VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu nghiên cứu
Cây Bạch tật lê, bao gồm thân, quả và rễ, được thu hoạch từ vùng trồng đạt tiêu chuẩn VietGAP của Viện Ứng dụng Công nghệ tại Ninh Thuận Thời điểm thu hoạch là vào tháng 9, khi quả bắt đầu chuyển sang màu vàng nhẹ.
Hình 2.1 Mẫu cây Bạch tật lê đƣợc phơi khô và mẫu đã khô
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
- Dung môi kỹ thuật: Methanol, dichloromethane, acetone, ethyl acetate, n- hexane (Hàn Quốc, Indonesia), cồn thực phẩm, nước cất 1 lần.
- Dung môi phân tích HPLC: methanol, acetonitrile, nước tinh khiết HPLC (Fisher)
- Bột sắc ký silica gel pha thường, pha đảo C-18, sephadex LH-20, dianion HP20
- Bình chiết thuỷ tinh 10, 5, 2, 1 lít
- Cột sắc ký thuỷ tinh
- Bình cầu thuỷ tinh cất quay.
- Bình định mức loại 25mL.
- Máy cất quay chân không
- Bộ lọc busne, máy bơm hút chân không.
- Chất chuẩn Protodioscin 98% (TRC, Canada).
- Máy LC-MS: Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems.
- Cột sắc ký HPLC: Cột VertiSep GES C18 (150x4,6 mm; 5μm) và cột bảo vệ GES C18 của hãng Vertical.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch tật lê Để lựa chọn dung môi chiết phù hợp nhất, mẫu Bạch tật lê (2 kg) đƣợc xay thành bột mịn và ngâm chiết với các dung môi khác nhau methanol, ethanol 95%, 50% và nước Chiết mẫu bằng cách ngâm chiết ở điều kiện thường, đun hồi lưu trong 2 giờ và ngâm chiết kết hợp siêu âm với thời gian ngâm chiết khác nhau Sau đó hỗn hợp đƣợc lọc qua giấy lọc và máy cô quay để thu cặn ethanol, methanol, nước khô Mẫu được chiết lần lượt 4 lần Dịch chiết của các lần chiết được cất loại dung môi để cân so sánh khối lƣợng cao chiết thu đƣợc Ký hiệu là cao chiết A.
2.2.2 Phương pháp lựa chọn phương pháp chiết (kiểu chiết), nhiệt độ, thời gian chiết tổng Bạch tật lê
Nghiên cứu chiết xuất Bạch tật lê từ 2kg nguyên liệu đã được thực hiện bằng các phương pháp khác nhau, bao gồm đun hồi lưu ở 95ºC trong 2 giờ, ngâm cách thuỷ ở 80ºC trong 2 giờ, siêu âm ở 40ºC trong 30 phút và ngâm chiết ở nhiệt độ thường trong 24 giờ Sau khi thu được cao chiết, khối lượng sản phẩm đã được cân và hiệu suất của từng phương pháp chiết xuất đã được so sánh.
Phương pháp chiết đã được lựa chọn, với thời gian và nhiệt độ chiết được tối ưu hóa ở các mức 95ºC, 80ºC và 60ºC, cùng với thời gian chiết là 2h, 3h và 4h Việc cân và so sánh lượng cao chiết thu được giúp xác định điều kiện tối ưu cho phương pháp chiết này.
2.2.3 Phương pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch tật lê
Sau khi lựa chọn dung môi chiết tổng và thu được cao chiết tổng, cao chiết này được phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để loại bỏ các thành phần hóa học không mong muốn và làm giàu protodioscin Cao chiết A được hòa vào 3 lít nước và chiết bằng dung môi ethyl acetate (1 lít x 3 lần) Sau đó, lớp dung môi hữu cơ được tách ra, và dịch nước được cô quay còn 2 lít để loại bỏ dung môi hữu cơ tồn dư, thu được dịch B.
2.2.4 Phương pháp tách sắc ký làm giàu protodioscin
Lọc dịch B qua cột diaion HP20, sau đó thực hiện giải hấp bằng dung môi nước và dung môi cồn 80% Cuối cùng, gom dịch giải hấp cồn 80% và tiến hành cất để thu được dung môi cao C.
Tách phân đoạn cao chiết C được thực hiện trên cột sắc ký sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường với tỷ lệ cao chiết/chất hấp phụ là 1/5 theo khối lượng Cột nhồi có đường kính 10cm, và dung môi giải hấp được sử dụng lần lượt là ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol 50:1, ethyl acetate:ethanol 10:1 và ethanol 95% Dịch giải hấp từ hệ ethyl acetate:ethanol 10:1 được thu gom, sau đó cất để loại bỏ hoàn toàn dung môi, thu được cao D.
Hàm lượng protodioscin trong cao chiết D được kiểm tra độ sạch bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng máy Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems Cột sắc ký sử dụng là Zorbax Eclipse XDB C18 (250 x 4.6 mm, 5μm) kết hợp với cột bảo vệ C18 của Agilent Điều kiện phân tích bao gồm pha động gradient 2% acetonitrile trong nước trong thời gian 20 phút với tốc độ dòng 0.5 ml/phút, thể tích bơm mẫu 5μl, nhiệt độ cột 30ºC và đầu dò DAD phân tích ở bước sóng 210 nm.
2.2.5 Phương pháp dựng đường chuẩn định lượng protodioscin Đường chuẩn định lượng có dạng y = ax + b được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa diện tích pic UV được chọn (y) và nồng độ tương ứng của chất chuẩn (x).Đường chuẩn định lượng thu được đạt độ tuyến tính cao với hệ số tương quan R 2 ≥0,999 đối với phương pháp định lượng bằng DAD.
Chất chuẩn Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan
Hình 2.2 Đường chuẩn định lượng chất chuẩn protodioscin
2.2.6 Phương pháp thử nghiệm sự thay đổi hormon sinh dục trên chuột
Bài nghiên cứu được thực hiện với 40 chuột nhắt trắng đực trưởng thành, chia thành 4 nhóm ngẫu nhiên: nhóm I là nhóm chứng (10 chuột), nhóm II, III, IV là nhóm được điều trị bằng tinh chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê với các liều lượng 2,5mg/kg, 5,0mg/kg và 10mg/kg (mỗi nhóm 10 chuột) Trong 4 tuần, chuột ở nhóm II, III, IV được cho sử dụng dịch chiết protodioscin 1 lần/ngày Sau liều cuối cùng, máu của chuột được lấy để định lượng nồng độ hormon testosterone và gonadotropin (FSH, LH) bằng phương pháp ELISA sử dụng thiết bị QTXN.MD.002/003/007 V 1,0 Cobas6000 tại bệnh viện phụ sản Trung ương, nhằm so sánh nồng độ hormon sinh dục giữa nhóm chứng và nhóm điều trị.
2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel và STATA, với mục tiêu kiểm định giá trị trung bình Chúng tôi xác định hàm lượng và các tính chất lý hóa của sản phẩm, thực hiện lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác.