TỔNG QUAN VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, HÓA HỌC,TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA TRINH NỮ HOÀNG CUNGCRINUM LATIFOLIUM L. VÀ VIỆC PHÂN LẬP CÁC ALKALOID TRONG CÂY

TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC

Vị trí trong bảng phân loại thực vật

Họ Amaryllidaceae, thường được gọi là họ Thủy tiên, Loa kèn đỏ, Náng hay Lan Huệ, bao gồm chi Crinum Theo hệ thống phân loại thực vật hạt kín của A L Takhtajan, được công bố năm 1987 và sửa đổi năm 2009, chi Crinum thuộc về họ này.

Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) Chi Crinum L

CHI CRINUM

Crinum, thuộc họ Thủy tiên, là cây thân cỏ sống lâu năm nhờ hành hoặc thân rễ Lá cây mọc từ gốc, có hình dáng mỏng hoặc mọng nước với gân lá song song Chi Crinum có thân giả cao từ 10-15 cm, với cụm hoa dạng chùm hoặc tán, thường có nhiều hoa và được bao bọc bởi một mo Trục cụm hoa dài mọc từ mặt đất, hoa đều và lưỡng tính, có 5 vòng và mẫu 3 Bao hoa gồm 6 phiến cùng màu, dính thành ống dài, đôi khi có tràng phụ Bộ nhị gồm 6 nhị được đính trên 2 vòng, với chỉ nhị có thể rời hoặc dính nhau Bao phấn có thể thẳng hoặc lắc lư Bộ nhụy bao gồm 3 lá noãn tạo thành bầu dưới 3 ô, mỗi ô chứa nhiều noãn, đính noãn trung trụ, và có 1 vòi nhụy với đầu nhụy chia.

3 thùy Quả thông thường là nang nứt lưng Hạt có nội nhũ [27]

Chi Crinum có khoảng 130 loài ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và vùng nóng Ở Việt Nam, chi Crinum có 6 loài được trồng làm cảnh và làm thuốc:

Crinum amabile Donn., Crinum asiaticum L., Crinum defixum Ker Gawl., Crinum giganteum Andr., Crinum latifolium L., Crinum moorei Hook F [27]

Cây thân thảo lưu niên cao khoảng 1m, với lá mọc từ gốc, dài 1m và rộng từ 5-10 cm Cụm hoa hình tán chứa từ 6-12 hoa, có ống hoa mảnh màu lục, các phiến hoa hẹp và dài Hoa có 6 nhị với chỉ nhị màu đỏ và bao phấn vàng Quả mọng của cây có hình gần tròn, đường kính từ 3-5 cm, thường chỉ chứa một hạt.

Cây có hành tròn đường kính 15cm, với cổ dài từ 30 đến 40cm, bao quanh bởi nhiều lá hình ngọn giáo dày, màu xanh lục, dài khoảng 1m và rộng 0,10m Hoa có hình ống màu đỏ tươi, dài 10cm, với 20 - 30 đóa hoa tập hợp thành tán ở đầu cán hoa dẹp, mọc từ rễ, dài từ 60cm đến 1m Thân cây có hành tròn đường kính 5 - 6cm, vẩy màu nâu, và thân giả cao.

Lá cây có hình dải dài từ 30 - 60cm và rộng 2 - 3cm, với đầu nhọn Cán hoa mảnh màu mận quân, tán hoa gồm 5 - 6 bông được bao quanh bởi những hoa màu xanh Cánh hoa dài từ 5 - 6cm, có màu lục nhạt, mặt ngoài có sắc hồng hoặc tím Ống hoa có màu đỏ, chỉ nhị cũng màu đỏ, trong khi bầu hoa hình trứng ngược với vòi nhụy mảnh.

Cỏ thân hành có đường kính từ 10-15 cm, với bẹ lá xếp chồng tạo thành một thân giả dài khoảng 10-15 cm Loại cỏ này có nhiều lá mỏng kéo dài từ 80-100 cm và rộng từ 5-8 cm, với mép lá lượn sóng Hoa của cây mọc thành tán, gồm từ 6-18 bông hoa trên một cán hoa dài từ 30-60 cm, cánh hoa màu trắng điểm xuyết màu tím đỏ.

Hành có kích thước lớn, đường kính lên đến 15cm và có cổ dài Lá của cây hình dải, dài khoảng 1m và rộng từ 10 đến 12cm Cán hoa nằm ở bên, có hình dẹp, cao khoảng 1m và mang từ 5 đến 6 bông hoa màu trắng với vệt xanh bên ngoài Vòi các phiến hoa có hình thuôn, tù, dài tối đa 10cm, trong khi chỉ nhị có màu trắng và bao phấn có màu xanh đậm.

Cây có thân lớn hình trứng, cao khoảng 30cm với lá lớn, hình kiếm, dài từ 60cm đến 1m và rộng 8-10cm Đầu lá nhọn dài, gốc lá tù và mép lá nhăn Cán hoa to vượt qua lá, mang từ 6 đến 8 hoa thành tán rộng Hoa có ống màu xanh nhạt dài 10cm, phiến hoa rộng, thuôn, màu trắng và thường có sắc hồng.

Loài crinum latifolium L

Hình 1.1: Cây Trinh Nữ Hoàng Cung [20]

TNHC còn được gọi là Hoàng Cung Trinh Nữ, Tỏi lơi lá rộng, Náng lá rộng Được nhiều nhà thực vật học Việt nam mô tả rất chi tiết.

Thân hành, hình cầu, phía ngoài có áo mỏng, phía trên có thân giả ngắn 7-10 cm, do các bẹ lá ôm sát nhau làm thành.

Hình 1.2: Thân cây Trinh Nữ Hoàng Cung [29]

Phiến lá có kích thước từ 60-90 cm, màu xanh nhạt, với đặc điểm mặt trên hơi lõm xuống và mép lượn sóng Gân giữa nổi bật ở mặt dưới, trong khi gân bên song song, chóp lá nhọn và gốc dạng bẹ.

Hình 1.3: Phiến lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung [31]

Cụm hoa dạng tán, có 10-20 hoa; cuống cụm dài 60-90 cm, chiều ngang 1,5-2,0 cm, màu xanh, gốc tím nhạt

Hình 1.4: Cụm hoa cây Trinh Nữ Hoàng Cung [30]

Hoa có tính lưỡng tính, với lá bắc tổng bao dạng mo, mỏng, kích thước 7,5-10,0 cm, màu tím hồng và đứng thẳng Cuống hoa ngắn, bao hoa dài 15-20 cm, gồm 6 mảnh dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống dài 9-10 cm, thẳng đứng hoặc cong lên Phần trên có 6 thùy hình mũi giáo, với dải màu tím hồng ở giữa, nhạt dần ra phía mép và chóp nhọn ngắn có mũi màu hồng Nhị có 6, rời nhau, với chỉ nhị dài 6-7 cm, màu trắng, đính ở họng ống bao hoa Bao phấn màu vàng, dài 1,2-1,8 cm, hình dải, mở bằng khe dọc Bầu hạ hình thoi, có 3 ô, mỗi ô chứa 5-6 noãn; vòi nhụy dài 15-18 cm, màu tím thẫm ở phía trên và nhạt dần xuống phía dưới, với đầu nhụy nhỏ, dạng cầu.

