NGHIÊN cứu và THU NHẬN PHLOROTANNIN BẰNG kỹ THUẬT NGÂM dầm kết hợp với ENZYME

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu và chuẩn bị mẫu

Vào tháng 3/2017, rong nâu Sargassum đã được thu mẫu tại tỉnh Ninh Thuận Sau khi được rửa sạch bằng nước biển, rong được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong điều kiện mát mẻ Tại đây, rong được sấy lạnh, xay nhỏ và bảo quản trong bao bì PE để phục vụ cho nghiên cứu Nguyên vật liệu và hóa chất cho khóa luận được cung cấp từ đề tài “Nghiên cứu sản xuất một số sản phẩm mới từ rong mơ Sargassum tại Ninh Thuận”, do PGS TS Vũ Ngọc Bội làm chủ nhiệm.

Hình 3.1 Một nhánh của rong nâu Sargassum 3.1.2 Loại enzyme

Ba loại enzyme: E.Termamyl, E.Cellulase, E.Viscozyme L được mua từ Công ty Nam Giang

E.Termamyl (hay còn gọi là α-amylase): là một enzyme loại protein thủy phân liên kết alpha của các polysaccharide chứa lên kết alpha

E.Cellulase: thủy phân cellulose thông qua phân cắt liên kết 1,4-ᵝ glucoside

E.Viscizyme L: phức hợp đa enxyme dùng để xử lý nguyên liệu thực vật có tác dụng làm giảm độ nhớt, cải thiện tính chất của nguyên liệu.

Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng phlorotannin tổng số (Daniel và cộng sự (2008)) Định lượng Phlorotannin: Định lượng phlorotannin tổng số theo phương pháp Folin-Ciocateu như mô tả bởi Singleton và cộng sự (1999) và dùng phloroglucinol để xõy dựng đường chuẩn Lấy 300àl dung dịch mẫu bổ sung 1ml Folin-Ciocateu 10%, giữ 5 phút Tiếp theo thêm 2ml Na 2 CO 3 10%, trộn đều, giữ 90 phút trong bóng tối Sau đó, đo độ hấp thụ ở bước song 750nm

3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng

Hoạt tính chống oxy hóa tổng theo phương pháp Prieto và cộng sự, (1990) với chất chuẩn là acid ascorbic

3.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính khử sắt

Hoạt tính khử Fe (RP): xác định theo Zhu và cộng sự, (2002) với chất chuẩn là FeSO 4 Lấy 0.5ml mẫu bổ sung 0.5 ml đệm phosphate (pH 7,2) và 0,2 ml

Hỗn hợp K 3 [Fe(CN) 6 ] 1% được giữ ở 50 o C trong 20 phút Tiếp theo, thêm CCl 3 COOH 10%, 0,3 ml nước cất và 80 µl FeCl3 0,1% Cuối cùng, đo quang ở bước sóng 655 nm với chất chuẩn là FeSO 4.

3.2.4 Xác định loại cacbon bằng phổ DEPT – NMR (Distortionless

Kỹ thuật DEPT-NMR được sử dụng để xác định loại cacbon trong phân tử hợp chất hữu cơ bằng cách thực hiện đồng thời trong cả hai kênh 1H và 12C với các xung phức tạp đã được lập trình Kết quả của các xung này là cacbon gắn một, hai hoặc ba nguyên tử hydro sẽ được ghi nhận với các pha khác nhau Để thu được phổ, cần thực hiện ba lần ghi phổ khác nhau: lần đầu gọi là DEPT-45, trong đó cacbon mang 1H sẽ xuất hiện một mũi trên phổ; lần hai gọi là DEPT-90, chỉ những cacbon loại metin >CH- mới xuất hiện trong phổ.

