Phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong lá cây sum liên ( adinandra lienii hien yakovlev)

TỔNG QUAN

Tổng quan về họ Pentaphylacaceae

Họ Pentaphylacaceae, hay còn gọi là họ Ngũ liệt hoặc Ngũ mạc, là một họ thực vật có hoa thuộc bộ Ericales (bộ Đỗ quyên) Số lượng chi và loài trong họ này vẫn chưa thống nhất trong các hệ thống phân loại hiện nay Một số phân loại trước đây chỉ công nhận một chi duy nhất là Pentaphylax, với loài duy nhất là Pentaphylax euryoides Theo hệ thống phân loại APG IV, họ Pentaphylacaceae được xác định rõ hơn.

Pentaphylacaceae bao gồm ba tông với 12 chi và khoảng 400 loài, bao gồm [46]:

Tông Pentaphylaceae: bao gồm một chi Pentaphylax với loài duy nhất Pentaphylax euryoides phân bố ở phía nam Trung Quốc, Sumatra và phía bắc Việt

Tông Ternstroemieae: bao gồm hai chi (Ternstroemia, Anneslea) với khoảng

103 loài Phân bố ở vùng nhiệt đới, đặc biệt là Đông Nam Á, Trung và Nam Mỹ

Tông Frezierieae bao gồm 9 chi như Adinandra, Balthasaria, Cleyera, Euryodendron, Eurya, Freziera, Taonabo, Symplococarpon và Visnea, với tổng cộng hơn 200 loài, trong đó Adinandra có 80 loài, Eurya 75 loài và Freziera 63 loài Phân bố của tông này trải dài từ Đông Nam Á, Malesia, Hawaii, Trung Mỹ, Nam Mỹ, Đông Phi (Balthasaria), Tây Phi (Adinandra) đến đảo Canary (Visnea) Đặc điểm thực vật của họ Pentaphylacaceae là cây bụi hoặc cây gỗ, thường xanh, hiếm khi rụng lá, với hoa lưỡng tính, và lá đơn mọc so le, gân lá hình lông chim Hoa thường xuất hiện ở nách lá hoặc ngọn cành, có thể đơn độc hoặc tập trung thành cụm xim hay chùm, với đài hoa 5 và tràng hoa có màu trắng, đỏ hoặc vàng Số lượng nhị hoa rất đa dạng, thường xếp thành 1-6 vòng, trong khi bầu hoa có 3-5 lá noãn, tạo thành bầu 3-5 ô với đính noãn trung trụ.

100 hoặc nhiều hơn) noãn trên mỗi vị trí đính noãn Quả nang thường có hình trứng Hạt hình cầu, hình bán nguyệt, hình trứng, có thể có cánh [19]

Tổng quan về chi Adinandra Jack

Chi Adinandra Jack (chi Sum hay Dương đồng) thuộc họ Pentaphylacaceae, bộ Đỗ quyên (Ericales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Vị trí phân loại của chi Adinandra Jack được thể hiện như sau [46]:

Chi Dương đồng: Adinandra Jack

1.2.2 Về đặc điểm thực vật và phân bố

Chi Adinandra bao gồm các loài cây gỗ nhỏ đến lớn, đôi khi là cây bụi, thường xanh và có nhánh non với lông nhung Lá đơn, mọc so le, có mép nguyên hoặc xẻ răng cưa, mặt lá có thể có lông Hoa lưỡng tính, mọc đơn độc hoặc thành cặp ở nách lá, có cấu trúc mẫu 5 với 2 lá bắc đính ở đỉnh cuống hoa Đài hoa dày, có 5 lá và thường có lông, trong khi cánh hoa hình thoi, có thể nhẵn hoặc có lông Bộ nhị gồm 15-60 nhị, có thể rời hoặc dính một phần, với bao phấn hình thuôn có lông Bộ nhụy gồm 5 lá noãn tạo thành bầu trên, bầu có 2-5 ô, mỗi ô chứa từ 20-100 noãn Quả mọng, nhiều hạt, hạt nhỏ màu nâu, bóng hoặc có chấm lõm.

Các loài thuộc chi Adinandra phân bố tại nhiều nơi trên thế giới như

Chi Adinandra được phân bố rộng rãi tại nhiều quốc gia như Bangladesh, Campuchia, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, phía nam Nhật Bản, Lào, Malaysia, Myanmar, đảo New Guinea, Sri Lanka, Thái Lan và các rừng nhiệt đới châu Phi Tại Việt Nam, có 12 loài thuộc chi này được tìm thấy, phân bố chủ yếu ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Quảng Trị, Kon Tum và Lâm Đồng.

