TỔNG QUAN
Tổng quan về amoxicilin và sulbactam
1.1.1 Đặc điểm của amoxicilin và sulbactam
Công thức cấu tạo, tính chất lý hóa và độ ổn định của amoxicilin (AM) và sulbactam (SB) được tổng hợp trong bảng 1.1:
Bảng 1.1 Đặc điểm của AM và SB
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của SB Tên khoa học
(2S,5R,6R)-6-{[(2R)-2-Amino-2-(4- hydroxyphenyl)acetyl]amino}-3,3- dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo
(2S,5R)-3,3-Dimethyl-7-oxo- 4-thia-1-azabicyclo[3.2.0] heptan-2-carboxylic acid 4,4- dioxid [28]
AM trihydrat là một loại bột tinh thể màu trắng, có tính chất khó tan trong nước và ethanol 96%, đồng thời cũng không tan trong dầu béo Tuy nhiên, nó có khả năng tan trong các dung dịch acid loãng hoặc hydroxyd kiềm loãng Dung dịch 0,2% AM trihydrat trong nước có pH dao động từ 3,5 đến 5,5.
AM natri là một bột màu trắng hoặc gần như trắng, có tính hút ẩm cao Chất này tan tốt trong nước, hơi tan trong ethanol khan và khó tan trong aceton.
Dung dịch 10 % trong nước có pH từ 8,0 – 10,0 [28]
SB natri là một hợp chất kết tinh dạng bột màu trắng hoặc gần trắng, dễ tan trong nước và dung dịch acid loãng, nhưng ít tan trong ethanol 96% Dung dịch 5% SB natri trong nước có pH dao động từ 4,5 đến 7,2 Độ ổn định của hợp chất này rất quan trọng trong các ứng dụng thực tiễn.
Độ ổn định của AM bị ảnh hưởng bởi pH và nhiệt độ môi trường Khi nhiệt độ tăng cao, AM có khả năng bị phân hủy, mức độ phân hủy phụ thuộc vào nhiệt độ và thời gian bảo quản Để đảm bảo tính ổn định, nhiệt độ bảo quản được khuyến cáo nên duy trì trong khoảng từ 2 đến 8ºC.
− AM ổn định trong dung dịch nước trong khoảng pH từ 4 – 7 [7] Vòng beta-lactam dễ bị thủy phân khi pH cách xa điểm đẳng điện (pH 4,8) [7]
− AM trihydrat trong dung dịch nước ổn định nhất trong khoảng pH từ 5,0 – 7,0 [10]
− SB ổn định về mặt hóa học hơn AM Độ ổn định phụ thuộc vào thời gian, pH và nhiệt độ bảo quản [26]
− SB natri ổn định trong dung dịch nước trong khoảng pH từ 3 – 7; ổn định nhất ở pH khoảng 5,08 [14]
1.1.2 Cơ chế tác dụng và chỉ định
AM là một loại kháng sinh bán tổng hợp thuộc nhóm aminopenicilin, có khả năng tác động rộng rãi lên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương Tác dụng diệt khuẩn của AM diễn ra khi thuốc gắn vào các protein gắn penicilin của vi khuẩn, làm gián đoạn quá trình tổng hợp peptidoglycan, một thành phần thiết yếu trong cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Kết quả là vi khuẩn tự phân hủy nhờ các enzym tự hủy trong thành tế bào như autolysin và murein hydrolase Tuy nhiên, vòng beta-lactam của AM có thể bị bất hoạt bởi enzym beta-lactamase, do đó, phổ tác dụng của AM thường không bao gồm các vi khuẩn sản sinh enzym này.
SB, hay acid sulfon penicilamic, có khả năng ức chế beta-lactamase một cách không thuận nghịch thông qua plasmid và nhiễm sắc thể, ngăn chặn enzym này tương tác với kháng sinh Tuy nhiên, khi được sử dụng một mình, SB chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn yếu.
Sự kết hợp giữa AM và SB mang lại hiệu quả hiệp đồng trong việc tiêu diệt vi khuẩn, bao gồm cả những vi khuẩn sản xuất và không sản xuất beta-lactamase Điều này đặc biệt hiệu quả đối với các cầu khuẩn Gram dương như Streptococcus pneumoniae và Streptococcus pyogenes.
Staphylococcus aureus…), cầu khuẩn Gram âm (Moraxella gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis…), trực khuẩn Gram âm (Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae…), vi khuẩn kỵ khí [2], [17]
Phối hợp giữa AM và SB được chỉ định trong các trường hợp nhiễm khuẩn do vi khuẩn nhạy cảm, bao gồm nhiễm khuẩn hô hấp, tai mũi họng, tiết niệu, da và mô mềm, cũng như trong điều trị và dự phòng nhiễm trùng phụ khoa và phẫu thuật.
1.1.3 Một số dạng bào chế kết hợp
Tại Việt Nam, sự kết hợp giữa AM và SB rất phổ biến, với nhiều dạng bào chế như viên nén, viên nang, cốm pha hỗn dịch uống, bột pha hỗn dịch uống và thuốc bột pha tiêm đang được lưu hành trên thị trường.
Thuốc bột pha tiêm Vimotram, được sản xuất bởi Công ty cổ phần dược phẩm VCP, hiện đang có mặt trên thị trường Mỗi lọ thuốc chứa công thức đặc biệt, đáp ứng nhu cầu điều trị của người bệnh.
Amoxicilin : 1000 mg Sulbactam : 500 mg Bảng 1.2 Một số dạng bào chế kết hợp AM và SB
500 mg) Zelfamox 875/125 DT Thuốc bột, cốm pha hỗn dịch
Zelfamox 250/125 Fortamox 375 mg Bactamox (625 mg, 375 mg)
Trifamox IBL 1500 Bactamox Plus (Injection 1,5 g)
Hình 1.3 Thuốc bột pha tiêm Vimotram
Tình hình nghiên cứu và sự cần thiết tiến hành nghiên cứu
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Tính đến nay, DĐVN V đã phát triển chuyên luận cho một số chế phẩm đa thành phần chứa kháng sinh như AM kết hợp với acid clavulanic, cloxacilin, ampicilin và SB, cũng như cefoperazon và SB, với phương pháp định lượng chủ yếu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa có chuyên luận nào cho thuốc bột pha tiêm chứa đồng thời AM và SB, và cũng chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố về việc định lượng đồng thời hai thành phần này trong chế phẩm bằng HPLC.
