hạn chế.
Phân loại nấm men
Để phân loại nấm men dựa vào một số đặc điểm sau đây (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2010)
Đặc điểm hình thái: tế bào, khuẩn lạc, kiểu nảy chồi, các dạng bào tử vô tính và hữu tính, khuẩn ty và khuẩn ty giả
Đặc điểm sinh lý và sinh hóa:
− Lên men 13 loại đường: D – glucose, D – xylose, D – galactose, D – lactose,
D – maltose, D – saccharose (sucrose), D – celiobiose, D – trehalose, D – melezitose,
− Tính chống chịu với 0,01% hoặc 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm trong bộ kit ID 32C)
− Đồng hóa 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamin hydrochlorid, Llyzin, cadaverin dihydrochlorid, creatin
− Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenat, biotin, thiamin hydrochlorid, pyridoxin hydrochlorid, niacin, folicacid, p-aminobenzoic acid)
− Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25 0 C, 30 0 C, 35 0 C, 37 0 C, 42 0 C
− Sản sinh acid từ glucose
− Năng lực sản sinh sắc tố
− Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% va 60% glucose
− Phản ứng với Diazonium Blue B
− Phát triển trên môi trường chứa axit acetic 1%
Để xác định loài mới, cần tiến hành phân tích thành phần acid béo và đường trong tế bào, hệ coenzym Q, tỷ lệ G+C, đặc tính huyết thanh miễn dịch, cũng như thực hiện giải trình tự ADN và lai ADN.
Nấm men Rhodotorula
Giới thiệu
Rhodotorula, giống như các loại nấm men khác, là một loại cơ thể đơn bào và phân bố rộng rãi trên toàn cầu, bao gồm cả Việt Nam Nhiều nghiên cứu đã tiến hành phân lập Rhodotorula từ các môi trường khác nhau trong nước.
– Trên vỏ lá cây: táo, dưa hấu, dâu tây, dâm bụt…
Vào năm 1921, A Harden đã lần đầu tiên phân lập loài Rhodotorula mucilaginosa Đến nay, đã có 34 loài Rhodotorula được phân lập, trong đó ba loài chính được ứng dụng phổ biến trong sản xuất lương thực, thực phẩm và chăn nuôi thú y là Rhodotorula glutinus, Rhodotorula minuta và Rhodotorula mucilaginosa.
Rhodotorula thuộc nhóm nấm men không sinh bào tử, không thuộc họ
The Sporobolomycetaceae family includes 12 genera of yeasts, such as Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Kloeckera, Oosporidium, Pityrosporum, Rhodotorula, Schizoblactosporion, Sterigmatomyces, Torulopsis, Trichosporon, and Trigonopsis Notably, Rhodotorula is a group of moisture-loving microorganisms that thrive at temperatures ranging from 20 degrees Celsius.
Hình thái và kích thước
Rhodotorula có nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm hình trứng, hình dài, elip, hình cầu, tròn và hình gậy, tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và loài.
Rhodotorula là một loại nấm men có đặc điểm khuẩn lạc trơn, nhẵn bóng, đôi khi gồ ghề và xếp nếp, với màu sắc đa dạng từ kem đến vàng hoặc đỏ Loại nấm này không tạo bào tử và không có khuẩn ty.
Tế bào nấm men Rhodotorula có hình dạng đơn bào, với kích thước dao động từ 2 – 5 μm chiều rộng và 2,5 – 10 μm chiều dài (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2010) Khuẩn lạc Rhodotorula phát triển nhanh, có bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục, đôi khi ghồ ghề, mịn và nhớt, với mép khuẩn lạc không có răng cưa Màu sắc khuẩn lạc có thể từ kem, hồng đến đỏ san hô, cũng có thể xuất hiện màu vàng và đỏ cam, và kích thước khuẩn lạc phụ thuộc vào môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ nuôi cấy Dưới kính hiển vi, không quan sát thấy sự hình thành sợi nấm, mặc dù một số loài có sinh sợi nấm giả nhưng phát triển rất kém và không hình thành bào tử túi (Nguyễn Lân Dũng và cs.).
Hình 2.1Khuẩn lạc nấm men Rhodotorula
Hình 2.2 Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis
2.6.3 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula
Nghiên cứu về cấu tạo của nấm men Rhodotorula vẫn chưa được mô tả chi tiết Tuy nhiên, cấu trúc chung của Rhodotorula tương tự như các loài nấm men khác, bao gồm những phần cơ bản sau:
Tế bào Rhodotorula, tương tự như các loài nấm men khác, được cấu tạo chủ yếu từ các thành phần cơ bản bao gồm thành tế bào, màng nguyên sinh, nguyên sinh chất, nhân và các cơ quan con khác.
Thành tế bào được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau, trong đó các thành phần chính bao gồm glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ như kitin.
Maana: là hợp chất cao phân tử của D- manose, mỗi phân tử thường chứa 200-
Manose là một thành phần quan trọng trong cấu trúc polysaccharide, thường liên kết với protein theo tỷ lệ 2:1, với các liên kết chủ yếu là -1,6; -1,3 và -1,3 Phân tử lượng của manan khoảng 5.10^4 Glucan, một polysaccharide phân nhánh, được cấu tạo từ D-glucose và có các liên kết -1,3 và -1,6, phân bố đều trên bề mặt tế bào.
Protid thường kết hợp với các thành phần khác như manan và chứa nhiều acid amin Các polysaccharide thường nằm gần bào tương trong cấu trúc của chúng.
Kitin, chiếm khoảng 3% ở phần nảy chồi, là một chất bền vững không bị enzyme phá hủy, giúp bảo vệ chồi non hiệu quả.
