TỔNG QUAN
Tổng quan về progesteron
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của progesteron
- Khối lượng phân tử: 314,5 g/mol
- Danh pháp: Pregn-4-en-3,20-dion [3]
1.1.2 Tính chất lý hóa a) Tính chất vật lý:
- Dạng bột kết tinh màu trắng
- Độ tan: tan rất ít trong nước (7,00 – 8,81 mg/l), dễ tan trong alcol, aceton, dioxan và dầu thực vật b) Tính chất hóa học:
- Hệ số phân bố dầu nước: log P = 3,87
- Độ tan thấp và khả năng thấm kém [27]
Progesteron (PGT) là hormon steroid tự nhiên chủ yếu được sản xuất từ hoàng thể trong nửa sau chu kỳ kinh nguyệt, hình thành từ các tiền chất steroid trong buồng trứng, tinh hoàn, vỏ thượng thận và nhau thai Ở phụ nữ, PGT có vai trò quan trọng trong việc tăng sinh nội mạc tử cung, kích thích sự phát triển của tuyến vú, gây giãn cơ trơn tử cung, ngăn chặn sự hình thành và rụng trứng, cũng như ổn định quá trình thai nghén.
Hỗ trợ kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (ART) là giải pháp hiệu quả cho phụ nữ vô sinh do thiếu hụt PGT, suy buồng trứng hoàn toàn hoặc một phần, và cho những trường hợp an thai, chống sảy thai tái phát sau khi thụ tinh trong ống nghiệm hoặc chuyển phôi Ngoài ra, phương pháp này còn được áp dụng trong điều trị rối loạn kinh nguyệt, bổ sung hormone cho phụ nữ tiền mãn kinh, và điều trị trầm cảm sau sinh Bên cạnh đó, ART cũng có thể hỗ trợ trong việc điều trị tạm thời ung thư màng trong tử cung di căn, ung thư thận và ung thư vú.
1.1.5 Một số chế phẩm trên thị trường
Bảng 1.1 Một số chế phẩm thị trường chứa PGT Đường dùng Chế phẩm Chỉ định Âm đạo Gel đặt âm đạo
- Vô sinh do thiếu hụt PGT
- Dùng hỗ trợ trong kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (ART) ở phụ nữ vô sinh do thiếu hụt PGT Tiêm bắp Dung dịch Gestone
- Dùng kèm estrogen để bổ sung cho phụ nữ tiền mãn kinh
- Điều trị rối loạn kinh nguyệt
- Ngăn ngừa sảy thai và duy trì thai kì khi thiếu hụt PGT Đường uống Viên nang
- Sử dụng trong liệu pháp thay thế hormon
- Dùng kèm estrogen để bổ sung cho phụ nữ tiền mãn kinh
Qua da Gel Progestogel 1% - Hỗ trợ điều trị các bệnh u lành tính ở tuyến vú, các bệnh đau vú do mất cân bằng hormon estrogen và PGT.
Tương quan in vitro – in vivo
FDA định nghĩa tương quan in vitro – in vivo (IVIVC) là một mô hình toán học mô tả mối quan hệ giữa đặc tính in vitro của dạng bào chế, thường là tốc độ hoặc mức độ thuốc hòa tan hoặc giải phóng, và đáp ứng in vivo Mô hình này giúp hiểu rõ hơn về cách thức thuốc hoạt động trong cơ thể, từ đó cải thiện quy trình phát triển và đánh giá chất lượng sản phẩm dược phẩm.
4 tương ứng (thường là nồng độ dược chất trong huyết tương hoặc lượng dược chất hấp thu) [11]
1.2.2 Sinh khả dụng in vitro và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng qua da
Sinh khả dụng in vitro đánh giá quá trình giải phóng, hòa tan dược chất từ dạng thuốc [1]
1.2.2.2 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng qua da
Một trong những thách thức trong việc xây dựng IVIVC cho thuốc qua da là mô phỏng chính xác sự thấm của thuốc Mặc dù có nhiều phương pháp hòa tan như cánh khuấy kết hợp đĩa thấm, xi lanh quay và giỏ dao dộng, nhưng chúng có thể không phản ánh đúng cơ chế thấm phức tạp của thuốc Do đó, nghiên cứu khả năng thấm thường được ưa chuộng hơn Hai loại thiết bị khuếch tán phổ biến là kiểu “tĩnh” và kiểu “dòng chảy” Thiết bị khuếch tán kiểu “tĩnh” như bình Franz và thiết bị “side-by-side” có thể tích ngăn nhận từ 2-10 ml và diện tích màng từ 0,2 – 2 cm2 Sự khác biệt chính là thiết bị “side-by-side” có thể đo khả năng thấm của dung dịch bão hòa, trong khi bình Franz thường được sử dụng cho dạng bào chế bán rắn, lý tưởng để mô phỏng khả năng thấm in vivo.
Hình 1.2 Một số thiết bị thử khuếch tán
1.2.3 Sinh khả dụng in vivo và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo cho thuốc qua da
Sinh khả dụng in vivo đánh giá giai đoạn hấp thu dược chất từ chế phẩm bào chế
1.2.3.2 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo cho thuốc qua da
Nhiều mô hình động vật như da chuột, lợn, thỏ và da người đã được sử dụng để nghiên cứu khả năng thấm in vitro và in vivo Mặc dù da người được coi là lý tưởng nhất, nhưng vấn đề đạo đức, độ sẵn có và khó khăn trong bảo quản đã thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm mô hình động vật thay thế Mỗi loại động vật có mật độ lông và độ dày tầng sừng khác nhau, với độ dày lớp sừng thường tăng theo kích cỡ động vật Các nghiên cứu so sánh khả năng thấm in vivo giữa các mô hình động vật cho thấy kết quả phụ thuộc vào loại thuốc, do đó không thể đưa ra kết luận chung Vì vậy, việc xây dựng tương quan là cần thiết để lựa chọn loại da phù hợp trong các thí nghiệm thử khả năng giải phóng in vitro của dược chất.