Bảng 1.3 Định lượng một số chế phẩm đa thành phần chứa kháng sinh bằng
Dạng bào chế Thành phần Điều kiện sắc ký
− Pha động: MeOH – dung dịch đệm phosphat 0,78 % pH 4,4 (5 : 95)
− Tốc độ dòng: 2,0 mL/phút
Thuốc bột pha hỗn dịch, viên nén
− Pha động: ACN – dung dịch đệm phosphat 0,02 M pH 5,0 (gradient nồng độ)
− Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút
Dạng bào chế Thành phần Điều kiện sắc ký
− Pha động: ACN – dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,005 M pH
− Tốc độ dòng: 2,0 mL/phút
− Pha động: ACN – dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,005 M pH 5,0 ± 0,1 (25 : 75)
− Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút
1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Hiện nay, một số nghiên cứu trên thế giới về định lượng đồng thời AM và
SB trong chế phẩm dạng phối hợp được công bố, chủ yếu sử dụng phương pháp HPLC (bảng 1.4)
Năm 2004, Qi M., Wang P và cộng sự đã phát triển phương pháp định lượng đồng thời AM natri và SB natri trong thuốc bột pha tiêm bằng HPLC, với thời gian lưu của AM và SB lần lượt là 8,1 phút và 5,5 phút Tuy nhiên, thời gian phân tích dài có thể ảnh hưởng đến độ ổn định của AM và SB khi sử dụng pha động là MeOH kết hợp với dung dịch đệm acetat 10 mM pH 4,0.
Năm 2012, Anusha N và cộng sự đã công bố quy trình định lượng đồng thời AM natri và SB natri trong thuốc tiêm Amoxirum forte bằng sắc ký lỏng phân bố pha đảo, với thời gian lưu của AM và SB lần lượt là 4,2 phút và 6,4 phút Tuy nhiên, việc sử dụng dung dịch đệm phosphat 100 mM và bước sóng định lượng cho AM và SB ở 230 nm chưa thực sự hợp lý Nghiên cứu cũng chưa đánh giá sự ổn định của các chất phân tích trong dung môi pha mẫu.
Năm 2015, Chandana P và cộng sự đã công bố phương pháp định lượng đồng thời AM natri và SB natri trong viên nén AMPHY IBL bằng kỹ thuật HPLC, với thời gian lưu của AM và SB lần lượt là 3,297 phút và 5,157 phút Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng bước sóng phát hiện 238 nm vẫn chưa thực sự hợp lý.
Bảng 1.4 Một số nghiên cứu định lượng đồng thời AM và SB bằng HPLC
Tài liệu Chuẩn bị mẫu Điều kiện sắc ký
[25] − Chuẩn bị mẫu trong pha động
− Nồng độ AM và SB trong mẫu thử tương ứng là 600 àg/mL và 150 àg/mL
− Pha động: MeOH – dung dịch đệm acetat 10 mM pH 4,0 (5 : 95)
− Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
[4] − Chuẩn bị mẫu trong pha động
− Nồng độ AM và SB trong mẫu thử tương ứng là 80 àg/mL và 40 àg/mL
− Pha động: ACN – dung dịch đệm phosphat 100 mM pH 5,0 (1 : 10)
− Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
[11] − Chuẩn bị mẫu trong pha động
− Nồng độ AM và SB trong mẫu thử tương ứng là 560 àg/mL và SB 240 àg/mL
− Pha động: ACN – dung dịch đệm phosphat 50 mM pH 4,6 (10 : 90)
− Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút
1.2.2 Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu
Thuốc bột pha tiêm Vimotram của Công ty cổ phần dược phẩm VCP đang được sử dụng phổ biến tại Việt Nam, với thành phần chính là sự kết hợp giữa AM và SB Để đảm bảo chất lượng của sản phẩm, việc xây dựng phương pháp định lượng đồng thời AM và SB là cần thiết, yêu cầu độ chính xác cao, thời gian phân tích ngắn và quy trình đơn giản, nhằm phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc thường quy.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC là phương pháp phân tích được ưa chuộng nhờ vào khả năng cung cấp kết quả nhanh chóng, độ chọn lọc cao, độ chính xác và độ nhạy tốt, đặc biệt trong việc xác định hàm lượng thuốc trong các kiểm nghiệm.
Khi các chất phân tích di chuyển qua cột chứa hạt pha tĩnh, chúng được rửa giải ở các thời điểm khác nhau nhờ dòng pha động bơm ở áp suất cao, dựa vào khả năng tương tác khác nhau với pha tĩnh và pha động.
Tùy vào bản chất của pha tĩnh, các cơ chế phân tách có thể là:
− Sắc ký hấp phụ: pha tĩnh là chất rắn có khả năng hấp phụ, phân tách các chất dựa trên cơ chế hấp phụ
− Sắc ký phân bố: pha tĩnh không trộn lẫn với pha động, phân tách dựa trên sự phân bố của các chất giữa pha động và pha tĩnh
Sắc ký trao đổi ion sử dụng nhựa trao đổi ion làm pha tĩnh, phân tách các ion dựa vào lực hút trái dấu giữa chúng và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh.
− Sắc ký loại cỡ: pha tĩnh là vật liệu có kích thước lỗ được kiểm soát chính xác, các chất được phân tách dựa vào kích thước phân tử
Dựa vào độ phân cực của hai pha, có thể chia thành 2 loại hình sắc ký: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo:
− Sắc ký pha thuận: sử dụng pha tĩnh phân cực (silica, alumina…) và pha động kém phân cực (hexan…) Trong quá trình sắc ký, các chất phân cực
10 được pha tĩnh lưu giữ lâu hơn trên cột do đó được rửa giải muộn hơn các chất kém phân cực
Sắc ký pha đảo là kỹ thuật sử dụng pha tĩnh không phân cực như hydrocarbon và pha động phân cực như nước hoặc MeOH Trong quá trình sắc ký, các hợp chất kém phân cực sẽ được giữ lại lâu hơn trên cột so với các hợp chất phân cực, dẫn đến việc chúng được rửa giải muộn hơn.