Ngoài ra còn thấy trong thành tế bào có lipit ở dạng photpholipit, khoảng 1%- 10%
Màng sinh chất:Màng nguyên sinh gồm các hợp chất phức tạp như protein, photpholipit, enzym permerase
Trong thời kỳ còn non và khi tế bào già màng nguyên sinh bám sát thành tế bào làm giảm khả năng trao đổi chất của nấm men
Nguyên sinh chất trong tế bào non có tính đồng nhất cao, nhưng khi tế bào già đi, tính đồng nhất này giảm dần do sự xuất hiện của nhiều không bào và hạt voluten, dẫn đến nguyên sinh chất trở nên lổn nhổn.
Thành phần bao gồm: nước, protit, lipit, gluxit, muối khoáng và enzyme
Tế bào chất luôn luôn chuyển động, thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào
Nhân: Ở Rhodotorula đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình cầu Nó được bao bọc bởi lớp màng bên trong lớp dịch nhân
Các thành phần khác: Không bào là nơi chứa đựng protease
Volutin không phải là một thành phần cấu trúc tế bào, mà xuất hiện trong những điều kiện đặc biệt, chẳng hạn như khi nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường giàu carbohydrate và phosphate vô cơ.
Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C:N và sự có mặt của S cũng như của vitamin Volutin đóng vai trò quan trọng sau:
Là chất dự trữ dinh dưỡng cho tế bào
Tham gia điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào
Làm nguồn năng lượng cho tế bào
2.6.3.2 Sinh sản Đa số loài của nấm men Rhodotorula sinh sản bằng cách nẩy chồi như: Rh pilimanae, Rh pilatii, Rh javaniti, Rh ingniosa, Rh diffluens và Rh bogoriensis và phân đôi, nhưng giống Rhodotorula không có hình thức sinh sản hữu tính
Sinh sản của nấm men bằng hình thức nảy chồi bắt đầu khi hạch nấm men dài ra và thắt lại ở giữa, tạo thành một chồi con Tế bào mẹ phát triển chồi con, trong đó một phần hạch và nguyên sinh chất chuyển vào chồi Khi chồi con đạt kích thước gần bằng chồi mẹ, nó sẽ được tách ra để sống độc lập Đây là phương pháp sinh sản vô tính chủ yếu của nấm men.
Sinh sản bằng hình thức phân đôi:
Trong quá trình phân chia tế bào, tế bào ban đầu dài ra và sau đó thắt lại ở giữa Vị trí thắt này ngày càng nhỏ cho đến khi tế bào bị đứt hoàn toàn, tạo ra hai tế bào con độc lập Hai tế bào con này hoàn toàn giống nhau và đều chứa một nửa vật chất di truyền từ tế bào mẹ.
Tốc độ sinh sản của Rhodotorula:Nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi thường từ 2 – 6 giờ
Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men bao gồm bốn giai đoạn chính: giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn diệt vong.
Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula trong khoảng 24 – 96 giờ tùy loài, tùy thuộc vào thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy
Harrison đã phân loại giống nấm men Rhodotorula.spp theo các đặc điểm như sau:
Bảng 2.1 Hình thái tế bào của một số loài Rhodotorula nuôi cấy trên môi trường thạch malt từ các nguồn phân lập khác nhau
Stt Loài Màu khuẩn lạc Hình dạng Nguồn phân lập
1 Rh.Acheniorum Hồng Dài Quả dâu, lá lê
2 Rh Araucariae Hồng Tròn cầu Gỗ cây bách tán
3 Rh Aurantiaca Hồng hoặc đỏ Dài Không khí, bia, đất
4 Rh Bogoriensis Kem hoặc hồng Gậy
5 Rh Diffluens Kem Tròn cầu, elip
6 Rh Fujisanense Kem hoặc hồng Gậy Cây nho dại
7 Rh Glutinis Hồng hoặc đỏ Tròn cầu
8 Rh Graminis Hồng Tròn cầu
9 Rh Ingeniosa Kem Tròn cầu
11 Rh Lactosa Vàng, hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí
12 Rh Marina Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Con tôm
Nấm men Rhodotorula có một số đặc tính sinh hóa sau:
– Không lên men các loại đường như: D-glucose, D-galactose, maltose, me--
Cấu tạo và sinh sản cảu nấm men Rhodotorula
Hiện nay, các sản phẩm hóa học tổng hợp không còn được chấp nhận làm chất phụ gia cho thực phẩm và thức ăn vật nuôi do lo ngại về an toàn sức khỏe Vì vậy, nhu cầu phát triển các chất carotenoid từ thiên nhiên để thay thế các hợp chất tổng hợp đang trở nên cấp thiết.
Hợp chất carotenoid trong thực vật và động vật thường có số lượng hạn chế, khiến việc tách chiết trở nên khó khăn và tốn kém Theo các nghiên cứu hiện nay, nuôi cấy tế bào vi sinh vật có khả năng tích lũy carotenoid được xem là phương pháp hiệu quả nhất để sản xuất công nghiệp các hợp chất này Trong số đó, tế bào nấm men Rhodotorula nổi bật với hàm lượng carotenoid rất cao.
Carotenoid là một loại phụ gia quan trọng trong thực phẩm, được sử dụng để tạo màu cho nhiều loại thực phẩm và đồ uống Ngoài ra, carotenoid còn được bổ sung vào thức ăn cho gia súc và gia cầm, giúp tạo màu cho lòng đỏ trứng và làm đẹp màu sắc cho thịt cá, tôm, cua Đặc biệt, carotenoid cũng nổi bật với hoạt tính chống oxi hóa, góp phần phòng ngừa ung thư hiệu quả.
3 VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNGCÂY TRỒNG
Sự cố định nitơ phân tử
Quá trình cố định nitơ phân tử
Quá trình cố định nitơ phân tử là một trong những quá trình vi sinh vật quan trọng đối với nông nghiệp Mặc dù không khí chứa tới 80,000 tấn nitơ mỗi hecta đất, nhưng con người, gia súc và cây trồng không thể sử dụng nitơ ở dạng phân tử Hàng năm, cây trồng trên toàn cầu tiêu thụ khoảng 100-110 triệu tấn nitơ, trong khi phân đạm hóa học chỉ bổ sung khoảng 30% lượng nitơ bị mất Để phá vỡ ba liên kết trong phân tử nitơ (N≡N) và sản xuất phân bón hóa học, cần phải áp dụng các điều kiện kỹ thuật phức tạp như nhiệt độ và áp suất cao cùng với chất xúc tác đắt tiền.