Hình 1.5: Hoa cây Trinh Nữ Hoàng Cung [30]

Quả nang, hình cầu, đường kính 4-5 cm

Hình 1.6: Quả Trinh Nữ Hoàng Cung [30]

Cây Trinh nữ hoàng cung, được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia như Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia, Philippines, Campuchia và Lào, chủ yếu phát triển tại các tỉnh từ Quảng Nam - Đà Nẵng trở vào ở Việt Nam Cây ưa ẩm, thích ánh sáng hoặc bóng râm một phần, sinh trưởng tốt trong khí hậu nóng ẩm của vùng nhiệt đới Mỗi năm, cây sản sinh 6-8 lá mới và tạo ra 3-5 hành con, với mùa hoa diễn ra từ tháng 6 đến tháng 8 Bộ phận được sử dụng chủ yếu là lá và thân hành, và cây đã được nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp cấy mô.

Hình 1.7.(1) Cây với thân hành và lá (2) Cụm hoa (3) Một phần bao hoa và bộ nhị; (4)

1.3.3 Đặc điểm vi phẫu [31] http://tuaf.edu.vn/gallery/files/Xay_dung_tieu_chuan_duoc_lieu.doc

Dùng mẫu tươi Cắt xuyên tâm bằng tay với lưỡi lam Chọn lát cắt thật mỏng để nhuộm.

Nhuộm vi phẩu tiến hành tuần tự như sau: (1) Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel từ 15-

Trong quy trình chuẩn bị mẫu vi phẫu, đầu tiên, rửa mẫu bằng nước cất nhiều lần trong 30 phút Tiếp theo, ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic 1%-3% trong 2 phút để loại bỏ Javel còn sót lại, sau đó rửa lại bằng nước cất Nếu lát cắt chưa đủ trắng và trong, ngâm tiếp vào dung dịch cloral hydrat khoảng 10-15 phút rồi rửa lại bằng nước cất Sau đó, ngâm vào dung dịch lục iod từ 5-10 giây và rửa lại bằng nước cất Cuối cùng, ngâm vào dung dịch son phèn khoảng 15-30 phút và rửa lại bằng nước cất cho đến khi dung dịch không còn màu Sau khi hoàn tất, mẫu vi phẫu đã sẵn sàng để soi bằng nước.

Kết quả cho thấy phần gân lá có tiết diện lõm ở mặt trên và lồi ở mặt dưới Gân lá được cấu tạo bởi hai lớp tế bào xếp dãy ở hai mặt, kèm theo lớp mô mềm đạo Ở trung tâm của gân, bó libe-gỗ được sắp xếp hình vòng cung, tạo thành cấu trúc libe-gỗ.

Hình 1.8 Cấu tạo vi phẫu và sơ đồ cấu tạo lá Trinh nữ hoàng cung

Hình 1.9 Mép lá với 2 lớp tế bào

Hình 1.10 Sơ đồ cấu tạo chi tiết lá Trinh nữ hoàng cung Kết quả bóc tách biểu bì lá:

Hình 1.11: Mảnh biểu bì mang lỗ khí có cấu tạo đặc trưng của lớp 1 lá mầm 1.3.3.2 Vi phẩu rễ

Vi phẫu rễ được thực hiện tương tự như vi phẫu lá, với kết quả là tiết diện tròn Lớp ngoài cùng là biểu bì, tiếp theo là lớp cutin dày Dưới lớp cutin là mô mềm đặc, gồm một lớp tế bào sắp xếp kế tiếp, sau đó là lớp mô mềm khuyết xen kẽ Bên trong, nội bì và trụ bì chứa các bó libe gỗ xếp gần nhau, tạo thành một vòng kín Libe bao gồm các đám tế bào nhỏ màu hồng, được sắp xếp lộn xộn, trong khi bó gỗ có từ 4 đến 5 mạch gỗ hướng tâm.

Hình 1.12 Cấu tạo vi phẫu và sơ đồ cấu tạo rễ 1.3.3.3 Khảo sát bột dược liệu

Phương pháp thử nghiệm bao gồm việc nhỏ 1-2 giọt nước lên lam và thêm một lượng bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm vào giọt nước đó Sau khi khuấy kỹ, đậy lamelle lên trên lam và sử dụng ngón tay để di chuyển nhẹ nhàng, giúp bột phân tán đều Cuối cùng, dùng giấy lọc để thấm nhanh nước thừa ở mép lamelle.

Bột lá dược liệu trinh nữ hoàng cung có màu nâu, mùi hắc và vị chát đắng Qua soi kính hiển vi, bột này cho thấy nhiều mảnh mô mềm, có thể chứa tinh thể calci oxalat hình kim, cùng với nhiều mạch xoắn và mảnh biểu bì mang lỗ khí.

Hình 1.14 Mảnh biểu bì mang lỗ khí Hình 1.15 Mảnh mô mềm

Hình 1.16 Mạch xoắn Hình 1.17 Tinh thể calci oxalat hình kim

Hình 1.18: Tinh thể canxi oxalat hình khối

THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Alkaloid

Đến nay đã có 36 alkaloid được phân lập và định danh, phần lớn thuộc khung crinin và lycorin.

Các alkaloid trong cây TNHC ở Việt Nam có sự biến đổi đáng kể về thành phần và hàm lượng theo thời kỳ sinh trưởng cũng như trước và sau khi ra hoa Đến nay, đã có 12 alkaloid được phân lập từ dịch chiết lá và thân hành của cây này Trong số đó, alkaloid thuộc khung crinin chiếm ưu thế với 7 loại, bao gồm 6-hydroxybuphanidrin, ambelin, crinin, powellin, crinamidin, 6-hydroxycrinamidin và 6-hydroxyundulatin Ngoài ra, khung lycorin chứa pratorinin, lycorin, hippadin và lycorin-1-OAc, cùng với khung augustamin có augustamin.

Có 4 Alkaloid từ dịch chiết lá, trong đó 6-hydroxycrinamidin là hợp chất Alkaloid đầu tiên được công bố (năm 1998) [2]

Flavonoid

Flavonoid của Trinh Nữ Hoàng Cung: so với nhóm Alkaloid thì Flavonoid có số lượng các hợp chất được công bố ít hơn, gồm 7 Flavonoid sau: [12]

(7) Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của các hợp chất Flavonoid trong cây TNHC.