1.3.2 Cấu tạo hệ thống HPLC
Hình 1.4 Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC
2- Bơm 6- Phần mềm xử lý
3- Tiêm mẫu 7- Bình nước thải
Hệ thống HPLC bao gồm những bộ phận chính sau:
Bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký, hệ tiêm mẫu, cột sắc ký, detector, máy tính (ghi nhận và xử lý dữ liệu)
1.3.2.1 Hệ thống cấp pha động
Pha động được lưu trữ trong bình chứa thích hợp và được lọc qua màng 0,45 µm trước khi vào bộ phận bơm Tùy thuộc vào chế độ vận hành, quá trình rửa giải pha động có thể chia thành hai loại: đẳng dòng và gradient Trong phương pháp đẳng dòng, thành phần pha động giữ nguyên trong suốt quá trình rửa giải.
Gradient: tỉ lệ các thành phần trong pha động có thể thay đổi theo một chương trình đã định
Bộ phận bơm trong hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp pha động, tạo ra dòng chảy liên tục với áp suất và tốc độ phù hợp Bơm HPLC có khả năng tạo áp suất cao, đảm bảo quá trình phân tích diễn ra chính xác và hiệu quả.
11 cao (có thể lên tới 350 – 500 bar) và có thể cho lưu lượng dòng từ 0,1 đến 10 mL/phút [23]
Bộ phận tiêm mẫu đóng vai trò quan trọng trong việc tiêm mẫu phân tích vào dòng pha động trước khi vào cột trong hệ thống sắc ký hiện đại Thiết kế của bộ phận này cho phép thực hiện việc lấy mẫu và tiêm mẫu một cách tự động, nâng cao hiệu quả và độ chính xác trong quá trình phân tích.
Cột sắc ký là thiết bị chứa hạt pha tĩnh với kích thước, hình dáng và đặc tính bề mặt phù hợp, nơi diễn ra quá trình tách các chất khi pha động, pha tĩnh và chất phân tích tiếp xúc Một số hệ thống sắc ký lỏng hiện đại được trang bị bộ phận điều nhiệt cột, với kích thước cột sắc ký thường gặp có đường kính trong từ 4,5 đến 5 mm và chiều dài từ 100 đến 250 mm.
Sau khi các chất phân tích được tách ra khỏi cột sắc ký, chúng có thể được phát hiện bằng các loại detector như UV-VIS và detector khối phổ Trong số đó, detector UV-VIS thường được ưa chuộng để phân tích các hợp chất hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS Detector phổ biến hiện nay là detector mảng diod (DAD), cho phép định lượng đồng thời tại nhiều bước sóng, từ đó lựa chọn bước sóng tối ưu cho chất phân tích.
1.3.3 Một số thông số đặc trưng của quá trình rửa giải
Hiệu năng của cột, hay hiệu lực biểu kiến, được thể hiện qua số đĩa lý thuyết (N) của cột Số đĩa lý thuyết này phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất liệu, loại cột, nhiệt độ, pha động và thời gian lưu Công thức tính số đĩa lý thuyết của cột được trình bày dưới đây [1].
Trong đó: tR: là thời gian lưu của pic tương ứng với chất phân tích
Wh: là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Theo hướng dẫn của CDER (trung tâm đánh giá và nghiên cứu thuốc, Hoa Kỳ), số đĩa lý thuyết > 2000 là phù hợp [9], [27]
Hệ số đối xứng (hay còn gọi là hệ số kéo đuôi, T) của một pic được tính theo công thức sau [1]:
Chiều rộng pic, ký hiệu W0,05, được đo ở 1/20 chiều cao pic Khoảng cách d là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của pic, cũng được tính ở 1/20 chiều cao pic.
Khi AS = 1,0 thì pic hoàn toàn đối xứng Khi AS > 1,0 thì pic bị kéo đuôi Khi AS < 1,0 thì pic bị doãng về phía trước
Theo hướng dẫn của CDER, T ≤ 2 là phù hợp [9], [27]
1.3.3.3 Độ phân giải (R S ) Độ phân giải (RS) giữa hai pic của hai chất được tính theo công thức sau [1]:
Trong đó: tR2 > tR1 tR1, tR2: là thời gian lưu của các pic tương ứng
Wh1, Wh2: là chiều rộng pic ở nửa chiều cao pic
RS là thước đo mức độ phân tách hai pic liền kề Theo hướng dẫn của CDER, RS > 2 là phù hợp [9], [27]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là AM và SB trong thuốc bột pha tiêm Vimotram do Công ty cổ phần dược phẩm VCP sản xuất, số lô 030918
Amoxicilin natri (1000 mg tính theo nguyên trạng)
Sulbactam natri (500 mg tính theo nguyên trạng)
− Amoxicilin trihydrat: chuẩn DĐVN (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương), hàm lượng 86,39 % C16H19N3O5S tính theo nguyên trạng, số kiểm soát: 1117017.04
− Sulbactam: chuẩn đối chiếu thứ cấp (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương), hàm lượng 99,38 % C8H11NO5S tính theo nguyên trạng, số kiểm soát: 0118348.01
− Hệ thống HPLC: Agilent Technologies 1200 Series, Mỹ
− Cột sắc ký: VertiSep GES C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 m) (Vertical – Thái
− Cân phân tích: A&D, Model GR-200, Nhật Bản
− Máy siêu âm: Ultrasonic LC 60H, Đức
− Máy đo pH: Eutech, Singapore
− Phễu lọc Buchner, màng lọc cellulose acetat 0,45 àm
− Màng lọc: Cellulose acetat 0,45 m, Mỹ
− Các dụng cụ khác: bình định mức; pipet chính xác; cốc có mỏ; vial…
Nội dung nghiên cứu
Phương pháp định lượng đồng thời AM và SB trong hỗn hợp hai thành phần bằng HPLC được xây dựng thông qua việc xác định các điều kiện sắc ký quan trọng Các yếu tố cần chú ý bao gồm cột sắc ký, thành phần và tỉ lệ pha động, tốc độ dòng, pH và nồng độ dung dịch đệm, thể tích tiêm mẫu, cũng như bước sóng phát hiện.
Thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn ICH bao gồm các tiêu chí quan trọng như độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian Đồng thời, việc đánh giá độ ổn định của các dung dịch chuẩn gốc AM và SB cũng được thực hiện Cuối cùng, hàm lượng AM và SB trong thuốc bột pha tiêm Vimotram sẽ được xác định thông qua phương pháp đã được xây dựng.
