Luận thuyết trung tâm
Luận thuyết trung tâm mô tả quy trình chuyển giao thông tin giữa DNA, RNA và protein Tế bào chuyển đổi thông tin từ DNA thành protein thông qua hai bước chính: phiên mã và dịch mã Trong phiên mã, vùng mã hóa của gen được sao chép thành RNA, và đối với tế bào nhân thực, RNA này được xử lý thành mRNA nhỏ hơn, sau đó di chuyển đến tế bào chất Tại đây, ribosome, một cỗ máy phân tử phức tạp, thực hiện dịch mã bằng cách lắp ráp các amino acid theo thứ tự được quy định bởi mRNA.
Các amino acid được hình thành từ các bộ ba mã hóa, bao gồm 4 nucleotide A, C, G, U, với tổng cộng 64 bộ ba có khả năng đại diện cho nhiều amino acid khác nhau Ví dụ, UUU và UUC đều mã hóa cho Phenylalanine, một α-amino acid không phân cực và trung hòa điện Sợi DNA khuôn mẫu có các trình tự từ 100 đến 1000 bp gọi là promoter, nằm trước vùng mã hóa RNA và không tham gia vào quá trình phiên mã mRNA Vùng phía 3' của promoter được gọi là vùng thượng nguồn, trong khi vùng phía 5' là vùng hạ nguồn, chứa vùng mã hóa RNA dài từ 20.000 đến 30.000 bp Sản phẩm phiên mã đầu tiên là pre-mRNA, bao gồm cả intron và exon, với tế bào loại bỏ intron để tạo ra mRNA trưởng thành mRNA chứa các codon, nhưng không phải tất cả đều tham gia dịch mã; vùng 5' UTR dài khoảng 170 nucleotides, gắn với ribosome và chứa các trình tự điều hòa Bộ ba đầu tiên AUG mã hóa cho Methionine và có thể bị loại bỏ Quá trình dịch mã kết thúc tại codon kết thúc UAA, UAG, hoặc UGA, không mã hóa cho amino acid nào.
Nhiễm sắc thể
DNA chủ yếu nằm trong nhân của tế bào nhân thực, được gấp thành các nhiễm sắc thể và tái tạo trong quá trình phân chia tế bào Mỗi nhiễm sắc thể chứa một phân tử DNA liên kết với protein, và trong quá trình phân chia, replisome tách DNA thành hai sợi, tạo ra hai chuỗi DNA mới giống nhau Mỗi tế bào người, ngoại trừ tế bào trứng và tinh trùng, có 23 cặp nhiễm sắc thể, với một nửa di truyền từ bố và nửa còn lại từ mẹ, tạo thành lưỡng bội Đối với nhiễm sắc thể giới tính, nữ giới có hai nhiễm sắc thể X, trong khi nam giới có một nhiễm sắc thể X và một Y Quá trình phân chia tế bào trứng và tinh trùng gọi là meiosis, chia một tế bào ban đầu thành 4 tế bào con, mỗi tế bào con chứa một bản sao của mỗi nhiễm sắc thể, tức là đơn bội.
Vùng promoter trong quá trình phiên mã của DNA không tham gia vào quá trình này, mà vùng từ promoter đến vị trí 3' được gọi là vùng thượng nguồn, trong khi vùng từ promoter đến vị trí 5' là vùng hạ nguồn Vùng hạ nguồn chứa các đoạn mã hóa RNA, kết thúc tại đoạn terminator Các pre-mRNA được phiên mã từ gen bao gồm cả exon (đoạn mã hóa amino acid) và intron (đoạn không mã hóa) Tế bào sẽ loại bỏ intron để tạo ra mRNA trưởng thành trước khi tiến hành dịch mã Trong mRNA, đoạn 5' UTR kết nối với ribosome và chứa các trình tự điều hòa, không tham gia vào quá trình dịch mã Vùng dịch mã chứa các codon, với codon bắt đầu luôn là AUG và codon kết thúc có thể là UAA, UAG hoặc UGA, không mã hóa cho amino acid nào.