(1) 4',7-dihydroxyflavan, (2) 2',4',7trihydroxydihydrochalcon, (3) 4',7-dihydroxy-3'- methoxyflavan, (4) 7-hydroxy-8-methoxyflavanon, (5) 4',7-dihydroxy-3'- vinyloxyflavan, (6) 5,6,3'-trihydroxy-7,8,4'-trimethoxyflavon, (7) Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl

Các nhóm hợp chất khác

Nhóm cacbohydrat: glucan A và B; lectin (methyl -α-mannopyranosid) đều được phân lập từ dịch chiết thân hành [12]

Coumarin: từ dịch chiết methanol, với hợp chất coumarin 4-senecioyloxymethyl-6,7- dimethoxycoumarin Hiện tại thành phần này chưa được phát hiện trong các loài crinum khác [12]

Nhóm acid hữu cơ: para-hydroxycinnamic methyl ester và 2,5-dihydroxycinnamic ethyl ester từ dịch chiết lá tươi [12]

TÁC DỤNG DƯỢC LÝ

chống oxy hóa

Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết trong nước TNHC được đánh giá qua thử nghiệm ORAC, cho thấy TNHC có khả năng dọn dẹp gốc tự do mạnh với giá trị ORAC đạt 1610 ± 150 àmol TE/g Giá trị này cao hơn nhiều so với các loại thảo mộc khác Một nghiên cứu của Liao H về 45 loại thảo mộc trong y học Trung Quốc cho thấy hoạt động ORAC dao động từ 40 đến 1990 àmol TE/g, trong đó chỉ có hai loại chiết xuất từ thảo dược đạt giá trị cao (Spatholobus suberectus: 1990 àmol TE/g; Sanguisorba officinalis).

1940 mmol TE/ g) cho thấy giá trị ORAC dịch chiết TNHC được phân tích trong nghiên cứu này cao hơn [9]

hoạt tính chống viêm

Dịch chiết nước TNHC có tác dụng chống viêm mạnh mẽ trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) thông qua việc ức chế enzym IDO và giảm sản xuất neopterin, dẫn đến tác động điều hòa trên các tế bào T và sản xuất IFN-γ Ngoài ra, dịch chiết TNHC cũng ngăn chặn sự thoái hóa tryptophan, cho thấy khả năng chống oxy hóa tương tự như vitamin C, E, resveratrol và các chiết xuất từ cacao, trà xanh hay đậu đen, thể hiện tác dụng ức chế mạnh lên PBMC khi bị kích thích.

Khả năng chống tăng sinh tế bào

Dịch chiết nước từ lá TNHC đã chứng minh khả năng hỗ trợ điều trị ung thư tuyến tiền liệt ở các dòng tế bào PC3 và LNCaP, cũng như trong trường hợp tăng sản tuyến tiền liệt BPH Nghiên cứu cho thấy dịch chiết này ức chế đáng kể sự tăng sinh tế bào, với hiệu quả phụ thuộc vào liều lượng sau 72 giờ nuôi cấy Đồng thời, mức độ ức chế tăng trưởng của các tế bào được so sánh với cisplatin, một chuẩn dương tính, cho thấy dòng tế bào nhạy cảm nhất bị ảnh hưởng rõ rệt.

The study found an inhibitory concentration of 2120 ± 41 µg/ml, which corresponds to approximately 10.6 µg/ml of total alkaloids and 0.6 µg/ml of crinamidine, following treatment with TNHC extract Additionally, the IC50 value was determined to be 2.3 ± 0.3 nM after treatment with cisplatin.

Sự tăng trưởng của các tế bào PC3 và LNCaP bị ức chế bởi dịch chiết TNHC ở liều

IC50 4540 ± 791 àg / ml (~ 22,7 àg/ ml alkaloid toàn phần; 1,3 àg/ ml crinamidin) và

Nghiên cứu cho thấy nồng độ alkaloid toàn phần là 11,7 àg/ml và crinamidin là 0,7 àg/ml, với giá trị trung bình 2344 ± 148 àg/ml Cisplatin thể hiện tác dụng chống tăng sinh mạnh mẽ trên các tế bào PC3 và LNCaP, với liều IC50 lần lượt là 6,3 ± 0,8 nM và 5,5 ± 0,9 nM.

Dịch chiết lá TNHC có tác dụng tích cực đối với PBMC và ức chế sự gia tăng của tế bào tuyến tiền liệt, nhờ vào các hợp chất chống oxy hóa và alkaloid như crinamidin Phân tích hóa thực vật cho thấy loài Crinum chứa hơn 170 hợp chất, chủ yếu là alkaloid Amaryllidaceae, với nhiều hoạt động sinh học như giảm đau và chống ung thư Các alkaloid crinan trong dịch chiết đã chứng minh có hoạt tính chống ung thư thông qua cơ chế gây độc tế bào mà không gây hại cho tế bào khỏe mạnh Cytokin IFN-γ kích hoạt IDO trong các tế bào, góp phần vào việc ức chế sự phát triển tế bào ác tính và tăng cường đáp ứng miễn dịch Tuy nhiên, khía cạnh ức chế miễn dịch của IDO có thể cho phép tế bào ung thư vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch, dẫn đến suy giảm miễn dịch và tiến triển bệnh.

IDO có tác dụng ức chế sự phát triển khối u thông qua các chất ức chế cụ thể, được chứng minh trong các mô hình động vật Nghiên cứu của Friberg et al cho thấy 1-MT (1-Methyl tryptophan) tăng cường hoạt tính tế bào T in vitro và làm chậm sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi ở chuột.

Uyttenhove et al đã chứng minh rằng biểu hiện ectopic của IDO từ tế bào khối u ở chuột miễn dịch thúc đẩy sự phát triển khối u ở chuột chưa miễn dịch, và điều này có thể được đảo ngược bằng cách sử dụng 1-MT Nghiên cứu của Muller et al trên chuột mang gen ung thư vú cho thấy rằng 1-MT có khả năng làm chậm sự phát triển khối u Tuy nhiên, khi kết hợp 1-MT với paclitaxel hoặc hóa trị liệu khác, sự tái phát nhanh chóng của khối u đã xảy ra ở những con chuột đã kiệt sức Các chất ức chế IDO khác như MTH-trp và brassinin phytoalexin cũng cho thấy hoạt tính chống ung thư tương tự Tóm lại, dịch chiết TNHC có tác dụng ức chế mạnh mẽ hoạt động IDO trong PBMC, chứng minh hiệu quả chống ung thư của TNHC Hơn nữa, tác dụng ức chế trên tế bào u tuyến tiền liệt đã được xác nhận Cả hai tác dụng này, bao gồm ức chế sự tăng trưởng tế bào khối u và phục hồi chức năng miễn dịch, có thể góp phần vào hiệu quả điều trị u tuyến tiền liệt của TNHC.

Ức chế phân bào

Nghiên cứu dược lý cho thấy cao MeOH từ thân và rễ của TNHC, cùng với cao chiết alkaloid toàn phần, có khả năng ức chế phân bào Trong mô hình gây u báng sacom và ung thư đùi ở chuột nhắt, các loại cao này đã làm giảm sự phát triển của khối u và di căn tế bào Alkaloid như lycorin có hoạt tính sinh học, ức chế protein và DNA của tế bào chuột, đồng thời ngăn chặn u báng sacom cấy ở chuột Thử nghiệm cho thấy lycorin làm giảm khả năng sống của tế bào u và ngăn chặn sự phát triển của virus bại liệt bằng cách ức chế các tiền chất cần thiết cho sự sinh trưởng của virus này.