Trong phổ DEPT-135, các cacbon metin (>CH-) và metyl (-CH3) xuất hiện với mũi tên dương, trong khi cacbon metylen (-CH2) hiển thị mũi tên hướng ngược lại Đặc biệt, cacbon thứ cấp (>C) không xuất hiện trong phổ vì không mang hydro.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một kỹ thuật quan trọng trong việc xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất hữu cơ Phương pháp này dựa trên việc ghi lại đồ thị năng lượng hấp thụ và bức xạ của nguyên tử khi chúng tham gia vào quá trình cộng hưởng theo thời gian.

Hóa chất

Ethanol; Methanol; FeSO 4 ; H 2 SO 4 ; Na 2 CO 3 ; Na 2 HPO 4 ; NaH 2 PO 4 ;

K 3 [Fe(CN) 6 ]; CCl 3 COOH; FeCl 3 ; HCl; n-hexan; CH 3 Cl; n-butanol; ammonium Molybdate; acid ascorbic; … là hóa chất phân tích được thương mại hóa trên thị trường

Bố trí thí nghiệm

3.4.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát

* Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 3.2 Quy trình chiết xuất phlorotannin từ rong nâu Sargassum duplicatum có hỗ trợ enzyme

Nguyên liệu: Rong khô đã được chuẩn bị ở công đoạn chuẩn bị mẫu

Xử lý enzyme là công đoạn quan trọng trong việc sử dụng enzyme để bào mòn màng tế bào rong, từ đó hỗ trợ hiệu quả cho quá trình chiết xuất phlorotannin có tính chống oxy hóa từ tế bào rong.

Cô đặc Phân đoạn Chạy cột

Thời gian 24 giờ Đánh giá

Hoạt tính Chống oxy hóa tổng Khử sắt

Nhiệt độ 45 0 C Áp suất 120 psi

Trong nghiên cứu này, các yếu tố quan trọng được xem xét bao gồm loại enzyme, tỷ lệ enzyme so với dung dịch, và thời gian xử lý enzyme Để đánh giá hiệu quả của các điều kiện xử lý enzyme, hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa được sử dụng làm chỉ số đánh giá.

Chiết: Dung môi được sử dụng để chiết phlorotannin là ethanol 96%, thời gian 24 giờ ở nhiệt độ phòng

Lọc: Thu nhận dịch chiết bằng vải và giấy lọc để loại bỏ những tạp chất không tan như cát, bã rong và các tạp chất khác

Cô đặc: Dịch lọc được đem đi cô đặc để loại bỏ bớt dung môi thu nhận cao chiết chuẩn bị cho quá trình phân đoạn

Sau khi cô đặc, các phân đoạn được tách bằng n-hexan, chloroform, EtOAC và n-butanol Phân đoạn EtOAC được cô đặc và tiếp tục phân đoạn bằng chloroform và n-butanol Sau đó, phân đoạn EtOAC được cô đặc để loại bỏ dung môi và phân đoạn bằng ethanol 96% Cuối cùng, phân đoạn ethanol 96% được thu nhận và cô đặc thành cao để phục vụ cho quá trình tinh chế.

Chạy sắc ký cột sử dụng gel Sephadex LH20 nhằm tăng độ sạch và phân đoạn phlorotannin theo các nhóm khối lượng khác nhau Dung môi rửa giải được sử dụng trong quá trình này là chloroform, methanol và acid formic với tỷ lệ 90:9:1.

Cô đặc là bước quan trọng để loại bỏ dung môi và thu được phlorotannin tinh ở dạng cao Sau đó, quá trình đông khô được thực hiện để bảo quản phlorotannin tinh, giúp thuận lợi cho việc phân tích đặc điểm cấu trúc của chúng.

Phlorotannin tinh: có màu trắng đục được mang đi phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 13C, NMR 1H và DEPT

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa đƣợc thu nhận

Tìm ra được loại enzyme thích hợp để tiến hành xử lý rong nguyên liệu

Rong được xử lý trong dung dịch đệm phosphate 7,2 với các enzyme E.Termamyl, E.Cellulase, E.Viscozyme L trong 2 giờ, với tỷ lệ dung dịch/rong là 15/1 (v/w) và enzyme/dung dịch là 5% ở nhiệt độ 40°C Sau đó, dịch rong được lọc và phlorotannin chống oxy hóa được chiết xuất bằng ethanol 96% trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, dịch phlorotannin thu được được lọc để đánh giá hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa nhằm lựa chọn enzyme xử lý phù hợp.