Đột biến
Đột biến là sự thay đổi trình tự nucleotide trong quá trình nhân đôi DNA, dẫn đến sự thay đổi chức năng của protein Đột biến có thể có lợi, có hại hoặc không ảnh hưởng đến sinh vật Nếu đột biến xảy ra trong tế bào mầm (như tế bào chứng và tinh trùng), chúng có thể di truyền cho thế hệ sau Ngược lại, đột biến trong tế bào soma (các tế bào cơ thể) không di truyền, nhưng có thể tích lũy theo thời gian và gây ra các bệnh như ung thư.
Trong bài viết này, chúng ta sẽ khám phá một số khái niệm quan trọng liên quan đến đột biến, bao gồm allele, kiểu gen, kiểu hình và biến thể Những thuật ngữ này sẽ được đề cập thường xuyên trong các phần tiếp theo, giúp bạn hiểu rõ hơn về vai trò của chúng trong nghiên cứu di truyền.
• Allele: là các phiên bản khác nhau của gen mã hóa cho các phiên bản khác nhau của protein.
Kiểu gen (genotype) là tập hợp các allele quyết định các đặc điểm thể chất của sinh vật, như màu mắt và chiều cao, trong khi kiểu hình (phenotype) là biểu hiện của những đặc điểm này Chẳng hạn, một cá thể có kiểu gen với hai allele quy định màu mắt từ bố và mẹ, trong đó allele từ bố là màu mắt xanh và allele từ mẹ là màu mắt đen, sẽ có kiểu hình là màu mắt xanh Điều này cho thấy kiểu hình là sự kết hợp giữa kiểu gen và ảnh hưởng từ môi trường.
• Biến thể (variant): là vùng của gen với các khác biệt về trình tự.
Bộ gen con người có 3 tỷ cặp bazơ tương ứng với 6 tỷ nucleotide, trong đó 99,9% trình tự giống nhau, chỉ có khoảng
Giữa các cá thể có khoảng 6 triệu nucleotide khác nhau, với các biến thể phát sinh trong quá trình nhân đôi DNA xảy ra với tỷ lệ một trên một tỷ cặp bazơ Điều này có nghĩa là trong mỗi lần tế bào phân chia và DNA được sao chép, trung bình sẽ có 3 nucleotide khác biệt xuất hiện.
Một gen đột biến có thể có nhiều biến thể, vì vậy để đánh giá tác động của nó, cần xác định các loại biến thể và mức độ ảnh hưởng của chúng đến cơ thể sống.
Bệnh liên quan đến gen
Sự thay đổi trong trình tự DNA ở cấp độ loài có thể giúp loài thích nghi với môi trường hoặc dẫn đến sự tuyệt chủng Ở cấp độ cá thể, một số đột biến có thể cải thiện thể chất, trong khi hầu hết không ảnh hưởng đến chức năng sinh học và một số khác thì không phù hợp Bệnh được định nghĩa là những thay đổi không thích hợp ảnh hưởng đến cá thể trong quần thể, gây ra tình trạng bất thường và suy giảm chức năng sinh lý.
Trong nghiên cứu tin sinh học, chúng ta phân tích bệnh ở ba cấp độ: phân tử (DNA, RNA, protein), hệ thống (bào quan, nội tạng) và sinh vật (kiểu hình lâm sàng, mô hình động vật, tổ chức) Mỗi cấp độ đều có các cơ sở dữ liệu lớn hỗ trợ nghiên cứu Một số rối loạn liên quan đến gen được ghi nhận trong quá trình này.
Rối loạn đơn gen, hay còn gọi là bệnh Mendel, là các bệnh lý do sự đột biến của một gen duy nhất gây ra Một số ví dụ điển hình của rối loạn đơn gen bao gồm thiếu máu hồng cầu hình liềm (Sickle cell anemia), múa giật (Huntington), ung thư vú liên quan đến gen BRCA1 và BRCA2, cùng với bệnh máu khó đông A (Hemophilia A).
