TỔNG QUAN
Chất ngọt thay thế đường – Lịch sử nghiên cứu và phát triển
Tên IUPAC: 1,1-dioxo-1,2-benzothiazol-3-one
Công thức phân tử: C7H5NO3S
Tinh thể trắng, không mùi, ít tan trong nước Độ ngọt gấp 200 – 800 lần sucrose, vị chát, hậu vị kim loại
Vào năm 1907, saccharin là đường hóa học đầu tiên được dùng như phụ gia thay thế đường trong thực phẩm cho bệnh nhân tiểu đường
Saccharin từng bị cấm sử dụng vào năm 1977 do các nghiên cứu chỉ ra rằng nó có thể gây ra khối u bọng đái ở chuột khi sử dụng với liều cao Tuy nhiên, lệnh cấm này đã được dỡ bỏ vào năm 1993.
Công thức phân tử: C6H12NO3S.Na
Màu trắng, không mùi, dạng bột tinh thể có vị ngọt (độ ngọt gấp 30 lần so với đường mía)
Tan trong nước, không tan trong benzen,chloroform, ethanol và diethyl ether
Tính ổn định: dung dịch cyclamate ổn định với nhiệt, ánh sáng và không khí trên một khoảng pH rộng
Sodium cyclamate (E 952) là một chất ngọt nhân tạo, có độ ngọt gấp 30 – 50 lần so với đường thông thường Chất này được phát hiện vào năm 1937 bởi Michael Sveda, một sinh viên tại trường Đại Học Illinois, Mỹ.
Cyclamate, được cấp phép sử dụng tại Mỹ từ năm 1958 với tên gọi “sucaryl”, đã trở thành một chất tạo ngọt thay thế đường mía phổ biến không chỉ ở Mỹ mà còn trên toàn thế giới Tuy nhiên, vào năm 1970, các nghiên cứu về tác động của cyclamate trên chuột đã dẫn đến lệnh cấm sử dụng chất tạo ngọt này trên toàn nước Mỹ.
Aspartame là dipeptid của 2 amino acid: L-aspartic acid và metil ester của L - phenylalanin
Vị gần như đường, không có hậu vị đắng, kim loại Độ ngọt gấp 160 – 220 lần sucrose Ít tan trong nước, không ổn định ở nhiệt độ cao
Aspartame, một chất tạo ngọt nhân tạo, được phát hiện tình cờ vào năm 1965 bởi nhà hóa học James Schlatter trong quá trình thử nghiệm thuốc chống lở loét vết thương tại tập đoàn G D Searle Sau đó, chất này đã được cho phép sử dụng trong các loại nước giải khát có gas.
1983 Hiện nay, aspartame được sử dụng rộng rãi trên thế giới trong các loại thực phẩm khác nhau như bánh kẹo, nước giải khát
Các chất ngọt này được trích ly từ tự nhiên, mà không qua con đường tổng hợp hoá học gồm có: glycyrrhizin, thaumatin, stevioside
Rễ cây cam thảo (Glycyrrhiza glabra L., họ Fabaceae) chứa glycyrrhizin, một glycoside bao gồm muối kali và canxi của acid glycyrrhizic Glycyrrhizin có phần aglycon là acid glycyrrhetic, thuộc nhóm triterpen với cấu trúc oleanan.
Glycyrrhizin có độ ngọt gấp 50 – 150 lần so với đường mía, và khi thủy giải bằng enzym để mất 1 đơn vị đường (acid D-glucuronic), độ ngọt tăng lên 941 lần Tên thương mại của glycyrrhizin là cam thảo (liquorice hay licorice) Tại Nhật Bản, dịch chiết chứa 90% glycyrrhizin được sử dụng trong thực phẩm, đồ uống và thuốc đông y để che đậy vị đắng Tuy nhiên, glycyrrhizin không được sử dụng trong đồ uống có gas do có xu hướng kết tủa ở pH < 4,5.
Thaumatin (E 957) là một chất ngọt tự nhiên có hương vị cam thảo, ngọt hơn sucrose ít nhất 5000 lần Chất này có bản chất là protein và lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1972 từ axit D-glucuronic và axit glycyrrhetic.
