ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
V t liệu
- Thu th p mẫu trong 15 tháng (từ tháng 3/2014 đến tháng 5/2015).
- Xét nghiệm (xét nghiệm và định type NoV): Tháng 4 - tháng 7 năm 2015
- Máy real time PCR Rotogene (Qiagen, Đức)
- Máy luân nhiệt (Eppendorf, Hoa Kỳ)
- Máy điện di (BioRad, Hoa Kỳ)
- Máy chụp ảnh gel VersaDoc (BioRad, Hoa Kỳ)
- Máy ly tâm (Hettick, Đức),
- Đĩa 96 giếng Maxisorp (Nunc, Hoa Kỳ)
- Đầu côn có lọc, ống khử trùng: 0,1 ml, 0,2 ml, 1,5 ml.
Ngoài ra, trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị hỗ trợ như cân phân tích, máy đo pH, máy trộn, micropipet, máy minispin và lò vi sóng cũng rất cần thiết.
- Sinh phẩm cho phản ứng Realtime phát hiện các chủng NoV trong mẫu phân: + Kit tách chiết ARN – High pure viral RNA kit (Roche, Đức)
+ Bộ sinh phẩm real time RT-PCR (SuperScript III Platinum One-Step qRT- PCR Kits-Invitrogen, Hoa Kỳ)
+ Chứng dương NoV chủng GI.1 và GII.4 (Phòng Miễn dịch Vắc xin, Viện
Vệ sinh Dịch tễ Trung ương)
+ Cặp mồi và đầu dò đặc hiệu NoV trong phản ứng Realtime RT-PCR
+ Bộ sinh phẩm One-step RT-PCR (Qiagen, Đức)
+ Bộ Kit Wizard SV gel and PCR Clean-up System (Promega, Hoa Kỳ)
- Sinh phẩm cho xác định kiểu gen FUT-2:
+ Kit tách chiết Gentra Puregene Buccal Cell Kit (Qiagen, Đức)
+ Mồi amplify đoạn 1033 bp của gen FUT 2 (IDT, Hoa Kỳ)
+ Bộ Kit Wizard SV gel and PCR Clean-up System (Promega, Hoa Kỳ)
- Sinh phẩm cho xác định kiểu hình HBGA (ABH và Lewis)
+ Các loại kháng thể đơn dòng A, B, H, Lewis x, Lewis y, Lewis a, Lewis b (Covance, Hoa kỳ)
+ Các loại kháng thể cộng hợp đề kháng chuột (KPL, Hoa Kỳ)
Để thu thập mẫu phân, sử dụng thìa sạch để lấy khoảng 5g phân từ bô của trẻ không có triệu chứng tiêu chảy, sau đó cho vào ống vô trùng không chứa chất bảo quản Bảo quản ống mẫu ở nhiệt độ -20°C và vận chuyển đến Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương định kỳ mỗi tháng một lần Tại phòng thí nghiệm, mẫu phân sẽ được bảo quản ở -70°C cho đến khi tiến hành xét nghiệm.
Để thu thập mẫu niêm mạc, cần thực hiện ít nhất 30 phút sau khi trẻ ăn Sử dụng chổi lấy mẫu, quệt vào hai má trong của trẻ, mỗi bên 10 lần Sau đó, cắt phần lông chổi và cho vào ống chứa 1 ml đệm bảo quản Mẫu cần được bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 1 tháng trước khi tiến hành tách chiết ADN.
Để thu thập mẫu nước bọt, sử dụng ống hút để lấy khoảng 100-200 µl nước bọt từ mỗi trẻ Sau khi lấy mẫu, cần bảo quản ở nhiệt độ 4 độ C và vận chuyển đến Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
Số lượng mẫu và mục đích nghiên cứu được thể hiện ở sơ đồ sau:
Hìn 2.1 S đồ tóm tắt các loạ mẫu t u t ập sử dụn c o n ên cứu
2.4.2 Kỹ thuật real time-RT PCR phát hiện ARN của NoV a Phương pháp tách chiết ARN từ mẫu phân
Bước 1: Mẫu phân được lấy từ -80 o C Sau khi tan băng, pha loãng 4 lần bằng nước DEPC-H2O (100 àl mẫu: 300 àl nước DEPC-H2O)
Bước 2: Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4 o C, thu dịch nổi.
ARN đ ợc tách chiết t eo ớng dẫn của bộ kít H pure v ral ARN của n à sản xuất Roc e, Đức Cụ thể:
Bước 1: Cho 200 àl dịch nổi mẫu pha loóng vào ống eppendorf 1,5 ml chứa hỗn hợp poly (A) carrier ARN: Binding Buffer, trộn đều trong 15 giây.
