TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Đinh lăng (Polyscias)
Theo nghiên cứu về phân loại thực vật, chi Polyscias có vị trí phân loại như sau: [88]
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Sơn thù du (Cornales)
1.1.2 Phân bố của chi Đinh lăng (Polyscias)
Chi Đinh lăng có từ 114 đến 150 loài, chủ yếu phân bố tại Madagascar và một số đảo ở Thái Bình Dương Tại Việt Nam, nhiều loài Đinh lăng được trồng để làm cảnh và làm hàng rào, trong đó chỉ có một vài loài được sử dụng trong y học.
Đinh lăng lá nhỏ thường gọi là cây Lá gỏi hay Đinh lăng lá xẻ, tên khoa học:
Polyscias fruticosa L Harms.- Nothopanax fruticosus (L.) Miq Tieghemopanax fruticosus Vig
Đinh lăng lá tròn: Polyscias balfouriana Baill
Đinh lăng trổ còn gọi là Đinh lăng viền bạc: Polyscias guilfoylei (Cogn
Đinh lăng lá to còn gọi là Đinh lăng ráng, tên khoa học là Polyscias filicifolia (Merr) Baill
Đinh lăng đĩa: Lá to tròn, tên khoa học là Polyscias scutellarius (Burm F.)
Đinh lăng lá răng: Lá 2 lần kép, thân màu xám trắng, tên khoa học là Polyscias serrata Balf
1.1.3 Đặc điểm thực vật của chi Đinh lăng (Polyscias)
Chi Đinh lăng (Polyscias) bao gồm các cây gỗ nhỏ hoặc nhỡ, có dáng mảnh và tán lá đẹp, thường xanh và không có gai Lá của chúng có thể là lá kép lông chân vịt hoặc lá đơn với thùy chân vịt, có hình dạng lá chét thay đổi Cụm hoa thường tạo thành chùm hoặc chùy, với cuống hoa có khớp rụng Đài hoa có 5 răng, cánh hoa có 5 chiếc, và bộ nhị gồm 5 nhị, bao phấn hình trứng hoặc thuôn Bầu dưới thường có 2 ô, ít khi có 3-4 ô, vòi nhụy có 2-4 phần rời hoặc hợp lại ở gốc Quả của chi này thường dẹt, với hạt dẹt.
1.1.4 Thành phần hoá học của chi Đinh lăng (Polyscias)
Chi Đinh lăng là một trong hai chi lớn nhất thuộc họ Nhân sâm, tuy nhiên, trên thế giới, chỉ có một số loài của chi Polyscias được nghiên cứu, bao gồm P fruticosa, P filicifolia, P scutellaria, P amplifolia, P dichroostachya, P fulva, P murrayi và Polyscias sp nov.
Loài P fruticosa (L.) Harms thuộc chi Đinh lăng (Polyscias) đã thu hút sự chú ý đáng kể trong nghiên cứu về thành phần hoá học Nhiều nghiên cứu trước đây đã công bố thông tin về thành phần hoá học của một số loài trong chi này, được tổng hợp trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Polyscias
Tên loài Tên chất TLTK
(Baker) Harms acid 3–O–β–D–galactopyranosyloleanolic (28); acid 3–
O–β–D–galactopyranosyl–(14)–β–D– galactopyranosyloleanolic (29); acid 3–O–β–D– galactopyranosyl–(14)–β–D–xylopyranosyloleanolic (30); acid 3–O–β–D–galactopyranosyl–(14)–α–L– arabinopyranosyloleanolic (31)
Polyscias filicifolia Balf stigmasterol (7); spinasterol (8); quercetin–3,7,3’,4’– tetrametyl eter (17); acid oleanolic (26); 3–O–β–D– glucopyranosyl stigmasterol (11); kaempferol–3,7–di–
O–α–L–rhamnopyranosid (18); acid 3–O–β–D– glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (32);1–O–etyl–6–O– (1– hydroxymetyl–2–hydroxy)etylglucose
3–O–α–L–rhamnopyranosyl– (12) –α–L– arabinopyranosylhederagenin (53); 3–O–α–L– rhamnopyranosyl– (12) –α–L– arabinopyranosylhederagenin–28–O–β–L– rhamnopyranosyl–(14)–β–D–glucopyranosyl–(16)– β–D–glucopyranosyl ester (kalopanax saponin B) (56);
[25] lichexanthon (19); β–sitosterol (6); 3–O–β–D– glucopyranosyl stigmasterol (11); 3–O–β–D– glucopyranosyl β–sitosterol (9); acid oleanolic (26); hederagenin (27); 3–O–α–L– arabinopyranosylhederagenin (52); 3–O–α–L– rhamnopyranosyl– (12) –α–L– arabinopyranosylhederagenin (53); 3–O–α–L– rhamnopyranosyl– (12) –α–L–
6 arabinopyranosylhederagenin–28–O–β–L– rhamnopyranosyl–(14)–β–D–glucopyranosyl–(16)– β–D–glucopyranosyl ester (kalopanax saponin B) (56);
(58); acid 3–O–α–L–rhamnopyranosyl–(12)–α–L– arabinopyranosyloleanolic(β-hederin) (33); acid 3–O–
Harm β–elemen; α–bergamoten; β–germacren–D; E–γ– bisabolen (12-14) [29]
(8E)–heptadeca–1,8–dien–4,6–diyn–3,10–diol (1); (8E) –heptadeca–1,8–dien–4,6–diyn–3–ol–10–on (2); (8Z)– heptadeca–1,8–dien–4,6–diyn–3–ol–10–on (3); falcarinol (4) và panaxydol (5); acid oleanolic (26)
[55] acid 3–O–β–D–galactopyranosyl–(12)–β–D– glucopyranosyloleanolic (34); acid 3–O–α–L– rhamnopyranosyl–(14)–β–D–glucopyranosyl–28–O– β–D–glucopyranosyloleanolic (35)
[67] acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (32); acid 3–O–β–D– glucopyranosyl–(12)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (36); acid 3–O–[β–D– glucopyranosyl–(12),β–D–glucopyranosyl–(14)]– β–D–glucuronopyranosyloleanolic (37); acid 3–O–[α–
7 glucopyranosyl(14)]–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (38); acid 3–O–[β–D– galactopyranosyl–(12),β–D–glucopyranosyl–(13)]– β–D–glucuronopyranosyloleanolic (39); 3–O–β–D– glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D– glucopyranosyl ester (40); 3–O–[β–D–glucopyranosyl–
(12),β–D–glucopyranosyl–(14)]–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D– glucopyranosyl ester (41); 3–O–[α–L– arabinopyranosyl–(12), β–D–glucopyranosyl–
D–glucopyranosyl ester (43); 3–O–β–D- glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–α–L– rhamnopyranosyl–(13)–β–D–glucopyranosyl ester (44); 3–O–[β–D–glucopyranosyl–(12), β–D– glucopyranosyl– (14)]–β–D–7– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–α–L– rhamnopyranosyl–(13)–β–D–glucopyranosyl ester
Polyscias murrayi Harms acid 3,4–di–O–3–(4–hydroxyphenyl)propionyl–1,5– dihydroxycyclohexancarboxylic (23); acid 3,5–di–O–3–
(4–hydroxyphenyl)propionyl–1,4– dihydroxycyclohexancarboxylic (24); acid 3–(4– hydroxyphenyl)propanoic (21); acid 3–(3,4–
8 dihydroxyphenyl)propanoic (22); acid 3,5–dicaffeoyl– muco–quinic (25) Polyscias nodosa (Blume)
3–O–β–D–glucopyranosyloleanan (60); acid 3–O–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (46); acid 3–O–β–D– glucopyranosyl–(12)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (36); acid 3–O–β–D– glucopyranosyl–(13)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (47); 3–O–β–D– glucopyranosyl–(13)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D– glucopyranosyl ester (48); acid 3–O–β–D– glucopyranosyl–(12)–β–D–glucopyranosyl–(14)– β–D–glucuronopyranosyloleanolic (49); acid 3–O–β–D– glucopyranosyl–(12)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (36); 3–O–β–D– glucopyranosyl–(14)–β–D–glucopyranosyl–(12)– β–D–glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D– glucopyranosyl ester (50)