Cây Thaumatococcus daniellii Benth, được Daniel phát hiện vào năm 1855, có nguồn gốc từ Tây Phi, đặc biệt là ở Sierra Leone, nơi người dân địa phương gọi nó là “Katemfe” Loại cây này, được tìm thấy ở Cộng hòa Zaire, Sudan và Uganda, thường được sử dụng để làm giảm mùi vị của trái chua hoặc rượu vang kém chất lượng.
Vào năm 1939, cây cỏ ngọt đã được chiết xuất từ cây Stevia rebaudiana Bertoni, đánh dấu sự khởi đầu cho việc phát triển một chất ngọt mới Sau hơn 40 năm nghiên cứu, stevioside đã được xác định là ngọt hơn sucrose khoảng 300 lần, đồng thời sở hữu nhiều đặc tính ưu việt và được sử dụng rộng rãi.
Giới thiệu về cỏ ngọt
Tên thường gọi: Cỏ ngọt hay cỏ đường, cỏ mật, cỏ cúc
Tên tiếng anh: Sweetleaf, candyleaf, Sweet herb of Paraguay
Tên khoa học: Stevia rebaudiana Bertoni
Hình 1.5 Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni)
A: Cây cỏ ngọt đã trổ hoa
B: Cây cỏ ngọt chưa trổ hoa
Bảng 1.1 Phân loại thực vật học cỏ ngọt
Có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở đông bắc Panama Trung Mỹ
Vào thế kỷ 16, thủy thủ Tây Ban Nha đã biết đến loại thảo mộc này, nhưng mãi đến năm 1888, nhà thực vật học Paraguay Mises Santiago Bertoni mới phân loại và đặt tên chính thức là Stevia rebaudiana Bertoni.
Từ ngàn năm nay thổ dân Guarani người Paraguay đã dùng loại thảo mộc này để làm dịu ngọt các loại thức ăn, nước uống có tính đắng
1.2.4 Đặc điểm thực vật học
Theo Dược điển Việt Nam IV (Bộ Y tế, 2009) cây được mô tả như sau:
Cỏ ngọt có dạng thân bụi, chiều cao trung bình khi thu hoạch là 50 – 60 cm Trong điều kiện thâm canh có khi cao tới 80 – 120 cm
Thân và cành cỏ ngọt tròn, có nhiều lông, đường kính thân chỗ to nhất từ 5 –
8 mm, thân già có màu tím nâu, phần non màu xanh, có khả năng ra rễ bất định Toàn thân có vị ngọt, nhiều nhất ở lá
Lá cây có hình trái xoan hẹp hoặc hình trứng ngược, màu xanh lục vàng, dài từ 2,5 đến 6,0 cm và rộng từ 1,0 đến 1,8 cm Cả hai mặt lá đều có lông mịn và mép lá khía răng cưa Lá mọc đối, có hình mũi mác với mặt trên có ba gân nổi rõ xuất phát từ cuống lá Lá già có kích thước dài từ 5 đến 7 cm, rộng từ 1,5 đến 2 cm, với ba gân song song và các gân phụ phân nhánh.
Lá già chết khô ở dưới nhưng cuống lá rất dai nên không rụng (vẫn còn vị ngọt) Trên một thân, số lá có thể đạt tới 70 - 90 lá
Hoa cỏ ngọt là loại hoa đầu phức hợp, với mỗi tổng bao chứa 5 hoa nhỏ có tràng hình ống màu trắng ngà và 5 cánh nhỏ Hoa thường mọc ở đầu cành hoặc kẽ lá, tạo thành hình xim hai ngã, và ở cuống chùm hoa có hai lá chét nhỏ Chiều dài của hoa khoảng 10 cm.
12 cm Có hai vòi nhụy dài thò ra ngoài Hoa có mùi thơm nhẹ Mùa hoa từ tháng
Quả nhỏ màu nâu thẫm, có 5 cạnh và chiều dài khi chín từ 2 đến 2,5 mm, với lông giúp gió phát tán hạt đi xa Cây non được gieo từ hạt phát triển chậm hơn so với cây được nhân giống từ cành giâm, trong khi trọng lượng của 1000 hạt dao động từ 0,35 đến 0,40 g.
Rễ chùm của cây có hình dạng nón, phát triển ít phân nhánh và thường mọc cạn từ 0 đến 30 cm, tùy thuộc vào độ phì nhiêu, độ ẩm của đất và mức nước ngầm Hệ rễ phát triển mạnh mẽ nhất ở độ sâu 20 – 30 cm trong điều kiện đất tơi xốp và đủ độ ẩm.
1.2.5 Các steviol glycoside trong cỏ ngọt
Theo Nabors (2012), lá cỏ ngọt chứa từ 7% đến 15% steviol glycoside, bao gồm khoảng 4.0% đến 8.5% stevioside, 1.5% đến 5% rebaudioside A, 0.1% đến 2.5% rebaudioside C, và 0.1% đến 1% dulcoside A Điều này cho thấy hai loại đường steviol glycoside có tiềm năng khai thác thương mại trong cây là stevioside và rebaudioside A.
Bảng 1.2 Thành phần các steviol glycoside
Công thức hóa học: C 38 H 60 O 18 (M = 804,8 g/mol) Độ ngọt gấp 150 – 250 lần đường mía (sucrose) Không tạo calorie Độ tan trong nước ở 25 0 C: 0,13% (w/v)
Công thức hóa học: C 44 H 70 O 23 (M = 966,5 g/mol) Độ tan trong nước ở 25 0 C: 0,8% (w/v)
Theo Prakash (2008) trong dung dịch, rebaudioside A bền ở pH 4-8 và kém bền ở pH < 2 Trong dịch nước ở pH 2-8, rebaudioside A có thể giảm cấp cho ra stevioside, rebaudioside B, steviolbioside
1.2.6 Những nghiên cứu trước đây
Theo tác giả Jaitak et al (2009)
Jaitak et al (2009) thực hiện chiết stevioside và rebaudioside A bằng 3 phương pháp:
• Ngâm chiết thông thường (Conventional extraction):
Lá cỏ ngọt được phơi khô dưới bóng râm, rồi nghiền trong cối thành bột đến cỡ hạt 60 mesh (bằng rây); bảo quản ở nhiệt độ phòng
Ngâm mẫu lá cỏ ngọt với 5 hệ dung môi khác nhau [methanol, ethanol, nước, methanol:nước (80:20), và ethanol:nước (80:20)] ở nhiệt độ phòng (25 o C) trong 12 giờ Lọc lấy dịch chiết
• Chiết siêu âm (Ultrasound-assisted extraction):
Bột lá khô được chiết bằng 5 hệ dung môi như trên trong bể siêu âm ở nhiệt độ 35 ± 5°C trong 30 phút Lọc lấy dịch chiết
• Chiết vi sóng (Microwave-assisted extraction):
Bột lá khô được chiết xuất bằng 5 hệ dung môi trong lò vi sóng với công suất từ 20 đến 160 W, thời gian từ 30 giây đến 5 phút và nhiệt độ từ 10 đến 90 °C Sau đó, tiến hành lọc để thu được dịch chiết.
Sau khi thu dịch chiết bằng ba phương pháp, mẫu được cô cạn ở nhiệt độ 50 °C bằng máy cô quay Cao chiết loại béo được thực hiện bằng hexan, sau đó lọc bỏ các tạp chất Dung môi hexan được thu hồi dưới áp suất thấp cho đến khi cạn Cuối cùng, cặn khô được hòa tan trong 10 ml acetonitril:nước (80:20) và lọc qua màng 0,45 µm để phù hợp cho phân tích HPLC.
Kết quả HPLC cho thấy rằng phương pháp chiết vi sóng đạt hiệu suất cao nhất trong việc cô lập stevioside và rebaudioside A, với giá trị lần lượt là 8,64% và 2,34% khi sử dụng công suất tối ưu 80 W, nhiệt độ 50 °C, và thời gian chiếu xạ chỉ 1 phút So với các phương pháp ngâm chiết, hiệu suất của chiết siêu âm là 4,20% cho stevioside và 1,98% cho rebaudioside A, trong khi phương pháp ngâm chiết đạt 6,54% và 1,20%.