Hình 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme xử lý rong đến phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết

3.4.3 Xác định tỷ lệ enzyme/nguyên liệu dùng xử lý rong nguyên liệu

Xử lý enzyme Đánh giá

Hoạt tính Chống oxi hóa tổng Khử sắt

Lựa chọn enzyme thích hợp

- Tỷ lệ enzyme/ dung dịch: 5%;

- Tỷ lệ dung dịch / rong là 15/1 (v/w)

Lựa chọn tỷ lệ enzyme/ nguyên liệu phù hợp để tiến hành xử lý rong nguyên liệu

Rong được xử lý trong dung dịch đệm phosphate pH 7,2 chứa enzyme đã chọn với thời gian 2 giờ, tỷ lệ dung dịch/rong là 15/1 (v/w) và nhiệt độ 40°C Tỷ lệ enzyme/dung dịch được khảo sát ở các mức 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5% và 15% Sau khi lọc dịch thu rong, phlorotannin chống oxy hóa được chiết xuất bằng ethanol 96% trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, dịch phlorotannin thu nhận được đánh giá hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa để xác định tỷ lệ enzyme/nguyên liệu tối ưu.

Hình 3.4 Lựa chọn tỷ lệ enzyme thích hợp

Xử lý enzyme Đánh giá

Hoạt tính Chống oxi hóa tổng Khử sắt

Lựa chọn tỷ lệ enzyme/ nguyên liệu phù hợp

- Tỷ lệ dung dịch / rong là 15/1 (v/w)

3.4.4 Khảo sát thời gian xử lý rong nguyên liệu bằng enzyme

Hình 3 5 Khảo sát thời gian phù hợp để xử lý rong nguyên liệu bằng enzyme Mục đích

Lựa chọn thời gian phù hợp để xử lý rong nguyên liệu bằng enzyme

Rong được xử lý trong dung dịch đệm phosphate 7,2 với enzyme đã chọn, theo tỷ lệ dung dịch/rong là 15/1 (v/w) và nhiệt độ xử lý 40°C Tỷ lệ enzyme/dung dịch được xác định từ khảo sát trước đó, với thời gian xử lý kéo dài từ 1 đến 5 giờ Sau khi xử lý, dịch thu được từ rong được lọc, và phlorotannin chống oxy hóa được chiết xuất bằng ethanol 96% trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, dịch phlorotannin được lọc để đánh giá hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa, nhằm lựa chọn thời gian xử lý tối ưu cho rong nguyên liệu bằng enzyme.

3.4.5 Phân đoạn phlorotannin hoạt tính

Mục đích: tìm phân đoạn phlorotannin sạch và tiềm năng

- Tỷ lệ dung dịch / rong là 15/1 (v/w)

1 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ 5 giờ

Nhiệt độ: phòng Đánh giá

Hoạt tính Chống oxi hóa tổng Khử sắt

Lựa chọn thời gian phù hợp để xử lý rong nguyên liệu bằng enzyme

Sau khi cô đặc, mẫu được phân đoạn bằng n-hexan, chloroform, EtOAC và n-butanol Phân đoạn EtOAC được cô đặc và tiếp tục phân đoạn bằng chloroform và n-butanol Sau đó, phân đoạn EtOAC được cô đặc để loại bỏ dung môi và phân đoạn bằng ethanol 96% Cuối cùng, phân đoạn ethanol 96% được thu nhận và cô đặc thành cao để phục vụ cho quá trình tinh chế.