Bước 2: Ủ ở nhiệt độ thường (15-25 o C) trong 10 phút sau đó spindown.
Để tiến hành bước 3, hãy đặt cột vào tuýp hứng 2 ml mới Tiếp theo, đổ toàn bộ dung dịch mẫu cùng với poly (A) carrier ARN: Binding Buffer vào cột, lưu ý không làm ướt mép cột Sau đó, đóng nắp và ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 15 giây Cuối cùng, chuyển cột sang tuýp 2 ml mới.
Bước 4: Cẩn th n mở nắp cột, tránh không làm bắn giọt và nhiễm chéo Thêm
500 à l Inhibitor Removal Buffer vào cột.Đúng nắp và ly tõm 8.000 vũng/phỳt trong 1 phút Chuyển cột sang tuýp 2 ml mới.
Bước 5: Cẩn th n mở nắp cột và cho 450 ml Wash Buffer vào ống lọc Đóng nắp và ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút Chuyển cột sang tube 2 ml mới.
Bước 6: Mở nắp cột cẩn thận và thêm 450 ml Wash Buffer (lần 2) vào ống lọc Đóng nắp lại và ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút Sau đó, loại bỏ dịch trong ống 2 ml và ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong khoảng 10 giây.
Bước 7: Chuyển cột sang tuýp 1,5 ml mới và cho 50 àl dung dịch Elution Buffer vào giữa cột và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 8: Bỏ cột, thu dịch, bảo quản ARN của virus ở -80°C. b Kỹ thuật realtime- RT PCR phát hiện ARN của NoV
Phát hiện ARN của Norovirus (NoV) trong bệnh phẩm sử dụng cặp mồi và đầu dò đặc hiệu với độ nhạy và đặc hiệu cao Đầu dò này cho phép khẳng định sự hiện diện của ARN NoV, trong khi cặp mồi nhắm vào đoạn gen ít thay đổi nhất giữa gen mã hóa protein polymerase và gen mã hóa vỏ (capsid) của virus Một đoạn gen khoảng 100 bp sẽ được nhân lên và nhận biết bởi đầu dò trong vùng gen này, với tín hiệu huỳnh quang để xác định sự có mặt của ARN virus Quy trình kỹ thuật này đã được Kageyama và cộng sự (2003) áp dụng, với ngưỡng dương tính thông thường của kỹ thuật real time RT-PCR là 40 Các mẫu dương tính có Ct350àl, lặp lại bước trờn
Bước 6: Loại bỏ dịch Nhỏ 0,75ml dung dịch Membrane wash solution vào cột Bước 7: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch.
Bước 8: Thêm 0,5ml Membrane wash solution vào cột, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 9: Loại bỏ dịch và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút
Chuyển cột sang tuýp 1.5ml mới và thêm 50µl H2O-DEPC vào chính giữa màng Sau đó, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút Nếu cần tăng nồng độ sản phẩm, có thể giảm lượng H2O-DEPC.
H2O cho vào ớt nhất là 15àl.
Bước 11: Bỏ cột và bảo quản sản phẩm ở -20 o C.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được kiểm tra độ tinh khiết và hàm lượng thông qua việc đo OD tại bước sóng 260 nm và điện di trên gel agarose 1% Các mẫu đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết (chỉ có một băng duy nhất trên gel agarose) và hàm lượng (nồng độ tối thiểu 20 ng/µl) sẽ được gửi đến công ty Macrogen (Hàn Quốc) để thực hiện giải trình tự gen.
Kết quả giải trình tự gen đã được phân tích thông qua phần mềm Mega5, và cây phân loại được xây dựng dựa trên các trình tự có sẵn trên Genbank cũng như các trình tự gen của các chủng NoV được phát hiện trong nghiên cứu này.
2.4.4 Phương pháp xác định kiểu gen FUT-2
ADN được tách chiết từ mẫu niêm mạc miệng của trẻ theo hướng dẫn của bộ kít Gentra Puregene Buccal Cell của nhà sản xuất Qiagen, Đức Cụ thể:
Để thu thập mẫu tế bào niêm mạc miệng, sử dụng chổi lấy mẫu quệt vào hai má trong của trẻ, mỗi bên 10 lần, tốt nhất là thực hiện sau khi trẻ ăn hoặc uống 1 giờ Cắt phần lông chổi và cho vào ống 1,5ml, mẫu có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong tối đa 1 tháng trước khi tiến hành tách chiết ADN ADN có thể được tách chiết ngay lập tức hoặc lưu trữ trong ống thu mẫu niêm mạc miệng ở nhiệt độ phòng (15-25°C) trong tối đa 1 tháng.