Polyscias scutellaria stigmasterol (7); spinasterol (8); 3–O–β–D– glucopyranosyl stigmasterol (11); acid 3–O–β–D– glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (32); 3–O–β–D– glucopyranosyl–(14)–β–D– glucuronopyranosyloleanolic–28–O–β–D– glucopyranosylester (40); 3–O–β–D–glucopyranosyl–
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập từ các loài thuộc chi Polyscias được trình bày theo các nhóm hợp chất sau:
(8E) –heptadeca–1,8–dien–4,6– diyn–3–ol–10–on (2)
(8Z)–heptadeca–1,8–dien–4,6–diyn–3–ol–10– on (3) falcarinol (4) panaxydol (5)
Các sterol và glycosid của sterol β–sitosterol (6) stigmasterol (7) spinasterol (8) 3–O–β–D–glucopyranosyl β–sitosterol (9)
(16) quercetin–3,7,3’,4’– tetrametyl eter (17) kaempferol–3,7–di–O–α–
L–rhamnopyranosid (18) lichexanthon (19) acid 3–(4– hydroxyphenyl) propionyl choline (20) acid 3–(4– hydroxyphenyl)propanoic
(21) acid 3–(3,4– dihydroxyphenyl) propanoic (22) acid 3,4–di–O–3–(4– hydroxyphenyl)propiony l–1,5– dihydroxycyclohexancar boxylic (23)
12 acid 3,5–di–O–3–(4– hydroxyphenyl)propionyl–1,4– dihydroxycyclohexancarboxylic (24) acid 3,5–dicaffeoyl–muco–quinic (25)
Các triterpenoid acid oleanolic (26) hederagenin (27)
Các saponin có aglycon là acid oleanolic
Các saponin có phần aglycon là hederagenin
12–oxo–3–β–16–β–20(S)– trihydroxydammar–24–en–3–O–α–L– rhamnopyranosyl–(12)–β–D– glucopyranosid (57) acid 3–O–[α–L–rhamnopyranosyl–
Hình 1.1 Các hợp chất được phân lập từ chi Polyscias
1.1.5 Tác dụng sinh học của chi Đinh lăng (Polyscias) Đinh lăng được gọi là “nhân sâm của người nghèo” vì có những tác dụng tương tự Nhân sâm, như tăng cường sức dẻo dai, nâng cao sức đề kháng của cơ thể, giảm mệt mỏi, bổ dưỡng, giúp ăn ngon, ngủ yên, tăng khả năng lao động và làm việc bằng trí óc, tăng cân và chống độc….[3], [12] Cụ thể các nghiên cứu cho thấy:
Nước sắc từ rễ cây Đinh lăng lá xẻ có khả năng tăng cường sức dẻo dai của cơ thể, tương tự như tác dụng của Nhân sâm Các nghiên cứu trên chuột cho thấy Đinh lăng lá xẻ không chỉ có tác dụng lợi tiểu mà còn giúp tăng cường sức đề kháng cho chuột.
Đinh lăng lá xẻ là một loại thảo dược có tác dụng tăng cường sức lực, hỗ trợ tăng cân và nâng cao khả năng chịu đựng, đặc biệt hữu ích cho bộ đội và vận động viên thể thao.
Năm 1992, Lutomski J và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của các hợp chất có trong cây Đinh lăng lá xẻ Trong nghiên cứu, các hợp chất polyacetylen, đặc biệt là (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol, đã được phân lập từ cây Panax vietnamensis, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y học.
Polyscias fruticosa cho thấy có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương, kháng nấm Candida albican nhưng không kháng được vi khuẩn Gram âm [54]
Năm 1998, Bernard Bensita Mary và cộng sự đã công bố nghiên cứu cho thấy dịch chiết n-butanol từ lá cây Đinh lăng lá xẻ với liều 500 mg/Kg có tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm và diệt nhuyễn thể trên chuột nhắt trắng.
Năm 2001, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng cao Đinh lăng lá xẻ có tác dụng chống trầm cảm và giúp phục hồi giấc ngủ bị rút ngắn do stress, hiệu quả nhất với liều 45.
Liều 180 mg/Kg thể trọng có nhiều tác dụng tích cực như tăng cường sức lực, kích thích hoạt động não bộ và nội tiết, nâng cao sức đề kháng, cũng như chống viêm và xơ vữa động mạch Ngoài ra, dịch chiết cồn từ rễ Đinh lăng được nuôi cấy mô trong 6 tháng cho thấy khả năng tăng lực lâu dài, giúp chống stress nóng và có tác dụng kháng viêm tương tự như dịch chiết từ rễ cây Đinh lăng lá xẻ 5 năm tuổi trồng tự nhiên.
Năm 2007, một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Thu Hương và Phạm Thị
Nghiên cứu của Mỹ Loan cho thấy dịch chiết cồn 96% và 45% từ lá Đinh lăng lá xẻ có tác dụng tích cực trong việc ngăn chặn sự suy giảm miễn dịch do cyclophosphamid gây ra Cụ thể, bột cao lá Đinh lăng (50-100 mg/Kg) giúp ức chế sự giảm trọng lượng của lách và tuyến ức, đồng thời tăng cường chỉ số thực bào ở cả chuột bình thường và chuột bị suy giảm miễn dịch Hơn nữa, dịch chiết cồn từ rễ Đinh lăng lá xẻ nuôi cấy trong 6 tháng cho thấy khả năng tăng lực lâu dài, chống stress nóng và kháng viêm tương tự như dịch chiết từ rễ cây Đinh lăng 5 năm tuổi trồng tự nhiên.
Năm 2008, nghiên cứu của Nguyễn Trần Châu và cộng sự cho thấy cao lá Đinh lăng lá xẻ với liều 200 mg/Kg và 500 mg/Kg có khả năng giảm lượng Malondialdehyd trong não và gan chuột nhắt trắng sau khi bị gây tăng bằng CCl4 Ngoài ra, cao lá Đinh lăng cũng giúp giảm nồng độ cholesterol trong máu so với nhóm không điều trị.
200 mg/Kg có tác dụng chống oxy hóa và hạ cholesterol ở chuột nhắt tốt hơn so với liều
Năm 2011, Varadharajan và các cộng sự đã chứng minh rằng cao chiết ete dầu hỏa từ rễ Đinh lăng lá xẻ có tác dụng lợi tiểu trên động vật thí nghiệm.
Năm 2012, nghiên cứu của Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ ra rằng hai flavonoid quercitrin và kaempferol-3-O-rutinosid có khả năng ức chế enzym α-amylase trong điều kiện in vitro, với giá trị IC50 lần lượt là 4,61 µg/ml và 59,4 µg/ml.
Tổng quan về loài Polyscias guilfoylei
1.2.1 Đặc điểm thực vật của loài Polyscias guilfoylei
Polyscias guilfoylei Bail là một loài cây thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), có hình dáng cây bụi cao từ 3 đến 4 mét với thân cây ít phân nhánh Loài này nổi bật với lá đa dạng, có màu lục sáng và viền trắng, chia lông chim đều đặn Cuống lá ngắn và to, thường có sọc hoặc đốm, trong khi lá chét thuôn và có răng không đều.
Vào năm 2019, Đinh Thị Vân và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về đặc điểm thực vật của cây Đinh lăng răng, một loại cây gỗ nhỏ có chiều cao từ 2-3m Cây có rễ cọc ăn sâu và nhiều rễ phụ Thân cây phân nhánh từ gốc, với thân già có màu nâu và đường kính từ 4-6 cm, trong khi thân non có màu xanh đậm, đường kính từ 0,8-1,2 cm và có những đốm trắng nhỏ Bề mặt thân cây có nhiều nốt sần và sẹo dạng nhẫn, là dấu tích của bẹ lá sau khi rụng.
Lá kép lông chim 2 lần dài 18-36 cm; cuống lá dài 12-20 cm có bẹ lá dài 1,5-
Lá có chiều dài 2 cm, ôm lấy thân với mặt ngoài màu xanh đậm có nốt sần và mặt trong màu xanh nhạt Tại mấu đầu tiên của lá kép, có từ 2 đến 5 nhánh Số lượng lá chét dao động từ 22 đến 32, với cuống dài từ 1 đến 3 cm và đường kính 0,1-0,2 cm Cuống lá có cánh rộng khoảng 0,1-0,2 cm mỗi bên Phiến lá có màu xanh đậm, nhẵn cả hai mặt và có hình dạng đa dạng, bao gồm hình gần tròn, hình gốc lệch và ngọn lá chia.
2 thùy hoặc xẻ sâu thành 2-3 thùy đều hoặc không đều nhau, kích thước 2-6 cm × 2-
Lá có chiều dài khoảng 6 cm, với gốc lá thường hình tròn hoặc hơi tù Gân lá hình mạng nổi bật, có từ 2 đến 5 gân chính xuất phát từ gốc và rõ ràng ở cả hai mặt Mép lá có răng thưa, cách nhau từ 0,5 đến 1 cm.
1.2.2 Thành phần hoá học của loài Polyscias guilfoylei
Năm 2009, Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã công bố kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học của Polyscias guilfoylei gồm các hợp chất sau [16]: isophytol (63) acid oleanolic (26)
19 acid 3–O–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (64) acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–(13)–β– D–glucuronopyranosyloleanolic (65) acid 3–O–β–D–glucopyranosyl–(14)– β–D–glucuronopyranosyloleanolic (66) acid 3–O–[β–D–glucopyranosyl–(13), β–D–glucopyranosyl–(14)]–β–D– glucuronopyranosyloleanolic (67) acid 3–O–[β–D–glucopyranosyl
Năm 2019, Ashmawy và cộng sự đã công bố 9 hợp chất phân lập được từ lá
Polyscias guilfoylei [21], cụ thể là: ent-labda-8(17),13-diene-15,18-diol
(8Z)–2–(2–hydroxypentacosanoylamino) octadeca–8–ene–1,3,4–triol (73) 4–hydroxybenzoic acid (74) tamarixetin–3,7–di–O–α–L–rhamnopyranoside (75)
Năm 2019, Đinh Thị Vân và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất từ lá của
Polyscias guilfoylei [17], đó là các hợp chất: methyl 3,5-dicaffeoylquinate (76) acid chlorogenic (77)
(79) acid oleanolic (26) acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)- β-D-glucuronopyranosyloleanolic (80)
Năm 2019, Lê Hương Giang và cộng sự đã phân lập được 2 hợp chất từ thân cây Polyscias guilfoylei [5], bao gồm: acid chlorogenic (77) acid rosmarinic (81)
Hình 1.2 Các hợp chất được phân lập từ loài Polyscias guilfoylei
1.2.3 Tác dụng sinh học của loài Polyscias guilfoylei
Năm 2008, Giuseppina Cioffi đã nghiên cứu tác dụng chống tế bào ung thư của hợp chất 3–β–O–[β–D–glucopyranosyl–(1→2)–α–L–arabinopyranosyl]–echinocysticacid–28–[O–β–D–glucopyranosyl–(1→6)–O–β–D–glucopyranosyl] ester trên ba dòng tế bào ung thư J774.A1, HEK-293, và WEHI-164 Kết quả cho thấy hợp chất này ức chế cả ba dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 lần lượt là 0.19 ± 0.001 μM đối với J774.A1 và 0.35 ± 0.003 μM đối với HEK-293.
Năm 2015, Reksi và cộng sự nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá của lá cây
Polyscias guilfoylei, kết quả cho thấy dịch chiết methanol của lá Polyscias guilfoylei cho kết quả hoạt tính chống oxy hoá rất có triển vọng [78]
Năm 2018, Ashmawy và các cộng sự đã công bố nghiên cứu về tinh dầu lá Polyscias guilfoylei, cho thấy hoạt tính kháng tụ cầu vàng với giá trị MIC là 313 μg/mL và hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào Caco-2 với IC50 đạt 70,62 μg/mL.
Năm 2019, Ashmawy và cộng sự đã công bố rằng dịch chiết từ lá Polyscias guilfoylei có tác dụng kháng khuẩn đối với Escherichia coli với giá trị IC50 là 9.76 μg/ml Họ cũng phát hiện hợp chất N-(1,3-dihydroxyoctadecan-2-yl) palmitamide, được phân lập từ lá, có khả năng ức chế giải phóng histamin trong tế bào đơn nhân U937 của người với giá trị IC50 là 38,65 μg/ml.
Năm 2019, Rajani và các cộng sự đã công bố nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào của tinh dầu lá Polyscias guilfoylei, cho thấy hiệu quả trên cả mô hình in vivo và in vitro đối với tế bào ung thư hạch bạch huyết.
Năm 2019, Đinh Thị Vân và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng tăng lực của cây Đinh lăng răng dựa trên tri thức dân gian Kết quả cho thấy, khi cho chuột trắng uống cao chiết đinh lăng với liều 3g/kg liên tục trong 2 tuần, đã ghi nhận sự cải thiện đáng kể về sức lực trong mô hình trụ quay rota-rod.
Tổng quan về đánh giá hoạt tính chống oxy hoá
Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính chống oxy hoá
Các chất chống oxy hóa ngoại sinh phổ biến bao gồm β-carotene, curcumin, selenium, α-tocopherol, các hợp chất polyphenol, flavonoid, polysaccharid và triterpenoid Những chất này chủ yếu có nguồn gốc từ thiên nhiên, đặc biệt là thực vật, và thường được sử dụng trong thực phẩm cũng như làm dược liệu.
Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
Việc đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được tiến hành theo các bước:
Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa hóa học in vitro dựa trên cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa, bao gồm các mô hình thử nghiệm để đánh giá khả năng cho electron và nguyên tử hydro Mỗi mô hình sử dụng các thuốc thử khác nhau, do đó chỉ phản ánh một khía cạnh của hoạt tính chống oxy hóa Để có đánh giá toàn diện, cần sử dụng nhiều mô hình thử nghiệm Mặc dù sàng lọc hóa học đơn giản, rẻ tiền và có thể thực hiện hàng loạt, nhưng đây chỉ là bước đầu, vì chất có hoạt tính chống oxy hóa tốt trong mô hình hóa học chưa chắc đã hoạt động hiệu quả trong cơ thể sinh vật.
Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa sinh học in vitro được thực hiện thông qua việc thử nghiệm khả năng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào được tách ra từ cơ thể sinh vật thí nghiệm như chuột và thỏ Các tế bào này sẽ được gây tổn thương bằng chất oxy hóa để đánh giá hiệu quả của các hợp chất chống oxy hóa.
Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa sinh học in vivo là quá trình thử nghiệm khả năng bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do chất oxy hóa gây ra trên cơ thể sinh vật Phương pháp này giúp đánh giá hiệu quả của các chất chống oxy hóa trong việc bảo vệ tế bào, từ đó cung cấp thông tin quý giá cho nghiên cứu và phát triển các sản phẩm bảo vệ sức khỏe.
Tổng quan về đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất thiên nhiên
Sàng lọc hoạt tính của các chất là bước quan trọng nhằm phát hiện các hoạt tính sinh học tiềm năng từ hợp chất thiên nhiên, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí trong nghiên cứu phát triển thuốc Các phương pháp thử nghiệm sinh học trở thành công cụ mạnh mẽ trong việc tìm kiếm hợp chất tự nhiên cho nhiều mục đích sinh học, đặc biệt trong lĩnh vực thuốc chống ung thư Mục tiêu của việc sàng lọc này là xác định các phân đoạn có hoạt tính sinh học cao, từ đó nghiên cứu thành phần hóa học để tìm ra các hợp chất tinh khiết, góp phần vào việc phát hiện các chất mới có hoạt tính gây độc tế bào từ thiên nhiên.
Các phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất thiên nhiên
Hiện nay, có hai phương pháp phổ biến để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trong các nghiên cứu, bao gồm phương pháp MTT của Tim Mosmann và phương pháp của Monks.
Tổng quan về đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Thực trạng về nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Hiện nay, sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật đã dẫn đến nhiều phương pháp thử nghiệm tác dụng kháng vi sinh vật Tuy nhiên, không phải tất cả các phương pháp đều phù hợp với sản phẩm từ thực vật Dưới đây là một số phương pháp hiệu quả để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các cao phân đoạn và các chất tinh khiết được chiết xuất từ thực vật.
Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
- Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar disk diffusion assay)
- Phương pháp pha loãng thạch (Agar dilution assay)
- Phương pháp pha loãng trên đĩa 96 giếng (Broth microdilution)
- Phương pháp sinh học tự động (Bioautography)
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là vỏ thân và lá của cây Đinh lăng răng thu hái vào tháng 8/2018 tại huyện Tiền Hải - Thái Bình, đã được giám định tên khoa học là Polyscias guilfoylei (W.Bull) L.H.Bailey cv quinquefolia (Phụ lục 1) Tiêu bản thực vật hiện đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản cây thuốc - Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội (Số hiệu HNIP/18547/19) (Phụ lục 2) Dược liệu được rửa sạch, cắt nhỏ, phơi sấy ở 55 o C đến độ ẩm dưới 10%, cho vào túi PE kín để bảo quản tại nơi thực hiện luận văn (Bộ môn Dược học cổ truyền)
2.1.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất
- Hóa chất: Bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), pha đảo RP18
F254s (Merck), chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 µm, Merck), và pha đảo RP-18 (30 - 50 µm, Merck) được sử dụng trong nghiên cứu Các dung môi công nghiệp bao gồm n-hexan, ethyl acetat, n-butanol, aceton, dichloromethan (CH2Cl2), methanol (MeOH) và nước cất (H2O).
- Các hóa chất thuốc thử khác đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam V
2.1.2.2 Phương tiện và máy móc
- Sắc ký cột dựng chất hấp phụ là silica gel F254 cỡ hạt 60 - 200 àm (Merck), sephadex LH-20
- Máy đo phổ khối LCMS8045 của Shimadzu, Nhật Bản
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC) của hãng Bruker với tần số 500MHz đang được sử dụng tại Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam (VAST).
- Máy đo HPLC điều chế của Shimadzu, Nhật Bản tại Viện Dược liệu
- Mỏy cụ quay 5 lớt và 20 lớt của BĩCHI, Thụy Sĩ
- Bể siêu âm Memmert WNB22, dung tích 22 lít
- Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench, Sanyo, Nhật Bản)
- Micropipet cỏc cỡ (0,5 àl - 1000 àl)
- Ống đong các loại (10 - 2000 ml)
- Bình cầu đáy tròn các loại (50 - 2000 ml)
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập các hợp chất
2.2.1.1 Chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn
Theo phương pháp chiết các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần của dung môi
Vỏ thân và lá cây được tách riêng, cắt nhỏ, sấy khô và xay thô, thu được 1,1 Kg vỏ thân khô và 4,1 Kg lá khô Sau đó, chúng được chiết xuất bằng dung môi ethanol kết hợp với siêu âm trong bể chiết siêu âm ổn định ở 45 o C, thực hiện siêu âm 30 phút, lặp lại 3 lần Dung môi được cất thu hồi và hòa vào nước, sau đó lắc phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan, n-buthanol, ethyl acetate và nước, thu được các phân đoạn cắn n-hexan, cắn ethyl acetate, cắn n-buthanol và cắn nước.
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn
2.2.1.2 Phân lập các hợp chất chính
Các phân đoạn được tách biệt bằng sắc ký cột silica gel pha thường (Merck), sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 và HPLC điều chế Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn 60 GF254 (Merck) và RP-18 (Merck) để theo dõi vết các chất từ các phân đoạn Sắc ký đồ được quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm, hoặc bằng cách sử dụng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol làm thuốc thử.
Hệ thống HPLC được sử dụng trong điều chế là của Shimadzu, Nhật Bản, với cột sắc ký Discovery HS C18 có kích thước 25cm x 21,2mm và kích thước hạt 10 µm Pha động là hỗn hợp gradient methanol và nước với tỷ lệ từ 4:6 (v:v) đến 10:0 (v:v) trong khoảng thời gian 75 phút, với tốc độ dòng chảy là 5,00 mL/phút.
- Chiết với ethanol 96%, 3 lần x 30 phút/ lần
- Lắc với ethyl acetat (3 lần)
2.2.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập dựa vào các tính chất hóa lý như trạng thái, màu sắc và độ quay cực, kết hợp với dữ liệu phổ khối (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) Ngoài ra, việc sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC) và so sánh các dữ liệu thu được với tài liệu đã công bố cũng là bước quan trọng trong quá trình này.
2.2.2 Phương pháp đánh giá một số hoạt tính sinh học từ cây Đinh lăng răng 2.2.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hoá
Bài viết này phân tích các ưu nhược điểm của các mô hình thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hóa học, trong đó mô hình đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH được lựa chọn do tính đơn giản, độ chính xác cao và khả năng áp dụng rộng rãi cho nhiều đối tượng nghiên cứu.
Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa dựa trên khả năng bẫy gốc tự do của DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) đã được công nhận Chất thử được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO 100%), trong khi DPPH được pha trong ethanol 96% Sự hấp thụ của DPPH tại bước sóng 515 nm được đo bằng máy đọc ELISA sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch mẫu thử trên phiến 96 giếng Kết quả thử nghiệm được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của ít nhất 3 phép thử lặp lại với độ lệch chuẩn (p ≤ 0,05).
Các bước tiến hành phép thử hoạt tính chống oxy hoá:
Bước 1: Pha dung dịch DPPH trong ethanol 96% với nồng độ 300 àM ngay trước khi dùng
Bước 2: Hòa tan mẫu thử trong dung môi DMSO 100% bằng máy Vortex
Bước 3: Trên mỗi giếng thử của phiến 96 giếng, trộn 10 µL dung dịch mẫu thử trong DMSO 100% với 190 µL dung dịch DPPH/EtOH Dải nồng độ mẫu trong mỗi giếng thử thay đổi tùy thuộc vào loại mẫu: 25-50-100-200-400 µg/mL cho các mẫu dịch chiết thô (cao toàn phần, cao chiết các phân đoạn); 12,5-25-50-100 µg/mL cho các mẫu chất tinh sạch (các chất tinh khiết phân lập được).
Bước 4: Chứng dương: Pha dung dịch acid ascorbic (Sigma-Aldicrich, USA) để có cỏc dung dịch cú nồng độ 12,5-100 àg/mL
Chứng õm: Pha dung dịch DPPH/EtOH + DMSO cú chứa 10 àL DMSO thay cho mẫu thử
Phiến thí nghiệm cần được bọc kín để tránh ánh sáng và ủ ở nhiệt độ 37 o C trong 30 phút, nhằm đảm bảo phản ứng oxy hóa diễn ra hoàn toàn Sau đó, tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 515 nm bằng máy đọc đĩa Tecan (Tecan F150, Austria).
Khả năng trung hòa các gốc tự do (Scavenging capacity, SC%)
Giá trị trung bình của SC (%) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xử lý số liệu Excel theo công thức:
𝑆𝐶% = [100 −OD (mẫu thử) – OD (mẫu trắng)
OD (chứng âm tính) × 100] ± 𝜎 Độ lệch tiêu chuẩn tính theo công thức của Ducan như sau:
𝑛 − 1 Các phép thống kê sử dụng phương pháp phân tích phương sai ANOVA (Excel, Microsoft Office)
Mẫu chất thử được pha loãng thành các nồng độ giảm dần và lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ Hiệu quả bẫy gốc tự do từ DPPH được tính toán dựa trên phần trăm trung hòa gốc tự do so với mẫu trắng và chứng âm tính Những mẫu có hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH sẽ được tiến hành các bước tiếp theo để xác định giá trị IC50 (µg/ml) Giá trị IC50 là nồng độ của chất thử tại đó trung hòa được 50% gốc tự do, được xác định thông qua phần mềm TableCurve AISN Software (Jandel Scientific) dựa trên giá trị SC% và dãy các nồng độ chất thử tương ứng.
2.2.2.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
Theo phương pháp của Skehan và Likhiwitayawuid, các nguyên tắc này đã được áp dụng tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) cũng như tại Trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago.
Dòng tế bào (cell lines)
- Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)
- Dòng A549 (Human lung carcinoma – Ung thư phổi)
- Dòng Vero (Vero cells – Tế bào biểu mô thận khỉ)
Môi trường và các dụng cụ, hóa chất:
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) and MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) are enriched with essential components such as L-Glutamine, Sodium Pyruvate, NaHCO3, and PSF (Penicillin-Streptomycin sulfate-Fungizone) Additionally, they contain NAA (Non-Essential Amino Acids) and 10% BCS (Bovine Calf Serum), making them suitable for various cell culture applications.
- Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic
- Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến 96 giếng, pipet pasteur, các đầu týp cho micropipet…
- Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipticine (Sigma-Aldicrich, USA) pha trong DMSO
Các bước tiến hành phép thử hoạt tính gây độc tế bào:
Bước đầu tiên trong quy trình thí nghiệm là thực hiện trypsin hóa tế bào để tách rời các tế bào, sau đó đếm số lượng tế bào trong buồng đếm nhằm điều chỉnh mật độ phù hợp Mật độ tế bào lý tưởng trong mỗi giếng thử của phiến 96 giếng là 5 x 10^3 tế bào.
Bước 2: Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp và để chúng phát triển trong ít nhất 72 giờ
Bước 3: Sử dụng một khay 96 giếng không chứa chất thử nhưng có 180 μL tế bào ung thư làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, tiến hành cố định tế bào trong đĩa đối chứng ngày 0 bằng Trichloracetic acid (TCA).
Nồng độ mẫu trong mỗi giếng thử phụ thuộc vào loại mẫu, với các mức 1-5-10-20-40 àg/mL cho mẫu dịch chiết thụ (cao toàn phần, cao chiết các phân đoạn) và 0,5-1-2,5-5-10 àg/mL cho mẫu chất tinh sạch (các chất tinh khiết phân lập được) Sau giai đoạn ủ trong tủ ấm CO2 (5%), tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA.
Sau khi nhuộm bằng SRB trong 30 phút, mẫu được ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ 37 độ C Tiếp theo, loại bỏ SRB và rửa các giếng thí nghiệm ba lần bằng dung dịch axit axetic 5%, sau đó để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cây Đinh lăng răng
3.1.1 Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất
Lá cây Đinh lăng răng (4,1 Kg) được cắt nhỏ và ngâm chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ 65°C, thực hiện 3 lần với 8 lít mỗi lần Sau khi lọc và gộp dịch lọc, dung môi được loại bỏ dưới áp suất giảm, thu được 1128,54 g cao chiết cồn Cao chiết này được chia thành 2 phần, hòa tan mỗi phần vào 1 lít nước cất, sau đó chiết lần lượt với n-hexan, EtOAc và n-butanol, mỗi loại 1 lít, 3 lần Kết quả thu được các phân đoạn n-hexan (282,66 g), EtOAc (126,07 g) và n-butanol (150,54 g), và tiến hành thu hồi dung môi theo từng phân đoạn.
Phân đoạn n-butanol (150,54 g) được xử lý qua cột sắc ký silica gel (11 x 64 cm) và rửa giải bằng hệ dung môi diclomethan-methanol với các tỷ lệ khác nhau (50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 v/v), tạo ra 59 phân đoạn (LB1 – LB59) Tiếp theo, phân đoạn LB28 (5,60 g) được đưa qua cột pha đảo RP-18 (2 x 45 cm) với pha động là methanol-nước theo các tỷ lệ (1:3, 1:2, 1:1,5, 1:1, 2:1, 3:1, 3,5:1), thu được 148 phân đoạn (LB28-1 – LB28-148).
Hợp chất 1 (LB1.1) được thu nhận từ 132 thu được Phân đoạn LB28-85 (0,8 g) tiếp tục được xử lý qua cột pha đảo RP-18 (2 x 45 cm) và rửa giải bằng hệ MeOH-H2O = 1:2 (v/v), tạo ra 8 phân đoạn (LB28-85-1 đến LB28-85-6) Phân đoạn LB28-85-2 (39,2 mg) được xử lý qua cột pha đảo RP-18 (1 x 45 cm) và rửa giải bằng hệ methanol-nước (1:3, 1:2,5, 1:2, 1:1), từ đó thu được hợp chất 2 (LB2) với khối lượng 26,9 mg (Hình 3.1)
Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất và phân lập từ lá Polyscias guilfoylei
Vỏ thân cây Đinh lăng răng (1,1 Kg) được cắt nhỏ và ngâm chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ 65 o C, thực hiện trong 3 lần với tổng thể tích 8 lít Sau khi lọc và gộp dịch lọc, dung môi được loại bỏ dưới áp suất giảm, thu được cao chiết cồn với khối lượng 375,24 g Cao chiết cồn này được hòa tan trong 1 lít nước cất và sau đó tiến hành chiết lần lượt với dung môi n-hexan (1 lít × 3 lần) và EtOAc (1 lít × 3 lần).
38 lần), và n-butanol (1 lít × 3 lần) Thu được các phân đoạn phân đoạn n-hexan (43,84 g), EtOAc (17,65 g) và n-butanol (20,19 g) Tiến hành thu hồi dung môi theo từng phân đoạn
Phân đoạn n-butanol (20,19 g) được tách qua cột sắc ký silica gel (3 x 60 cm) bằng hệ dung môi diclomethan-methanol với tỷ lệ 20:1, 10:1, 5:1 và 1:1, thu được 26 phân đoạn (VB1 – VB26) Phân đoạn VB19 (1,64 g) tiếp tục được xử lý qua cột pha đảo RP-18 (2 x 45 cm) với pha động methanol-nước ở các tỷ lệ 1:2,5, 1:2, 1:1,5, 1:1, 2:1 và 3:1, cho ra 240 phân đoạn (LB19-1 – LB19-240) Trong số đó, phân đoạn VB19-143 chứa hợp chất 3 (12,5 mg) được ký hiệu là VB4, trong khi phân đoạn VB19-150 đến VB19-205 được gộp lại (120,34 mg) và sử dụng phương pháp HPLC với pha động MeOH-H2O để điều chế.
= 40%-60% đến 100%-0% trong thời gian 75 phút với tốc độ dòng 5,00 mL/phút thu được 7 phân đoạn (VB19-150-1 – VB19-150-7) (Hình 3.3) Phân đoạn VB19-150-
4 (thời gian lưu 44,6 phút) thu được hợp chất 4 (ký hiệu VB1) (15,4 mg) và phân đoạn VB19-150-5 (thời gian lưu 46,9 phút) thu được hợp chất 5 (ký hiệu VB2) (9,6 mg) (Hình 3.2)
Hình 3.2 Sơ đồ chiết xuất và phân lập từ vỏ thân Polyscias guilfoylei
Sắc ký đồ HPLC của phân đoạn từ vỏ thân Polyscias guilfoylei cho thấy hai vị trí quan trọng, được đánh dấu là VB1 với thời gian lưu 44,6 phút và VB2 với thời gian lưu 46,9 phút.
UV 366 nm Hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol
Hình 3.4 Sắc ký lớp mỏng của phân đoạn VB19-150 đến 205 (ký hiệu: T) và 2 chất phân lập được VB1 và VB2
3.1.2 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được
Hợp chất 1 (ký hiệu: LB1.1) thu được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng
Dựa vào tín hiệu mảnh ion m/z = 793,60 [M-H] trong phổ khối ESI-MS và kết hợp với phổ 13C NMR, công thức phân tử của hợp chất LB1.1 đã được xác định.
C42H66O14 (M = 794) có các tín hiệu singlet đặc trưng của nhóm methyl (CH3) trong phổ 1H NMR tại các vị trí δH 0,74 (3H, s, H-25); 0,90 (3H, s, H-24); 0,91 (3H, s, H-29); 0,92 (3H, s, H-26); 0,95 (3H, s, H-30); 1,22 (3H, s, H-23); và 1,25 (3H, s, H-27), cho thấy đây là các tín hiệu đặc trưng của nhóm methyl trong khung triterpen Kết hợp với phổ 13C NMR, đã thu được 42 tín hiệu, trong đó có 2 tín hiệu carbon tại δC.
Hợp chất LB1.1 được xác định là một triterpen thuộc khung oleanan, với nối đôi ở vị trí C12-C13 và tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của nhóm -COOH tại vị trí C-28 Sự hiện diện của hai carbon anomer tại δC 106,4 (C-1′) và 105,4 (C-1′′) cùng với 8 carbon loại -CH trong vùng 87,1 - 71,3 ppm cho thấy LB1.1 là một saponin gắn hai phân tử đường Phần aglycon của LB1 là acid oleanolic, trong khi phần đường bao gồm hai phân tử glucose (δC = 62,2, C-6′′) và glucuronat (δC = 172,0, C-6′ (-COOH)) Sự hiện diện của hai phân tử đường còn được xác định qua tín hiệu proton ở δH = 5,32 (1H, d).
Hợp chất LB1.1 được xác định là một saponin, với phần aglycon là acid oleanolic và cấu trúc đường bao gồm một phân tử glucuronat và một phân tử glucose Các hằng số ghép của hai proton anomer trong cấu hình β của phân tử đường là J = 7,5 Hz và 8,0 Hz Phân tử đường thứ nhất gắn vào aglycon tại C3 (δC = 89,1), trong khi phân tử đường thứ hai gắn vào phân tử đường thứ nhất tại C-3′ (δC = 71,4) Phổ ESI-MS và dữ liệu phổ NMR đã được so sánh với các giá trị đã công bố, giúp khẳng định cấu trúc của hợp chất này.
LB1.1 được xác định là acid 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1→3)- β -D- glucuronopyranosyloleanolic (Hình 3.5)
Bảng 3.1 So sánh số liệu NMR của hợp chất 1 với tài liệu tham khảo
(Pyridine) [74] δH (ppm) ( J , Hz) δC (ppm) δH (ppm) ( J , Hz) δC (ppm)
Hình 3.5 Công thức cấu tạo của hợp chất 1
Hợp chất 2 (ký hiệu: LB2) thu được dưới dạng bột vô định hình, màu vàng
Dựa trên dữ liệu phổ ESI-MS với mảnh ion m/z = 593,30 [M-H] - và các tín hiệu carbon từ phổ 13C NMR, công thức phân tử của hợp chất LB2 được xác định là C27H30O15 (M = 594) Phổ UV của hợp chất này cho thấy hai mũi hấp thu cực đại tại 256 nm.
LB2 có thể là một flavonoid với phổ 1H NMR cho thấy các tín hiệu proton của vòng benzen tại δH 7,36 (H-2') và 6,94 (H-5'), cho thấy các proton ở vị trí ortho và meta Việc không ghi nhận tín hiệu proton tại H-3' và H-4' cho phép kết luận rằng hai vị trí này có nhóm thế, xác định LB2 có khung quercetin Ngoài ra, phổ 1H NMR còn ghi nhận hai tín hiệu δH 5,58 và δH 5,39, đặc trưng cho 2 proton anomer của 2 phân tử đường Phổ 13C cho thấy hợp chất có 17 carbon trong vùng δC = 180,0 – 95,6, xác nhận LB2 là một flavonoid gắn 2 phân tử đường Ở vùng từ trường cao, có hai mũi đôi với δH 1,29 và δH 0,97.
Hợp chất LB2 được xác định là quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid dựa trên dữ liệu phổ NMR, trong đó hai nhóm –CH3 có δC lần lượt là 17,6 (C-6'') và 18,1 (C-6''') So sánh với các giá trị công bố trong tài liệu tham khảo [92] ở bảng 3.2 cho thấy sự tương đồng rõ ràng.
Bảng 3.2 So sánh số liệu NMR của hợp chất 2 với tài liệu tham khảo
Hợp chất LB2 (MeOD) quercetin-3,7-O-α-L- dirhamnopyranoside (MeOD) [92] δH (ppm) ( J , Hz) δC
(ppm) δH (ppm) ( J , Hz) δC (ppm) 100Hz
4′′ CH 3,33 – 3,52, 4H, m 73,2 3,25 – 3,52, 4H, m 73,2 5′′ CH 4,25, 1H, br s 71,7 4,16, 1H, br s 71,7 6′′ CH3 1,29, 3H, d (6,0) 17,6 1,20, 3H, d (5,6) 17,7 3-O-Rha
4′′′ CH 3,33 – 3,52, 4H, m 73,6 3,25 – 3,52, 4H, m 73,6 5′′′ CH 4,05, 1H, br s 71,3 3,95, 1H, br s 71,3 6′′′ CH3 0,97, 3H, d (6,0) 18,1 0,89, 3H, d (6,4) 18,1
Hình 3.6 Công thức cấu tạo của hợp chất 2
Hợp chất 3 (VB4) được thu nhận dưới dạng vô định hình, màu trắng Kết quả kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho thấy hợp chất VB4 trùng với hợp chất LB1.1 được phân lập từ lá Do đó, hợp chất VB4 được xác định là acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic.
Hình 3.7 Hình ảnh kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) của hợp chất LB 1.1 (ký hiệu: T) và hợp chất VB4 (ký hiệu: 143)
Datafile Nam e:VB19 - 143.lcd Sample Nam e:VB19 - 143
Hình 3.8 Hình ảnh kiểm tra bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của hợp chất
VB4 (ký hiệu VB19-143) và hợp chất LB1
Datafile Nam e:Chat sach LB1.lcd Sample Nam e:Chat sach LB1
Hợp chất 4, ký hiệu VB1, xuất hiện dưới dạng bột vô định hình màu trắng với công thức phân tử C13H12O2 và khối lượng phân tử M = 200 Phân tích số liệu phổ đã được thực hiện để xác định các đặc tính của hợp chất này.
1H NMR (Bảng 3.3) cho thấy có 8 proton vòng thơm cho tín hiệu cộng hưởng tại vùng trường thấp δH 6,70 (4H, d, J = 8,0, H-3, 5, 3′, 5′) và δH 6,99 (4H, d, J = 7,5, H-
Kết quả đánh giá một số hoạt tính sinh học của cây Đinh lăng răng
3.2.1 Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hoá
Có 07 mẫu thử bao gồm Cao toàn phần, phân đoạn n-hexan của lá (LH), phân đoạn n-butanol của lá (LB), phân đoạn ethylacetat của lá (LE), phân đoạn n-butanol của vỏ thân (VB), chất tinh khiết LB1.1, LB2 được đánh giá hoạt tính chống oxy hoá theo phương pháp đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH được thực hiện như mục 2.2.2.1 Kết quả hoạt tính chống oxy hoá của các phân đoạn và các chất tinh khiết được trình bày ở bảng 3.5:
Bảng 3.5 Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hoá
Nồng độ đầu của mẫu
Khả năng trung hoà gốc tự do (SC, %)
(g/ml) Đối chứng (+) 50 82,230,75 13,88 Đối chứng (-) - 0 -
7 LB1.1 100 1,940,53 - Đối chứng (-): DPPH/EtOH + DMSO Đối chứng (+): DPPH/EtOH + acid ascorbic Kết quả:
- Mẫu thử LB và LB2 biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH với giỏ trị IC50 lần lượt là 373,92 và 46,15 àg/ml
- Các mẫu thử còn lại không biểu hiện hoạt tính chống oxy hoá trên hệ DPPH tại nồng độ thử nghiệm
3.2.2 Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
Có 06 mẫu thử bao gồm phân đoạn hexan của lá (LH), phân đoạn n-butanol của lá (LB), phân đoạn ethylacetat của lá (LE), phân đoạn n-butanol của vỏ thân (VB), chất tinh khiết LB1.1, LB2 được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.2.2.2
Dòng tế bào (cell lines)
- Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)
- Dòng A549 (Human lung carcinoma – Ung thư phổi)
- Dòng Vero (Vero cells – Tế bào biểu mô thận khỉ)
Kết quả hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn và các chất tinh khiết được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6 Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
- Các mẫu không biểu hiện hoạt tính ức chế hai dòng tế bào ung thư (Hep-G2 và A549) và dòng tế bào Vero tại nồng độ thử nghiệm
3.2.3 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Có 07 mẫu thử bao gồm cao toàn phần, phân đoạn n-hexan của lá (LH), phân đoạn n- butanol của lá (LB), phân đoạn ethylacetat của lá (LE), phân đoạn n-butanol của vỏ thân (VB), chất tinh khiết LB1.1, LB2 được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.2.2.3
Các chủng vi sinh vật kiểm định
- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922)
- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis subsp spizizenii (ATCC 6633)
Staphylococcus aureus subsp aureus (ATCC 25923)
- Nấm sợi: Aspergillus niger (ATCC 6275)
- Nấm men: Candida albicans (ATCC 10231)
- Streptomycin cho vi khuẩn Gr (+)
- Tetracyclin cho vi khuẩn Gr (-)
- Nystatin cho nấm sợi và nấm men
Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp
Kết quả hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các phân đoạn và các chất tinh khiết được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Nồng độ đầu của mẫu
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, g/ml) Nhận xét
Vi khuẩn Gram (+) Nấm mốc Nấm men
- Mẫu LB1.1 biểu hiện hoạt tính ức chế 2 chủng VSV thuộc S cerevisiae và
C albicans với nồng độ ức chế tối thiểu MIC lần lượt là 12,5 và 50 àg/ml
- Các mẫu Cao toàn phần, LH, LB, VB biểu hiện khả năng ức chế 1 chủng
VSV kiểm định tại nồng độ thử nghiệm
- Các mẫu thử còn lại không biểu hiện hoạt tính tại nồng độ thử nghiệm
BÀN LUẬN
Về chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất tinh khiết
Luận văn nghiên cứu thành phần hóa học của phần trên mặt đất của cây Đinh lăng răng, mặc dù trong y học cổ truyền, bộ phận được sử dụng chủ yếu là rễ Điều này cho thấy sự khác biệt giữa nghiên cứu hiện đại và ứng dụng truyền thống, mở ra hướng đi mới trong việc khai thác giá trị dược liệu của cây Đinh lăng.