Sau khi bôi thuốc lên da, dược chất sẽ trải qua một quá trình nhiều bước để vào vòng tuần hoàn chung, bao gồm: hòa tan và giải phóng dược chất từ dạng bào chế, phân bố vào lớp sừng, khuếch tán qua lớp sừng chủ yếu qua các khoảng gian bào thân dầu, phân bố từ lớp sừng vào lớp biểu bì thân nước, khuếch tán vào lớp hạ bì và các mao mạch, trước khi vào vòng tuần hoàn chung Phương pháp phổ biến nhất để xác định sinh khả dụng của thuốc qua da là lấy mẫu máu.
Có năm cách tiếp cận quan trọng để nghiên cứu sự phân bố của thuốc: (a) xác định lượng thuốc còn lại trên bề mặt da; (b) phân tích mức độ thuốc thẩm thấu vào trong da; (c) theo dõi sự hiện diện của thuốc trong tĩnh mạch dẫn đến vị trí bôi; (d) đánh giá sự phân bố của thuốc trong vòng tuần hoàn chung; và (e) kiểm tra sự có mặt của thuốc trong các sản phẩm bài tiết.
1.2.3.3 Tính mức độ và tốc độ hấp thu thuốc bằng phương pháp giải tích chập
Sau khi thu được đồ thị nồng độ thuốc trong máu, có ba phương pháp chính để đánh giá mức độ và tốc độ hấp thu thuốc, bao gồm Wagner-Nelson, Loo-Riegelman và giải chập đại số Trong đó, hai phương pháp Wagner-Nelson và Loo-Riegelman được sử dụng phổ biến để phân tích dữ liệu này.
Mô hình ngăn Wagner-Nelson, mặc dù được sử dụng để đánh giá tốc độ và mức độ hấp thu của dược chất, không hoàn toàn chính xác khi sự hấp thu bị giới hạn Trong khi đó, mô hình 2 ngăn của Loo-Riegelman mở rộng phương pháp này bằng cách sử dụng dữ liệu đường tiêm Phương pháp giải chập đại số phân tích dược động học không dựa trên mô hình ngăn cho kết quả đáng tin cậy hơn và ít bị ảnh hưởng bởi mô hình hấp thu, do đó có khả năng ứng dụng rộng rãi hơn so với phương pháp Wagner-Nelson.
Phương pháp giải tích chập cho phép xác định nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian khi sử dụng đường tiêm tĩnh mạch, được biểu thị bằng hàm số 𝐶(𝑡) Tốc độ hấp thu của thuốc theo thời gian được mô tả bằng hàm số 𝑟(𝑡), trong khi 𝐶(t) cũng phản ánh nồng độ thuốc trong huyết tương sau khi tiêm tĩnh mạch.
Tại một thời điểm u bất kì, có một lượng thuốc 𝑟(𝑢) được hấp thu Đến thời điểm
Sau khoảng thời gian 𝑡 − 𝑢, lượng thuốc hấp thu sẽ được thải trừ tương tự như khi tiêm tĩnh mạch, dẫn đến lượng thuốc còn lại trong cơ thể chỉ là.
𝐶 (𝑡 − 𝑢) 𝑟(𝑢)𝑑𝑢 Lấy tích phân từ thời điểm 0 đến t, ta được nồng độ thuốc trong máu tại thời điểm t theo công thức:
Hay có thể viết đơn giản:
𝐶(𝑡) = 𝑈𝐼𝑅(𝑡) 𝐹(𝑡) Trong đó: 𝑈𝐼𝑅(𝑡) là hàm số biểu thị nồng độ thuốc trong máu tại thời điểm t sau khi tiêm tĩnh mạch một đơn vị liều
Hàm số 𝐹(𝑡) biểu thị tốc độ đưa thuốc vào cơ thể tại thời điểm t Bằng cách sử dụng phương pháp khớp đường cong với dữ liệu từ đường tiêm tĩnh mạch, khi biết 𝐶(𝑡) và 𝐹(𝑡), ta có thể xác định hàm 𝑈𝐼𝑅(𝑡) dưới dạng tổng các số hạng mũ Tiếp theo, áp dụng phương pháp giải tích chập với hàm 𝑈𝐼𝑅 đã xác định, kết hợp với nồng độ thuốc trong huyết tương sau khi bôi gel 𝐶(𝑡), chúng ta có thể tính toán tốc độ thấm in vivo 𝐹(𝑡).
1.2.4 Tương quan in vitro – in vivo
1.2.4.1 Phân loại mô hình tương quan
Theo hướng dẫn của FDA về IVIVC, có năm mức tương quan được phân loại dựa vào khả năng dự đoán nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian sau khi sử dụng chế phẩm Trong đó, tương quan mức A được xác định là mức cao nhất.
Mối tương quan cao nhất giữa đồ thị tốc độ giải phóng in vitro và tốc độ hấp thu in vivo cho phép dự đoán đáp ứng in vivo chỉ bằng cách so sánh kết quả in vitro Điều này có nghĩa là khi có bất kỳ thay đổi nào về nguyên liệu, nhà xưởng, quy trình sản xuất hay công thức, không cần thực hiện các phép thử trên người.
Tương quan mức B sử dụng phương pháp thống kê thời điểm để thiết lập mối quan hệ giữa thời gian hòa tan in vitro trung bình (MDTin vitro) và thời gian lưu trú in vivo (MRT) hoặc thời gian hòa tan in vivo trung bình (MDTin vivo) Điều này cho thấy rằng nhiều đường cong in vivo khác nhau có thể có cùng MRT, dẫn đến sự phức tạp trong việc phân tích tương quan này.
B không phải là tương quan điểm – điểm, không phản ánh được nồng độ thực tế có trong huyết tương c) Tương quan mức C:
Trong mức tương quan này, thời điểm hòa tan in vitro (t50%, t90%,…) được so sánh với các thông số dược động học như AUC, tmax hoặc Cmax Đây là mức tương quan yếu nhất vì chỉ phản ánh một phần mối quan hệ giữa hấp thu và hòa tan Tương tự như mức B, tương quan mức C thường được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển công thức ở quy mô pilot.