Gia Lai (Bảng 1.1) [2], [4] Trong đó loài Sum Hòn Giao (Adinandra hongiaoensis

H T Son & L V Dung) mới được phát hiện ở Hòn Giao-Lâm Đồng được công bố lần đầu năm 2014, loài Sum liên Adinandra lienii công bố lần đầu năm 1986 [12],

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Adinandra Jack phân bố tại Việt Nam

TT Tên loài Tên thường gọi

1 Adinandra annamensis Gagnep ex Kobuski Sum đỏ

2 Adinandra caudata Gagnep ex Kobuski Sum đuôi

3 Adinandra donnaiensis Gagnep ex Kobuski Sum đồng nai

4 Adinandra glischroloma Hand.-Mazz Sum lông

5 Adinandra hainanensis Hayata Sum Hải Nam

6 Adinandra integerrima T.Anderson ex Dyer Sum nguyên

7 Adinandra microcarpa Gagnep Sum trái nhỏ

8 Adinandra milletii (Hook & Arn.) Benth &

Hook.f ex Hance Sum millett

9 Adinandra petelotii Gagnep Sum petelot

10 Adinandra poilanei Gagnep Sum poilan

11 Adinandra lienii Hien & Yakovlev Sum liên

12 Adinandra hongiaoensis H T Son & L V Dung Sum Hòn Giao

1.2.3 Tình hình nghiên cứu chi Adinandra Jack

Nghiên cứu về các loài thuộc chi Adinandra vẫn còn hạn chế, đặc biệt là ở Trung Quốc, nơi mà các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào một số loài cụ thể trong chi này.

Adinandra nitida, phân bố tại phía nam Trung Quốc, được biết đến với lá cây sử dụng làm trà Shiyacha, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như kháng khuẩn, giảm đau, hạ huyết áp và chống oxy hóa Loài cây này có thể được dùng như thực phẩm hoặc thuốc Tại Việt Nam, hiện nay chỉ có các nghiên cứu công bố liên quan đến loài A hainanensis.

Dưới đây là các tổng kết các kết quả nghiên cứu đáng chú ý về thành phần hóa học và tác dụng sinh học một số loài thuộc chi Adinandra

1.2.3.1.Các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học

Loài A nitida là đại diện nổi bật trong chi và đã thu hút sự chú ý đáng kể từ các nghiên cứu hóa học Các nghiên cứu này đã chiết xuất nhiều hợp chất quan trọng, chủ yếu thuộc hai nhóm flavonoid và triterpen.

Năm 2003, Wang và cộng sự đã công bố việc phân lập 6 hợp chất thuộc hai nhóm flavonoid và triterpen, bao gồm apigenin, camellianin A, quercitrin, kajiichigosid F1, nigaichigosid F2, và pedunclosid.

Hình 1.1 Các hợp phân lập từ A nitida theo Wang (2003)

Năm 2005, Jie Zhang cùng các cộng sự đã tiếp tục phân tích các thành phần trong dịch chiết của lá A nitida, đã xác định được 6 flavonoid là epicatechin,

Rhoifolin, apigenin, quercitrin, camellianin A, and camellianin B are key components found in Shiyacha tea The presence of epicatechin, rhoifolin, and apigenin can serve as a basis for quality control and testing of Shiyacha tea and related products.

Hình 1.2 Các hợp chất flavonoid từ A nitida theo Jie Zhang (2005)

Năm 2008, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 6 hợp chất triterpen từ loài A nitida, bao gồm arjunetin, sericosid, nigaichigosid F1, glucosyl tormentat, arjunglucosid I và [2𝛼, 3𝛼, 19𝛼-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid-28-O-β-D-glucopyranosid] Đặc biệt, hợp chất thứ 12 là hợp chất đầu tiên được phân lập từ tự nhiên.

Hình 1.3 Các hợp chất phân lập từ A nitida theo Wang (2008)

Năm 2018, Lu phân lập được naringenin, luteolin, 3'-methoxy luteolin, protocatechin, p-metoxyphenol, 3,3',4,4'-tetrahydroxybiphenyl, scopoletin và acid palmitic (Hình 1.4) bên cạnh một số chất khác đã được phân lập trước đó [37]

Hình 1.4 Một số hợp chất được phân lập bởi Lu (2018) từ loài A nitida

Năm 2019, Yuan và cộng sự đã phân lập thành công 4 hợp chất triterpenoid saponin và 1 flavonoid từ lá cây A nitida, trong đó nổi bật là hợp chất mới 2α,3α-dihydroxyursolic acid 28-O-β-d-glucopyranosyl este.