Chống ung thư

G.S Ghosal nhà khoa học Ấn Độ cũng đã phân tích thành phần hóa học của cây TNHC giai đoạn 1984 – 1989 thấy có một số dẫn chất alkaloid có tác dụng chống ung thư. ông công bố tìm được một số dẫn chất alkaloid có tác dụng chống ung thư Đến năm

Năm 1989, các nhà nghiên cứu đã phân lập được hai alkaloid mới từ dịch chiết ở cán hoa cây TNHC, bao gồm epilycorin và epipancrassidin Một số nhà khoa học Nhật Bản như Kobayashi Shigenru, Tomoda và Masashi cũng đã phát hiện thêm các alkaloid khác từ cây TNHC Y học hiện đại đã chứng minh rằng TNHC tại Việt Nam chứa nhiều hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặn sự phát triển của tế bào u và kích thích hoạt động của tế bào lympho T Ngoài ra, TNHC còn có các hoạt chất hỗ trợ điều trị chứng phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung, cùng với các hoạt chất như crinafolidin, crinafolin và paratorimin có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư.

SƠ LƯỢC VỀ BỆNH U XƠ TỬ CUNG

Tỷ lệ và yếu tố thuận lợi

Tỷ lệ xuất hiện của UXTC khó xác định do khối u nhỏ thường không được phát hiện lâm sàng, với độ tuổi xuất hiện chủ yếu từ 30-50 tuổi, thời kỳ hoạt động sinh dục Mặc dù chưa có bằng chứng rõ ràng về ảnh hưởng của số lần mang thai và sinh đẻ, một số tác giả cho rằng việc sinh ít và vô sinh có thể là yếu tố thuận lợi Các thuốc tránh thai chứa estrogen liều thấp dường như không ảnh hưởng đến tỷ lệ xuất hiện của UXTC, trong khi yếu tố di truyền trong gia đình vẫn chưa được làm rõ.

Nguyên nhân

Giả thuyết về nguyên nhân phát sinh UXTC được nêu: [32]

Thuyết về virus: virus u nhú ở người (Human papilloma virus HPV) có thể gây ra khối u tổ chức liên kết ở chuột thực nghiệm.

Thuyết về nội tiết: UXTC hay xuất hiện vào thời kỳ hoạt động sinh dục, điều này gợi ý UXTC có mối liên quan đến nội tiết.

Estrogen đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích tổng hợp protein ở tử cung, đặc biệt trong thời kỳ mang thai khi nó làm tăng actomyosin và gây quá sản tế bào Mặc dù một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng liều cao estrogen có thể dẫn đến khối u tử cung, nhưng các nghiên cứu nội tiết ở phụ nữ UXTC lại cho thấy nồng độ estrogen không cao.

Cơ chế estradiol kích thích sự phát triển của UXTC vẫn chưa được làm rõ Điều này có thể liên quan đến rối loạn tổng hợp estrogen tại chỗ hoặc sự kháng estrogen cùng với catechol estrogen, những sản phẩm chuyển hóa của estradiol 17β, có khả năng ức chế và kìm hãm khối u.

Progesteron đóng vai trò quan trọng như một chất kháng estrogen, góp phần tăng cường tổng hợp các catechol estrogen (REDDY 1981) Khi nồng độ progesteron giảm, quá trình tổng hợp catechol estrogen cũng bị ảnh hưởng, dẫn đến sự giảm thiểu đáng kể trong cơ thể.

Nội tiết tăng trưởng đóng vai trò quan trọng trong sức khỏe sinh sản của phụ nữ, đặc biệt là ở những người có u xơ tử cung (UXTC), nơi nồng độ hormon tăng trưởng cao Nghiên cứu trên động vật cho thấy hormon tăng trưởng, khi kết hợp với estradiol, có khả năng làm tăng thể tích tử cung, điều này đã được chứng minh qua thí nghiệm trên chuột cái đã cắt bỏ tuyến yên và buồng trứng (Graltalora, 1959).

Triệu chứng

Hầu hết các khối u mới hình thành thường không gây ra biến đổi bất thường trong cơ thể, do đó nhiều chị em chỉ đi khám khi triệu chứng u xơ tử cung đã xuất hiện và khối u đã phát triển lớn Nếu bạn gặp phải các dấu hiệu như đau bụng dưới, chảy máu bất thường hoặc cảm giác nặng nề ở vùng bụng, hãy ngay lập tức nghĩ đến khả năng bị u xơ tử cung.

- Bụng to ra, cảm giác trằn nặng bụng dưới hoặc đau vùng hạ vị.

- Có hiện tượng rong kinh, kinh ra nhiều, rong huyết dài ngày, cơ thể mất máu gây mệt mỏi, xanh xao.

Đi tiểu nhiều lần, khó tiểu và bí tiểu có thể do khối u lớn chèn ép bàng quang Ngoài ra, táo bón và đau khi đại tiện thường xảy ra khi khối u chèn ép trực tràng Hơn nữa, khối u cũng có thể gây rối loạn tiêu hóa do chèn ép ruột.

Hướng điều trị

Khối u xơ chủ yếu là lành tính, nhưng phương pháp điều trị phụ thuộc vào kích thước của chúng; khối u lớn thường cần phẫu thuật, trong khi khối u nhỏ có thể được điều trị bằng thuốc để thu nhỏ và đào thải Bệnh nhân cũng có thể áp dụng các bài thuốc Đông y và thuốc Nam để hỗ trợ quá trình điều trị và loại bỏ khối u Đặc biệt, những người đã từng mắc khối u xơ có nguy cơ tái phát cao, vì vậy việc sử dụng các bài thuốc phòng ngừa là rất cần thiết.

Theo y học hiện đại, cây TNHC chứa các hoạt chất sinh học có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và kích thích hoạt động cũng như sự phát triển của tế bào lympho T.

Cây TNHC (Trinh nữ hoàng cung) là một trong những loại thảo dược độc đáo với hoạt chất hỗ trợ điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung, cũng như có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư nhờ các hợp chất như crinafolidin, crinafolin và paratorimin Mặc dù có đến 12 giống cây TNHC thuộc họ náng Crinum, nhưng mỗi giống lại có tác dụng khác nhau; ví dụ, Trinh nữ hoàng cung Campuchia không chỉ có tác dụng tương tự như TNHC Việt Nam mà còn có thêm khả năng tránh thai Nghiên cứu dược lý cho thấy cao methanol từ thân, rễ và cao chiết alkaloid toàn phần của TNHC có khả năng hạn chế sự phát triển của khối u và di căn tế bào Một số alkaloid như Lycorin trong cây còn cho thấy hoạt tính sinh học mạnh mẽ, ức chế protein và DNA của tế bào chuột, đồng thời ngăn chặn sự hình thành u báng cấy ở chuột.

Trong thử nghiệm, Lycorin cho thấy khả năng giảm sống sót của tế bào u và ngăn chặn sự phát triển của virus bại liệt bằng cách ức chế các tiền chất cần thiết cho sự sinh trưởng của virus này Nó cũng hỗ trợ điều trị u xơ tử cung, u xơ tiền liệt tuyến và u vú, đồng thời ngăn chặn sự phát triển của tế bào khối u ung thư Đặc biệt, thuốc có độ an toàn cao, không gây ra tác dụng phụ và không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận cũng như các chức năng sống khác của cơ thể.