Phương pháp nghiên cứu
Dung dịch chuẩn gốc AM có nồng độ khoảng 500 µg/mL được tạo ra bằng cách hòa tan 0,0289 g chất chuẩn AM trihydrat vào bình định mức 50 mL, sau đó thêm nước cất hai lần cho đến khi đạt thể tích yêu cầu.
Dung dịch chuẩn gốc SB có nồng độ khoảng 500 µg/mL, được tạo ra bằng cách hòa tan 0,0252 g chất chuẩn SB vào bình định mức 50 mL, sau đó bổ sung nước cất hai lần đến vạch định mức.
Các dung dịch chuẩn AM, SB và hỗn hợp AM-SB được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc bằng nước cất hai lần Trước khi tiến hành tiêm sắc ký, dung dịch cần được lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Trộn đều bột thuốc từ 5 lọ, sau đó cân chính xác 50 mg AM và 25 mg SB Tiến hành hòa tan và định mức lượng bột vừa đủ vào bình định mức.
50 mL bằng nước cất hai lần Pha loãng 10 lần bằng nước cất hai lần và lọc qua màng lọc 0,45 àm trước khi tiờm sắc ký
2.3.2 Xác định điều kiện sắc ký
Dựa trên các tính chất lý hóa của AM và SB, cùng với những nghiên cứu đã được công bố, nghiên cứu này khảo sát điều kiện sắc ký trên hệ thống Agilent Technologies 1200 Series với detector DAD Cột sắc ký được sử dụng là VertiSep GES C18 với kích thước 250 mm x 4,6 mm và kích thước hạt 5 µm, trong đó thể tích tiêm được xác định để tối ưu hóa quy trình phân tích.
Khảo sát và lựa chọn các thông số quan trọng như bước sóng phát hiện, thành phần pha động, tỉ lệ pha động, pH và nồng độ dung dịch đệm, cùng với tốc độ dòng, nhằm định lượng đồng thời AM và SB trong thuốc bột pha tiêm Vimotram.
Tiến hành thẩm định phương pháp đã xây dựng theo hướng dẫn của ICH
2.3.3.1 Độ phù hợp hệ thống
Cách tiến hành: tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ
AM 100 àg/mL và SB 50 àg/mL (nồng độ 100 %) Ghi lại đỏp ứng của AM và
SB (thời gian lưu; diện tích pic, số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng và độ phân giải)
− RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu ≤ 2 %
Để tiến hành phân tích, trước tiên cần phân tích lần lượt các dung dịch: mẫu trắng (nước cất hai lần), mẫu chuẩn AM, mẫu chuẩn SB, mẫu chuẩn hỗn hợp AM và SB, cùng với mẫu thử Các phương pháp đã được xây dựng sẽ được áp dụng để ghi lại sắc ký đồ.
− Trên sắc ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic của
AM và SB trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn
− Các pic AM và SB có độ tinh khiết cao và phân tách hoàn toàn khỏi nhau
− Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu của AM và SB
Cách tiến hành: từ các dung dịch chuẩn gốc của AM và SB, chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (6 điểm) có nồng độ tương ứng bằng 60 %, 80 %, 100
%, 120 %, 140 % và 160 % so với mức hàm lượng ghi trên nhãn
Tiến hành phân tích trong cùng điều kiện theo phương pháp đã xây dựng
Lập phương trình hồi quy biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ của
AM và SB Tính phần trăm hệ số chặn (tại nồng độ 100 %) Y (%) theo công thức:
− Hệ số tương quan hồi quy (R) nằm trong giới hạn R ≥ 0,995
− Phần trăm hệ số chặn Y ≤ 2,0 % [19], [21]
Để tiến hành thí nghiệm, cần chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp của AM và SB với nồng độ 80 %, 100 % và 120 % so với hàm lượng ghi trên nhãn Mỗi nồng độ sẽ được thực hiện với 3 mẫu độc lập Sau đó, tính toán tỷ lệ phần trăm lượng AM và SB tìm lại so với lượng chuẩn đã thêm vào.
Yêu cầu: phần trăm tìm lại đạt 98,0 – 102,0 % và RSD (%) ≤ 2 % [5], [20]
2.3.3.5 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian
Cách tiến hành: tiến hành phân tích 6 mẫu thử độc lập trong cùng ngày
Ghi lại diện tích pic, tính RSD (%) của hàm lượng AM và SB so với nhãn
− Độ chính xác trung gian
Tiến hành phân tích tương tự độ lặp lại trong 3 ngày khác nhau Ghi lại diện tích pic, tính RSD (%) của hàm lượng AM và SB so với nhãn
Yêu cầu: RSD (cùng ngày) ≤ 2 %, RSD (khác ngày) ≤ 3 % [21]
2.3.4 Đánh giá độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc AM và chuẩn gốc SB
Chuẩn bị hai dung dịch chuẩn gốc AM 500 àg/mL và SB 500 àg/mL, mỗi dung dịch bao gồm ba mẫu độc lập Tiến hành phân tích theo phương pháp đã thiết lập tại thời điểm 0 giờ và 3 giờ sau khi bảo quản ở nhiệt độ phòng, đồng thời ghi lại diện tích pic của AM và SB.
Yêu cầu: diện tích pic thay đổi không quá 2 % và RSD (%) ≤ 2 %
2.3.5 Xác định hàm lượng AM và SB trong thuốc bột pha tiêm Vimotram
Tiến hành phân tích mẫu thử để xác định hàm lượng AM và SB trong chế phẩm theo các phương pháp đã được xây dựng và thẩm định Nồng độ AM và SB được tính toán dựa trên phương trình hồi quy thể hiện mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ, được thiết lập trong cùng một ngày.
Kết quả định lượng AM và SB được xử lý thống kê toán học (giá trị trung bình, độ lệch chuẩn tương đối…) sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2016
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký
3.1.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện
Quét phổ hấp thụ tử ngoại của AM và SB, kết quả được trình bày trong hình
Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại của AM
Dựa trên dữ liệu phổ hấp thụ tử ngoại của AM và SB, cả hai đều có khả năng hấp thụ UV trong khoảng bước sóng từ 210 đến 260 nm, trong đó AM hấp thụ UV không đáng kể và SB hầu như không hấp thụ ở bước sóng trên 260 nm Qua khảo sát các bước sóng từ 210 đến 260 nm, kết quả cho thấy tại bước sóng 215 nm, AM và SB có đáp ứng tốt với nhiễu nền thấp Vì vậy, bước sóng 215 nm được lựa chọn để ghi sắc ký đồ.