Trong mối tương quan này, một hoặc nhiều thông số dược động học như Cmax và AUC được so sánh với lượng thuốc hòa tan tại các thời điểm cụ thể, thường là đầu, giữa và cuối đồ thị hòa tan Việc đạt được tương quan đa điểm C là tín hiệu quan trọng để dự đoán khả năng xây dựng tương quan mức.
A là có thể khả thi
Tổng quan về lưu biến học và ứng dụng trong đánh giá đặc tính của thuốc mềm dùng trên da và niêm mạc
Đánh giá thể chất của các chế phẩm thuốc mềm dùng trên da thường dựa vào cảm quan và có thể khác nhau giữa các cá nhân Tuy nhiên, ứng dụng lưu biến học cho phép xác định các thông số cụ thể như khả năng dàn trải và độ ổn định nhiệt độ của hệ, từ đó trở thành công cụ hữu ích trong việc so sánh các công thức bào chế.
1.3.1 Giới thiệu về lưu biến học
Lưu biến học, một nhánh của hóa lý, tập trung vào việc nghiên cứu sự biến dạng và chảy của vật liệu Các thí nghiệm trong lĩnh vực này không chỉ phản ánh đặc tính chảy của chất lỏng mà còn thể hiện đặc tính biến dạng của chất rắn Mối quan hệ giữa hai đặc tính này được thể hiện qua lực trượt, có khả năng gây ra biến dạng lớn và làm cho nhiều vật liệu trở nên chảy.
1.3.2 Một số đại lượng dùng trong lưu biến
Mô hình 2 tấm ván được sử dụng để xác định các đại lượng trong lưu biến, với tấm ván trên có diện tích trượt A được kéo theo phương ngang bởi lực trượt F, tạo ra tốc độ trượt v, trong khi tấm phía dưới đứng yên (v = 0) Khoảng cách giữa hai tấm ván là h, nơi mẫu được chứa và đo Để đảm bảo tính chính xác của kết quả, mẫu phải dính chặt vào cả hai tấm ván mà không bị trơn trượt giữa chúng, và trạng thái chảy phải ổn định, không có hiện tượng xoáy, mà phải theo tầng lớp.
Ứng suất trượt là đại lượng phản ánh tác động của ngoại lực lên khối vật liệu, được định nghĩa là độ lớn của lực tác dụng song song với bề mặt trên một đơn vị diện tích Công thức tính ứng suất trượt được sử dụng để xác định giá trị này một cách chính xác.
14 τ = Trong đó: τ là ứng suất trượt (N/m 2 )
A là diện tích bề mặt tác dụng (m 2 ) b) Khái niệm mức độ biến dạng trượt
Sau một khoảng thời gian dt, quãng đường di chuyển tối đa của lớp trên cùng được gọi là s Để so sánh mức độ biến dạng của các khối chất lỏng khác nhau, chúng ta sử dụng thông số mức độ biến dạng trượt γ, không có thứ nguyên; γ càng lớn thì mức độ biến dạng trượt càng cao Khái niệm tốc độ trượt được sử dụng để so sánh tốc độ biến dạng của hai khối vật liệu trong cùng một khoảng thời gian, và tốc độ trượt được tính theo công thức cụ thể.
Vật liệu nhớt có tốc độ biến dạng chậm hơn, trong khi vật liệu ít nhớt biến dạng nhanh hơn Độ nhớt trượt được xác định bằng tỷ số giữa ứng suất trượt và tốc độ trượt tương ứng Công thức tính độ nhớt trượt là η = τ / ẇ, trong đó η là độ nhớt trượt (Pa.s) và τ là ứng suất trượt (Pa).
𝛾̇ là tốc độ trượt (1/s) e) Mô đun nhớt G”, mô đun đàn hồi G’ và tan δ
Trong chế độ đo dao động, chúng ta thu được hai thông số quan trọng là mô đun đàn hồi G’ và mô đun nhớt G” Mô đun đàn hồi G’ phản ánh tính đàn hồi của vật liệu, trong khi mô đun nhớt G” thể hiện tính nhớt của nó.
Tanδ là tỷ lệ giữa mô đun nhớt G” và mô đun đàn hồi G’ trong biến dạng nhớt - đàn hồi, phản ánh độ mạnh yếu của các thành phần trong cấu trúc vật liệu Công thức tính tanδ được xác định như sau:
Chất rắn đàn hồi lý tưởng có góc mất mát δ = 0° và tỉ số tanδ = 0, cho thấy mô đun đàn hồi G’ lớn hơn nhiều so với mô đun nhớt G” Ngược lại, chất lỏng nhớt lý tưởng có góc mất mát δ = 90° và tỉ số tanδ = ∞, với G” vượt trội so với G’ Khi vật liệu có tính nhớt và đàn hồi tương đương, góc mất mát δ = 45° và tỉ số tanδ = 1, tức là G’ và G” bằng nhau.
1.3.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính lưu biến của thuốc mềm dùng qua da và niêm mạc a) Ứng dụng chế độ trượt liên tục
Trong chế độ trượt liên tục, để xác định độ nhớt trượt η, thí nghiệm sẽ sử dụng giá trị ứng suất trượt 𝜏 để đo tốc độ trượt 𝛾̇ hoặc ngược lại Từ các điểm η thu được, chúng ta có thể xây dựng đường cong nhớt Việc xác định độ nhớt trượt giúp kiểm tra đặc tính biến dạng chảy lỏng (shear-thinning) hoặc biến dạng đông đặc (shear-thickening) của mẫu.
- Vật liệu biến dạng chảy lỏng có giá trị độ nhớt trượt giảm dần khi tăng tốc độ trượt hoặc ứng suất trượt
- Vật liệu biến dạng đông đặc có giá trị độ nhớt trượt tăng dần khi tăng tốc độ trượt hoặc ứng suất trượt
Chế phẩm bôi da có đặc tính chảy lỏng giúp dễ dàng lấy ra khỏi lọ tuýp, đồng thời khi thoa lên da, sản phẩm sẽ dàn mỏng, mang lại cảm giác dễ chịu và hấp thu nhanh chóng.