KINH NGHIỆM SỬ DỤNG

Điều trị u tuyến tiền liệt, u nang buồng trứng, u xơ tử cung, u vú, viêm loét dạ dày

Dùng 30-40 g lá khô rửa sạch, thái nhỏ Sắc với 1 lít nước đến khi nào còn 1/2 lít nước chia đều uống 2 lần/ngày sau khi ăn Hoặc: lá Trinh nữ hoàng cung (20g), Nga truật (20g), Xuyên điền thất (10g), Lá đu đủ khô (50g).

Thuốc được sử dụng theo liệu trình 3 đợt, mỗi đợt kéo dài khoảng 30 ngày, sau đó nghỉ 7 ngày trước khi bắt đầu đợt tiếp theo Liệu pháp này giúp điều trị các khối u như u da, u nội tạng và hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung, ung thư đại tràng và u vú.

Chữa u xơ tiền liệt tuyến

Sử dụng 3 lá tươi cây TNHC, mỗi lá dài khoảng 5 tấc, rửa sạch và thái nhỏ Đun sôi với 2 chén nước cho đến khi còn lại nửa chén, uống 3 lần mỗi ngày sau bữa ăn.

Sử dụng lá khô: Sau khi phơi khô, lá cần được trần qua nước sôi và để ráo Mỗi ngày, bạn nên sắc 200g lá với 2 bát nước cho đến khi còn lại nửa bát, chia thành 3 lần uống trong ngày sau bữa ăn.

Ngoài ra, để phòng và chữa bệnh yếu sinh lý do tác động của thuốc, bệnh nhân u tuyến tiền liệt thêm cây đinh lăng vào vị thuốc.

Để sử dụng lá đinh lăng, bạn cần 50g lá tươi hoặc 200g lá khô, sắc chung với lá cây TNHC Lưu ý, nên đổ nước ngập dược liệu và sắc cùng với 2 bát nước cho đến khi còn nửa bát Chia nước sắc thành 3 lần uống trong ngày, sau khi ăn.

Theo TS.DS Nguyễn Thị Ngọc Trâm, nước sắc từ lá Trinh nữ hoàng cung được sử dụng trong dân gian để điều trị u xơ tử cung, u nang buồng trứng và u xơ tiền liệt tuyến Cách sử dụng là mỗi ngày uống nước sắc từ 3 lá Trinh nữ hoàng cung tươi, cắt nhỏ khoảng 1 - 2 cm, sau đó sao khô đến khi có màu hơi vàng Liệu trình uống kéo dài 7 ngày, sau đó nghỉ 7 ngày, tiếp tục uống 7 ngày Tổng cộng có 3 đợt uống, tương đương với 63 lá, xen kẽ giữa các đợt là thời gian nghỉ uống 7 ngày.

Điều trị viêm họng hạt

Dùng 30-40 g lá khô rửa sạch, thái nhỏ Sắc với 1 lít nước đến khi nào còn 1/2 lít nước chia đều uống 2 lần/ngày sau khi ăn Hoặc,

Lá TNHC 1/3 lá tươi, rễ cây dằng xay 3g Hai loại này rửa sạch, thêm vào hạt muối nhai ngậm hàng ngày [23]

Tăng sức đề kháng cho bệnh nhân ung thư

Nghiên cứu của bác sĩ Đông Y cho thấy sự kết hợp giữa TNHC và cây xạ đen mang lại hiệu quả điều trị ung thư ấn tượng Tinh chất trong TNHC và xạ đen giúp ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư, giảm đau và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể Thành phần sử dụng bao gồm TNHC (40 g) và xạ đen (40 g).

Cách dùng: đun sắc với 1,5 lít nước, uống trong ngày, sử dụng thường xuyên từ 2 tới 6 tháng [21]

Các bài thuốc của tiến sĩ võ văn chi

Suy nhược thần kinh, mất ngủ: TNHC 15 g dùng riêng hoặc phối hợp với cúc bạc đầu 15 g, chua me đất 30 g Sắc uống.

Viêm phế quản mạn tính có thể được điều trị bằng cách sử dụng 30g TNHC và 16g rễ lá cây cẩm, sắc nước và chia thành 2 lần uống trong ngày Đối với triệu chứng đau ngang thắt lưng và nhức mỏi gân xương, có thể dùng 20-30g rễ trinh nữ rang lên, tẩm rượu và sao vàng, sau đó sắc uống Ngoài ra, có thể phối hợp thêm với rễ cúc tần và bưởi bung để tăng hiệu quả điều trị.

Để chữa trị AIDS và các triệu chứng như sốt nhẹ, cảm giác không thoải mái toàn thân, da nổi mẩn đỏ và chảy nước, có thể sử dụng các vị thuốc như TNHC, trắc bách tiệp, hoàng bá, rau sam, thảo quyết minh và thạch lựu bì với tỷ lệ bằng nhau Nấu tất cả các vị thuốc này và chắt lấy nước đặc để tắm hoặc rửa Ngoài ra, có thể dùng 2g hùng hoàng nghiền thành bột trộn với lòng trắng trứng gà để bôi lên vùng bị đau.

Một số kinh nghiệm khác

Chỉ dùng lá TNHC có hai dạng: lá khô và lá tươi với liều lượng như sau:

Để sử dụng lá tươi, bạn cần 3 lá dài khoảng 5 tấc Sau khi rửa sạch, thái nhỏ và sắc với 2 chén nước cho đến khi còn lại nửa chén Chia nước sắc thành 3 lần uống hàng ngày sau bữa ăn.

Lá khô: Dùng 200g lá khô sắc với 2 chén nước Sắc đến khi nào còn nửa chén chia uống 3 lần trong ngày, sau khi ăn.

Thuốc được sử dụng theo chu kỳ, mỗi đợt kéo dài từ 20 đến 25 ngày, sau đó nghỉ 10 ngày trước khi bắt đầu đợt tiếp theo Ngoài ra, có thể lựa chọn uống một đợt liên tục trong 64 ngày cho nam và 49 ngày cho nữ.

Tác dụng: Chữa các bệnh u tuyến tiền liệt, u nang buồng trứng, u xơ tử cung, viêm họng, mụn nhọt, u vú, viêm loét dạ dày.

CHIẾT XUẤT ALKALOID TRONG TRINH NỮ HOÀNG CUNG .21

Các quy trình chiết cao cồn, alkaloid từ TNHC

6.1.1 Chiết cao cồn, phân đoạn alkaloid bằng phương pháp ngấm kiệt

Chiết cao cồn là một phương pháp chiết xuất dược liệu bằng cách ngâm trong dung môi khoảng 12 giờ, với chiều sâu ngập dược liệu từ 1-2 cm và thời gian ngâm khoảng 24 giờ Sau đó, dịch chiết được rút ra cho đến khi không còn phản ứng với thuốc thử Dragendorff và thuốc thử FeCl3 1% Tỷ lệ dung môi so với dược liệu là 10:1, sau đó gộp dịch chiết, lọc và cô đặc để thu được cao đặc.