Cơ chế quá trình cố định nitơ phân tử
Cố định đạm sinh học là quá trình chuyển hóa N2 thành NH3 nhờ sự xúc tác của enzym nitrogenase Sau khi hình thành, NH3 có thể kết hợp với các axit hữu cơ để tạo ra protein Trong khí quyển, N2 tồn tại dưới dạng rất bền và chiếm tới 78,16% tổng thể không khí.
Cây trồng, động vật và con người không thể hấp thụ trực tiếp nitơ tự do từ không khí, vì vậy trong ngành công nghiệp, việc sản xuất phân đạm hóa học yêu cầu một lượng năng lượng lớn để phá vỡ liên kết của khí nitơ, gây ra hạn chế về hiệu quả kinh tế cho người sử dụng Ngược lại, tế bào vi sinh vật có khả năng phá vỡ liên kết này thông qua một phản ứng lên men đơn giản ở nhiệt độ và áp suất bình thường, nhờ vào sự hiện diện của phức hệ enzym nitrogenase trong tế bào vi sinh vật cố định nitơ.
Ngày nay, nhiều nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng NH3 không chỉ là sản phẩm của quá trình cố định nitơ mà còn là yếu tố điều hòa hoạt tính của enzym nitrogenase Khi NH3 tích lũy đến một nồng độ nhất định, nó sẽ ngay lập tức làm ngừng hoạt động của nitrogenase Kiểu điều hòa này được gọi là "Điều hòa liên hệ ngược".
NH3 không tham gia trực tiếp vào quá trình điều hòa mà thông qua enzym glutamin synthetase Khi nồng độ NH3 cao, enzym này bị adenin hóa và trở nên bất hoạt Ngược lại, trong môi trường có nồng độ NH3 thấp hoặc không có, enzym sẽ không bị adenin hóa và hoạt động bình thường Ở trạng thái hoạt động, enzym này kích hoạt hệ gen chịu trách nhiệm tổng hợp nitrogenase (Bạch Lan Phương, 2004).
Các loài vi sinh vật cố định nitơ
Vi khuẩn: Pseudomonas azotogensi, Azotomonas insolita (hiếu khí), Aerobac acrogennes (hiếu khí bắt buộc), Rhodospirillum rublum, Chromaticum sp (kị khí),
Xạ khuẩn: một số loại Streptomyces ( hay Actinomyces)
Tảo: Glococapsa sp (đơn bào), Plectonemasp, Anabaena ambigua
Nấm men: Rhodotosula sp(Bạch Lan Phương, 2004)
Vi sinh vật hòa tan lân
Vai trò của lân đối với cây trồng
Lân đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển của cây trồng nhờ vào thành phần protit, cần thiết cho việc hình thành tế bào mới và tổng hợp axit amin Khi cây phát triển và tạo ra nhiều tế bào mới, chúng cần thêm nucleo-protit, đồng thời hấp thụ cả đạm và lân Việc thiếu đạm mặc dù có lân trong đất sẽ cản trở sự phát triển của cây (Bạch Lan Phương, 2004).
Lân là một thành phần quan trọng trong nhiều hợp chất tham gia vào quá trình hô hấp và quang hợp của cây Theo Bạch Lan Phương (2004), lân luôn có mặt trong các quá trình sinh hóa diễn ra trong cây, đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì sự sống và phát triển của thực vật.
Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa lân thành dạng muối của acid phosphoric, giúp cây sử dụng một phần dinh dưỡng này Phần còn lại sẽ được cố định dưới dạng khó tan như Ca3(PO4)2 Trong môi trường có pH thích hợp, các dạng khó tan này sẽ được chuyển hóa thành dạng dễ tan, trong đó vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong quá trình này (Bạch Lan Phương, 2004).
Nhóm vi sinh vật hòa tan lân (PSM- phosphate solubilizing microorganism) bao gồm: Aspergillus niger, một loài vi khuẩn Pseudomonas, Bacillus,Micrococcus
Nhóm vi sinh vật này có khả năng nuôi cấy dễ dàng trên môi trường nhân tạo và sử dụng cơ chế hòa tan lân, giúp cải thiện hiệu quả trong những vùng đất thiếu lân cho cây trồng.
Vi sinh vật hòa tan lân hữu cơ
Vi sinh vật hòa tan lân hữu cơ chủ yếu là Bacillus và Pseudomonas, trong đó B megaterium var phosphatsum nổi bật với khả năng hòa tan lân hữu cơ cao B megaterium còn có khả năng hình thành bào tử, giúp nó duy trì sức sống mạnh mẽ Quá trình phân giải xác động vật và thực vật, bao gồm axit nucleic, nucleotid và phospholipid, cuối cùng tạo ra H3PO4 Nhiều nhóm vi sinh vật thuộc các giống Bacillus và Pseudomonas tham gia vào quá trình này, có thể được biểu diễn tổng quát qua một sơ đồ.
Quá trình phân giải lân:
Vi sinh vật hòa tan lân vô cơ
Nhiều loại vi khuẩn như Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, cùng với một số vi sinh vật trong hệ rễ, nấm và xạ khuẩn, có khả năng phân giải Ca3(PO4)2 Vi sinh vật vùng rễ đặc biệt mạnh mẽ trong việc phân giải Ca3(PO4)2, và cơ chế này liên quan chặt chẽ đến sự sản sinh axit trong quá trình sống của chúng Trong số bốn loại axit như H3PO4, H2CO3, HNO3 và H2SO4, axit H2CO3 đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình phân giải này.
H2CO3 đã làm cho Ca3(PO4)2 phân giải (Bạch Lan Phương, 2004)
Quá trình phân giải như sau:
Các loài vi sinh vật hòa tan lân
Vi khuẩn: Bacillus subtilis, B circulans, B megaterium, B polymixa, Pseudomonas striat, P diazotrophicus, P cepacia
Vi sinh vật sinh IAA
IAA (Axit Indole Axetic) là một hormone auxin quan trọng trong sự phát triển của thực vật, có khả năng điều chỉnh phân chia và giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, cũng như phát triển trái và hạt Một số vi khuẩn có thể tổng hợp IAA từ tryptophan qua các con đường khử amin, cacboxyl và oxy hóa Tác động của IAA phụ thuộc vào loại tế bào và nồng độ, ví dụ, nó kích thích sự giãn dài của trục lá mầm, ngăn cản sự phát triển của rễ chính, và khởi đầu sự hình thành rễ bên và lông rễ Nhiều vi sinh vật cũng sản sinh axit indolaxetic (IAA) để thúc đẩy sinh trưởng và ra hoa, trong khi axit indolbutyric (IBA) giúp tăng cường khả năng thụ phấn của cây.
Trong thực vật, IAA (axit indole-3-acetic) có thể tồn tại dưới dạng tự do hoặc liên kết với glucose và peptide Ở thực vật bậc cao, IAA thường tập trung nhiều tại các chồi, lá đang sinh trưởng, tầng phát sinh, hạt đang lớn và phấn hoa Axit amin tryptophan là tiền chất để tổng hợp IAA, và IAA di chuyển từ đỉnh cây xuống gốc với tốc độ nhất định.
Auxin có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của thực vật, ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn và tính hướng của cây Nó kích thích sự giãn nở của tế bào, đặc biệt là theo chiều ngang, giúp các bộ phận của cây phát triển to hơn về chiều ngang Điều này góp phần vào sự sinh trưởng của quả và sự hình thành quả không hạt (Trịnh Thị Hồng, 2009).
Tryptophan (Trp) Indole acetic Acid (IAA)
Hình 1.3Cấu trúc phân tử của IAA và Tryptophan
Hợp chất carotenoid
Cơ chế sinh tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật
PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1 TỔNG QUAN VỀ CÂY MÍA
1.1 Đặc tính của cây mía
Cây mía, có tên khoa học là Saccharum officinarum L., thuộc họ hòa thảo (Graminae) và đã được thuần hóa từ 8000 năm trước công nguyên tại đảo Tân Ghi Nê Qua thời gian, cây mía lan rộng đến Trung Quốc, Ấn Độ và các đảo Thái Bình Dương, nơi người Ấn đã biết sử dụng mía để chế biến đường từ 3000 năm trước công nguyên Đến thế kỷ 16, đường mía trở thành mặt hàng quan trọng trong thương mại giữa Nam Mỹ và Châu Âu Hiện nay, cây mía được trồng phổ biến ở 70 quốc gia, chủ yếu từ vĩ độ 30° Nam đến 30° Bắc.
Mía đã được lan truyền rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới khoảng 4000 – 3000 năm trước công nguyên, trong đó có Việt Nam, nơi có điều kiện tự nhiên lý tưởng cho cây mía phát triển như ánh nắng, nhiệt độ, độ ẩm và lượng mưa Với vị trí địa lý trải dài từ 8 đến 23 vĩ độ Bắc, Việt Nam là nơi thích hợp cho việc trồng mía Kể từ năm 1975, nhiều vùng trồng mía đường đã được hình thành để sản xuất đường, bao gồm các tỉnh miền Bắc như Sơn Tây, Vĩnh Yên, Bắc Giang, Hà Nội, Nam Định, Thái Bình; miền Trung với Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa; và miền Nam như Tây Ninh, Thủ Dầu Một, Biên Hòa, Tân An, Bến Tre (Hiệp Hội Mía Đường Việt Nam).
1.2 Đặc điểm thực vật học
Rễ mía được chia thành hai loại: rễ hom và rễ cây Rễ hom nhỏ, phân nhánh nhiều và ăn cạn, chỉ có tác dụng tạm thời trong 1-3 tháng sau khi trồng, vì vậy còn được gọi là rễ tạm hay rễ sơ sinh Trong khi đó, rễ cây lớn, phân nhánh ít và ăn sâu, có thời gian sống lâu hơn, thường được gọi là rễ thứ sinh hay rễ chính thức Rễ cây có hai nhiệm vụ chính là hút nước và chất dinh dưỡng, và được phân thành ba loại: rễ mặt, rễ giữ và rễ thừng (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi, 1997).
Thân mía có vai trò quan trọng trong việc mang lá và vận chuyển chất dinh dưỡng cùng nước, đồng thời chứa đường được tích trữ trong các tế bào vách mỏng Đây là sản phẩm cuối cùng mà người trồng mía thu hoạch.
Thân mía có cấu trúc gồm nhiều đốt và lóng, với phần gốc có đốt và lóng ngắn, xếp sít nhau, dần dài ra ở phần giữa và ngắn lại ở ngọn Cây mía khi thu hoạch thường có từ 20 – 30 lóng, mỗi lóng dài từ 10 – 20 cm Chiều cao trung bình của cây mía đạt từ 2 – 3 m, đường kính từ 2 – 4 cm, và trọng lượng từ 500 g – 2 kg Hình dạng và màu sắc của lóng thay đổi tùy thuộc vào giống, là yếu tố quan trọng để phân biệt các giống mía khác nhau Lóng có thể có hình dạng như hình trụ, ống chỉ, trống, chóp cụt, hoặc xuôi, và màu sắc có thể là vàng, đỏ, xanh, tím Cấu trúc lóng bao gồm vòng sinh trưởng, vòng rễ, nốt rễ, sẹo lá và mầm (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi, 1997).