Xử lý số liệu
Các số liệu thu th p được xử lý bằng phương pháp thống kê y học và chương trình Epi info 7, SPSS.
Xử lý trìn tự nucleot de
+ Sau khi nh n được các trình tự nucleotide từ Macrogen, các trình tự thô được xử lý bằng phần mềm Bioedit 7.0 và Mega 5.0.
+ Kiểu gen của NoV được xác định bằng cách đăng tải trình tự nucleotide lên trang web http://www.rivm.nl/mpf/NoV/typingtool
Kiểu gen của FUT-2 tại các vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 đã được xác định thông qua phân tích đỉnh sóng bằng phần mềm Bioedit 7 Các trình tự đã được chỉnh sửa thủ công để phát hiện vị trí dị hợp tử Tất cả các vị trí đa hình được gửi để tính toán tỷ lệ đột biến ở các vị trí C357T, A385T, G428A, C571T, C628T, 685delTGG, G849A, nhằm dự đoán mối quan hệ giữa các đột biến này và độ nhạy cảm của virus norovirus (NoV).
SƠ ĐỒ TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Hìn 2.2 S đồ tóm tắt nộ dun n ên cứu
Phát hiện ARN trong mẫu phân của NoV bằng kỹ thu t real time- RT PCR
Tách ADN từ mẫu niêm mạc miệng của trẻ khỏe mạnh
Phát hiện kháng nguyên trong mẫu nước bọt bằng kỹ thu t ELISA
Xác định NoV genotype bằng khuếch đại vùng gen C và giải trình tự.
Xác định các kiểu SNP trên gen FUT2 và thực hiện giải trình tự để đánh giá mối liên quan giữa kiểu hình của kháng nguyên HBGA với tính cảm nhiễm NoV Đồng thời, nghiên cứu cũng xem xét mối liên hệ giữa tính cảm nhiễm NoV và kiểu gen để hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền ảnh hưởng đến sự nhạy cảm với virus này.
Xác định tỷ lệ nhiễm
NoV và kiểu gen của các chủng NoV ở trẻ khỏe mạnh
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Mối liên hệ giữa tính cảm nhiễm NoV với kiểu gen của FUT-2
Có thể nói chủng GII.17 đang ngày một lan rộng và nhanh không kém gì GII.4.
Như v y, nghiên cứu này của chúng tôi đã góp phần đánh giá vai trò tiềm ẩn của NoV lưu hành ở trẻ em Việt Nam và thế giới nói chung.
3.3 Mố l ên ệ ữa tín cảm n ễm NoV vớ k ểu en của FUT-2
Mức độ cảm ứng của cơ thể đối với virus Norovirus (NoV) liên quan đến gen FUT-2, gen này mã hóa enzym fucosyltransferase α(1,2) để điều chỉnh biểu hiện của kháng nguyên H, từ đó xác định tình trạng tiết của các kháng nguyên ABH trong nhóm máu Việc xác định trạng thái tiết trong nhóm máu là quan trọng cho nghiên cứu mối liên quan giữa bệnh và các đột biến nucleotit trong gen FUT-2, đặc trưng cho từng dân tộc Nghiên cứu này đã tiến hành giải trình tự hai exon của gen FUT-2 từ 85 mẫu trẻ từ 6-60 tháng tuổi tại một trường mầm non ở tỉnh Hà Nam, nhằm mô tả tỷ lệ đa hình nucleotit đơn (SNP) ở trẻ nhiễm và không nhiễm NoV, từ đó xác định mối quan hệ giữa SNP và sự nhạy cảm với nhiễm NoV.
3.3.1 Tần số SNP tại vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trên gen FUT-2
Sau khi tiến hành giải trình tự, chúng tôi đã sử dụng phần mềm Bioedit v7.1 để xác định các SNP Kết quả cho thấy có 7 SNPs bao gồm C357T, A385T, G428A, C571T, C628T, 685delTGG và G849A trong vùng mã hóa của gen FUT-2 Các mẫu này được thu thập từ 85 trẻ mẫu giáo ở Hà Nam thông qua việc phân tích tế bào niêm mạc miệng Chúng tôi đã ghi nhận được hình tín hiệu của các SNP ở gen FUT2.
Tần số các đột biến nucleotit này được trình bày trong bảng 3.5.