3.1.2 Lựa chọn điều kiện pha động
3.1.2.1 Khảo sát sơ bộ và lựa chọn thành phần pha động
Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát sơ bộ và đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện pha động đến quá trình sắc ký, dựa trên các tài liệu đã công bố về khoảng pH ổn định của AM và SB Các yếu tố được xem xét bao gồm thành phần pha động, bao gồm dung dịch đệm (acetat, phosphat) và dung môi (MeOH, ACN), pH dung dịch đệm trong khoảng từ 4,0 đến 5,0, cùng với tỉ lệ thành phần dung môi từ 5% đến 10%.
Tiến hành sắc ký trờn cột VertiSep GES C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 àm), thể tớch tiờm 20 àL, nồng độ dung dịch đệm 25 mM, detector ở 215 nm
Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.1:
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sơ bộ điều kiện pha động
STT Pha động pH Tỉ lệ đệm/DM
STT Pha động pH Tỉ lệ đệm/DM
Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp AM và SB khi khảo sát sơ bộ với các hệ pha động khác nhau Nhận xét:
Khảo sát sơ bộ cho thấy rằng thành phần pha động có thể ảnh hưởng đến hình dáng pic và độ phân giải của các mẫu AM và SB Bên cạnh đó, dung môi pha động cũng có tác động đến thời gian lưu và thứ tự rửa giải của các chất phân tích.
ACN cho thấy khả năng rửa giải vượt trội hơn MeOH với cùng tỉ lệ dung môi, giúp giảm thời gian phân tích và lượng dung môi sử dụng nhờ vào thời gian lưu ngắn hơn của các chất phân tích Ngoài ra, khi sử dụng dung dịch đệm phosphat làm pha động, ACN còn mang lại hiệu quả phân tách AM và SB tốt hơn với chỉ số RS cao hơn so với MeOH.
Tuy nhiên, với pha động gồm dung dịch đệm acetat và ACN, pic AM và
SB có thể bị chẻ, có vai hoặc chưa được phân tách hoàn toàn Việc sử dụng pha động là dung dịch đệm acetat và MeOH giúp cải thiện hình dáng pic và nâng cao hiệu quả phân tách AM và SB.
Khi thay đổi dung môi, thứ tự rửa giải các chất sẽ khác nhau Cụ thể, với dung môi ACN, AM được rửa giải trước SB, trong khi nếu sử dụng MeOH, thứ tự này sẽ thay đổi.
SB sẽ được rửa giải ra trước
Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy rằng các thông số pH của dung dịch đệm và tỷ lệ dung môi pha động ảnh hưởng đáng kể đến thời gian lưu, hình dáng pic và độ phân giải của AM và SB.
Kết luận: qua khảo sát, nghiên cứu lựa chọn hai hệ pha động cho phép định lượng đồng thời AM và SB gồm:
− Hệ pha động A: dung dịch đệm phosphat – ACN
− Hệ pha động B: dung dịch đệm acetat – MeOH
3.1.2.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện pha động
− Hệ pha động A: dung dịch đệm phosphat – ACN
Khảo sát pH của dung dịch đệm phosphat từ 4,0 đến 5,3 cho thấy tại pH 4,0, các pic AM và SB chưa cân xứng và bị giãn rộng Tuy nhiên, trong khoảng pH từ 4,3 đến 5,3, các pic được phân tách rõ ràng, đặc biệt tại pH 5,0, sự phân tách này càng rõ nét hơn.
AM và SB được phân tách hiệu quả, với hình dáng pic cân xứng và duy trì sự ổn định của các chất Vì vậy, nghiên cứu đã chọn pH 5,0 cho các khảo sát tiếp theo.
Khảo sát nồng độ dung dịch đệm phosphat từ 10 mM đến 50 mM cho thấy rằng việc tăng nồng độ đệm không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả phân tách và hình dáng pic AM và SB Do đó, nồng độ đệm được lựa chọn là 10 mM để đảm bảo sự ổn định của hệ thống.
Khảo sát tỷ lệ ACN trong pha động từ 2% đến 10% cho thấy tại 2% ACN, thời gian phân tích kéo dài trên 20 phút Khi tỷ lệ ACN tăng, các hợp chất AM và SB được rửa giải nhanh hơn, dẫn đến thời gian lưu ngắn hơn và thời gian phân tích mẫu giảm Tuy nhiên, khi tỷ lệ ACN đạt 9%, pic AM vẫn chưa tách khỏi pic dung môi.
Sử dụng dung dịch đệm phosphat 10 mM pH 5,0 kết hợp với ACN theo tỉ lệ 92:8 mang lại hiệu quả tối ưu cho quá trình phân tích Các pic được phân tách hoàn toàn, thời gian phân tích ngắn, và các pic AM và SB thể hiện hình dạng nhọn, cân xứng với T từ 0,7 đến 0,8.
Khảo sát tốc độ dòng từ 1,0 đến 2,0 mL/phút cho thấy rằng khi tăng tốc độ dòng, thời gian lưu của AM và SB giảm, nhưng độ phân giải của hai pic cũng giảm và áp suất cột tăng Tại tốc độ dòng 1,5 mL/phút, các pic AM và SB được phân tách tốt với độ phân giải RS > 2, thời gian phân tích ngắn dưới 7 phút và áp suất qua cột ổn định khoảng 100 bar.
Sau khi khảo sát, điều kiện sắc ký tối ưu cho hệ pha động A được xác định là dung dịch đệm phosphat 10 mM pH 5,0 kết hợp với ACN theo tỉ lệ 92:8 và tốc độ dòng 1,5 mL/phút Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp AM với nồng độ 100 µg/mL và SB với nồng độ 50 µg/mL được trình bày trong hình 3.4.
Hỡnh 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp AM 100 àg/mL và SB 50 àg/mL – hệ pha động A
− Hệ pha động B: dung dịch đệm acetat – MeOH
Khảo sát pH của dung dịch đệm acetat cho thấy rằng ở pH 5,2, pic AM bị chẻ, trong khi ở pH từ 4,0 đến 5,0, các pic AM và SB được phân tách hoàn toàn với hình dạng cân xứng Đặc biệt, pH 5,0 mang lại hiệu quả phân tách tối ưu và thời gian phân tích ngắn nhất Do đó, pH 5,0 được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo.