Mầm (hoặc mắt) nằm trong vòng rễ, gần hoặc xa sẹo lá, và có hình dạng đa dạng như hình trứng, bầu dục, tròn, tam giác, ngũ giác hay chữ nhật Đặc điểm hình dạng của mầm là yếu tố quan trọng để phân biệt các giống cây trồng Khi nhận dạng giống, cần chú ý chọn mầm đang trong quá trình sinh trưởng.
10 tháng tuổi mới biểu hiện rõ đặc tính giống (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi,
Thân mía thường mọc thành từng bụi, mỗi bụi có từ 5 đến 20 cây với kích thước, tuổi tác và đường kính khác nhau Hàm lượng đường trong các cây mía cũng không đồng nhất, trong đó hàm lượng đường ở phần gốc thường cao hơn so với phần ngọn của cùng một cây.
Lá mía có cấu trúc đặc trưng với các lá mọc cách nhau, mỗi đốt trên thân cây mang một lá Thành phần của lá bao gồm phiến lá, bẹ lá, thân lá và gối lá (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi, 1997).
Phiến lá là bộ phận quan trọng trong quá trình quang hợp và tổng hợp chất hữu cơ, đồng thời cũng là phần tiếp xúc nhiều nhất với môi trường Màu sắc, kích thước và tư thế của phiến lá có sự biến đổi tùy thuộc vào giống cây, từ đó tạo thành đặc điểm phân biệt giữa các giống khác nhau.
Bẹ lá ôm chặt thân mía và có màu sắc đa dạng như xanh, tím, tùy thuộc vào giống mía Độ dày của lớp sáp bên ngoài bẹ lá cũng khác nhau giữa các giống Sự khô và tự rụng của bẹ lá cũng biến đổi theo từng giống mía (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi, 1997).
Gối lá là phần kết nối giữa bẹ lá và phiến lá, bao gồm hai mảnh ghép lại với nhau Hình dạng và màu sắc của gối lá có sự khác biệt tùy thuộc vào từng giống cây.
Hoa mía, hay còn gọi là cờ mía, có cấu trúc gồm một trục thẳng đứng với nhiều nhánh dày đặc Kích thước, hình dạng và màu sắc của hoa mía thay đổi tùy theo từng giống khác nhau (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi, 1997).
Hạt mía là loại quả thóc (caryopsis) nhỏ, kích thước dài 1 – 1,5 mm và rộng 0,5 mm, với trọng lượng từ 0,15 – 0,25 mg Tỷ lệ kết hạt và nảy mầm của hạt mía khá thấp và có sức sống ngắn, do đó cần được gieo ngay sau khi thu hoạch Đặc tính trổ cờ của hạt mía là yếu tố quan trọng trong việc lai tạo giống và sản xuất mía nguyên liệu.
2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN
Endomycetaceae Saccharomycetaceae Cryptoccaceae Rhodotorulaceae Họ
Endomyces Saccharomyces Crytococus Rhodotorula Giống Schizosaccharomyces Zygosaccharomyces Kloeskera
Sơ đồ 1.1 Phân loại nấm men (theo W Carol Frazier) 2.1 Sơ lược nấm men
Nấm men, hay còn gọi là yeast (levure), là nhóm vi nấm đơn bào, thường sinh sản bằng phương pháp nẩy chồi Chúng không thuộc về một phân loại taxon cụ thể nào và có thể nằm trong hai ngành nấm túi hoặc nấm đảm.
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt ở những môi trường có chứa đường và pH thấp Chúng thường xuất hiện trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, mật ong, cũng như trong đất ruộng mía và đất vườn cây ăn quả, bao gồm cả các khu vực có nhiễm dầu mỏ (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2010).
2.2 Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men
Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thực Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn
Trên thế giới
Nghiên cứu của Gai và cộng sự (2009) đã thành công trong việc phân lập một số chủng nấm men nội sinh từ cây họ quýt và cam, nổi bật trong số đó là loài Rhodotorula mucilaginosa.
Pichia guilliermondii và Cryptococcus flavescens đã được nghiên cứu bởi Gai và cộng sự (2009) Theo nghiên cứu của Khan và cộng sự (2012), vi khuẩn và nấm men nội sinh trong cây dương và cây liễu có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của cây trồng trong mùa vụ Nghiên cứu của Nutaratat và cộng sự cũng đã chỉ ra những lợi ích tương tự trong việc cải thiện năng suất cây trồng.
Nghiên cứu năm 2014 đã chỉ ra rằng một số chủng nấm men nội sinh từ lá mía và lá lúa có khả năng sinh IAA, giúp kéo dài và phân chia tế bào, đồng thời hòa tan lân và cố định đạm, từ đó thúc đẩy sự phát triển của cây trồng (Nutaratat và cs., 2014) Theo Xin và cộng sự (2009), ba chủng nấm men nội sinh được phân lập từ cây chi dương (Populus), trong đó Rhodotorula graminis được tìm thấy ở cây dương hoang dại (Populus trichocarpa) và Rhodotorula mucilaginosa từ thân cây dương lai (P trichocarpa, Populus deltoides), đều có khả năng sản xuất axit indolo-3-acetic (IAA) khi ủ với L-tryptophan Năm 2013, nghiên cứu của Akhtyamova đã phát hiện chủng nấm men Rhodotorula rubra TG-1 có khả năng kháng lại một số nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây, góp phần thúc đẩy tăng trưởng và bảo vệ cây trồng khỏi bệnh (Akhtyamova và cs., 2013).
Nhóm nghiên cứu của Mata – Gómez và cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng nấm men có khả năng sản xuất carotenoid với hàm lượng cao từ nước thải công nghiệp Đồng thời, Iriani và cộng sự (2007) cũng đã xác định được một số chủng nấm men có khả năng sinh carotenoid từ Bazil.