Hệ dung môi MeOH + H2O (80:20) là lựa chọn tối ưu cho phương pháp vi sóng trong việc chiết xuất stevioside Bên cạnh đó, phương pháp ngâm chiết thông thường cũng đạt hiệu quả cao với hệ dung môi này Tuy nhiên, để chiết rebaudioside A, cần chuyển sang sử dụng hệ dung môi EtOH hoặc EtOH + H2O.
Theo tác giả Kovylyaeva et al (2007)
Theo Kovylyaeva (2007), quá trình cô lập steviol glycoside gặp khó khăn do cần tinh chế dịch chiết nước khỏi các tạp chất hữu cơ như sắc tố màu (chlorophyll, xanthophyll, β-carotene), protein, acid hữu cơ, resin và sesquiterpen lactone Một số phương pháp đã được áp dụng bao gồm kết tủa tạp chất bằng hydroxide như Ca(OH)2 hoặc AlCl3 + NaOH từ dịch nước, cùng với sắc ký cột sử dụng pha tĩnh Al2O3 và pha động là hệ butanol:methanol:nước.
Chiết xuất được thực hiện bằng cách đun hồi lưu 50 g lá khô với 700 ml nước trong 1 giờ Sau đó, lọc để thu dịch chiết và cô đặc dưới áp suất thấp 40-60 mmHg, tạo ra cao chiết sệt màu nâu đen với mùi chua giống như xi-rô.
Để tinh chế khỏi sắc tố màu, protein và nhựa, pha loãng 100 g syrup (83 ml, 50%) với 500 ml nước cất và thêm 41 g AlCl3.6H2O, khuấy cho tan Sau đó, thêm từ từ dung dịch NaOH (19 g/25 ml H2O) đến khi đạt pH 5-6, khoảng 600 ml, và để yên 30 phút cho kết tủa lắng xuống Lọc bỏ kết tủa bằng phễu Buchner Cuối cùng, cho một nửa lượng syrup qua cột với pha tĩnh Al2O3 và rửa cột bằng nước để thu được dung dịch màu nâu nhạt (250 ml).
Dịch chiết nước 250 ml được chiết bằng bình lóng với butanol 12 × 30 ml, thu hồi dung môi butanol để thu được 13 g cao thô màu xanh lá Sau đó, hòa tan 13 g cao butanol với 200 ml methanol và kết tinh lại hai lần, thu được 2,5 g stevioside có nhiệt độ nóng chảy từ 201-203 °C; phổ MS (MALDI) của stevioside cho mũi 827 [M+Na]+.
Sắc ký cột trên Al2O3 được thực hiện bằng cách đun hoàn lưu dịch chiết đã tinh chế từ hydroxide, nhựa và protein với 100 ml methanol Sau khi loại bỏ methanol, cặn sệt thu được được hòa tan trong BuOH:MeOH:H2O và tiến hành sắc ký qua cột nhồi Al2O3 Kết quả là cô đặc dịch rửa giải cao thô màu vàng (0,5 g), sau đó tinh chế lại trong methanol thu được stevioside 0,3 g Dung dịch mẫu còn lại được sử dụng để cô lập rebaudioside A và C.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Tất cả các thí nghiệm nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa - Môi trường thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh, có địa chỉ tại 68 Lê Thị Trung, Phường Phú Lợi, Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương.