Hình 3 6 Sơ đồ phân đoạn phlorotannin bằng kỹ thuật chiết lỏng lỏng

Thu được sản phẩm là phlototannin tinh

Cao phlorotannin thu được ở công đoạn trên được tiến hành cho chạy sắc ký sephadex LH 20 với dung môi rửa giải là chloroform : methanol : acid formic (90:9:1)

Cao phlorotannin n-hexan Chloroform Ethyl acetate n-butanol

Phân tích dữ liệu

The graph was created using Microsoft Excel 2007, while the data was processed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 16.0 An ANOVA analysis was conducted using the Duncan test to determine average values, with a significance level set at p< 0.05 indicating statistically significant differences.

Hoạt tính chống oxy hóa tổng khử sắt Đông khô Phlorotannin

Dung môi rửa giải: chloroform : methanol : acid formic (90:9:1)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả tinh chế phlorootannin

Hình 4.7 Hàm lượng phlorotannin của các phân đoạn sau cột sephadex LH20

Sau khi chạy qua cột, kết quả thu được 60 phân đoạn, trong đó phân đoạn 17 –

Các phân đoạn 28 và 36 – 45 đã được xác định là chứa phlorotannin, với hàm lượng phlorotannin ở phân đoạn 17 – 28 đạt 4,1 – 177,3 mg phloroglucinol/1087,56 mg cao chiết và ở phân đoạn 36 – 45 là 8,3 – 112,2 mg phloroglucinol/1087,56 mg cao chiết Phân đoạn phlorotannin 17 – 28 có khối lượng phân tử cao hơn so với phân đoạn 36 – 45, điều này được thể hiện qua diện tích peak, trong đó diện tích peak của phân đoạn 17 – 28 chiếm 79,68% so với diện tích peak của phân đoạn 36 – 45.

4.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa tổng

Hình 4.8 Hoạt tính chống oxy hóa tổng của các phân đoạn sau cột sephadex LH20

Sau khi chạy qua cột, kết quả thu được 60 phân đoạn, trong đó phân đoạn 17 –

Các phân đoạn 28 và 36 – 45 đã được xác định chứa phlorotannin, với hoạt tính chống oxy hóa tổng ở các phân đoạn 17 – 28 đạt 12,48 – 585,52 mg acid ascorbic/1087,56 mg cao chiết và ở phân đoạn 36 – 45 là 28,08 – 371,28 mg acid ascorbic/1087,56 mg cao chiết Hoạt tính chống oxy hóa tổng ở các phân đoạn này có mối tương quan mạnh mẽ với hàm lượng phlorotannin (R² = 0,99), cho thấy phlorotannin đóng vai trò quyết định trong hoạt tính chống oxy hóa tổng Sự biến đổi của hoạt tính chống oxy hóa tổng phụ thuộc vào hàm lượng phlorotannin.

Hình 4.9 Hoạt tính khử sắt của các phân đoạn sau cột sephadex LH20

Sau khi chạy qua cột, kết quả thu được 60 phân đoạn, trong đó phân đoạn 17 –

Các phân đoạn 28 và 36 – 45 được xác định chứa phlorotannin, với hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt ở các phân đoạn 17 – 28 và 36 – 45 lần lượt là 15,6 – 765,44 mg FeSO4 / 1087,56 mg cao chiết và 33,28 – 486,72 mg FeSO4 / 1087,56 mg cao chiết Hoạt tính khử sắt có mối tương quan mạnh mẽ với hàm lượng phlorotannin (R2 = 0,99), cho thấy phlorotannin có vai trò quyết định trong hoạt tính chống oxy hóa tổng, và sự biến đổi hoạt tính khử sắt phụ thuộc vào hàm lượng phlorotannin.

Đặc điểm cấu trúc của phlorotannin

Hình 4.11 Phổ Proton của Phlorotannin khi tinh chế

Hình 4.12 Phổ cacbon của Phlorotannin khi tinh chế

Phân tích phổ 1H - NMR và 13C - NMR cho thấy hợp chất này có hai tín hiệu cơ bản, với phổ 1H – NMR tại δ = 4.790 và 6.033, cùng với phổ 13C – NMR tại δ = 157.79 và 95.18 Phổ proton chỉ ra sự hiện diện của hydro trong nhóm –CH vòng thơm, trong khi phổ DEPT xác nhận sự có mặt của Carbon từ nhóm –CH và nhóm –CO Kết quả từ ba phổ này cho thấy cấu trúc của hợp chất khá đơn giản.