Bản 3.5 Tần số các SNP tạ v trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trên en
FUT-2 ở trẻ tạ 01 tr ờn mẫu áo tạ Hà Nam
Theo bảng 3.5, đột biến C357T là phổ biến nhất ở Việt Nam, với chỉ 1 trẻ (1,2%) có kiểu gen AA trong số 85 trẻ được khảo sát Tần số kiểu gen Aa và aa lần lượt là 15,3% và 83,5% Đột biến A385T cũng phổ biến, với tần số kiểu hình Aa đạt khoảng 52,9% trong quần thể, trong khi 28,2% trẻ mang kiểu gen aa Không có trẻ nào trong số 85 trẻ khảo sát mang SNP ở vị trí 685delTGG và không có kiểu hình aa ở các vị trí 428, 571, 628, 849 trong quần thể.
Kết quả thu được phù hợp với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam và các quần thể khác nhau về khu vực địa lý, như thể hiện trong bảng 3.6.
Bản 3.6 Các tần số đột b ết ở FUT-s ở các quần t ể C âu Á lán ền và V ệt Nam
Nam Hán 154 84,4 43,5 0 0,7 0 - 0 Chang et al[25]
Thái Lan 530 88,9 50,94 0 0,6 0,4 - 0,9 Chang et al[25]
3.3.2 Mối quan hệ giữa alen đồng hợp lặn A385T và sự kháng nhiễm NoV
SNP C357T không ảnh hưởng đến cấu trúc amino axit của enzyme fucosyltransferase, trong khi SNP A385T gây ra sự không ổn định cho enzyme này Nghiên cứu đã chỉ ra mối liên hệ giữa SNP A385T và khả năng kháng nhiễm virus Norovirus (NoV) Các mẫu được thu thập từ trẻ em tại trường mầm non ở Hà Nam trong khoảng thời gian từ tháng 03/2014 đến tháng 05/2015, với mẫu phân được thu thập hàng tháng Tổng cộng, 85 mẫu tế bào niêm mạc miệng từ 85 trẻ em đã được thu thập, trong đó NoV được phát hiện và xác định kiểu gen từ 83 mẫu phân Trong số 31 trường hợp dương tính với NoV, có 9 trường hợp nhiễm nhóm gen NoV GI và 22 trường hợp nhiễm nhóm gen NoV GII.
Bản 3.7 P ân bố k ểu en 385 tron 85 n ờ có mẫu p ân đ ợc xét n ệm lây n ễm NoV
Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ trẻ em nhiễm virus Norovirus (NoV) giữa các nhóm gen là tương đương Cụ thể, trong số 9 trường hợp nhiễm NoV genotype I (GI), có 3 trường hợp (33,3%) mang gen aa, trong khi trong tổng số 22 trường hợp nhiễm NoV genotype II (GII), có 5 trường hợp (22,7%) mang gen aa.
Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng sự tiết kháng nguyên HBGA trên niêm mạc và trong dịch tiết có liên quan đến việc tăng nguy cơ nhiễm virus norovirus (NoV), trong khi những người không tiết HBGA có khả năng nhiễm NoV thấp hơn Thêm vào đó, các nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học cho thấy những người tiết kháng nguyên có mức kháng thể cao hơn và thường xuyên bị tái nhiễm NoV hơn so với những người không tiết HBGA Bài viết này sẽ trình bày mối quan hệ giữa bảy đột biến ở gen FUT-2 và độ nhạy cảm với nhiễm NoV.
Nghiên cứu cho thấy số lượng cặp mẫu phân-niêm mạc miệng của trẻ thu thập không nhiều, do đó chưa thể kết luận rõ ràng về mối liên quan giữa kiểu gen đồng hợp lặn aa và sự kháng nhiễm NoV Tuy nhiên, có thể nhận thấy rằng trẻ có kiểu gen aa ở vị trí A385T có xu hướng kháng nhiễm NoV nhóm GII.
3.4 Mố t n quan ữa k án n uyên n óm máu t n dun tổ c ức và k ả năn cảm n ễm NoV ở trẻ k ỏe mạn tạ tr ờn mầm non ở Hà Nam
3.4.1 Kiểu hình HBGA ở trẻ khỏe mạnh tại trường mầm non Hà Nam
Tình trạng tiết kháng nguyên HBGA được quyết định bởi enzyme FUT-2, trong khi kiểu hình Lewis ab, xy và ABO phụ thuộc vào enzyme FUT-3 cùng với enzyme A/Enzyme B Để xác định tình trạng tiết kháng nguyên HBGA, cần xem xét kiểu hình Lewis ab và xy, trong đó sự vắng mặt của kháng nguyên Lewis b và Lewis y, cùng với sự hiện diện của kháng nguyên Lewis a và Lewis x, chỉ ra kiểu hình không tiết Việc phân tích sự biểu hiện của hai loại kháng nguyên tiền chất khác nhau (H1 cho Lewis ab và H2 cho Lewis xy) giúp đánh giá chính xác hơn tình trạng tiết HBGA.