Thời gian: từ tháng 10/2015 đến tháng 3/2016
Lá cỏ ngọt khô (Stevia rebaudiana Bertoni) được thu tại Đà Lạt ở dạng khô
Hình 2.1 Lá cỏ ngọt khô Stevia rebaudiana Bertoni
Becher 50 ml, 100 ml, 250 ml, 600 ml, 1000 ml
Phễu thủy tinh, giấy lọc, đĩa petri Ống đong 100 ml, 500 ml Đũa thủy tinh, ống nhỏ giọt, pipet 10 ml
Tủ sấy Memmert ALM400, bể ổn nhiệt Memmert WB7
Cân kỹ thuật Ohaus TAJ202 và Shinko GS3000
Hệ thống Soxhlet (gồm bình cầu 1000 ml, trụ chiết 400 ml, ống sinh hàn)
Bếp khuấy từ có gia nhiệt VELP ARE + cá từ
Hệ thống chưng cất trực tiếp (gồm bình cầu, ống sinh hàn nằm ngang, nhiệt kế, bình cầu thu hồi dung môi)
Hệ thống lọc áp suất kém (gồm erlen có vòi, phễu Buchner, máy bơm)
Một số hình ảnh thiết bị
Hình 2.2 Bộ chiết Soxhlet và bộ chiết lỏng - lỏng
Hình 2.3 Bộ thu hồi dung môi
Hình 2.4 Máy quang phổ hồng ngoại FT- IR
Hóa chất dùng trong thí nghiệm chủ yếu là dung môi trích ly
Bảng 2.1 Một số thông tin về dung môi
STT Tên dung môi Điểm sôi
Quốc Ngoài ra còn có:
- Bản nhôm tráng sẵn silica gel 60 F 254 (Merck)
- Chất stevioside chuẩn (TCI, Nhật)
- Silica gel để tráng bản mỏng: silica gel 60 G và silica gel 60 GF254 (Merck).
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.5 Quy trình chung trích ly các steviol glycosides
Chiết Soxhlet với hệ dung môi
Cô cạn và thêm nước
Chiết lỏng - lỏng với petroleum ether (1: 1)
Chiết lỏng - lỏng với chloroform (1: 1)
Chiết lỏng - lỏng với ethyl acetate (1: 1)
Chiết lỏng - lỏng với n- butanol (1: 1)
Bước 1: Làm khô nguyên liệu và trích ly
Nguyên liệu đem cắt nhỏ rồi sấy trong tủ sấy nhiệt độ là 60 0 C cho đến khi khối lượng không đổi thì đem đi xay thành bột
Nhồi các túi bột cỏ ngọt có khối lượng 100 g cho vào hệ thống Soxhlet trích ly bằng các hệ dung môi để tận trích lấy dịch
Bước 2: Thu hồi dung môi và loại tạp chất
Sau khi tiến hành trích ly, chúng ta thu được hỗn hợp bao gồm dung môi và dịch chiết Để thu hồi dung môi, sử dụng bộ thu hồi dung môi, trong đó dung môi có nhiệt độ sôi thấp hơn dịch chiết sẽ bay hơi qua hệ thống ống sinh hàn Kết thúc quá trình này, chúng ta sẽ có dịch chiết với một phần dung môi đã được loại bỏ.
Hòa dịch này với 150 ml nước Lọc lấy dịch X đem cô cạn thu được dịch A Bước 3: Chiết thô
Tiến hành chiết lỏng- lỏng dịch chiết với các loại dung môi từ không phân cực đến phân cực như: petroleum ether, chloroform, ethyl acetate và n- butanol
Chưng cất thu hồi dung môi, thu được cao n- butanol
Để kết tinh thu tinh thể, đầu tiên đun nóng dung môi methanol và sử dụng pipet Pasteur để thêm từng lượng nhỏ dung môi vào cao thô, khuấy đều cho đến khi cao tan hoàn toàn Nếu dịch còn tạp chất, cần lọc hoặc gạn lại Sau đó, để nhiệt độ trong becher giảm dần và khi becher đã nguội, cho vào tủ lạnh và để yên trong 2 - 3 ngày để quá trình kết tinh diễn ra Lặp lại quy trình cho đến khi xuất hiện chất kết tinh màu trắng.
Sấy khô tới khối lượng không đổi, thu được các steviol glycosides thô
Bước đầu tiên trong quy trình là làm khô nguyên liệu và tiến hành trích ly Tại giai đoạn này, cần thiết lập các thí nghiệm để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình chiết, bao gồm hai thí nghiệm chính.