Thẩm định phương pháp
3.2.1 Độ phù hợp hệ thống
Kết quả độ phù hợp hệ thống của hai phương pháp (tương ứng với hai hệ pha động A và B) được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2 Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống của hai hệ pha động A và B
STT Hệ pha động A Hệ pha động B
AM SB AM SB t R phút
Kết luận cho thấy rằng cả hai phương pháp đã xây dựng đều cho thấy hệ thống HPLC hoạt động ổn định, với các thông số quan trọng như số đĩa lý thuyết N, hệ số đối xứng T và độ phân giải đạt yêu cầu.
RS) đều đáp ứng yêu cầu cho định lượng đồng thời AM và SB
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu trắng, chuẩn AM, chuẩn SB, chuẩn hỗn hợp và mẫu thử bằng hai phương pháp đã được xây dựng Kết quả thẩm định độ chọn lọc của hai phương pháp được trình bày rõ ràng trong hình 3.6 và hình 3.7.
Hình 3.6 Sắc ký đồ các mẫu thẩm định độ chọn lọc – hệ pha động A
Hình 3.7 Sắc ký đồ các mẫu thẩm định độ chọn lọc – hệ pha động B
Kết quả thẩm định độ chọn lọc cho thấy rằng, trong sắc ký đồ mẫu trắng không có đỉnh nào nằm trong khoảng thời gian lưu của AM và SB Đối với mẫu chuẩn AM, không có đỉnh nào xuất hiện trong khoảng thời gian lưu của SB, với thời gian lưu của AM là 3,086 phút (hệ pha động A) và 8,155 phút (hệ pha động B).
Trong nghiên cứu này, mẫu chuẩn SB không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu của AM, với thời gian lưu của SB lần lượt là 3,928 phút (hệ pha động A) và 6,747 phút (hệ pha động B) Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp AM và SB cho thấy pic AM ở 3,085 phút (hệ pha động A) và 8,146 phút (hệ pha động B), cùng với pic SB ở 3,924 phút (hệ pha động A) và 6,740 phút (hệ pha động B), với độ phân tách hoàn toàn (RS > 2) Đối với mẫu thử, pic AM xuất hiện ở 3,076 phút (hệ pha động A) và 8,168 phút (hệ pha động B), trong khi pic SB xuất hiện ở 3,905 phút (hệ pha động A) và 6,765 phút (hệ pha động B), cũng với độ phân tách hoàn toàn (RS > 2) Các pic AM và SB đạt độ tinh khiết cao trên 99,9%, và hệ số chồng phổ hấp thụ UV của chúng với phổ mẫu chuẩn tương ứng xấp xỉ 1.
Kết luận: hai phương pháp đã xây dựng đáp ứng tiêu chuẩn về độ chọn lọc cho phép định lượng đồng thời AM và SB
Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn hỗn hợp AM và SB với nồng độ AM từ 60 àg/mL đến 160 àg/mL và nồng độ SB từ 30 àg/mL đến 80 àg/mL Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính của hai phương pháp được trình bày trong bảng 3.3 và 3.4, trong đó bảng 3.3 thể hiện kết quả thẩm định khoảng tuyến tính cho hệ pha động A.
27 a AM b SB Đồ thị 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của AM và SB − hệ pha động A
Bảng 3.4 Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính – hệ pha động B
Đồ thị 3.2 minh họa mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của AM và SB trong hệ pha động B Kết quả khảo sát cho thấy, trong khoảng nồng độ tuyến tính đã xây dựng, phương trình hồi quy của AM và SB đạt hệ số tương quan R ≥ 0,995 và phần trăm hệ số chặn Y ≤ 2,0 %.
Kết luận: khoảng nồng độ tuyến tớnh của AM (từ 60 àg/mL đến 160 àg/mL) và
SB (từ 30 àg/mL đến 80 àg/mL) đỏp ứng yờu cầu cho phộp định lượng đồng thời
Kết quả thẩm định độ đúng của hai phương pháp được trình bày trong bảng 3.5 và bảng 3.6:
Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ đúng – hệ pha động A
Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng – hệ pha động B
Kết quả thẩm định độ đúng cho thấy, cả hai phương pháp AM và SB đạt được phần trăm tìm lại cao ở ba mức nồng độ 80%, 100% và 120%.
%) đều đạt trong giới hạn từ 98,0 – 102,0 % (từ 98,4 – 101,9 % với hệ pha động
A, từ 98,4 − 101,3 % với hệ pha động B) và RSD ≤ 2 %
Kết luận: hai phương pháp đã xây dựng đáp ứng yêu cầu độ đúng cho phép định lượng đồng thời AM và SB
3.2.5 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian
Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ chính xác trung gian của hai phương pháp được trình bày ở bảng 3.7 và bảng 3.8:
Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ lặp lại, độ chính xác trung gian – hệ pha động A
Hàm lượng % so với nhãn Hàm lượng % so với nhãn
Bảng 3.8 Kết quả thẩm định độ lặp lại, độ chính xác trung gian – hệ pha động B
Hàm lượng % so với nhãn Hàm lượng % so với nhãn
Cả hai phương pháp phân tích đều cho thấy giá trị RSD hàm lượng của AM và SB so với nhãn đạt ≤ 2% trong cùng một ngày Trong ba ngày phân tích khác nhau, RSD hàm lượng của AM và SB so với nhãn vẫn duy trì ở mức ≤ 3%.
Kết luận: Các phương pháp xây dựng có độ lặp lại và độ chính xác trung bình đáp ứng yêu cầu cho phép định lượng đồng thời AM và SB một cách hiệu quả.
3.3 Đánh giá độ ổn định của các dung dịch chuẩn gốc AM và chuẩn gốc SB
Nghiên cứu tiến hành đánh giá độ ổn định của các dung dịch chuẩn gốc AM
500 àg/mL và chuẩn gốc SB 500 àg/mL trong thời gian 3 h bảo quản ở nhiệt độ phòng Kết quả đánh giá độ ổn định được trình bày trong bảng 3.9:
Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc AM, chuẩn gốc
Nhận xét: Từ kết quả đánh giá độ ổn định cho thấy: nồng độ dung dịch chuẩn gốc
Sau 3 giờ bảo quản ở nhiệt độ phòng, nồng độ dung dịch mới pha cho thấy sự chênh lệch từ 0,3% đến 0,7% với RSD là 0,2%, cả hai đều nhỏ hơn 2,0% Đối với nồng độ dung dịch chuẩn gốc SB, sự chênh lệch nằm trong khoảng từ 0,7% đến 1,6% và RSD đạt 0,4%, cũng nhỏ hơn 2,0%.