50 định sơ bộ, chất này là monomer của phlorotannin hay nói cách khác là phloroglucinol, điều này phù hợp với công bố của Võ Mai Như Hiếu (2015)

4.4 Mối tương quan giữa hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa

4.4.1 Mối tương quan giữa hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa dưới tác động của loại enzyme xử lý rong nguyên liệu

Hình 4.13 Sự tương quan giữa hàm lượng phlorotannin và hoạt tính oxy hóa tổng

Hình 4.14 Sự tương quan giữa hàm lượng phlorotannin và hoạt tính khử sắt

Nghiên cứu cho thấy rằng khi hàm lượng phlorotannin tăng, hoạt tính chống oxy hóa và khả năng khử sắt cũng gia tăng Cụ thể, với hàm lượng phlorotannin đạt 3,26 ±0,08 mg phloroglucinol/g DW, hoạt tính chống oxy hóa tương ứng được ghi nhận.

7,85 ±0,21 mg acid ascorbic/g DW và hoạt tính khử sắt là 7,38 ±0,23 mg FeSO4/g

Khi hàm lượng phlorotannin đạt 3,57 ±0,11 mg phloroglucinol/g DW, hoạt tính chống oxy hóa tương đương với 8,44 ±0,27 mg acid ascorbic/g DW, trong khi hoạt tính khử sắt là 7,91 ±0,18 mg FeSO4/g DW.

Hàm lượng phloorotannin và hoạt tính chống oxy hóa có mối tương quan rất mạnh 100% theo phương trình phi tuyến tính: y = 54,252x 2 - 368,64x + 633,04 với

Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính khử sắt cũng có mối tương quan rất mạnh 100% theo phương trình phi tuyến tính: y = 1,8058x 2 + 14,043x – 19,209 với

4.4.2 Mối tương quan giữa hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa dưới tác động của tỷ lệ enzyme/ dung dịch xử lý rong nguyên liệu

Hình 4.15 Sự tương quan giữa hàm lượng phlorotannin và hoạt tính oxy hóa tổng

Hình 4.16 Sự tương quan giữa hàm lượng phlorotannin và hoạt tính khử sắt

Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi hàm lượng phlorotannin tăng, hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính khử sắt cũng tăng theo Cụ thể, ở tỷ lệ enzyme 2,5%, hàm lượng phlorotannin đạt 2,94 ± 0,06 mg phloroglucinol/g DW, tương ứng với hoạt tính oxy hóa 7,03 ± 0,14 mg acid ascorbic/g DW và hoạt tính khử sắt 6,54 ± 0,19 mg FeSO4/g DW Tương tự, ở tỷ lệ enzyme 5%, hàm lượng phlorotannin là 3,57 ± 0,11 mg phloroglucinol/g DW, với hoạt tính oxy hóa 8,44 ± 0,27 mg acid ascorbic/g DW.

Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa có mối tương quan rất mạnh 98,43% theo phương trình phi tuyến tính: y = 0,0632x 2 + 1,782x + 1,3141 với

Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính khử sắt cũng có mối tương quan rất mạnh

97,87% theo phương trình phi tuyến tính: y = 0,6392x 2 -2,2044 x + 7,5846 với R² = 0,9787

4.4.3 Mối tương quan giữa hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa qua thời gian xử lý rong nguyên liệu bằng enzyme