2007) Năm 2005, Heba và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa sản xuất carotenoid từ
Rhodotorulađược phân lập từ muối pho mát Nhóm nghiên cứu đã cho thấy sau 120
Trong nghiên cứu của Kanzy và cộng sự (2005), Rhodotorula được nuôi cấy trong môi trường có pH 6,6, ở nhiệt độ 30°C trong 35 giờ, với sự bổ sung 3% NaCl Kết quả cho thấy hàm lượng khô cao nhất đạt 13,95 g/l và hàm lượng carotenoid cao nhất là 6,544 mg/l.
Trong nước
Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu về nấm men chủ yếu tập trung vào các mẫu thực phẩm Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Minh Thủy đã lựa chọn các dòng nấm men từ nước thốt nốt nhằm tìm ra các chủng nấm có hoạt lực cao, phục vụ hiệu quả cho sản xuất rượu vang thốt nốt Ngoài ra, nghiên cứu của Ngô Thị Phương Dung và cộng sự cũng đã tiến hành phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men trong dịch chiết dưa hấu.
Nghiên cứu năm 2011 của Ngô Thị Phương Dung và cộng sự đã xác định các điều kiện ảnh hưởng của nấm men đến quy trình sản xuất rượu vang dưa hấu Đồng thời, Nguyễn Văn Thành và nhóm nghiên cứu của ông đã phân lập và tuyển chọn nấm men từ nước thốt nốt nhằm sản xuất rượu vang thốt nốt từ các chủng nấm men thuần Mặc dù có nhiều công trình nghiên cứu về nấm men tại Việt Nam, nhưng vẫn chưa có nghiên cứu nào về nấm men nội sinh và nấm men vùng rễ có khả năng kích thích tăng trưởng và kháng bệnh cho cây trồng.
Năm 2001, Nguyễn Minh Nguyệt đã nghiên cứu quá trình tổng hợp carotenoid từ nấm men Rhodotorula Tiếp theo, vào năm 2006, nhóm nghiên cứu của Tô Minh Châu đã khảo sát điều kiện tăng sinh khối của Rhodotorula spp để tìm ra môi trường tối ưu nhằm giảm thiểu chi phí và thời gian sản xuất Đến năm 2011, Nguyễn Thị Minh Nguyệt tiếp tục nghiên cứu để tuyển chọn chủng Rhodotorula có khả năng tổng hợp beta-caroten trên môi trường bán rắn, phục vụ cho việc sản xuất thức ăn bổ sung cho gà đẻ trứng.
PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 10 năm 2017 đến tháng 4 năm
2018 tại phòng Công nghệ Vi sinh - Cơ sở III, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh.
Thiết bị, dụng cụ, môi trường
PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1 TỔNG QUAN VỀ CÂY MÍA
1.1 Đặc tính của cây mía
Cây mía, hay còn gọi là Saccharum officinarum L., thuộc họ hòa thảo (Graminae) và đã được thuần hóa cách đây 8000 năm ở đảo Tân Ghi Nê Từ đó, mía dần lan rộng đến Trung Quốc, Ấn Độ và các đảo Thái Bình Dương Người Ấn Độ đã biết sử dụng mía để chế biến đường từ 3000 năm trước công nguyên Đến thế kỷ 16, đường mía trở thành mặt hàng quan trọng trong thương mại giữa Nam Mỹ và Châu Âu Hiện nay, cây mía được trồng rộng rãi ở 70 quốc gia, chủ yếu từ vĩ độ 30 độ Nam đến 30 độ Bắc.
Cách đây khoảng 4000 – 3000 năm, mía đã được lan truyền đến nhiều vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, bao gồm cả Việt Nam Cây mía phát triển tốt trong điều kiện khí hậu đặc trưng của vùng này, với ánh nắng, nhiệt độ, độ ẩm và lượng mưa phù hợp Việt Nam, trải dài từ 8 đến 23 độ Bắc, có điều kiện lý tưởng cho cây mía Từ năm 1975, nhiều vùng trồng mía đường đã được hình thành để sản xuất đường, với các khu vực nổi bật ở miền Bắc như Sơn Tây, Vĩnh Yên, Bắc Giang, Hà Nội, Nam Định, Thái Bình; miền Trung có Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa; và miền Nam với Tây Ninh, Thủ Dầu Một, Biên Hòa, Tân An, Bến Tre (Hiệp Hội Mía Đường Việt Nam).
1.2 Đặc điểm thực vật học
Rễ mía được chia thành hai loại: rễ hom và rễ cây Rễ hom nhỏ, phân nhánh nhiều và chỉ có tác dụng trong thời gian ngắn từ 1 đến 3 tháng sau khi trồng, do đó còn được gọi là rễ tạm hay rễ sơ sinh Ngược lại, rễ cây lớn, phân nhánh ít, có tuổi thọ dài hơn và đảm nhận hai nhiệm vụ chính là hút nước và chất dinh dưỡng Rễ cây bao gồm ba loại: rễ mặt, rễ giữ và rễ thừng.
Thân mía đóng vai trò quan trọng trong việc mang lá và vận chuyển chất dinh dưỡng cũng như nước Đường được tích trữ trong các tế bào có vách mỏng trong thân mía Đây là sản phẩm cuối cùng mà người trồng mía thu hoạch.
Thân mía có cấu trúc gồm nhiều đốt và lóng, với phần gốc có đốt và lóng ngắn, dần dài ra ở giữa và ngắn lại ở ngọn Khi thu hoạch, cây mía thường có từ 20 – 30 lóng, mỗi lóng dài từ 10 – 20 cm, cây cao trung bình từ 2 – 3 m, đường kính từ 2 – 4 cm và trọng lượng từ 500 g – 2 kg Hình dạng và màu sắc của lóng thay đổi theo giống, có thể là hình trụ, ống chỉ, trống, chóp cụt hoặc xuôi, với màu sắc như vàng, đỏ, xanh, tím Lóng mía bao gồm các vòng sinh trưởng, vòng rễ, nốt rễ, sẹo lá và mầm (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi, 1997).
