VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
2.1.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm Địa điểm: PTN Nuôi cấy mô, Trung tâm nghiên cứu Giống cây trồng Miền Nam, ấp Tân Hiệp, huyện Phú Giáo, tỉnh Bình Dương
Thời gian: Từ tháng 11/2013 đến tháng 4/2014
+ Hạt giống bắp tẻ lai đơn F1 NK67 nguồn gốc từ Indonesia do Công ty Syngenta nhập khẩu và phân phối
+ Hạt giống bắp nếp lai đơn F1 HN88 của Công ty CTCP Giống cây trồng Trung ƣơng
Bảng 2.1: Các hóa chất đƣợc sử dụng trong đề tài
STT Tên hóa chất Xuất xứ
3 Hóa chất pha môi trường MS, N6, YP Sigma
Phytagel, than hoạt tính, Casein hydrolysate
Sigma Đường sucrose CTCP Đường Biên
Hi Media Laboratories, Ấn Độ
- Thiết bị, dụng cụ: Kính hiển vi, tủ lạnh, máy cất nước, nồi hấp khử trùng, bình nuôi cấy, tủ cấy, găng tay, khẩu trang…
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Xác định giai đoạn phát triển của hạt phấn bắp in vivo
Nghiên cứu sự tương quan giữa sự phát triển của hạt phấn bắp và đặc điểm hình thái của cờ bắp, bông bắp và bao phấn giúp xác định giai đoạn phát triển tối ưu cho nuôi cấy bao phấn Việc lựa chọn giai đoạn phát triển phù hợp dựa trên hình thái của cờ, bông và bao phấn bắp sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nghiên cứu và sản xuất giống bắp hiệu quả hơn.
Cờ bắp được thu hoạch khi chưa nhú ra khỏi bẹ lá và được ủ trong 14 ngày ở nhiệt độ 9°C Sau quá trình xử lý lạnh, giai đoạn phát triển của hạt phấn được xác định dưới kính hiển vi với vật kính 40X Bao phấn được lấy từ những bông trên trục chính của cờ bắp, sau đó nhuộm bằng acetocarmine hoặc soi tươi để xác định giai đoạn phát triển Cuối cùng, sự phát triển của hạt phấn được đối chiếu với đặc điểm của cờ bắp, bông bắp và bao phấn để rút ra kết luận.
2.2.2 Thí nghiệm 1: Xác định môi trường cảm ứng tạo phôi thích hợp cho nuôi cấy bao phấn bắp
Khảo sát khả năng tạo phôi của bao phấn bắp trên ba môi trường MS, N6 và YP
Từ đó tìm ra môi trường cảm ứng tạo phôi thích hợp: tỷ lệ phôi tạo ra nhiều
Thí nghiệm được thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại và 5 bình nuôi cấy cho mỗi lặp lại Các nghiệm thức này được áp dụng trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi trong quy trình nuôi cấy bao phấn bắp.
Bảng 2.2: Các nghiệm thức thí nghiệm 1
1 MS-T (ĐC1) Nuôi cấy bao phấn kiểu gen NK67 trên môi trường MS
2 MS-N (ĐC2) Nuôi cấy bao phấn kiểu gen HN88 trên môi trường MS
3 N6-T Nuôi cấy bao phấn kiểu gen NK67 trên môi trường N6
4 N6-N Nuôi cấy bao phấn kiểu gen HN88 trên môi trường N6
5 YP-T Nuôi cấy bao phấn kiểu gen NK trên môi trường YP
6 YP-N Nuôi cấy bao phấn kiểu gen NH88 trên môi trường YP
Môi trường MS bổ sung: 500mg/l casein hydrolysate + 0,5 g/l than hoạt tính +
Môi trường N6 bổ sung: 500mg/l casein hydrolysate + 0,5 g/l than hoạt tính +
Môi trường YP bổ sung: 500mg/l casein hydrolysate + 0,5 g/l than hoạt tính +
Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp lấy chỉ tiêu
Tỷ lệ cấu trúc dạng phôi được hình thành sẽ được kiểm tra sau khoảng một tháng nuôi cấy bao phấn bắp trên môi trường cảm ứng tạo phôi Tính toán tỷ lệ này theo công thức cụ thể để đánh giá hiệu quả của quá trình nuôi cấy.
2.2.3 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của myo-inositol và nồng độ sucrose lên sự tạo phôi của bao phấn bắp
Khảo sát tác động của các nồng độ myo-inositol và sucrose đến khả năng cảm ứng tạo phôi của bao phấn bắp nhằm xác định nồng độ tối ưu cho nuôi cấy bao phấn bắp Nghiên cứu này sẽ giúp cải thiện quy trình nuôi cấy và tăng cường hiệu quả trong sản xuất giống bắp.
Thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại và 5 bình nuôi cấy cho mỗi lần lặp Các nghiệm thức được thực hiện trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi của quy trình nuôi cấy bao phấn bắp, sử dụng môi trường tối ưu đã được xác định từ thí nghiệm trước.