Thí nghiệm 1: Khảo sát hệ dung môi tối ưu ảnh hưởng đến quá trình chiết
Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian tối ưu ảnh hưởng đến quá trình chiết
Thí nghiệm 1: Khảo sát hệ dung môi tối ưu ảnh hưởng đến quá trình chiết
Steviol glycosides tan tốt trong dung môi hữu cơ phân cực Do vậy, tiến hành khảo sát các hệ dung môi chính đó là: nước, methanol, ethanol
Khảo sát tác động của các loại dung môi khác nhau đến hiệu suất trích ly nhằm xác định hệ dung môi tối ưu, mang lại hiệu suất cao nhất trong khi vẫn đảm bảo chất lượng stevioside thô không bị ảnh hưởng nhiều.
Các thí nghiệm đều được khảo sát trên 100 g bột lá cỏ ngọt
Tiến hành chiết theo tỉ lệ bột lá:nước là 1:15 trên bếp khuấy từ với nước ở nhiệt độ 100 0 C trong 5 giờ Lọc lấy dịch nước rồi cô cặn thu cao
Với các hệ dung môi còn lại
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát hệ dung môi tối ưu ảnh hưởng đến quá trình chiết
Hệ dung môi methanol ethanol 80%
Tận trích thu dịch và hòa tan với 150 ml nước Sau đó, bổ sung Ca(OH)2 để kết tủa các tạp chất Lọc lấy dịch X và cô cạn Tiến hành thí nghiệm theo các bước 2, 3, 4 đã nêu.
Chỉ tiêu đánh giá: khối lượng cao thô thu được
Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian tối ưu ảnh hưởng đến quá trình chiết
Khi tìm được loại dung môi chiết tối ưu ở thí nghiệm 1, ở thí nghiệm 2 ta sẽ khảo sát sâu hơn về thời gian chiết tối ưu
Tìm ra thời gian chiết tối ưu với loại dung môi tốt nhất ở thí nghiệm 1, để hiệu suất trích ly cao nhất
Cân chính xác 100 g bột cỏ ngọt Bố trí phương pháp trích ly bằng Soxhlet lần lượt ở
Ba khoảng thời gian thí nghiệm được thực hiện là 10 giờ, 15 giờ và 20 giờ, với mỗi khoảng thời gian được lặp lại ba lần Sau đó, dịch chiết được đuổi dung môi và tiếp tục theo quy trình chung để thu được các steviol glycosides.
Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian trích ly Soxhlet
Rửa sạch, cắt nhỏ, xay Chiết Soxhlet
Trích ly Soxhlet trong ethanol
Bước 2: Thu hồi dung môi và loại tạp chất Ở bước này, tiến hành khảo sát tác dụng của Ca(OH)2 đến quá trình lọc
Hình 2.7 Không sử dụng Ca(OH) 2
Hình 2.8 Có sử dụng Ca(OH) 2
Cô cạn, thêm nước và 2,5 g Ca(OH)2
Lọc bằng phễu Buchner 2 lần
Cô cạn, thêm nước Khuấy từ
Lọc bằng phễu Buchner 2 lần
Loại béo, chlorophyl, xantohophylls, b- carotene, proteine, acid hữu cơ, nhựa và các tạp chất khác
Tiến hành chiết lỏng - lỏng dịch A với petroleum ether (1:1) hai lần Dung dịch phân làm 2 lớp; thu lớp dịch nước B phía dưới
Tiến hành chiết lỏng - lỏng dịch nước B với chloroform (1:1) ba lần Dung dịch phân làm 2 lớp; thu lớp dịch nước C phía trên
Tiến hành chiết lỏng - lỏng dịch C với ethyl acetate (1:2) hai lần Dung dịch phân làm
2 lớp; thu lớp dịch nước D phía dưới
Tiến hành chiết lỏng - lỏng dịch nước D với n-butanol (1:1) một lần Dung dịch phân làm 2 lớp; thu lớp dịch n-butanol phía trên
2.2.3 Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký bản mỏng
Loại bản mỏng: bản nhôm đã tráng sẵn silica gel 60 F 254 , kích thước 20 × 20 cm
Hoạt hóa bản mỏng ở 105 o C trong 1 giờ
• Chuẩn bị ly sắc ký:
Ly thủy tinh có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng
Cắt 1 tờ giấy lọc hình chữ nhật có kích thước 10 × 15 cm Đặt tờ giấy lọc vào bao phủ mặt trong của bình sắc ký (để bão hòa dung môi trong bình) sao cho có khoảng trống để quan sát bản ở bên trong
Cho 1 lượng dung môi (khoảng 10 ml) vào ly sắc ký sao cho lớp dung môi cao khoảng 0,5 - 0,7 cm (mực dung môi phải thấp hơn vị trí vết chấm)
Sau khi cho dung môi vào ly sắc ký để bão hòa trong khoảng 15 phút
• Chấm bản để kiểm tra chất kết tinh thu được:
Bản mỏng có kích thước 3 × 10 cm
Chọn hệ tốt nhất trong khảo sát
Chấm mẫu chất rebaudioside A bên trái, stevioside chuẩn 80% ở giữa và steviol glycosides thô bên phải bản mỏng
Trước khi tiến hành chấm bản, cần đánh dấu mức xuất phát cách đáy bản 1 cm và vạch ngang "vạch mức dung môi" cách đầu bản 0,5 cm bằng đầu nhọn của ống vi quản.