Rối loạn phức tạp hình thành từ sự kết hợp của nhiều đột biến gen cùng với tác động của môi trường và hành vi, làm tăng nguy cơ mắc bệnh Một số ví dụ về rối loạn phức tạp bao gồm tâm thần phân liệt, hen suyễn, trầm cảm, tiểu đường, cao huyết áp và béo phì.
Rối loạn hệ gen gây ra bất thường lớn trên các nhiễm sắc thể, với những thay đổi như dị bội (aneuploidies) bao gồm thừa hoặc thiếu bản sao nhiễm sắc thể Các dạng dị bội như tam nhiễm (trisomy), đơn bội (monosomy), tetrasomy và nullsomy có thể dẫn đến nhiều bệnh lý, ví dụ như hội chứng Patau (trisomy 13).
Hội chứng Edwards (trisomy 18) và hội chứng Down (trisomy 21) là những rối loạn di truyền phổ biến Bên cạnh đó, còn tồn tại các rối loạn liên quan đến nhiễm sắc thể giới tính, chẳng hạn như hội chứng Klinefelter.
(47, XXY), hội chứng XYY (47, XYY), hội chứng tam bội X (47,XXX).
Các công nghệ giải trình tự DNA
Giải trình tự Sanger 7 1.2.2Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS)
Công nghệ giải trình tự đầu tiên được Frederick Sanger cùng các cộng sự nghiên cứu từ năm 1977 và được thương mại hóa vào năm
Năm 1986, phương pháp giải trình tự Sanger được phát triển dựa trên kỹ thuật sao chép DNA trong ống nghiệm Nhờ công nghệ này, bộ gen người đầu tiên đã được giải trình trong vòng một thập kỷ Quy trình giải trình tự Sanger bao gồm bốn bước chính.
Để tách sợi xoắn kép DNA thành hai sợi đơn, bước đầu tiên là gia nhiệt Quá trình này diễn ra nhờ vào việc nhiệt độ làm yếu đi các liên kết hidro giữa hai sợi DNA, khiến chúng dễ dàng tách rời.
1.2 Các công nghệ giải trình tự DNA
Bước 2 trong quá trình tổng hợp DNA là bơm protein DNA polymerase và bổ sung các nucleotide mới Enzyme DNA polymerase có vai trò quan trọng trong việc liên kết các nucleotide, tạo ra sợi bổ sung ngược tương ứng với sợi khuôn mẫu ban đầu.
Để ngăn chặn sự kéo dài của các sợi bổ sung ngược, người ta thêm vào các nucleotide chỉnh sửa được đánh dấu bằng chất huỳnh quang với các màu khác nhau Khi một nucleotide chỉnh sửa liên kết với chuỗi bổ sung ngược, DNA polymerase không thể tiếp tục thêm nucleotide, khiến chuỗi bổ sung ngược dừng lại Sau đó, cả sợi khuôn mẫu và sợi bổ sung ngược được tách ra, mỗi sợi trở thành một khuôn mẫu để tổng hợp DNA mới Qua mỗi chu trình, số lượng DNA tăng gấp đôi, nhưng chiều dài của các sợi bổ sung ngược ngắn hơn sợi khuôn mẫu và được gọi là các đoạn (fragment), với chiều dài không xác định do vị trí các nucleotide chỉnh sửa là ngẫu nhiên.
Trong bước 4 của quy trình giải trình tự DNA, các đoạn DNA mang điện tích âm được đưa qua một ống nghiệm chứa gel trong trường điện, với các fragment ngắn hơn di chuyển nhanh hơn đến cuối ống nghiệm Một nguồn laser chiếu vào các fragment, cho phép máy xác định loại nucleotide dựa trên sự đánh dấu huỳnh quang của các nucleotide kết thúc Quá trình này tiếp tục cho đến khi máy đọc được một chuỗi trình tự Công nghệ giải trình tự Sanger có xác suất tổng hợp các đoạn dài thấp, với chiều dài trình tự tối đa chỉ đạt 1000 bp; các trình tự dài hơn sẽ được chia thành các phần nhỏ hơn để giải trình tự riêng biệt Kết quả từ máy giải trình tự Sanger là các trình tự ngắn (short read) Mặc dù giải trình tự Sanger chậm hơn so với giải trình tự thế hệ mới (NGS), nhưng nhờ độ chính xác cao, công nghệ này vẫn được sử dụng để giải trình tự nhắm mục tiêu vào gen và kiểm tra kết quả từ các phương pháp giải trình tự mới.