Bảng 2.3: các nghiệm thức thí nghiệm 2
1 S9M0 (ĐC1) Nuôi cấy bao phấn bắp trên môi trường bổ sung 9% sucrose
2 S9M1 Nuôi cấy bao phấn bắp trên môi trường bổ sung 9% sucrose
3 S9M2 Nuôi cấy bao phấn bắp trên môi trường bổ sung 9% sucrose
(ĐC2) Nuôi cấy bao phấn bắp trên môi trường bổ sung 12% sucrose
5 S12M1 Nuôi cấy bao phấn bắp trên môi trường bổ sung 12% sucrose
6 S12M2 Nuôi cấy bao phấn bắp trên môi trường bổ sung 12% sucrose
Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp lấy chỉ tiêu
Tỷ lệ cấu trúc dạng phôi được hình thành sau khi kiểm tra phôi vào khoảng một tháng sau khi nuôi cấy bao phấn bắp trên môi trường cảm ứng tạo phôi, được tính theo công thức.
2.2.3 Thí nghiệm 3: Cải thiện khả năng tạo dòng đơn bội kép trong nuôi cấy bao phấn bắp bằng colchicine
Mục đích của nghiên cứu là khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ colchicine đến khả năng cảm ứng tạo phôi và tỷ lệ cây đơn bội kép từ bao phấn bắp Nghiên cứu này nhằm cải thiện hiệu quả trong việc tạo dòng đơn bội kép thông qua phương pháp nuôi cấy bao phấn bắp.
Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 7 lần và sử dụng 5 bình nuôi cấy cho mỗi lặp lại Các nghiệm thức được áp dụng trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi trong quy trình nuôi cấy bao phấn bắp, với bao phấn lấy từ kiểu gen NK67.
Bảng 2.4: Các nghiệm thức thí nghiệm 3
1 C0 (ĐC) Nuôi cấy bao phấn bắp trên môi trường YP, không xử lý colchicine
2 C1 Xử lý bao phấn trước khi nuôi cấy trong 3 ngày bằng colchicine 0,02%
3 C2 Xử lý bao phấn trước khi nuôi cấy trong 3 ngày bằng colchicine 0,03%
Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp lấy chỉ tiêu
- Quan sát số cấu trúc dạng phôi đƣợc tạo thành
- Tỉ lệ cây tái sinh từ phôi: tính theo công thức
Tỉ lệ cây tái sinh (%) = Số cây tái sinh x 100%
- Tỉ lệ cây đơn bội kép: tính theo công thức:
Tỉ lệ cây đơn bội kép (%) = Số cây đơn bội kép x 100%
Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý thống kê theo phần mềm Statgraphics plus 3.0 và Excel
Phương pháp cấy bao phấn in vitro bắp:
- Trồng và chăm sóc bắp nguồn
Hai giống gen HN88 và NK67 được trồng trong nhà lưới trên giá thể đất sạch kết hợp với 5% phân lân Quá trình tưới nước diễn ra hàng ngày, trong khi việc bón phân được thực hiện cách nhau 10 ngày.
- Giai đoạn tiền xử lý lạnh
Cờ bắp đƣợc thu khi chƣa nhú ra khỏi bẹ lá sau đó đƣợc bọc trong túi giấy và giữ ở nhiệt độ 9 o C trong 14 ngày (Genovesi, 1990)
- Giai đoạn cảm ứng tạo phôi
Trong quá trình nuôi cấy bao phấn, những đoạn cờ mang hạt phấn ở giai đoạn đơn nhân giữa đến hai nhân sớm được lựa chọn và khử trùng bề mặt bằng dung dịch clorine 7% trong 10 – 15 phút Sau đó, chúng được rửa lại ba lần với nước cất đã khử trùng Tiếp theo, bao phấn được nuôi cấy trên môi trường cảm ứng tạo phôi trong điều kiện phòng tối hoàn toàn, với nhiệt độ duy trì ở 28 độ C.
- Giai đoạn tái sinh chồi:
Sau khoảng 30 ngày nuôi cấy bao phấn bắp trên môi trường cảm ứng tạo phôi, phôi và mô sẹo hình thành sẽ được chuyển sang môi trường tái sinh MS có bổ sung 1 mg/l kinetine, 30 g/l sucrose và 7 g/l agar Quá trình nuôi cấy diễn ra dưới điều kiện chiếu sáng thích hợp.
Giai đoạn tái sinh rễ diễn ra khi cây đạt chiều cao 3-4 cm, cần chuyển cây sang môi trường ra rễ với thành phần gồm 1 mg/l kinetine, 1 mg/l NAA, 20 g/l sucrose, 7 g/l agar và 3 g/l than hoạt tính Quá trình nuôi cấy nên được thực hiện trong điều kiện chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày và nhiệt độ ổn định ở 25 độ C.
- Ra ngôi: Cây tái sinh đƣợc trồng trên giá thể đất sạch trong điều kiện phòng 2 ngày Cuối cùng, cây được chuyển ra các bầu đất trong nhà lưới.