Hình 1.5 Đường cong độ nhớt trượt của mẫu
Trong đó: (1) Chất lỏng Newton
(2) Vật liệu biến dạng chảy lỏng
(3) Vật liệu biến dạng đông đặc
16 b) Ứng dụng chế độ đo dao động
Chế phẩm bôi da thường xuyên phải đối mặt với sự thay đổi nhiệt độ giữa mùa hè và mùa đông, do đó cần đánh giá tác động của nhiệt độ lên độ ổn định của sản phẩm Việc thực hiện các chu trình nhiệt - lạnh cho phép khảo sát độ ổn định của mẫu thông qua các phép đo dao động Nếu giá trị tan δ không thay đổi qua các chu kỳ nhiệt độ, mẫu được coi là ổn định; ngược lại, nếu giá trị tan δ thay đổi đáng kể, mẫu sẽ được xem là không ổn định trong khoảng nhiệt độ đó.
Hình 1.6 Mối quan hệ giữa tan δ và nhiệt độ ở mẫu ổn định
Hình 1.7 Mối quan hệ giữa tan δ và nhiệt độ ở mẫu không ổn định
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và thiết bị
Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu
STT Tên nguyên liệu Xuất xứ Tiêu chuẩn
1 Progesteron Hubei Gedian Humanwell USP41
10 Magie sulfat Merck – Đức TCNSX
11 Natri clorid Merck – Đức TCNSX
Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu
STT Thiết bị Xuất xứ
1 Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson
2 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu Mỹ
3 Cân kỹ thuật Sartorius TE3102S Đức
4 Cân phân tích Sartorius BP121S Đức
5 Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H Đức
6 Máy ly tâm lạnh Universal 320R Anh
7 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC – MS/MS
SCIEX ExionLC TM AD Qtrap 6500 + Mỹ
8 Bể điều nhiệt WiseBath Đức
Nội dung nghiên cứu
Hoàn thiện quy trình bào chế hệ eutecti – hydrogel chứa progesteron
Sơ bộ nghiên cứu xây dựng tương quan in vitro – in vivo của hệ eutecti – hydrogel chứa progesteron và menthol
Các nội dung chính được trình bày trong sơ đồ sau:
Hình 2.1 Các bước chính nghiên cứu tương quan in vitro – in vivo của PGT
Bào chế dd tiêm tĩnh mạch chứa PGT
Mô hình hóa tổng các hàm số mũ
Bào chế hệ eutecti – hydrogel chứa PGT
SKD in vivo của hệ eutecti - hydrogel
Dữ liệu thử giải phóng in vitro Đường cong thấm in vivo Đường cong giải phóng in vitro
Tương quan in vitro – in vivo
Phương pháp đánh giá giải phóng
Lựa chọn SKD in vivo của dd tiêm tĩnh mạch
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp bào chế Để sơ bộ xây dựng tương quan in vitro – in vivo, khóa luận tiến hành bào chế 2 nhóm chế phẩm Nhóm thứ nhất: chế phẩm xây dựng tương quan chính là hệ eutecti – hydrogel chứa progesteron và menthol Nhóm thứ hai: chế phẩm đối chiếu là dung dịch tiêm tĩnh mạch chứa progesteron để tính toán sự phân bố, thải trừ của thuốc trong máu, từ đó tính toán được mức độ thấm in vivo của hệ eutecti – hydrogel
2.3.1.1 Bào chế hệ eutecti – hydrogel chứa progesteron và menthol a) Bào chế hệ eutecti của progesteron và menthol
Cân chính xác PGT và menthol theo tỷ lệ 15:85, sau đó cho vào ống nghiệm thủy tinh 10 ml và đậy kín bằng nắp xoáy Đun nóng hỗn hợp ở 65°C bằng bể đun cách thủy cho đến khi hoàn toàn chảy lỏng Sau khi trộn đều, để hỗn hợp nguội đến nhiệt độ phòng và ổn định trong 12 giờ Cuối cùng, bảo quản mẫu đã bào chế ở nhiệt độ -20°C ít nhất 1 tuần.
[26] b) Bào chế hydrogel chứa eutecti gồm progesteron và menthol
Ngâm carbopol 934 5% trong 12h ở điều kiện phòng để trương nở hoàn toàn sau đó đem trung hòa bằng TEA đến pH = 7 để tạo gel
Cân chính xác hỗn hợp eutecti của PGT và menthol, sau đó bổ sung chất tăng thấm như ethanol hoặc transcutol P và khuấy đều Tiến hành phối hợp gel đã bào chế và đồng nhất bằng chày cối trong 20 phút để thu được hệ eutecti – hydrogel.
2.3.1.2 Bào chế dung dịch tiêm tĩnh mạch chứa progesteron
Bảng 2.3 Công thức thuốc tiêm chứa progesteron
Nước cất pha tiêm vđ 100ml
Progesteron được hòa tan trong dung môi bao gồm ethanol, PG và benzyl alcol Sau khi thêm đủ nước để đạt 100ml, dung dịch được lọc qua màng cellulose acetat với kích thước lỗ lọc 0,2 µm và được chứa trong lọ thủy tinh tối màu, được đậy nắp bằng cao su đã được tiệt khuẩn Cuối cùng, dung dịch được hấp tiệt khuẩn ở 121°C trong 15 phút và được dán nhãn hoàn chỉnh.
2.3.1.3 Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của hệ eutecti – hydrogel chứa progesteron a) Phương pháp đánh giá đặc tính lưu biến Điều kiện đo lưu biến:
Sử dụng máy đo lưu biến DISCOVERY HR-1 rheometer, mô hình sử dụng côn đĩa (côn nghiêng 4 o 1’08”, đường kính đĩa 40mm, đĩa có khả năng điều nhiệt)
Các mẫu cần được ổn định ở nhiệt độ đo trong khoảng 120 giây để loại bỏ ảnh hưởng từ ngoại lực và đảm bảo đồng đều về nhiệt Lượng mẫu cần thiết cho mỗi phép đo lưu biến với mô hình côn-đĩa rất nhỏ, chỉ khoảng 1,2-1,5g Sau mỗi lần đo, cần vệ sinh dụng cụ và thay mẫu mới lên đĩa.