Mầm (hoặc mắt) nằm trong vòng rễ, có thể ở gần hoặc xa sẹo lá, và hình dạng của mầm là một đặc trưng quan trọng để phân biệt các giống cây Mầm có thể có nhiều hình dạng khác nhau như hình trứng, bầu dục, tròn, tam giác, ngũ giác, hoặc chữ nhật Để nhận dạng giống cây, cần chọn mầm sinh trưởng để quan sát.
10 tháng tuổi mới biểu hiện rõ đặc tính giống (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi,
Thân mía thường mọc thành bụi với từ 5 đến 20 cây, có kích thước, tuổi tác và đường kính khác nhau Hàm lượng đường trong các cây mía cũng biến đổi, với mức đường ở gốc cao hơn so với ngọn của cùng một cây.
Lá mía có cấu trúc đặc trưng với các lá mọc cách nhau, mỗi đốt mang một lá Cấu tạo của lá bao gồm phiến lá, bẹ lá, thân lá và gối lá (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi, 1997).
Phiến lá là bộ phận chính tiếp xúc với môi trường, đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp và tổng hợp chất hữu cơ Màu sắc, kích thước và tư thế của phiến lá có sự thay đổi theo từng giống cây, từ đó giúp phân biệt các giống khác nhau.
Bẹ lá ôm sát thân mía có màu sắc đa dạng như xanh, tím và độ dày mỏng của lớp sáp bên ngoài phụ thuộc vào từng giống mía Sự rụng của bẹ lá khô cũng khác nhau tùy theo giống cây (Lê Song Dự và Nguyễn Thị Qúy Mùi, 1997).
Gối lá là phần kết nối giữa bẹ lá và phiến lá, bao gồm hai mảnh ghép lại với nhau Hình dạng và màu sắc của gối lá có sự biến đổi tùy thuộc vào từng giống cây.
Hoa mía, hay còn gọi là cờ mía, có cấu trúc gồm một trục thẳng đứng với nhiều nhánh phân tán dày đặc Kích thước, hình dạng và màu sắc của hoa mía thay đổi tùy thuộc vào từng giống.
Hạt mía là loại quả thóc (caryopsis) nhỏ, kích thước dài từ 1 – 1,5 mm và rộng 0,5 mm, với trọng lượng từ 0,15 – 0,25 mg Tỷ lệ kết hạt và nảy mầm của hạt mía thấp, và sức sống của chúng ngắn, do đó cần gieo ngay sau khi thu hoạch Đặc tính trổ cờ là yếu tố quan trọng trong công tác lai tạo giống và sản xuất mía nguyên liệu.
2 TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN
Endomycetaceae Saccharomycetaceae Cryptoccaceae Rhodotorulaceae Họ
Endomyces Saccharomyces Crytococus Rhodotorula Giống Schizosaccharomyces Zygosaccharomyces Kloeskera
Sơ đồ 1.1 Phân loại nấm men (theo W Carol Frazier) 2.1 Sơ lược nấm men
Nấm men, hay còn gọi là yeast, là nhóm vi nấm đơn bào có khả năng sinh sản bằng phương pháp nẩy chồi Chúng không thuộc về một taxon phân loại cụ thể nào và có thể thuộc ngành nấm túi hoặc ngành nấm đảm, theo nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2010).
Nấm men có mặt phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt ở những môi trường có chứa đường và pH thấp, như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, mật ong, cũng như trong đất ruộng mía và vườn cây ăn quả, thậm chí trong các khu vực đất bị ô nhiễm dầu mỏ.
2.2 Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men
Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thực Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn
Bố trí thí nghiệm
Dựa vào mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tôi bố trí thí nghiệm như sơ đồ
Quy trình lấy mẫu
Dựa vào bố trí thí nghiệm đã nêu ở mục 2.1, chúng tôi tiến hành quy trình lấy mẫu từ các mẫu mía khỏe và đất vùng rễ mía Các địa điểm lấy mẫu bao gồm tỉnh Bình Dương, tỉnh Tây Ninh, tỉnh Ninh Thuận và tỉnh Lâm Đồng.
Mẫu nội sinh được thu hoạch vào buổi sáng sớm hoặc chiều mát, từ những cây mía khỏe mạnh, tươi tốt, không bị sâu bệnh Toàn bộ cây mía được thu gom và rửa sạch để loại bỏ đất bám trên cây.
Phân lập
Lấy mẫu từ các bộ phận khác nhau của cây mía như rễ, thân, lá
Mẫu mía (rễ, thân, lá)
Phân lập mẫu trên DRBC
Quan sát đại thể, vi thể
Khảo sát hoạt tính có lợi
Khảo sát khả năng cố định đạm
Khảo sát khả năng sinh IAA
Khảo sát khả năng hoà tan lân
Khảo sát các chủng nấm men sinh sắc tố carotenoid
Khảo sát khả năng sinh enzym ngoại bào
Để chuẩn bị mẫu, trước tiên cần rửa sạch bằng nước máy để loại bỏ đất và bụi, sau đó tiếp tục rửa bằng nước cất vô trùng Tiếp theo, cắt rễ, thân, lá thành các đoạn dài từ 2 đến 4 cm và làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm.
Bước 2: Ngâm mẫu đã xử lý ở trên trong ethanol 70 % khoảng 2 phút
Bước 3: Ngâm trong dung dịch sodiumhypochlorite (NaOCl) 4-6 % khoảng 3 phút
Bước 4: Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng trong 2 phút
Bước 5: Đặt mẫu lên đĩa giấy hút ẩm vô trùng
Bước 6: Kiểm tra mẫu đạt yêu cầu Để xác định sự hiện diện của vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, lấy 50µl nước cất để rửa mẫu lần cuối và đặt lên môi trường NA, ủ ở 37°C trong 24 giờ Nếu sau thời gian ủ không có khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, mẫu được coi là đã khử trùng đạt yêu cầu (Pereira và cs., 1993) Tiếp theo, đặt các mẫu đã xử lý vào đĩa môi trường DRBC (King và cs., 1979) và ủ ở 25°C trong 5 - 6 ngày Chọn khuẩn lạc có màu trắng, hồng nhạt hoặc hồng đậm để cấy sang đĩa PDA.