Kết luận: dung dịch chuẩn gốc AM và chuẩn gốc SB ổn định trong vòng 3 h bảo quản ở nhiệt độ phòng
3.4 Định lượng thuốc bột pha tiêm Vimotram
Hai phương pháp đã được áp dụng để định lượng AM và SB trong mẫu thuốc bột pha tiêm Vimotram, với khối lượng trung bình của bột thuốc trong mỗi lọ là 1720,3 mg (số lô 030918) Kết quả định lượng chi tiết được trình bày trong bảng 3.10 và bảng 3.11.
Bảng 3.10 Kết quả định lượng thuốc bột pha tiêm Vimotram – hệ pha động A
Hàm lượng so với nhãn (%)
Hàm lượng so với nhãn (%)
Bảng 3.11 Kết quả định lượng thuốc bột pha tiêm Vimotram – hệ pha động B
Hàm lượng so với nhãn (%)
Hàm lượng so với nhãn (%)
Hàm lượng AM trong thuốc bột pha tiêm đạt trong khoảng 102,0 – 103,0
Hàm lượng so với nhãn của các hệ pha động A và B lần lượt đạt từ 101,9 đến 102,8% và từ 99,8 đến 101,0% Đặc biệt, hàm lượng của SB so với nhãn đạt từ 100,0 đến 100,7% với hệ pha động A.
So sánh hai phương pháp:
− So sánh độ lặp lại của hai phương pháp (chuẩn F) cho thấy:
Như vậy, độ lặp lại của 2 phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê, độ tin cậy 95 %
− So sánh độ đúng của hai phương pháp (chuẩn t):
Như vậy, với độ tin cậy 95 %, độ đúng của 2 phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê
Kết luận: Kết quả định lượng của 2 phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê, khoảng tin cậy 95 %
3.5.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện
Dựa trên phổ hấp thụ UV, SB cho thấy khả năng hấp thụ UV giảm dần từ 210 nm đến 260 nm, trong khi AM có khả năng hấp thụ tốt hơn trong cùng khoảng bước sóng Điều này liên quan đến cấu trúc phân tử của SB, với các nhóm mang màu như sulfonyl, carbonyl và carboxyl, trong khi AM có nhiều nhóm mang màu và nhóm trợ màu hơn, bao gồm vòng thơm, carbonyl, carboxyl, cũng như các nhóm amino và hydroxyl, dẫn đến khả năng hấp thụ UV vượt trội hơn.
Nghiên cứu đã chọn bước sóng 215 nm để định lượng AM và SB, vì tại bước sóng này, cả hai chất đều có khả năng hấp thụ UV tốt, mang lại đáp ứng tối ưu Hơn nữa, nhiễu nền ở bước sóng này là không đáng kể, do các dung môi như nước, MeOH và ACN hầu như không hấp thụ trong khoảng bước sóng này.
So với nghiên cứu [25], bước sóng 210 nm không phù hợp vì MeOH hấp thụ mạnh tại bước sóng này Bước sóng 230 nm (nghiên cứu [4]) và 238 nm (nghiên cứu [11]) cũng gặp hạn chế do SB hấp thụ kém, điều này có thể ảnh hưởng đến độ nhạy và đáp ứng của phương pháp.
Định lượng thuốc bột pha tiêm Vimotram
Hai phương pháp đã được áp dụng để định lượng AM và SB trong mẫu thuốc bột pha tiêm Vimotram, với khối lượng trung bình của bột thuốc trong mỗi lọ là 1720,3 mg (số lô 030918) Kết quả định lượng được thể hiện trong bảng 3.10 và bảng 3.11.
Bảng 3.10 Kết quả định lượng thuốc bột pha tiêm Vimotram – hệ pha động A
Hàm lượng so với nhãn (%)
Hàm lượng so với nhãn (%)
Bảng 3.11 Kết quả định lượng thuốc bột pha tiêm Vimotram – hệ pha động B
Hàm lượng so với nhãn (%)
Hàm lượng so với nhãn (%)
Hàm lượng AM trong thuốc bột pha tiêm đạt trong khoảng 102,0 – 103,0
Hàm lượng sản phẩm so với nhãn đạt từ 101,9% đến 102,8% với hệ pha động A, trong khi hệ pha động B cho kết quả từ 100,0% đến 100,7% Đối với SB, hàm lượng so với nhãn dao động từ 99,8% đến 101,0% với hệ pha động B.
So sánh hai phương pháp:
− So sánh độ lặp lại của hai phương pháp (chuẩn F) cho thấy:
Như vậy, độ lặp lại của 2 phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê, độ tin cậy 95 %
− So sánh độ đúng của hai phương pháp (chuẩn t):
Như vậy, với độ tin cậy 95 %, độ đúng của 2 phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê
Kết luận: Kết quả định lượng của 2 phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê, khoảng tin cậy 95 %
Bàn luận
3.5.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện
Dựa trên phổ hấp thụ UV, SB cho thấy khả năng hấp thụ UV giảm dần từ 210 nm đến 260 nm, trong khi AM có khả năng hấp thụ tốt hơn trong khoảng sóng này Điều này liên quan đến cấu trúc phân tử của SB với các nhóm màu hạn chế như sulfonyl, carbonyl, carboxyl và hai nhóm trợ màu methyl, trong khi AM có nhiều nhóm màu hơn như vòng thơm, carbonyl, carboxyl, cùng với các nhóm trợ màu như amino và hydroxyl, dẫn đến khả năng hấp thụ UV vượt trội hơn.
Nghiên cứu đã xác định bước sóng 215 nm để định lượng AM và SB, vì tại bước sóng này, AM và SB có khả năng hấp thụ UV tốt, mang lại đáp ứng tối ưu, đồng thời nhiễu nền từ các dung môi như nước, MeOH và ACN là không đáng kể.
So với nghiên cứu [25], bước sóng 210 nm cho detector không phù hợp vì MeOH hấp thụ mạnh ở bước sóng này Việc chọn bước sóng 230 nm (nghiên cứu [4]) và 238 nm (nghiên cứu [11]) cũng có hạn chế, do SB hấp thụ kém ở những bước sóng này, có thể ảnh hưởng đến độ nhạy và đáp ứng của phương pháp.