Cách đưa mẫu lên đĩa:
Đặt mẫu vào giữa đĩa và hạ côn xuống để mẫu bao phủ toàn bộ bề mặt côn Sử dụng mica để loại bỏ lượng mẫu thừa xung quanh côn, sau đó tiến hành các phép đo lưu biến.
Phương pháp đánh giá đặc tính gel
Sử dụng chế độ trượt liên tục để đánh giá đặc tính chảy lỏng hoặc đông đặc của các mẫu gel
Cách tiến hành: sử dụng phép đo trượt liên tục quét tốc độ trượt dao động từ 1 –
200 s -1 tại 25 o C để thu được kết quả biểu diễn dưới dạng đường cong độ nhớt
Phương pháp đánh giá độ ổn định nhiệt
Sử dụng chế độ đo dao động để đánh giá độ ổn định của công thức gel qua các chu kỳ nhiệt – lạnh mang lại nhiều lợi ích Chế độ đo dao động ưu việt hơn so với chế độ trượt liên tục, vì mẫu được đo trong vùng nhớt – đàn hồi tuyến tính, đảm bảo cấu trúc của mẫu không bị phá hủy trong quá trình thí nghiệm.
Để xác định vùng nhớt – đàn hồi tuyến tính của từng công thức, cần lựa chọn tần số dao động và ứng suất trượt phù hợp.
Sử dụng phép đo quét biên độ dao động với ứng suất trượt dao động trong khoảng 0,001 – 100 Pa ở nhiệt độ 25 oC giúp lựa chọn một giá trị ứng suất trượt phù hợp trong vùng nhớt – đàn hồi tuyến tính.
- Sử dụng phép đo quét tần số dao động với tần số dao động trong khoảng 0,1 –
Tại nhiệt độ 25 o C và tần số 100 rad/s, chúng tôi tiến hành lựa chọn giá trị tần số trong vùng nhớt – đàn hồi tuyến tính Để đánh giá độ ổn định của các công thức gel, chúng tôi sử dụng phép đo quét nhiệt độ dao động kết hợp với các thông số ứng suất trượt và tần số dao động đã chọn Thí nghiệm được thực hiện với thiết bị phù hợp, đánh giá độ ổn định của gel qua 3 chu kỳ nhiệt độ với tốc độ gia nhiệt 3 o C/phút.
- Chu kì 1: nhiệt độ tăng dần từ 10 – 40 o C
- Chu kì 2: nhiệt độ giảm dần từ 40 – 10 o C
- Chu kì 3: nhiệt độ tăng dần từ 10 – 40 o C
Gel được cho là ổn định nếu sau mỗi chu kì giá trị tan δ tại mỗi nhiệt độ (so sánh
3 chu kì với nhau) là không khác nhau quá nhiều b) Cảm quan
Quan sát bằng mắt thường về thể chất, màu sắc, độ đồng nhất của gel c) pH
Pha loãng gel 10 lần bằng nước cất trước khi đo pH d) Độ đồng nhất
Lấy 4 đơn vị đóng gói, mỗi đơn vị khoảng 0,02 đến 0,03 g, trải đều chế phẩm trên 4 phiến kính Đậy mỗi phiến kính bằng một phiến kính thứ 2 và ép mạnh cho tới khi tạo thành một vết có đường kính khoảng 2 cm Quan sát vết thu được bằng mắt thường (cách mắt khoảng 30 cm) [3] e) Định tính Định tính PGT trong chế phẩm bằng cách so sánh thời gian lưu và phổ UV – VIS của mẫu thử và mẫu PGT chuẩn f) Định lượng
Cân chính xác 0,5000 g gel và cho vào bình định mức 100,0 ml Tiếp theo, thêm 50 ml ethanol vào bình, sau đó dùng nước để định mức đến vạch chỉ định và siêu âm trong 30 giây.
22 phỳt Sau đú lọc qua màng lọc 0,45 àm thu lấy dịch trong để định lượng bằng HPLC với điều kiện chạy như sau:
- Thiết bị: máy HPLC Shimadzu
- Cột sắc ký Aligent C18 kích thước cột 250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi
- Pha động: hỗn hợp methanol : nước cất (80 : 20), siêu âm 20 phút để loại bọt khí
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Detector UV phát hiện ở bước sóng 254 nm
Để chuẩn bị mẫu chuẩn cho quá trình chạy sắc ký, cân chính xác khoảng 0,0300 g PGT và hòa tan trong 50,00 ml dung môi ethanol Sau đó, bổ sung nước từ từ cho đến khi đạt 100 ml, siêu âm trong 10 phút để thu được dung dịch S1 với nồng độ khoảng 300 µg/ml Tiếp theo, hút một lượng mẫu từ dung dịch S1 và pha loãng bằng pha động để tạo ra các dung dịch S2 đến S6 với nồng độ lần lượt là 6; 12; 30; 60; và 150 µg/ml.
Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp HPLC trong định lượng PGT, việc đánh giá các chỉ tiêu là rất quan trọng Phương pháp xử lý và điều kiện sắc ký cần được thẩm định dựa trên các tiêu chí cụ thể.
Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn từ S1 đến S6 theo điều kiện đã định Kết quả cho thấy mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ pic được thể hiện qua đường chuẩn với hệ số tương quan R² > 0,99.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Nghiên cứu phương pháp định lượng progesteron
3.1.1 Nghiên cứu phương pháp định lượng progesteron bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Để định lượng nồng độ PGT trong các mẫu đánh giá khả năng giải phóng in vitro của hệ eutecti – hydrogel, khóa luận tiến hành xây dựng phương pháp định lượng PGT sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Tiến hành khảo sát khoảng nồng độ các dung dịch chuẩn PGT trong khoảng từ 6,0 àg/ml đến 150,0 àg/ml Đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ PGT được thể hiện trong hình dưới đây:
Biểu đồ trong Hình 3.1 cho thấy mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic sắc ký của progesteron bằng phương pháp HPLC Giá trị R² = 0,9999 xác nhận rằng có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ progesteron (PGT) trong mẫu chuẩn và diện tích pic trong khoảng nồng độ khảo sát Điều này cho thấy khoảng tuyến tính này là phù hợp để định lượng nồng độ PGT trong các mẫu thử.
Kết luận cho thấy phương pháp định lượng PGT bằng HPLC có độ tin cậy cao, thể hiện qua độ lặp lại và tính tuyến tính Phương pháp này có thể được áp dụng hiệu quả để xác định nồng độ PGT trong các mẫu nhằm đánh giá khả năng giải phóng của dược chất, với phương trình y = 44352x + 39970 và hệ số R² = 0.9999.
Nồng độ dung dịch PGT (àg/ml)
3.1.2 Nghiên cứu phương pháp định lượng progesteron bằng LC–MS/MS Để định lượng nồng độ PGT trong huyết tương thỏ, tiến hành theo phương pháp đã trình bày ở phần 2.3.3.3, tiếp tục thẩm định phương pháp trên các tiêu chí đã trình bày ở phần 2.3.3.4, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1 Độ ổn định mẫu huyết tương thời gian dài Thời gian
% còn lại RSD % còn lại RSD
Sau 11 tuần, nồng độ chất phân tích trong huyết tương không thay đổi quá 15% so với mẫu ban đầu Giá trị RSD giữa các nồng độ định lượng của mỗi lô QC trong thời điểm phân tích đều dưới 15%.
Kết luận: mẫu ổn định trong huyết tương thời gian khảo sát là 11 tuần.
Nghiên cứu bào chế hệ eutecti – hydrogel chứa progesteron
Việc áp dụng hệ eutecti kết hợp với chất tăng thấm như ethanol và Transcutol P đã cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc nâng cao khả năng giải phóng của PGT Cụ thể, khi sử dụng hệ eutecti với ethanol, thông lượng giải phóng tăng lên 1,5 lần so với việc kết hợp với Transcutol P, và tăng 3,4 lần so với không sử dụng cả hai chất này.
Nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng của hệ eutecti và chất tăng thấm đến độ nhớt và độ ổn định nhiệt độ của hệ gel Các thí nghiệm được thực hiện với các tỉ lệ progesteron : menthol khác nhau và sử dụng hai loại chất tăng thấm là Transcutol P và ethanol, trong đó tỉ lệ progesteron trong gel được cố định ở mức 1% và gel được bào chế từ carbopol 934 theo phương pháp đã trình bày.
Bảng 3.2 Bảng thiết kế công thức đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ PGT : menthol, loại chất tăng thấm
3.2.1 Đánh giá ảnh hưởng của hệ eutecti và chất tăng thấm đến độ nhớt của gel
Độ nhớt không chỉ phản ánh tính chất vật lý của sản phẩm mà còn ảnh hưởng đến khả năng phân bố đều khi thoa lên da Hơn nữa, độ nhớt cũng liên quan đến khả năng giải phóng dược chất Khóa luận này sẽ tiến hành đánh giá độ nhớt theo phương pháp đã được trình bày trong mục 2.3.2.1.
Kết quả thu được như sau:
Hình 3.2 Đường cong độ nhớt của công thức F1, F2, F3, F4
Khi tác động ứng suất trượt đồng nhất, độ nhớt của các mẫu gel polyme giảm dần theo thứ tự F2, F3, F4 và F1 Điều này xuất phát từ việc Carbopol, một polyme liên kết chéo của acid acrylic, có đặc tính lưu biến phụ thuộc vào tương tác giữa các polyme và giữa polyme với dung môi Việc bổ sung chất tăng thấm như Transcutol P và ethanol có khả năng làm thay đổi độ nhớt bằng cách cạnh tranh với các liên kết giữa phân tử nước và Carbopol.
Tăng tỷ lệ ethanol và Transcutol P so với polyme dẫn đến giảm độ nhớt của gel do giảm sự hydrat hóa các polyme và giảm sự liên kết không gian.
Trong quá trình khảo sát tốc độ trượt, cả 4 mẫu đều cho thấy tính chất biến dạng chảy lỏng, phù hợp với các chế phẩm gel bôi da Chúng có khả năng đông đặc khi ở trong lọ hoặc tuýp, nhưng khi được bôi lên da và chịu tác động của lực, chúng dễ dàng dàn đều.
3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của hệ eutecti và chất tăng thấm đến độ ổn định nhiệt độ của hệ
Do các chế phẩm dùng ngoài da dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ môi trường, việc đánh giá độ ổn định nhiệt độ của các công thức là cần thiết Phương pháp trình bày trong mục 2.3.2.1 sẽ được áp dụng để thực hiện đánh giá này.
Kết quả thu được như sau:
Hình 3.3 Độ ổn định nhiệt của các công thức lần lượt F1, F2, F3, F4
Giá trị tan δ của các công thức F1 và F2 ổn định qua các chu kỳ nhiệt, trong khi F4 có dao động nhỏ và F3 có dao động lớn, cho thấy F3 không ổn định nhiệt độ Nguyên nhân có thể do điểm chảy của hệ eutecti trong F3 là 40,82 °C, thấp hơn so với hỗn hợp progesteron và menthol trong F1 và F2, dẫn đến hiện tượng chảy lỏng một phần tại nhiệt độ khảo sát, gây ra sự dao động của giá trị mô đun nhớt G” Cả F3 và F4 đều sử dụng hệ eutecti, nhưng F3 với chất tăng thấm Transcutol P tạo ra giá trị tan δ dao động lớn, trong khi F4 với ethanol chỉ có tan δ dao động nhỏ, vẫn giữ được cấu trúc gel với G’ < G”.