Sau khi nuôi ủ, chọn khuẩn lạc điển hình nhuộm methylen blue, quan xác hình dạng tế bào (hình ovan) để xác định chủng nấm men nghi ngờ.
Phân nhóm vi sinh vật
Hình dạng khuẩn lạc nấm men trên môi trường có thể được phân loại dựa vào các đặc điểm như hình dạng (tròn, bầu dục), kiểu dáng mép (tròn đều hoặc bờ răng cưa), và sự nhô của tâm khuẩn lạc Bên cạnh đó, màu sắc khuẩn lạc thường là trắng ngà hoặc trắng sữa, trong khi mùi hương có thể xuất hiện hoặc không Cuối cùng, khả năng sinh sắc tố cũng là một yếu tố quan trọng để xác định loại nấm men.
Nhuộm methylen blue: nhằm xác định hình thái tế bào, dạng cầu, ovan hay elip, hình thức nảy chồi của nấm men
Lấy một phiến kính sạch và nhỏ một giọt thuốc nhuộm xanh methylen lên đó Giọt thuốc nhuộm cần có kích thước vừa phải, không quá lớn để tránh tràn ra ngoài lamelle, cũng như không quá nhỏ để không tạo ra nhiều bọt khí khi đậy lamelle.
Khảo sát các đặc điểm sinh học của nấm men
Để chuẩn bị mẫu, lấy một ít nấm men đã nuôi cấy từ 2-3 ngày và hòa vào giọt thuốc nhuộm Sau đó, đặt một cạnh của lamelle sát vào bên ngoài giọt mẫu và hạ từ từ lamelle xuống để giọt mẫu tràn đều khắp lamelle Nếu giọt mẫu tràn ra ngoài, hãy sử dụng giấy lọc để thấm bớt.
Đầu tiên, hãy sử dụng vật kính nhỏ, sau đó chuyển sang vật kính lớn Bạn có thể phân biệt tế bào sống và tế bào chết dựa vào mức độ bắt màu đậm nhạt.
2.5 Khảo sát khả năng sinh enzym ngoại bào của nấm men
Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzym gelatinase ngoại bào, giúp thủy phân gelatin thành polypeptide và acid amin Để xác định khả năng phân giải gelatin của vi sinh vật, ta sử dụng tricloroacetic acid (TCA) 25% để gây tủa protein gelatin trong môi trường nuôi cấy Nếu vi sinh vật tiết ra gelatinase, sẽ xuất hiện vòng trong quanh khóm vi sinh vật (phản ứng dương tính) Ngược lại, nếu không có sự phân giải gelatin, khu vực quanh khóm vi khuẩn sẽ đục (phản ứng âm tính).
Khả năng phân giải gelatin của nấm men được kiểm tra bằng môi trường YPD có bổ sung 1% gelatin Đầu tiên, cấy chấm dịch nấm men đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 28°C trong 24 giờ Sau đó, ủ ở 28°C trong 48 giờ và thêm TCA 25%, đọc kết quả sau khoảng 3 phút Nếu có vòng quanh khuẩn lạc, nấm men có khả năng phân giải gelatin; ngược lại, nếu không có vòng, chủng nấm men không có khả năng phân giải gelatin.
Casein là một loại protein có trong sữa, không thể thẩm thấu qua màng tế bào vi sinh vật Trước khi vi sinh vật có thể sử dụng casein làm nguồn carbon và năng lượng, casein cần được phân giải thành các amino acid Do đó, vi sinh vật phải tiết ra enzym proteolytic để phân hủy casein thành các amino acid, giúp chúng dễ dàng chuyển vào bên trong tế bào.
Khi sữa được trộn vào môi trường thạch dinh dưỡng, casein trong sữa khiến môi trường có màu trắng đục Sau quá trình ủ, vi sinh vật tiết ra enzym protease, như caseinase, tạo ra vùng phân giải xung quanh khuẩn lạc trong phản ứng dương tính Ngược lại, nếu phản ứng âm tính, môi trường xung quanh khuẩn lạc vẫn giữ màu đục.
Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường YPD bổ sung 5% sữa gầy Sau 24 giờ kích hoạt, nấm men được cấy điểm và ủ ở 28°C trong 48 giờ Kết quả cho thấy khả năng phân giải casein sau hai ngày nuôi cấy.
Một số vi sinh vật có khả năng sản xuất enzym lipase, giúp phân giải dầu thực vật và các hợp chất béo khác Trong thử nghiệm lipase, môi trường nuôi cấy bao gồm CaCl2 và Tween 80 Nếu vi sinh vật tiết ra enzym lipase, quá trình thủy phân Tween 80 sẽ diễn ra, tạo ra các acid béo tự do Sự hiện diện của ion Ca2+ sẽ dẫn đến sự hình thành tủa calcium oleate, tạo ra một vùng mờ đục xung quanh và dưới khuẩn lạc.
Khả năng phân giải lipid được thực hiện trong môi trường YPD có bổ sung CaCl2 và 1% Tween 80 Để tiến hành thí nghiệm, sử dụng tăm vô trùng để chấm dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở 28°C trong 24 giờ lên đĩa môi trường Sau đó, ủ đĩa ở 37°C trong 48 giờ và tiến hành đọc kết quả.
Một số vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme amylase, giúp phân giải tinh bột thành các đường đơn dễ sử dụng Phản ứng này có thể được nhận biết bằng cách nhỏ dung dịch lugol vào môi trường nuôi cấy; nếu có tinh bột, môi trường sẽ chuyển sang màu xanh đậm Ngược lại, nếu không còn tinh bột, dung dịch lugol sẽ không làm thay đổi màu sắc của môi trường.