Chiết xuất alcaloid được thực hiện bằng cách kiềm hóa dịch acid sau khi chiết flavonoid với NH3 25% đến pH 9-10 Sau đó, lắc dung dịch với CHCl3 cho đến khi không còn phản ứng với thuốc thử Dragendorff, và cuối cùng thu hồi dung môi để thu được cao đặc chứa alcaloid.

6.1.2 Chiết alcaloid từ lá TNHC kết hợp 2 phương pháp

Chiết xuất alcaloid bằng phương pháp SFE sử dụng hệ thống chiết bằng CO2 sản xuất tại Đài Loan, bao gồm ba bình chiết song song với thể tích 20 lít mỗi bình Điều kiện chiết SFE được thiết lập với áp suất 200 bar, nhiệt độ 50 độ C và thời gian chiết kéo dài 2 giờ, kèm theo 15% cồn 96% Dịch SFE sau khi chiết được thu hồi dung môi, tạo ra cao L-SFE, sau đó cao này được hòa tan trong HCl 1% Cuối cùng, dịch acid sẽ được chiết alcaloid AL-SFE.

- Chiết alcaloid bằng phương pháp ngấm kiệt: bột lá sau khi chiết SFE được tiếp tục chiết ngấm kiệt với cồn 70% Dịch chiết cồn được chiết alkaloid AL-NK [10]

Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết TNHC

- Các PĐ alkaloid được chiết từ các bộ phận của cây TNHC, sau đó tách PĐ bằng VLC và phân lập các hợp chất bằng CC [10]

- Sử dụng chất hấp phụ là silica gel tẩm đệm pH 9 đối với mẫu phân lập alkaloid.

Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập thành công các hợp chất từ các cao TNHC, bao gồm một alcaloid mới được công bố lần đầu tiên với cấu trúc 6-ethoxyundulatin Ngoài ra, còn có 9 hợp chất đã được công bố trước đây từ TNHC, bao gồm hippadin, augustamin, lycorin, undulatin, crinamidin, 6-hydroxybuphanidrin, 6-hydroxyundulatin, 6-hydroxycrinamidin và astragalin.

Thiết lập chất đối chiếu

Các hợp chất có độ tinh khiết cao, khối lượng khoảng 500 mg và là chất đánh dấu của cây TNHC được chọn để thiết lập CĐC

Các nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: 4 alcaloid là crinamidin, 6- hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin;

- Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết bằng HPLC: Điều kiện phân tích: cột: C8 Phenomenex (250 x 4,6 mm; 5 m); nhiệt độ cột: 40 o C; detector PDA; tốc độ dòng 1 ml/phút.

- Mẫu thử: nguyên liệu CĐC được pha 100 μg/ml trong pha động.

- Thành phần pha động của mỗi chất được trình bày ở Bảng 3.1.

Bảng 6.1 Thành phần pha động của các quy trình xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu CĐC bằng phương pháp HPLC.

Tên chất khảo sát Thành phần và tỷ lệ pha động

Crinamidin Methanol – acid phosphoric pH 3 (35 :

Lycorin Methanol – acid phosphoric pH 3 (10 :

Hippadin Methanol – acid phosphoric pH 3 (70 :

Xác định tính phù hợp hệ thống: các hệ số sắc ký đều đạt yêu cầu, quy trình đạt tính phù hợp hệ thống.

- Tính đặc hiệu: sắc ký đồ mẫu trắng không có tín hiệu tại vị trí thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ mẫu thử.

- Tớnh tuyến tớnh: tiờm 4 nồng độ của mỗi chất từ 10 500 (àg/ml)

Phương trình hồi qui và hệ số tương quan như sau:

Nhận xét: có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các CĐC trong khoảng nồng độ khảo sát (R 2 > 0,998).

Kết quả khảo sát về độ chính xác được trình bày trong Bảng 3.2, cho thấy RSD % độ tinh khiết sắc ký của các pic chính nhỏ hơn 2% Điều này chứng tỏ rằng các quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký là rất hiệu quả.

CĐC đạt yêu cầu về độ chính xác.

Bảng 6.2 Kết quả độ tinh khiết sắc ký (%) của các CĐC bằng HPLC.

Tên chất đối chiếu Độ tinh khiết sắc ký (%) Crinamidin 98,71% (RSD% 0,02) hydroxycrinamidin 0,08)

- Độ đúng: chưa thực hiện được vì hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia chưa phân phối các chất đối chiếu gốc này.

Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá nguyên liệu đối chiếu

- Tính chất: các alkaloid là bột kết tinh màu trắng.

- Điểm chảy: thực hiện theo hướng dẫn DĐVN IV - Phụ lục 6.7

- Định tính: bằng các phương pháp phổ nghiệm

Phổ UV-Vis: mẫu được hũa tan trong methanol, nồng độ 10 àg/ml Quyột phổ trong khoảng bước sóng từ 200 – 800 nm

Phổ MS: xác định pic cơ bản (m/z).

Phổ IR: dập viên KBr Xác định các dao động đặc trưng.

Phổ NMR: xác định độ dịch chuyển của proton và carbon.

- Xác định độ tinh khiết sắc ký: thực hiện phương pháp HPLC

- Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: các quy trình đều đạt yêu cầu.

Kết quả đánh giá độ tinh khiết sắc ký của các CĐC: kết quả được trình bày ở Bảng 6.4.2 Các nguyên liệu CĐC có độ tinh khiết sắc ký ≥ 95%.

- Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá các CĐC:

Các CĐC khảo sát được xây dựng tiêu chuẩn đánh giá như CĐC hóa học thứ cấp dùng cho phép thử định lượng

Đóng gói và đánh giá đồng nhất của các CĐC được thực hiện trong các lọ thủy tinh nâu trong tủ Glove-box, với nhiệt độ bảo quản từ 2 - 8 o C Quá trình đánh giá đồng nhất lô đảm bảo rằng các lọ CĐC được đồng nhất trong suốt giai đoạn gói Đặc biệt, đánh giá đồng nhất liên phòng thí nghiệm chứng minh rằng độ tinh khiết của các CĐC không bị ảnh hưởng bởi phòng thí nghiệm tham gia, đảm bảo rằng các lọ CĐC vẫn giữ được tính đồng nhất.

Bảng 6.3 Kết quả đánh giá đồng nhất lô của CĐC sau khi đóng gói.

TT Độ tinh khiết sắc ký TB giữa 2 lần phân tích (%)

TT Độ tinh khiết sắc ký TB giữa 2 lần phân tích (%)

- Xác định giá trị ấn định và giá trị công bố:

Bảng 6.4 Giá trị ấn định và giá trị công bố các CĐC

Tờn chất khảo sỏt x*% s* àx X%

6.4.2 Dữ liệu phổ của CĐC criamidin [14]

- UV/methanol:  max (nm) 212 và 286

- IR (KBr): υ max (cm -1 ) 3200 (-OH); 1616 (C=C); 1046 (-OCH2O-)

- ESI-MS (+): m/z = 318,46 [M+H] + , M phù hợp với công thức nguyên C17H19NO5.