Kết luận: Chúng tôi khuyến nghị lựa chọn công thức F4, vì nó có khả năng giải phóng cao nhất, đặc tính chảy lỏng phù hợp và ổn định cấu trúc khi nhiệt độ thay đổi trong khoảng 10 – 40 độ C, để tiếp tục nghiên cứu.
Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ PGT : menthol, chất tăng thấm đến khả năng giải phóng của hệ
3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho hệ eutecti – hydrogel chứa progesteron
Với công thức F4 được lựa chọn ở trên:
Bảng 3.3 Công thức lựa chọn xây dựng IVIVC
Để đảm bảo tính đồng nhất trong quá trình bào chế và thuận lợi cho việc xây dựng IVIVC sau này, các đặc tính của hệ eutecti – hydrogel chứa PGT đã được cố định.
Bảng 3.4 Một số tính chất của hệ eutecti – hydrogel chứa PGT
STT Chỉ tiêu Yêu cầu
1 Cảm quan Gel có màu trắng, đồng nhất, thể chất mịn, không có bọt khí
2 Độ nhớt Mẫu phải có đặc tính chảy lỏng, khi tăng tốc độ trượt thì độ nhớt giảm
3 Độ ổn định nhiệt Mẫu phải ổn định trong khoảng nhiệt độ khảo sát, giá trị tan δ ổn định
4 Độ đồng nhất Độ đồng nhất phải đạt như yêu cầu DĐVN V với thuốc dùng ngoài da
Tại thời gian lưu của PGT chuẩn phải xuất hiện pic PGT của mẫu thử, phổ UV – VIS tương đồng nhau
Khi sử dụng màng thử giải phóng từ da chuột trong môi trường ethanol : nước với tỉ lệ 50 : 50, lượng dược chất giải phóng sau 24 giờ của gel không được thấp hơn 1230,63 µg/cm², theo các thông số đã nêu trong phần 2.3.2.1.
3.3 Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng in vivo Để tiến hành xây dựng tương quan in vitro – in vivo của hệ eutecti – hydrogel chứa progesteron, trước hết ta cần biết được đặc tính thấm in vivo của hệ thể hiện qua thông số dược động học và đồ thị biểu diễn mức độ thấm in vivo của gel
3.3.1 Đánh giá các thông số dược động học của chế phẩm đối chiếu và chế phẩm xây dựng tương quan
Phương pháp giải chập đại số được áp dụng để nghiên cứu mức độ thấm in vivo của hệ eutecti – hydrogel, với chế phẩm đối chiếu là dung dịch tiêm tĩnh mạch của PGT Sau khi thực hiện tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ theo phương pháp đã trình bày, kết quả định lượng nồng độ thuốc trong máu đã được thu thập và phân tích.
Sau khi tiêm tĩnh mạch, nồng độ PGT trong huyết tương thỏ được khảo sát với nhóm sử dụng hệ eutecti – hydrogel Kết quả định lượng cho thấy nồng độ thuốc trong máu đạt được những giá trị đáng chú ý.
Hình 3.6 Đồ thị PGT trong huyết tương thỏ sau khi bôi hệ eutecti – hydrogel
Sử dụng phần mềm Phoenix 8 để tính toán các thông số dược động học của hệ, kết quả trình bày ở bảng:
Bảng 3.5 Các thông số dược động học của dung dịch tiêm tĩnh mạch và hệ eutecti – hydrogel chứa PGT Thông số Dung dịch tiêm Hệ eutecti – hydrogel
Sau khi tiêm tĩnh mạch dung dịch chứa PGT, nồng độ thuốc trong máu được biểu diễn theo mô hình 2 ngăn Quá trình phân bố PGT vào mô diễn ra nhanh chóng, với nồng độ thuốc giảm nhanh sau 15 phút, tiếp theo là sự giảm chậm do quá trình chuyển hóa và bài tiết Thời gian lưu trú trung bình (MRT) của thuốc là 48,22 phút.
Sơ bộ nghiên cứu xây dựng tương quan in vitro – in vivo của PGT
Sau khi thu được đường cong biểu diễn mức độ thấm in vivo, cần tiến hành khảo sát để lựa chọn điều kiện thử giải phóng in vitro phù hợp nhất nhằm xây dựng mối tương quan Việc khảo sát sẽ được thực hiện với các loại môi trường và màng thử giải phóng khác nhau.
3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến kết quả thử giải phóng in vitro
Do PGT có khả năng tan kém trong nước, Valenta và cộng sự [20] đã chỉ ra rằng PG và ethanol là hai dung môi có thể cải thiện độ tan của PGT Vì vậy, nghiên cứu đã được thực hiện với hai môi trường thử nghiệm tính thấm trong ngăn nhận của bình Franz, cụ thể là ethanol : nước = 50 : 50 và PG : nước = 50 : 50, theo phương pháp đã mô tả ở phần 2.3.2.1 Kết quả thử nghiệm giải phóng in vitro đã được thu thập và phân tích.
Hình 3.8 trình bày đồ thị phần trăm PGT giải phóng trong các môi trường sử dụng dung môi khác nhau Mặc dù cả hai dung môi đều có khả năng cải thiện độ tan của PGT, nhưng khi thử nghiệm khả năng giải phóng qua màng thẩm thấu, môi trường nước: ethanol cho thấy hiệu quả rõ rệt hơn.
Môi trường ethanol : nước với tỷ lệ 50 : 50 cho kết quả giải phóng cao hơn hẳn, đạt 73,4% sau 24 giờ Trong khi đó, môi trường PG : nước với tỷ lệ 50 : 50 chỉ đạt 1,5% sau 24 giờ do độ nhớt cao của PG làm giảm khả năng khuấy trộn và dễ gây bọt khí Do đó, lựa chọn môi trường ethanol : nước = 50 : 50 là phù hợp cho các thí nghiệm khuếch tán tiếp theo.