Chọn bước sóng 215 nm để định lượng đồng thời AM và SB giúp hạn chế ảnh hưởng của dung môi đến độ hấp thụ của chúng Độ hấp thụ tốt của cả AM và SB tại bước sóng này cũng góp phần giảm thiểu sai số trong quá trình định lượng.
3.5.2 Lựa chọn điều kiện pha động
3.5.2.1 Khảo sát sơ bộ và lựa chọn thành phần pha động
Khảo sát sơ bộ cho thấy rằng thành phần pha động có thể tác động đến hình dáng pic và độ phân giải Bên cạnh đó, dung môi pha động cũng ảnh hưởng đến thời gian lưu và thứ tự rửa giải của AM và SB.
Sử dụng MeOH thay vì ACN với cùng hệ đệm và tỉ lệ dung môi sẽ dẫn đến thời gian lưu dài hơn cho AM và SB Nguyên nhân của hiện tượng này cần được nghiên cứu thêm để hiểu rõ hơn.
MeOH có độ phân cực cao hơn ACN, dẫn đến việc các chất phân tích bị giữ lâu hơn trong sắc ký lỏng pha đảo, làm tăng thời gian lưu MeOH là dung môi phân cực proton, có khả năng tạo liên kết hydro nội phân tử, trong khi ACN là dung môi phân cực không proton, không tạo được liên kết này, khiến các chất phân tích rửa giải nhanh hơn Khi sử dụng MeOH, độ chọn lọc sắc ký thay đổi so với ACN, với SB được rửa giải trước Sự khác biệt trong tính chất của ACN và MeOH làm thay đổi thứ tự rửa giải của AM và SB ACN không có nhóm -OH alcol mà thay bằng nhóm -CN, dẫn đến độ phân cực kém hơn và không có khả năng tạo liên kết hydro Tại pH từ 4 đến 5, AM tồn tại dưới dạng -NH3 +, có khả năng tạo liên kết với cặp electron tự do của ACN Mặc dù MeOH cũng có cặp electron tự do, nhưng liên kết nội hydro làm giảm khả năng tương tác với các chất phân tích acid Thêm vào đó, ACN có liên kết ᴫ trong phân tử, cho phép tương tác với các hệ thống ᴫ, điều mà MeOH không có.
Trong nghiên cứu sắc ký pha đảo, pH của dung dịch đệm và tỉ lệ pha động có ảnh hưởng lớn đến độ phân cực, từ đó tác động đến thời gian lưu, hình dáng pic và độ phân giải của các chất phân tích Cụ thể, AM có các giá trị pKa1 = 2,4 (carboxyl), pKa2 = 7,4 (amin) và pKa3 = 9,6 (phenol), trong khi SB có pKa = 2,5 Do đó, pH dung dịch đệm ảnh hưởng đến trạng thái tồn tại của AM và SB (dưới dạng phân tử hoặc ion hóa), dẫn đến sự thay đổi trong các thông số như thời gian lưu, hình dáng pic và độ phân giải khi pH được điều chỉnh.
3.5.2.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện pha động:
Nghiên cứu khảo sát các yếu tố như pH dung dịch đệm, nồng độ dung dịch đệm, tỉ lệ pha động và tốc độ dòng, trong đó pH và nồng độ đệm có ảnh hưởng đáng kể đến thời gian lưu và sự ổn định của hệ thống sắc ký Nồng độ đệm cao có thể dẫn đến tích tụ muối, gây ra sự không ổn định của đường nền và thậm chí kết tủa muối trong hệ thống Do đó, nồng độ đệm được khảo sát trong khoảng từ 10 mM đến 50 mM (dưới 100 mM) để đảm bảo sự ổn định của hệ thống Cụ thể, trong hệ A, nồng độ đệm phosphat được chọn là 10 mM, trong khi hệ B sử dụng nồng độ đệm acetat.
25 mM cho kết quả phân tích tối ưu Khi so sánh với nghiên cứu [4] lựa chọn nồng độ đệm phosphat cao (100 mM) là chưa thực sự hợp lý
Khi tăng tỉ lệ dung môi pha động trong sắc ký lỏng pha đảo, độ phân cực của pha động sẽ giảm, dẫn đến việc các chất phân tích được rửa giải sớm hơn.
Khi tăng tốc độ dòng chảy, các chất phân tích sẽ di chuyển nhanh hơn, dẫn đến thời gian lưu giảm Tuy nhiên, áp suất cao qua cột có thể ảnh hưởng đến độ ổn định của hệ thống.
Khảo sát thành phần pha động có ảnh hưởng lớn đến phân tích sắc ký Nghiên cứu đã lựa chọn hai hệ pha động hiệu quả để định lượng đồng thời.
Hệ pha động A bao gồm dung dịch đệm phosphat 10 mM pH 5,0 kết hợp với ACN theo tỉ lệ 92:8 và tốc độ dòng 1,5 mL/phút, trong khi hệ pha động B sử dụng dung dịch đệm acetat 25 mM pH 5,0 với MeOH theo tỉ lệ 90:10 và tốc độ dòng 1,0 mL/phút Mỗi hệ dung môi này mang lại những ưu điểm riêng biệt, phù hợp với các ứng dụng khác nhau trong phân tích.
Hệ dung dịch đệm phosphat – ACN cho phép thời gian phân tích ngắn hơn, giúp phân tích nhiều mẫu hiệu quả Điều này rất thuận lợi trong quy trình sản xuất liên tục, nơi cần có kết quả nhanh chóng và khả năng thử nghiệm trên nhiều mẫu.
− Hệ dung dịch đệm acetat – MeOH: dung môi MeOH có giá thành rẻ hơn ACN giúp tiết kiệm chi phí
− Cả 2 pha động đều gồm những thành phần được dùng phổ biến và an toàn trong phân tích như đệm phosphat, đệm acetat, ACN, MeOH Thời gian
Phân tích nhanh cho thấy AM và SB đã tách biệt (RS > 2), giúp tiết kiệm thời gian Việc sử dụng tỉ lệ dung môi ACN và MeOH thấp không chỉ giảm chi phí mà còn hạn chế tác động đến môi trường.
3.5.3 Đánh giá độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc AM và chuẩn gốc SB