1.2.2 Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS)
Công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) đã cách mạng hóa việc giải trình tự DNA với tốc độ nhanh chóng và chi phí ngày càng giảm, dẫn đến những thành tựu khoa học ấn tượng và các ứng dụng sinh học mới Đến năm 2008, NGS có khả năng tạo ra lượng dữ liệu tương đương với hàng trăm máy giải trình Sanger chỉ trong 24 giờ, với sự vận hành của một người Dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger, NGS đã có những cải tiến đáng kể, cho phép thao tác song song trên nhiều fragment trong mỗi chu kỳ, thay vì chỉ một fragment như trước đây.
Phương pháp giải trình tự Sanger bao gồm bốn bước chính Đầu tiên, DNA được gia nhiệt để tách thành hai sợi đơn Tiếp theo, protein DNA polymerase và các nucleotide mới được thêm vào để tổng hợp DNA mới Để ngăn chặn sự kéo dài không cần thiết của các sợi tổng hợp, các nucleotide chỉnh sửa, được đánh dấu bằng chất huỳnh quang với màu sắc khác nhau, được bổ sung vào cuối mỗi chuỗi Cuối cùng, các đoạn DNA mang điện tích âm được đưa qua ống nghiệm chứa gel trong trường điện, với các đoạn ngắn hơn di chuyển nhanh hơn về phía đáy ống nghiệm Một nguồn laser chiếu vào đáy ống nghiệm để xác định loại nucleotide chỉnh sửa, và quá trình này tiếp tục cho đến khi máy giải trình tự đọc được chuỗi trình tự.
Công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) đang được nhiều tổ chức phát triển với nhiều phương pháp khác nhau Bài viết này sẽ khám phá các bước chính trong một phương pháp tiêu biểu của NGS.
Để chuẩn bị thư viện NGS, trước tiên cần tạo các thư viện DNA tương ứng với mỗi bản sao DNA, sau đó cắt thành các đoạn nhỏ hơn Trong quá trình này, trình tự chỉ số (index) được thêm vào đầu các đoạn DNA để phân loại thư viện Mỗi thư viện NGS sẽ có trình tự chỉ số khác nhau, điều này rất quan trọng khi kết hợp trên một flow cell để thực hiện giải trình tự, gọi là multiplexing Các trình tự chỉ số cũng được giải trình tự để tách các fragment thành các tệp khác nhau, quá trình này được gọi là demultiplexing Bên cạnh đó, các đoạn nucleotide nhân tạo, gọi là adapter, cũng được thêm vào cuối mỗi đoạn DNA Trình tự nhận được từ một fragment được gọi là read, và nếu read chứa phần adapter, nó được coi là nhiễm bẩn adapter.
Để đảm bảo chất lượng dữ liệu trong giải trình tự, việc chọn lọc kích thước fragment là rất quan trọng Nếu fragment ban đầu có chiều dài 160 bp, read thu được sẽ không chứa adapter ở cuối Ngược lại, với các fragment ngắn hơn, chẳng hạn 145 bp, read sẽ bao gồm 10 bp adapter Do đó, việc lựa chọn các fragment có chiều dài tương đương giúp hạn chế nhiễm bẩn adapter Miền giá trị của kích thước fragment sẽ thay đổi tùy thuộc vào yêu cầu của từng máy giải trình tự.