3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại màng tới kết quả giải phóng in vitro
3.4.2.1 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của loại màng giải phóng Để đánh giá ảnh hưởng của loại màng giải phóng, khảo sát trên 2 loại màng là màng thẩm tích 12000 – 14000 Dalton và da lưng chuột nhắt đực theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.3.2.1 với cùng loại môi trường là ethanol : nước = 50 : 50, kết quả thu được như sau:
Thời gian (giờ)Màng thẩm tích - PG 50% Màng thẩm tích - EtOH 50%
Hình 3.9 Đồ thị phần trăm PGT giải phóng với các loại màng khác nhau
3.4.2.2 Mô hình hóa dữ liệu thử hòa tan in vitro
Dựa trên dữ liệu thử hòa tan in vitro, mô hình hóa dữ liệu theo phương pháp đã trình bày trong phần 2.3.4 cho phép tính toán giá trị AIC cho các loại mô hình khác nhau Kết quả cho thấy mức độ giải phóng PGT khi sử dụng màng thẩm tích và môi trường ethanol : nước với tỷ lệ 50 : 50, được thể hiện qua bảng 3.7, cho thấy sự khác biệt giữa các mô hình trong việc mô phỏng đồ thị giải phóng in vitro.
Makoid Banakar Uniform weighting -66,00434 -65,10431 Fail -64,80357
Dựa vào bảng trên, chúng tôi đã chọn mô hình Weibull với trọng số 1/(Y*Y) để mô phỏng dữ liệu thử nghiệm giải phóng khi sử dụng màng thẩm thấu trong môi trường ethanol và nước theo tỷ lệ 50:50.
Tương tự, với kết quả mức độ giải phóng PGT sử dụng da chuột và môi trường ethanol : nước = 50 : 50, mô hình hóa cho kết quả như sau:
Da chuột Màng thẩm tích
Bảng 3.8 Mô hình hóa đồ thị giải phóng in vitro sử dụng da chuột, môi trường nước : ethanol = 50 : 50 với các mô hình khác nhau
Makoid Banakar Uniform weighting -47,5062 -47,21764 Fail -47,18272
Mô hình Hill với trọng số 1/(Y*Y) được lựa chọn từ bảng trên để mô hình hóa dữ liệu thử nghiệm giải phóng khi sử dụng da chuột trong môi trường nước với tỷ lệ ethanol 50:50.
Hình 3.10 Đường cong mức độ giải phóng in vitro của hệ với các loại màng khác nhau
3.4.2.3 Lựa chọn loại màng cho phương pháp thử giải phóng
Sử dụng mô hình tuyến tính, chúng tôi đã xây dựng mối tương quan giữa mức độ thấm in vivo và mức độ giải phóng in vitro qua các loại màng khác nhau Kết quả được thu thập theo phương pháp mô tả trong phần 2.3.4 như sau:
Bảng 3.9 trình bày kết quả AIC cho thấy mối tương quan giữa mức độ thấm in vivo và mức độ giải phóng in vitro với các loại màng khác nhau Các loại màng giải phóng được đánh giá dựa trên chỉ số AIC, giúp xác định hiệu quả của chúng trong việc kiểm soát thấm và giải phóng.
Giá trị AIC cho tương quan xây dựng với da chuột thấp hơn so với màng thẩm tích, cho thấy việc sử dụng da chuột là phương pháp phù hợp hơn trong thí nghiệm thử giải phóng của hệ eutecti – hydrogel chứa PGT.
Mô hình lựa chọn để mô tả tương quan thu được:
Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỉ lệ giải phóng in vitro (dùng da chuột và môi trường EtOH : nước = 50 : 50) và tỉ lệ thấm in vivo
Mặc dù da chuột và da thỏ được sử dụng trong các thí nghiệm in vitro và in vivo khác nhau, nhưng do thiết bị Franz có diện tích màng thử giải phóng nhỏ (1,767 cm²), việc sử dụng da thỏ dày hơn có thể làm giảm lượng dược chất thấm qua, gây khó khăn trong việc định lượng Để giảm thiểu sai số, khóa luận đã sử dụng cùng một vùng da lưng trong các thí nghiệm.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN
Sau khi thực hiện đề tài “Sơ bộ xây dựng tương quan in vitro – in vivo của hệ eutecti – hydrogel chứa progesteron”, khóa luận đã đạt được những kết quả quan trọng, góp phần làm sáng tỏ mối liên hệ giữa các hệ thống eutecti và hydrogel trong việc giải phóng progesteron Những phát hiện này không chỉ cung cấp cái nhìn sâu sắc về tính chất của hydrogel mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc ứng dụng trong y học.
Quy trình bào chế hệ eutecti – hydrogel chứa PGT đã được hoàn thiện, với công thức hydrogel tối ưu giữa PGT và menthol cho khả năng giải phóng cao nhất Sản phẩm có đặc tính chảy lỏng phù hợp với chế phẩm bôi da và khả năng ổn định nhiệt độ trong khoảng khảo sát Đồng thời, tiêu chuẩn cơ sở cho hệ bào chế cũng đã được xây dựng.
Hệ eutecti – hydrogel bào chế đã được lựa chọn điều kiện thử giải phóng tối ưu cho hệ chứa progesteron, nhằm xây dựng tương quan in vitro – in vivo hiệu quả Điều kiện này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo giá trị của hệ thống.
Thiết bị Thiết bị bình Franz
Loại môi trường Ethanol : nước = 50 : 50
Loại màng thử giải phóng Da lưng chuột nhắt
Tốc độ khuấy 400 vòng/ phút
Thể tích môi trường 7 ml
Phương trình tương quan thu được:
Thẩm định lại tương quan đã xây dựng
Tiếp tục hoàn thiện công thức hệ eutecti – hydrogel có bổ sung các chất bảo quản, giữ ẩm
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1 Bộ môn Dược lâm sàng (2011), Dược động học - Những kiến thức cơ bản, Nhà xuất bản Y học
2 Bộ Y tế (2018), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội
3 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học Hà Nộ
4 Nguyễn Thị Ngân (2017), "Nghiên cứu phát triển hệ eutecti - hydrogel để tăng tính thấm qua da của progesteron", Trường Đại học Dược Hà Nội