- 1 H-NMR (500 MHz, CDC13): δ H (ppm) 1,59 (2H; m; H-4); 2,02 (1H; m; H-11); 2,39 (1H; dt; J=6; 11,5 Hz; H-11*); 2,79 (1H; m; H-12); 3,17 (1H; m; H-4a); 3,17 (1H; m; H-12*); 3,27 (1H; t; J = 2,5 Hz; H-2); 3,70 (1H; d; J = 17,5 Hz; H-6β); 3,76 (1H; d; J

= 3 Hz; H-1); 3,97 (3H; s; H-14); 4,18 (1H; d; J = 17,5 Hz; H-6α); 4,47 (1H; d; J = 2,5 Hz; H-3); 5,87 (2H; dd; J = 6,5; 1,5 Hz; H-13); 6,63 (1H; s; H-10).

Dữ liệu phổ của CĐC 6-hydroxycriamidin:

- UV/methanol:  max (nm) 212 và 286

- IR (KBr): υ max (cm -1 ) 3508 (-OH); 1616 (C=C); 1286 (-OCH3); 1037 (-OCH2O-)

- ESI-MS (+): m/z = 334,38 [M+H] + ] + , M phù hợp với công thức nguyên C17H19NO6

- 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3+MeOD): δ H (ppm) 1,52 (1H; m; H-4β); 1,60 (1H; m; H- 4α); 1,77 (1H; m; H-11); 2,35 (1H; m; H-11*); 2,70 (1H; m; H-12); 3,12 (1H; m; H- 12*); 3,28 (1H; brt; H-2); 3,68 (1H; dd; J = 13,5; 10 Hz; H-4a); 3,74 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-1); 4,05 (3H; s; H-14); 4,43(1H; d; J = 2 Hz; H-3); 5,19 (1H; s; H-6); 5,90 (2H; d; J = 1 Hz; H-13); 6,65 (1H; s; H-10)

- 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3+MeOD): δ C (ppm) 28,7 (C-4); 35,5 (C-11); 42,1 (C- 10b); 46,3 (C-12); 53,7 (C-1); 54,6 (C-4a); 56,4 (C-2); 59,7 (C-14); 64,9 (C-3); 85,2 (C-6); 96,7 (C-10); 101,2 (C-13); 119,3 (C-6a); 134,4 (C-8); 139,2 (C-10a); 142,9 (C- 7); 149,8 (C-9).

6.4.3 Dữ liệu phổ của CĐC lycorin [14]

- UV/methanol:  max (nm) 238 và 288

- IR (KBr): υ max (cm -1 ) 3333 (-OH); 1500 (C=C); 1018 (-OCH2O-).

- ESI-MS (+): m/z = 288,44 [M+H] + , M phù hợp với công thức nguyên C16H17NO4

- 1 H-NMR (500 MHz, DMSO): δ H (ppm) 2,20 (1H; m; H-12); 2,44-2,50 (2H; m; H- 11); 2,49 (1H; overlapped; H-10b); 2,60 (1H; d; J ,5 Hz; H-4a); 3,19 (1H; m; H- 12*); 3,32 (1H; d; J = 14,5 Hz; H-6β); 3,97 (1H; br s; H-2); 4,01 (1H; d; J = 14 Hz; H- 6α); 4,27 (1H; brs; H-1); 4,78 (1H; d; J = 4 Hz; 1-OH); 4,89 (1H; d; J = 6,5 Hz; 2- OH); 5,36 (1H; brt; H-3); 5,94-5,95 (2H; 2d; J = 0,5; 1 Hz; H-12); 6,67 (1H; s; H-7); 6,80 (1H; s; H-10).

6.4.4 Dữ liệu phổ của CĐC hippadin

- UV/methanol:  max (nm) 247; 297 và 349.

- ESI-MS (+): m/z = 286,31 [M+Na] + , M phù hợp với công thức nguyên C16H9NO3

- 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ H (ppm) 6,16 (2H; s; H-12); 6,90 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-4); 7,47 (1H; t; J = 8 Hz; H-2); 7,64 (1H; s; H-11); 7,74 (1H; d; J = 8 Hz; H-3); 7,91 (1H; d; J = 8 Hz; H-1); 7,97 (1H; s; H-8); 8,04 (1H; d; J = 3,5 Hz; H-5).

Xây dựng phương pháp HPLC,CE, dấu vân tay để định tính, định lượng alkaloid 26

Mẫu đối chiếu alcaloid: crinamidin (98,71%), 6-hydroxycrinamidin (96,75%), 6- hydroxypowellin (98,56%), 6-hydroxyundulatin (99,66%), undulatin (98,50%) và 6- hydroxybuphanidrin (98,65%).

6.5.1 Quy trình xử lý mẫu

Để thực hiện mẫu thử alkaloid, cân 10 g bột lá vào cốc và thêm 50 ml cồn 70%, sau đó siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 50 ± 2 o C, lặp lại 3 lần Toàn bộ dịch chiết được thu hồi dung môi và kiềm hóa bằng amoniac 25% đến pH 9 – 10 Tiến hành chiết với 30 ml cloroform, lặp lại 3 lần Cuối cùng, gộp toàn bộ dịch cloroform và thu hồi dung môi để thu được alcaloid AL-SA.

6.5.2.Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng HPLC

Các điều kiện sắc ký được thiết lập với cột C8 Phenomenex C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm), tốc độ dòng 1 ml/phút, bước sóng phát hiện 214 nm, thể tích tiêm 10 μl, và nhiệt độ cột 40 °C Phương pháp rửa giải sử dụng chương trình dung môi với pha động gồm methanol, dung dịch acid H3PO4 pH 3 và 0,2% TEA.

6.5.3 Quy trình định lượng đồng thời 6 alcaloid bằng CE

Điều kiện điện di bao gồm cột mao quản silica nung chảy với chiều dài tổng cộng 64,5 cm và chiều dài hiệu quả 56 cm, đường kính trong 50 μm Thể tích tiêm mẫu là 50 mbar trong 5 giây, với điện thế 25 kV và nhiệt độ cột duy trì ở 25°C Sóng phát hiện được đặt ở 214 nm Dung dịch điện di được chuẩn bị với dinatri tetraborat 25 mM, SDS 50 mM, và pH được điều chỉnh tới 9,5 bằng natri hydroxid 1N, cùng với 10% methanol trong dung dịch điện di.

Kỹ thuật điện di MEKC.

Bảng 6.5 Kết quả định lượng alcaloid trong lá TNHC (n = 6)

Tờn alcaloid Hàm lượng alcaloid trong lỏ TNHC (àg/g)

Tờn alcaloid Hàm lượng alcaloid trong lỏ TNHC (àg/g)

6.5.6 Phương pháp dấu vân tay định tính alkaloid

Mẫu thử: alcaloid AL-SA

Mẫu đối chiếu: các chất đối chiếu như trong phần định lượng alcaloid bằng phương pháp HPLC

Bản sắc ký tráng sẵn silica gel F254; chiều dài 10 cm; chiều rộng giữa các vết khoảng 1cm; khai triển một lần ở nhiệt độ phòng

Mẫu thử alcaloid: CHCl3 – MeOH – NH3 (5 : 1 : 0,05)

Tiến hành: chấm riêng biệt trên bản mỏng khoảng 20 μl dung dịch thử và đối chiếu.

Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi di chuyển khoảng 10 cm Sau đó, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff để phát hiện alcaloid hoặc bằng thuốc thử FeCl3 1% để nhận diện flavonoid.

Phát hiện các hợp chất bằng đèn UV 254 hoặc 365 nm, hoặc sử dụng phương pháp TT Dragendorff Đánh giá sắc ký đầy DVT – SKLM alkaloid TNHC yêu cầu có tối thiểu 6 vết có màu sắc tương đồng và chỉ số Rf tương đương với vết chuẩn CĐC.

6.5.6.2 Phương pháp DVT – HPLC Điều kiện: điều kiện sắc ký, các bước tiến hành xác định DVT alcaloid như Mục 3.4.2; xác định DVT flavonoid TNHC như Mục 3.4.3. Đánh giá: chọn các pic có tỷ lệ diện tích ≥ 5% tại λ = 214 nm (alkaloid) để ghi nhận thời gian lưu tương đối, % diện tích pic và phổ UV.

- DVT– HPLC alcaloid: mẫu thử có ít nhất 6 pic đặc trưng như sau:

Pi c Thời gian lưu (phút) diện tích (%) Phổ UV-Vis

Các pic alcaloid đều có phổ UV tương tự: λmax = 214 nm vai ở 281 nm

Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho bột lá TNHC

Một số chỉ tiêu của TCKN lá TNHC

Lá đã phơi hoặc sấy khô của cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae)

Mô tả: lá khô có màu từ vàng nâu đến nâu sẫm, dai, mùi hăng đặc biệt, dài 50 - 90 cm, rộng khoảng 2 - 5 cm Vị đắng.

Bột có mùi hăng và vị đắng, bao gồm các mảnh biểu bì mang lỗ khí với tinh thể calci oxalat hình kim và tế bào hình đa giác thuôn dài Ngoài ra, bột còn chứa mảnh mạch xoắn, hạt tinh bột riêng lẻ có dạng hình bầu dục và tễ hình sao Sợi cuộn nhiều, với sợi vách dày và khoang hẹp Độ ẩm của bột không vượt quá 12% theo tiêu chuẩn DĐVN IV - Phụ lục 9.6.

Tro không tan trong acid HCl: ≤ 2% (DĐVN IV - Phụ lục 9.7).

Tro toàn phần không được vượt quá 15% theo quy định tại DĐVN IV - Phụ lục 9.8 Đối với định tính, cần xác định hai nhóm hoạt chất chính là alcaloid và flavonoid, có thể thực hiện bằng một trong hai phương pháp đã được quy định.

A Phương pháp dấu vân tay sắc ký lớp mỏng: các bước tiến hành và phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 6.5.6.1.

B Phương pháp dấu vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao: các bước tiến hành và phương pháp đánh giá được thực hiện theo Mục 6.5.6.2. Định lượng: định lượng hai nhóm hoạt chất chính là alcaloid và flavonoid.

Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Định lượng alkaloid:

Pha động: Dung môi A: methanol

Dung môi B: dung dịch acid phosphoric pH 3 và 0,2% TEA.

Dung dịch đối chiếu: hòa tan crinamidin và 6-hydroxycrinamidin trong pha động để cú dung dịch đối chiếu cú nồng độ lần lượt là 150 àg/ml và 100 àg/ml.

Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu vào cốc có mỏ 250 ml, thêm

Sử dụng 50 ml ethanol 70% (TT) và siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 50 ± 2 o C, lặp lại 3 lần Cô dịch chiết ethanol đến gần cạn, để nguội và kiềm hóa bằng dung dịch amoniac 25% (TT) đến pH 9 – 10 Chuyển dịch chiết vào bình lắng gạn và chiết lấy alcaloid bằng cách lắc với 30 ml cloroform (TT) trong 3 lần Cô dịch chiết cloroform đến cạn dung môi để thu được cắn alcaloid Hòa tan cắn này trong bình định mức 10 ml với dung môi A và B theo tỷ lệ 25 : 75, thêm dung môi đến vạch và lắc đều Cuối cùng, lọc qua màng lọc 0,45 µm Điều kiện sắc ký sử dụng cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh.

Detector: PDA, bước sóng 214 nm.

Tốc độ dòng: 1ml/phút.

Để kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký, cần tiến hành sắc ký với dung dịch đối chiếu Phép thử sẽ chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích crinamidin cùng 6-hydroxycrinamidin không vượt quá 2,0%.

Tiến hành sắc ký để phân tích dung dịch thử và dung dịch đối chiếu, từ đó xác định hàm lượng crinamidin (C17H19NO5) và 6-hydroxycrinamidin (C17H19NO6) trong dược liệu dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ Dược liệu cần đạt tối thiểu 120 µg/g crinamidin và 100 µg/g 6-hydroxycrinamidin tính trên dược liệu khô kiệt Đồng thời, cần thực hiện định lượng flavonoid để hoàn thiện phân tích.

Pha động: methanol – dung dịch acid phosphoric pH 4 (20 : 80).

Dung dịch đối chiếu: hòa tan astragalin và isoquercitrin trong để có dung dịch đối chiếu cú nồng độ lần lượt là 250 àg/ml và 100 àg/ml.

Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu vào cốc có mỏ 250 ml, thêm

Sử dụng 50 ml ethanol 70% (TT), thực hiện siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 50 ± 2 o C, lặp lại 3 lần Cô dịch chiết đến gần cạn, để nguội và acid hóa bằng dung dịch acid hydrochloric 1% (TT) đến pH 3 – 4 Chuyển dịch chiết vào bình lắng gạn và chiết flavonoid bằng cách lắc với 30 ml ethyl acetat (TT), thực hiện 3 lần Cô dịch chiết ethyl acetat đến cạn dung môi để thu được cắn flavonoid, sau đó hòa tan trong bình định mức 10 ml với dung môi pha động, thêm dung môi đến vạch và lắc đều Cuối cùng, lọc qua màng lọc 0,45 µm Điều kiện sắc ký sử dụng cột thép không gỉ Phenomenex (25 x 4,6 mm) với pha tĩnh C8.

Detector: PDA, bước sóng 265 nm.

Tốc độ dòng: 1ml/phút.

Để kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký, cần tiến hành sắc ký với dung dịch đối chiếu Phép thử chỉ được coi là hợp lệ khi độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic của astragalin và isoquercitrin không vượt quá 2,0%.

Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Dựa vào diện tích pic

Trong nghiên cứu này, chúng tôi so sánh hàm lượng của hai flavonoid astragalin (C21H20O11) và isoquercitrin (C21H20O12) trong dược liệu Để đạt tiêu chuẩn chất lượng, dược liệu cần phải chứa ít nhất 250 µg/g astragalin và 100 µg/g isoquercitrin, được tính trên cơ sở dược liệu khô kiệt.