Theo tri thức dân gian tại Thái Bình, người dân sử dụng phần trên mặt đất (thân và lá) của cây Đinh lăng răng để tăng cường sức khỏe, nâng cao sức đề kháng và giảm đau đầu, mệt mỏi Luận văn này tập trung nghiên cứu nhằm phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất trong bộ phận trên mặt đất của cây Đinh lăng răng, từ đó làm tiền đề cho việc nghiên cứu tác dụng sinh học của cây.
Bộ phận rễ của cây Đinh lăng thường được chế biến theo phương pháp truyền thống như sao khô và ngâm rượu, trong khi người dân Thái Bình thường sắc lấy nước Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ, nhưng lá và thân cây vẫn chưa được chú trọng Do đó, luận văn này nhằm đóng góp thêm vào nghiên cứu về hóa học của lá và thân cây Đinh lăng bằng cách phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất trong phần trên mặt đất của cây.
Luận văn đã lựa chọn phân đoạn n-butanol của lá Đinh lăng răng để tiến hành phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất là do:
Nghiên cứu trước đây đã tập trung vào việc chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của phân đoạn ethyl acetat từ cây Đinh lăng răng Luận văn này tiếp tục khám phá các phân đoạn khác của cây nhằm mở rộng và hoàn thiện cơ sở dữ liệu về thành phần hoá học của nó.
Saponin là nhóm hợp chất đặc trưng có nhiều trong họ Nhân sâm (Araliaceae) và chi Đinh lăng (Polyscias), với tiềm năng nghiên cứu về hoạt tính diệt khối u, bảo vệ gan, tan máu và chống viêm Ngoài ra, saponin còn giúp giảm mức cholesterol trong máu và có thể được sử dụng như chất bổ trợ trong vắc xin Các hợp chất này thường tập trung ở phân đoạn n-butanol, nhờ vào khả năng hòa tan các hợp chất phân cực.
Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập các hợp chất saponin từ phân đoạn n-butanol của cây Đinh lăng răng Để thực hiện điều này, các kỹ thuật sắc ký cột và HPLC đã được sử dụng nhằm chiết xuất các hoạt chất từ dịch chiết ethanol của lá và vỏ thân cây.
Polyscias guilfoylei cv quinquefolia được nghiên cứu với chất nhồi cột là hạt silica gel và RP-C18 Luận văn đã áp dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR, 13C NMR) và phổ khối (ESI-MS) để phân tích, đồng thời so sánh với các dữ liệu đã công bố trước đó Kết quả nghiên cứu đã dẫn đến việc phân lập và xác định cấu trúc bốn hợp chất, bao gồm acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (LB1.1) thuộc nhóm saponin, quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid (LB2) thuộc nhóm flavonoid, và hai hợp chất phenolic là 4,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB1).
2,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB2) Kết quả này được so sánh với các nghiên cứu trước đây về thành phần hoá học của loài Polyscias guilfoylei tại Việt Nam, cụ thể là:
Nghiên cứu của Nguyễn Trần Bảo Huy [10] tập trung vào vỏ cây của loài Polyscias guilfoylei Bail, được thu hái tại Khánh Hòa Mặc dù chưa xác định rõ thứ trồng trọt, nhưng hình ảnh trong báo cáo cho thấy khả năng cao đây là giống Polyscias guilfoylei cv.
59 wild coffea (dạng nguyên thủy), không phải loài Polyscias guilfoylei cv quinquefolia
- Nghiên cứu của Văn Bá Lãnh [11] được thực hiện trên đối tượng là lá của loài
Polyscias guilfoylei cv quinquefolia: phân lập được 3 chất từ lá
Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài thuộc chi Polyscias, đặc biệt là Polyscias guilfoylei, trong đó saponin và một số flavonoid được phân lập từ lá Hợp chất saponin nổi bật là acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (LB1.1), còn gọi là Kalopanax Saponin E hoặc Spinasaponin A, lần đầu tiên được phân lập bởi Shao Chun-Jie và cộng sự vào năm 1989 Đến nay, trên thế giới, rất ít nghiên cứu ghi nhận sự phân lập hợp chất này, trong khi tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Ánh Tuyết vào năm 2009 đã thành công trong việc phân lập hỗn hợp chứa hai saponin với tỉ lệ 2:3 Công bố trước đó của nhóm nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự hiện diện của acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic, là đồng phân của hợp chất LB1.1.
Năm 2020, các nhà nghiên cứu đã phân lập thành công hợp chất acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (LB1.1) từ loài Polyscias guilfoylei, đánh dấu lần đầu tiên hợp chất tinh khiết này được tách ra từ cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.).
Hợp chất flavonoid quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid (LB2) được Ba Yin-ying và cộng sự công bố lần đầu tiên vào năm 2012 Cấu trúc khung của LB2 tương tự như khung kaempferol, nhưng kaempferol có nhiều hơn một nhóm -OH Do đó, cần thận trọng trong quá trình phân tích phổ 1H NMR và 13C NMR để tránh nhầm lẫn giữa hai hợp chất này.
60 tiên hợp chất quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid (LB2) được phân lập tại
Việt Nam đã lần đầu tiên phân lập hai hợp chất phenolic, 4,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB1) và 2,4′-dihydroxydiphenylmethane (VB2), từ loài Polyscias guilfoylei Hai hợp chất này cũng được tìm thấy trong các loài như Coeloglossum viride var bracteatum, Galeola faberi, Gastrodia elata, Xanthium strumarium và Tropidia curculioides, chủ yếu thuộc họ Lan và họ Cúc Chúng còn được gọi là Bisphenol F (BPF) và đã được chứng minh có tác dụng rối loạn hệ nội tiết, mặc dù mức độ ảnh hưởng phụ thuộc vào hàm lượng và khối lượng dược liệu sử dụng Do đó, cần tiến hành các nghiên cứu định lượng để xác định hàm lượng chất trong cây và đánh giá độc tính của nó Kết quả này góp phần làm phong phú thêm tri thức về hóa thực vật của chi Polyscias và loài Polyscias guilfoylei.
Về đánh giá một số hoạt tính sinh học từ cây Đinh lăng răng
4.2.1 Về đánh giá hoạt tính chống oxy hoá
Nhiều bệnh nhiễm trùng do vi sinh vật có thể dẫn đến sản xuất các phân tử phản ứng mạnh từ quá trình chuyển hóa oxy, gây ra nhiều tình trạng bệnh lý như xơ vữa động mạch, rối loạn chức năng tim mạch, bệnh viêm, ung thư và thoái hóa thần kinh Theo Tổ chức Y tế Thế giới, khoảng ba phần tư dân số ở các nước đang phát triển phụ thuộc vào hệ thống y học cổ truyền dựa trên thực vật Các loại thực vật như rau và dược liệu chứa nhiều hợp chất quan trọng như hợp chất nitơ, phenolic, terpenoid, vitamin và các chất chuyển hóa nội sinh khác, có khả năng thu gom gốc tự do và chống oxy hóa Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu khám phá các hợp chất chống oxy hóa mới từ động vật, vi sinh vật và thực vật, nhưng vẫn còn nhiều cây thuốc chưa được khai thác và nghiên cứu trong hệ thực vật của chúng ta.
Nghiên cứu này thử nghiệm hoạt tính chống oxy hoá trên các mẫu như Cao toàn phần, dịch chiết phân đoạn n-hexan, ethylacetat và n-butanol từ lá, cũng như dịch chiết n-butanol từ vỏ thân Các mẫu thử có khả năng trung hòa gốc tự do (Scavenging capacity, SC%) lớn hơn 50% sẽ được xác định giá trị IC50, tức nồng độ cần thiết để trung hòa 50% gốc tự do Kết quả cho thấy dịch chiết n-butanol từ lá (LB) và chất tinh khiết quercetin có hoạt tính chống oxy hoá đáng kể.
3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid (LB2) biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa trên hệ
DPPH có giá trị IC50 lần lượt là 373,92 và 46,15 µg/ml Các dịch chiết phân đoạn từ lá như n-hexan (LH) và ethylacetat (LE), cũng như dịch chiết n-butanol từ vỏ thân (VB) và chất tinh khiết acid 3-O-β-D-glucopyranosyl đều cho thấy tiềm năng chống oxy hóa đáng kể.
LB1.1, một hợp chất (1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic, không cho thấy hoạt tính chống oxy hóa ở nồng độ thử nghiệm So với acid ascorbic, mẫu chứng dương có giá trị IC50 là 13,88 µg/ml, cho thấy dịch chiết phân đoạn n-butanol từ lỏ trung hòa có tiềm năng hoạt tính thấp hơn.
62 gốc tự do DPPH kém hơn 26,94 lần và chất tinh khiết quercetin-3,7-O-α-L- dirhamnopyranosid kém hơn 3,32 lần
Việc ghi nhận hoạt tính chống oxy hoá của dịch chiết phân đoạn n-butanol từ lá cây Đinh lăng răng cho thấy tiềm năng phân lập các hợp chất tinh khiết có hoạt tính này Trong nghiên cứu, hợp chất quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid đã được phân lập và thể hiện khả năng trung hoà gốc tự do DPPH với giá trị IC50 là 46,15 µg/ml Mặc dù chưa có nghiên cứu đánh giá cụ thể về khả năng chống oxy hoá của hợp chất này, nhưng có thể so sánh dựa trên cấu trúc và tác dụng của nó với các hợp chất tương tự đã được nghiên cứu Các hợp chất flavonol như quercetin đã chứng minh khả năng chống oxy hoá nhờ vào sự hiện diện của nhóm 3-hydroxyl, cùng với nhóm hydroxyl tại vị trí 3′ và 4′, làm tăng hiệu quả dọn gốc tự do Do đó, cấu trúc của quercetin-3,7-O-α-L-dirhamnopyranosid hoàn toàn phù hợp với hoạt tính chống oxy hoá đã được ghi nhận trong nghiên cứu.
Luận văn đề xuất nghiên cứu cơ chế chống oxy hóa của hợp chất tinh khiết đã phân lập, dựa trên dữ liệu các chất cùng nhóm đã được nghiên cứu Các cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa bao gồm: (1) ức chế sự hình thành ROS thông qua việc ức chế enzym hoặc chelat hóa các nguyên tố vi lượng liên quan đến quá trình tạo gốc tự do; (2) ROS thu gom gốc tự do; và (3) điều chỉnh hoặc bảo vệ khả năng chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa của flavonoid liên quan đến hầu hết các cơ chế này, với một số tác động qua trung gian là sự hiệp đồng giữa hoạt động dọn gốc tự do và tương tác với chức năng enzym Flavonoid cũng ức chế các enzym như monooxygenase ở microsome, glutathione S-transferase, succinoxidase của ty thể và NADH oxidase.
4.2.2 Về đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
Luận văn này đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu dịch chiết từ lá và vỏ thân, bao gồm dịch chiết n-hexan (LH), ethylacetat (LE), n-butanol (LB, VB) và các chất tinh khiết LB 1.1, LB 2 Nghiên cứu được thực hiện trên ba dòng tế bào: Hep-G2 (ung thư gan), A549 (ung thư phổi) và Vero (tế bào biểu mô thận khỉ), những dòng tế bào phổ biến trong nghiên cứu hoạt tính độc tế bào của hợp chất tự nhiên Kết quả cho thấy hoạt tính gây độc tế bào tại nồng độ thử nghiệm 40.
g/ml, các mẫu không biểu hiện hoạt tính ức chế hai dòng tế bào ung thư (Hep-G2 và A549) và dòng tế bào Vero
Nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn và chất tinh khiết từ Polyscias guilfoylei và chi Polyscias đã cho thấy nhiều kết quả đáng chú ý.
Các hợp chất được chiết xuất từ Polyscias amplifolia bao gồm 3-O-β-D-galactopyranosyloleanolic acid, 3-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranosyloleanolic acid, 3-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranosyloleanolic acid và 3-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-α-L-arabinopyranosyloleanolic acid Những hợp chất này thể hiện hoạt tính yếu đối với dòng tế bào ung thư buồng trứng A2780, với giá trị IC50 dao động từ 6,7 đến 10,8 microg/mL.
- Năm 2008, tác giả Giuseppina Cioffi đánh giá tác dụng chống tế bào ung thư ở người: J774.A1, HEK-293, và WEHI-164 Kết quả cho thấy hợp chất 3–β–
28–[O–β–D–glucopyranosyl–(1→6)–O–β–D–glucopyranosyl] ester phân lập từ Polyscias guilfoylei ức chế cả ba dòng tế bào ung thư trên với IC50 = 0.19 ±
0.001 μM đối với J774 A.1, 0.35 ± 0.003 đối với HEK-293, và 0.64± 0.045 đối với WEHI-164 [38]
Vào năm 2018, Ashmawy và các cộng sự đã công bố nghiên cứu về tinh dầu lá Polyscias guilfoylei, cho thấy hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào Caco-2 (tế bào ung thư biểu mô trực tràng) với giá trị IC50 đạt 70,62 μg/mL.
Năm 2019, Rajani và các cộng sự đã công bố nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào của tinh dầu lá Polyscias guilfoylei, cho thấy hiệu quả của nó trên cả mô hình in vivo và in vitro đối với tế bào ung thư hạch bạch huyết.
So sánh kết quả của luận văn với các nghiên cứu trên, nhận thấy:
Nghiên cứu này nhằm sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn và chất phân lập từ loài Polyscias guilfoylei trên các dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan) và A549 (ung thư phổi) Kết quả cho thấy không ghi nhận hoạt tính ức chế đối với hai dòng tế bào ung thư này cũng như dòng tế bào Vero ở nồng độ 40 µg/ml Điều này cho thấy rằng chi Polyscias, đặc biệt là loài Polyscias guilfoylei, không có hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư gan và ung thư phổi trong điều kiện thử nghiệm hiện tại.
Các nghiên cứu trước đây đã ghi nhận hoạt tính gây độc tế bào trên các chất tinh khiết được phân lập, nhưng rất ít nghiên cứu đề cập đến tác dụng gây độc của cao chiết phân đoạn Trong luận văn này, các cao chiết phân đoạn không cho thấy hoạt tính ở nồng độ 40 g/ml, điều này có thể do nồng độ các chất tinh khiết trong cao chiết thấp, dẫn đến việc chưa thể hiện được hoạt tính.
Nghiên cứu của Ashmawy và cộng sự (2018) cùng với Rajani và cộng sự (2019) đã chỉ ra rằng tinh dầu lá có khả năng gây độc tế bào trên ung thư biểu mô trực tràng và tế bào ung thư hạch bạch huyết Các tinh dầu này được tách chiết bằng phương pháp sắc ký khí – phổ khối (GC/MS) Trong khi đó, phương pháp chiết xuất bằng ethanol và phân lập bằng sắc ký cột trong luận văn không thành công trong việc tách các hợp chất tinh dầu, do đó không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào.
- Đối với hai hợp chất tinh khiết phân lập được là acid 3-O- β -D-glucopyranosyl-
(1→3)- β -D-glucuronopyranosyloleanolic (LB1.1) và quercetin-3,7-O-α-L- dirhamnopyranoside (LB2), hiện nay cũng chưa ghi nhận các nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào của hai hợp chất này
4.2.3 Về đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Trong những năm gần đây, sự gia tăng vi sinh vật kháng kháng sinh đã tạo ra thách thức lớn trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn Thế kỷ XIX chứng kiến sự suy giảm đáng kể trong nghiên cứu và phát triển thuốc kháng vi sinh vật mới do chi phí cao Đồng thời, thực vật tự tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn như cơ chế bảo vệ chống lại vi sinh vật Tình trạng kháng kháng sinh và thiếu hụt thuốc mới nhấn mạnh tầm quan trọng của nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ dược liệu tự nhiên.