Mẫu steviol glycosides thô đã qua kết tinh lại được pha theo tỉ lệ: 0,02 g mẫu/1 ml methanol
Nhúng nhẹ đầu nhọn của ống vi quản vào dung dịch mẫu và chấm ba điểm lên cùng một bản: một điểm là steviosides chuẩn, một điểm là rebaudioside A chuẩn, và điểm bên phải là mẫu steviol glycosides thô thu được qua quá trình kết tinh lại.
Sau khi hoàn tất quá trình chấm, bản mỏng cần được giữ thẳng đứng và nhúng vào dung môi trong ly, tránh để hai cạnh bên của bản tiếp xúc với thành ly Khi đậy nắp ly sắc ký, dung môi sẽ được hút lên bản mỏng nhờ vào lực mao dẫn.
Theo dõi khi mực dung môi lên đến "vạch mức dung môi" thì lấy ra, để cho dung môi bay hơi
• Hiện hình bằng H 2 SO 4 10% trong ethanol:
Pha dung dịch H2SO4 10% trong ethanol
Cho dung dịch axit vào ống thủy tinh hình trụ có đường kính lớn hơn bề ngang của bản mỏng, đảm bảo mức dung dịch axit ngập cao hơn chiều cao của bản mỏng.
Để hiện hình bản nhôm, bạn cần nhúng bản vào dung dịch acid cho đến khi ngập hoàn toàn Sau đó, hãy lấy bản ra và lau khô phần acid còn lại Cuối cùng, sấy bản mỏng trên bếp điện để hoàn tất quá trình.
Khảo sát các hệ dung môi chạy sắc ký:
Bản mỏng có kích thước 2 × 10 cm
Vết chấm mẫu để so sánh là các mẫu stevioside chuẩn 80% (TCI) và mẫu rebaudioside A thương mại
Chấm mẫu chất stevioside chuẩn 80% bên trái và rebaudioside A bên phải bản mỏng
Các hệ dung môi chạy sắc kí:
Hệ 1: n-Buthanol - Acid acetic - H 2 O: 4 - 1 - 1 (Kumar S., 1986)
Hệ 2: Chloroform - Methanol - H 2 O: 60 - 30 - 6 (Kedik, S.A., S.V.Fedorov và cs., 2003)
Hệ 3: Chloroform - Methanol - H 2 O: 30 - 20 - 4 (Kohda H và cs., 1976)
Hệ 4: Acetone – Ethyl acetate – H2O: 5 – 4 – 1 (Tambe R và cs., 2010)
Hệ 5: Chloroform - Methanol - H2O: 15 - 8 - 1 (Nguyễn Văn Tài và cs., 2014)
Hiện hình bằng tia UV, bằng hơi Iod, bằng H 2 SO 4 10% trong ethanol
2.2.5 Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (FT- IR)
Phổ IR được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm của Đại học Khoa học Tự nhiên, địa chỉ 227 Nguyễn Văn Cừ, phường 4, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh.
