VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu nghiên cứu
Cây Bạch tật lê (thân, quả, rễ) khô được thu hoạch từ vùng trồng đạt tiêu chuẩn VietGAP của Viện Ứng dụng Công nghệ tại Ninh Thuận Thời điểm thu hoạch là vào tháng 9, khi quả bắt đầu chuyển sang màu vàng nhẹ.
Hình 2.1 Mẫu cây Bạch tật lê đƣợc phơi khô và mẫu đã khô
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
- Dung môi kỹ thuật: Methanol, dichloromethane, acetone, ethyl acetate, n- hexane (Hàn Quốc, Indonesia), cồn thực phẩm, nước cất 1 lần
- Dung môi phân tích HPLC: methanol, acetonitrile, nước tinh khiết HPLC (Fisher)
- Bột sắc ký silica gel pha thường, pha đảo C-18, sephadex LH-20, dianion HP20
- Bình chiết thuỷ tinh 10, 5, 2, 1 lít
- Cột sắc ký thuỷ tinh
- Bình cầu thuỷ tinh cất quay
- Bình định mức loại 25mL
- Máy cất quay chân không
- Bộ lọc busne, máy bơm hút chân không
- Chất chuẩn Protodioscin 98% (TRC, Canada)
- Máy LC-MS: Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems
- Cột sắc ký HPLC: Cột VertiSep GES C18 (150x4,6 mm; 5μm) và cột bảo vệ GES C 18 của hãng Vertical
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch tật lê Để lựa chọn dung môi chiết phù hợp nhất, mẫu Bạch tật lê (2 kg) đƣợc xay thành bột mịn và ngâm chiết với các dung môi khác nhau methanol, ethanol 95%, 50% và nước Chiết mẫu bằng cách ngâm chiết ở điều kiện thường, đun hồi lưu trong 2 giờ và ngâm chiết kết hợp siêu âm với thời gian ngâm chiết khác nhau Sau đó hỗn hợp đƣợc lọc qua giấy lọc và máy cô quay để thu cặn ethanol, methanol, nước khô Mẫu được chiết lần lượt 4 lần Dịch chiết của các lần chiết được cất loại dung môi để cân so sánh khối lƣợng cao chiết thu đƣợc Ký hiệu là cao chiết A
2.2.2 Phương pháp lựa chọn phương pháp chiết (kiểu chiết), nhiệt độ, thời gian chiết tổng Bạch tật lê
Từ 2kg Bạch tật lê, các phương pháp chiết xuất như đun hồi lưu ở 95ºC trong 2 giờ, ngâm cách thuỷ ở 80ºC trong 2 giờ, siêu âm ở 40ºC trong 0,5 giờ và ngâm chiết ở nhiệt độ thường trong 24 giờ đã được áp dụng Sau khi thu lấy cao chiết, khối lượng được cân và hiệu suất của từng phương pháp được so sánh.
Phương pháp chiết được tối ưu hóa bằng cách thử nghiệm ở các nhiệt độ 95ºC, 80ºC và 60ºC, cùng với thời gian chiết 2h, 3h và 4h Kết quả chiết xuất sẽ được cân và so sánh để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình chiết.
2.2.3 Phương pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch tật lê
Sau khi chọn dung môi chiết tổng và thu được cao chiết tổng, cao chiết này được phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để loại bỏ các thành phần hóa học không mong muốn và làm giàu protodioscin Cao chiết A được hòa vào 3 lít nước và chiết bằng dung môi ethyl acetate (1 lít x 3 lần) Sau đó, tách lớp dung môi hữu cơ, dịch nước được cô quay còn 2 lít để loại bỏ dung môi hữu cơ tồn dư, thu được dịch B.
2.2.4 Phương pháp tách sắc ký làm giàu protodioscin
Lọc dịch B qua cột diaion HP20 và rửa giải bằng dung môi nước cùng dung môi cồn 80% Sau đó, gom dịch rửa giải cồn 80% và tiến hành cất để thu được dung môi cao.
Tách phân đoạn cao chiết C được thực hiện trên cột sắc ký sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường với tỷ lệ cao chiết/chất hấp phụ là 1/5 theo khối lượng Cột nhồi có kích thước 10cm và các dung môi rửa giải được sử dụng lần lượt là ethyl acetate, hỗn hợp ethyl acetate:ethanol 50:1, ethyl acetate:ethanol 10:1 và ethanol 95% Dịch rửa giải từ hệ ethyl acetate:ethanol 10:1 được gom lại và sau đó cất để loại bỏ hoàn toàn dung môi, thu được cao D.
Hàm lượng protodioscin trong cao chiết D được kiểm tra độ sạch bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng máy Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems Phân tích được thực hiện trên cột Zorbax Eclipse XDB C18 (250 x 4.6 mm, 5μm) kết hợp với cột bảo vệ C18 của Agilent Pha động là gradient 2% acetonitrile trong nước trong thời gian 20 phút với tốc độ dòng 0.5 ml/phút Thể tích mẫu bơm là 5μl, và nhiệt độ cột được duy trì ở 30ºC Đầu dò DAD được thiết lập ở bước sóng phân tích 210 nm.
2.2.5 Phương pháp dựng đường chuẩn định lượng protodioscin Đường chuẩn định lượng có dạng y = ax + b được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa diện tích pic UV được chọn (y) và nồng độ tương ứng của chất chuẩn (x) Đường chuẩn định lượng thu được đạt độ tuyến tính cao với hệ số tương quan R 2 ≥ 0,999 đối với phương pháp định lượng bằng DAD
Chất chuẩn Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan
Hình 2.2 Đường chuẩn định lượng chất chuẩn protodioscin
2.2.6 Phương pháp thử nghiệm sự thay đổi hormon sinh dục trên chuột
Bài nghiên cứu này tiến hành thí nghiệm với 40 chuột nhắt trắng đực trưởng thành, chia thành 4 nhóm: nhóm I là nhóm chứng (10 chuột), nhóm II, III, IV được điều trị bằng tinh chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê với các liều lượng 2,5 mg/kg, 5,0 mg/kg và 10 mg/kg (mỗi nhóm 10 chuột) Các chuột trong nhóm II, III, IV được cho sử dụng dịch chiết này 1 lần/ngày trong 4 tuần Sau khi hoàn thành liệu trình, máu của chuột được lấy để định lượng nồng độ hormon testosterone và gonadotropin (FSH, LH) bằng phương pháp ELISA tại bệnh viện phụ sản Trung ƣơng Kết quả sẽ được so sánh giữa nhóm chứng và nhóm điều trị để đánh giá hiệu quả của protodioscin.
2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel và STATA, với việc kiểm định giá trị trung bình Chúng tôi xác định hàm lượng và các tính chất lý hóa của sản phẩm, thực hiện quy trình này lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.