Hình 4.17 Sự tương quan giữa hàm lượng phlorotannin và hoạt tính oxy hóa tổng

Hình 4.18 Sự tương quan giữa hàm lượng phlorotannin và hoạt tính khử sắt

Nghiên cứu cho thấy sự thay đổi thời gian xử lý ảnh hưởng đến hàm lượng phlorotannin và các hoạt tính chống oxy hóa, khử sắt Cụ thể, sau 4 giờ, hàm lượng phlorotannin đạt 4,32 ± 0,09 mg phloroglucinol/g DW, với hoạt tính chống oxy hóa là 10,58 ± 0,21 mg acid ascorbic/g DW và hoạt tính khử sắt là 10,23 ± 0,27 mg FeSO4/g DW Sau 5 giờ, hàm lượng phlorotannin giảm còn 4,07 ± 0,07 mg phloroglucinol/g DW, trong khi hoạt tính chống oxy hóa và khử sắt cũng giảm xuống còn 9,72 ± 0,25 mg acid ascorbic/g DW và 9,16 ± 0,19 mg FeSO4/g DW Phân tích dữ liệu cho thấy mối liên hệ rõ ràng giữa thời gian xử lý và các chỉ số này.

Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa có mối tương quan rất mạnh 99,43% theo phương trình phi tuyến tính: y = 0,96x 2 - 4,3185x + 11,298 với R² = 0,9943

Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính khử sắt cũng có mối tương quan rất mạnh 99,83% theo phương trình phi tuyến tính: y = 2,1748x 2 -13,463 x +27,869 với R² = 0,9983.

Đề xuất quy trình chiết phlorotannin từ rong mơ Sagassum duplicatum bằng phương pháp ngâm dầm kết hợp với enzyme

Hình 4.19 Quy trình chiết xuất phlorotannin từ rong nâu Sargassum duplicatum có hỗ trợ enzyme

Cô đặc Phân đoạn Chạy cột

Nhiệt độ phòng Thời gian 24 giờ

Tỷ lệ enzyme/ dung dịch: 7,5%

Tỷ lệ dung dịch/ rong: 15/1 (v/w)

Nhiệt độ: 40 0 C Thời gian: 3 giờ

Nhiệt độ 45 0 C Áp suất 120 psi

Nguyên liệu: Rong khô đã được chuẩn bị ở công đoạn chuẩn bị mẫu

Xử lý enzyme là bước quan trọng trong việc chiết xuất phlorotannin chống oxy hóa từ tế bào rong nâu, thông qua việc sử dụng enzyme để bào mòn màng tế bào Các yếu tố như loại enzyme, tỉ lệ enzyme/dung dịch và thời gian xử lý được nghiên cứu kỹ lưỡng Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa là tiêu chí chính để đánh giá hiệu quả của điều kiện xử lý enzyme.

Chiết: Dung môi được sử dụng để chiết phlorotannin là ethanol 96%, thời gian 24 giờ ở nhiệt độ phòng

Lọc: Thu nhận dịch chiết bằng vải và giấy lọc để loại bỏ những tạp chất không tan như cát, bã rong và các tạp chất khác

Cô đặc: Dịch lọc được đem đi cô đặc để loại bỏ bớt dung môi thu nhận cao chiết chuẩn bị cho quá trình phân đoạn

Sau khi cô đặc, mẫu được phân đoạn bằng n-hexan, chloroform, EtOAC và n-butanol Phân đoạn EtOAC được cô đặc và tiếp tục phân đoạn bằng chloroform và n-butanol Sau đó, EtOAC được cô đặc để loại bỏ dung môi và phân đoạn bằng ethanol 96% Cuối cùng, phân đoạn ethanol 96% được thu nhận và cô đặc thành cao để phục vụ cho quá trình tinh chế.

Chạy sắc ký cột sử dụng gel Sephadex LH20 nhằm tăng độ sạch và phân đoạn phlorotannin theo các nhóm khối lượng khác nhau Dung môi rửa giải được sử dụng là chloroform : methanol : acid formic (90:9:1) Sau đó, phân đoạn thu được sẽ được hòa tan trong ethanol 96% và tiến hành lọc.

Cô đặc là quá trình loại bỏ dung môi để thu được phlorotannin tinh ở dạng cao Sau đó, cao phlorotannin tinh này được đông khô để thuận tiện cho việc phân tích đặc điểm cấu trúc của phlorotannin.

Phlorotannin tinh: có màu trắng đục