Nghiên cứu này xác định HBGA, bao gồm kháng nguyên Lewis ab, Lewis xy và nhóm ABO, trong 119 mẫu nước bọt của trẻ khỏe mạnh tại trường mầm non ở Hà Nam bằng phương pháp ELISA Kết quả cho thấy sự phong phú của kiểu hình HBGA, với kiểu hình Le a-b+ Le x-y+ là phổ biến nhất, chiếm 46,2% và 52,9% tương ứng với 55 và 63 mẫu Tỷ lệ trẻ có kiểu hình tiết hoàn toàn (Le a-b+ Le x-y+) là 42,0%, trong khi kiểu hình tiết không hoàn toàn bao gồm các kiểu hình chứa Le a+b+ và/hoặc.
Trong nghiên cứu, kiểu hình Le x+y+ chiếm 53%, trong khi đó, kiểu hình không tiết kháng nguyên Le a+b- Le x+y- , Le a+b- , Le x-y- Le a-b- chỉ chiếm 2,5% Đặc biệt, kiểu hình không xác định tình trạng tiết kháng nguyên Le a-b- Le x-y- cũng chiếm 2,5% Các kết quả này được trình bày chi tiết trong bảng 3.8, 3.9 và 3.10.
Bản 3.8 P ân bố k ểu ìn k án n uyên n óm máu t n dun tổ c ức Lew s a, b ở trẻ tạ tr ờn mầm non ở Hà Nam (n9)
Kháng nguyên Số mẫu Tỷ lệ (%)
Bản 3.9 P ân bố k ểu ìn k án n uyên n óm máu t n dun tổ c ức Lew s x, y ở trẻ ta tr ờn mầm non ở Hà Nam (n9)
Kháng nguyên Số mẫu Tỷ lệ (%)
Bản 3.10 Tổ ợp k án n uyên n óm máu t n dun tổ c ức Lew s ab và xy ở trẻ tạ tr ờn mầm non ở Hà Nam (n9)
Kháng nguyên Le xy (%) Tổn Tỷ lệ (%)
Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kiểu hình tiết không hoàn toàn ở trẻ khỏe mạnh tại Việt Nam khá cao, với 5%, nhưng vẫn thấp hơn so với các nước châu Á khác (20%) Trong khi đó, tỷ lệ này rất ít gặp ở người gốc Âu và Phi Cụ thể, phân tích từ các mẫu nước bọt của trẻ tại các nhà trẻ ở Hà Nam chỉ ra rằng tỷ lệ trẻ có kiểu hình không tiết kháng nguyên chỉ chiếm 2,5% Điều này có thể giải thích cho tỷ lệ nhiễm Norovirus (NoV) cao ở Việt Nam và các nước châu Á.
Theo bảng 3.8 và 3.9, tỷ lệ không tiết kháng nguyên Lewis ab (Le a- b-) và Lewis xy (Le x-y-) tương đương nhau, lần lượt là 7,6% và 6,8% Việc kết hợp phát hiện kháng nguyên Lewis ab và Lewis xy cho phép xác định tình trạng tiết kháng nguyên hoàn toàn, không hoàn toàn hoặc không tiết ở 97,5% các trường hợp.
Có 3 trường hợp không xác định được tình trạng tiết kháng nguyên (kiểu hình Le a- b-/Le x-y- ), chiếm 2,5% (bảng 3.10) Do v y xét nghiệm đồng thời Lewis ab và xy cho phép tăng khả năng xác định kiểu hình tiết kháng nguyên HBGA.
Hiện nay, nghiên cứu về hai loại kháng nguyên có tiền chất H1 và H2 đối với tính cảm nhiễm virus vẫn còn hạn chế Phần lớn các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào Lewis ab với tiền chất H1 Một nghiên cứu của Bucardo và cộng sự (2009) chỉ ra rằng tỷ lệ người gốc Phi có kiểu hình Le a-b- khá cao, lên tới 25%, điều này gây khó khăn trong việc đánh giá tình trạng tiết HBGA.