Bước 2 trong quy trình giải trình tự DNA là tổng hợp các fragment gắn với flow cell, nơi các fragment từ thư viện NGS được kết nối với các oligo cố định trên flow cell nhờ vào các adapter Sau khi bơm protein DNA polymerase và nucleotide mới, quá trình tổng hợp các đoạn bổ sung ngược bắt đầu từ các oligo Các đoạn xoắn kép DNA được tạo thành sẽ được gia nhiệt để tách thành hai đoạn xoắn đơn theo chiều thuận và nghịch Bước 3 là loại bỏ các fragment không cần thiết, một bước quan trọng trước khi bắt đầu các chu kỳ giải trình tự, ảnh hưởng đến loại read xuất ra từ máy giải trình tự Mục tiêu là tạo ra các fragment chỉ cùng một chiều hoặc cả hai chiều, với yêu cầu các fragment cùng một chiều phải được tổng hợp tách biệt và loại bỏ các fragment không cần thiết trong thư viện NGS.
Để chuẩn bị thư viện NGS, DNA được cắt thành các đoạn nhỏ và gắn thêm adapter ở cuối Sau đó, các đoạn DNA này được gia nhiệt để tách thành các fragment chứa adapter và index Tiếp theo, các fragment được đưa vào flow cell, nơi các fragment thuận (từ 5' đến 3') liên kết với oligo 1 thông qua adapter bổ sung, trong khi các fragment nghịch (từ 3' đến 5') liên kết với oligo 2 Cuối cùng, DNA polymerase và nucleotide mới được bơm vào flow cell để tổng hợp các fragment nghịch từ oligo.
Quá trình tổng hợp các fragment thuận bắt đầu bằng việc thu thập các fragment từ oligo 2 và loại bỏ các fragment không cần thiết Sau khi gia nhiệt, các đoạn DNA được tách thành sợi đơn và những fragment không gắn oligo sẽ bị loại bỏ do không liên kết với flow cell Các fragment thuận được giữ lại thông qua việc cắt bỏ oligo 2, dẫn đến việc thu được các fragment có chiều nghịch gắn với flow cell, sẵn sàng cho quá trình tổng hợp tiếp theo Trong bước tiếp theo, các chu kỳ giải trình tự được thực hiện, trong đó các fragment bổ sung ngược được tổng hợp theo chiều thuận với các nucleotide chỉnh sửa Mỗi khi một nucleotide được liên kết, máy ảnh sẽ ghi lại hình ảnh nhờ màu lưu huỳnh đánh dấu, xác định loại nucleotide Sau đó, nucleotide sẽ được đảo ngược trở về dạng bình thường, và chu kỳ mới lại bắt đầu Giả sử cần tổng hợp các fragment có chiều thuận, ta cần giữ lại các fragment chiều nghịch, vì sau khi gia nhiệt, chúng sẽ không còn liên kết với oligo và dễ dàng bị loại bỏ, trong khi các fragment có chiều thuận vẫn gắn chặt với flow cell.
Bước 4 trong quy trình giải trình tự bao gồm thực hiện các chu kỳ giải trình tự, trong đó các nucleotide chỉnh sửa trên đoạn tổng hợp ngược sẽ được đảo ngược về các nucleotide thông thường Trước khi quá trình đảo ngược diễn ra, một máy ảnh sẽ ghi lại các nucleotide này, được phân biệt qua màu huỳnh quang đánh dấu Các chu kỳ này tiếp tục cho đến khi máy giải trình tự có thể đọc được trình tự của đoạn xoắn đơn DNA.
Như vậy, hai cải tiến chính của giải trình tự thế hệ tiếp theo so với giải trình tự Sanger là:
Quá trình tổng hợp sợi bổ sung trong giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp bắt đầu bằng việc chuyển đổi nucleotide chỉnh sửa thành nucleotide thường sau khi được đọc Mỗi chu kỳ của quá trình này kết thúc khi một nucleotide được đọc, và số lượng chu kỳ tương ứng với số nucleotide được đọc Quá trình diễn ra liên tục với từng nucleotide chỉnh sửa được xử lý lần lượt.