Nghiên cứu về loài A hainanensis đã phân lập thành công nhiều hợp chất triterpen, bao gồm lupeol, betulinal, acid acetylursolic, acid oleanolic và acid betulinic Ngoài ra, các tác giả cũng đã phát hiện thêm hai hợp chất từ lá của loài này là uvaol và acid ursolic.

Hình 1.5 Các hợp chất phân lập từ loài A hainanensis

1.2.3.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học chủ yếu tập trung vào loài A nitida, cho thấy loài này có nhiều hoạt tính phong phú như chống oxy hóa, hạ huyết áp và ức chế tế bào ung thư Mặc dù các nghiên cứu về các loài Adinandra khác không nhiều, nhưng một số thử nghiệm đã ghi nhận kết quả đáng chú ý trong việc chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư và ức chế α-glucosidase.

• Hoạt tính chống oxy hóa:

Yuan và cộng sự (2009) đã chiết xuất và định lượng camellianin A từ lá cây A nitida, đồng thời đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của flavonoid thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH và anion superoxid, cũng như xác định tổng khả năng khử Kết quả cho thấy flavonoid trong A nitida có tiềm năng chống oxy hóa đáng kể.

Camellianin A chiếm 59,3% trong các flavonoid của A nitida, cho thấy khả năng thu dọn gốc tự do đáng kể trong thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH và anion superoxid Nghiên cứu của Zhan Yu (2010) đã chỉ ra rằng khả năng bắt gốc tự do DPPH của flavonoid từ lá A nitida vượt trội hơn hẳn so với BHT trong cùng điều kiện thử nghiệm.

Năm 2010, Liu và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và ức chế men chuyển angiotensin của dịch chiết EtOH cùng với các hợp chất camellianin A, camellianin B và apigenin Kết quả cho thấy, giá trị IC50 của dịch chiết EtOH là 14,74 μg/ml, trong khi camellianin A, camellianin B và apigenin lần lượt là 1,62 mg/ml, 1,8 mg/ml và 0,95 mg/ml Các hợp chất flavonoid này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa kém hơn nhiều so với dịch chiết EtOH, với hiệu quả thấp hơn khoảng 100 lần trong thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH và Rancimat Điều này chỉ ra rằng tác dụng chống oxy hóa của lá cây A nitida có thể phụ thuộc vào các thành phần hóa học khác ngoài các flavonoid đã được đề cập.

Năm 2017, Chen và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các hợp chất từ lá cây A nitida (trà Shiyacha) trong quá trình tiêu hóa mô phỏng Nghiên cứu này tập trung vào sự thay đổi hoạt tính kháng oxy hóa của A nitida, được xác định dựa trên khả năng thu nhận các gốc tự do.

Tổng quan về loài Adinandra lienii Hien & Yakovlev

Loài Sum liên - Adinandra lienii Hien & Yakovlev, được công bố lần đầu vào năm 1986 và chính thức công nhận vào năm 2012, đã có sự đóng góp quan trọng từ hai nhà nghiên cứu Việt Nam, Nguyễn Hữu Hiến và Nguyễn Văn Liên.

Theo các công bố tới thời điểm hiện tại Việt Nam cũng là nơi duy nhất có sự phân bố của loài này [48]

Adinandra lienii là cây gỗ thường xanh, cao từ 8-10 m, với thân màu nâu và có lông bao phủ Lá đơn mọc cách, cuống dài 0,5-0,7 cm, phiến lá hình thuôn dài, kích thước khoảng 25-30 cm chiều dài và 8-12 cm chiều rộng Mặt trên lá nhẵn, trong khi mặt dưới có lông; gân lá hình lông chim với 20-25 cặp gân bên rõ ràng Hoa của cây mọc ở nách lá, cuống dài 1-2 cm, nụ hoa hình cầu có đường kính khoảng 1,5 cm, thường nở vào mùa hè từ tháng 5 đến tháng 8 hàng năm.

Do có vùng phân bố hẹp nên các kết quả nghiên cứu được thực hiện trên loài

Adinandra lienii là một loài cây quý hiếm, bị hạn chế cả ở Việt Nam và trên thế giới Mặc dù đã có một số nghiên cứu công bố về hoạt tính sinh học của các phân đoạn dịch chiết, như hoạt tính kháng khuẩn và ức chế aldose reductase, nhưng các nghiên cứu trước đây chủ yếu chỉ dừng lại ở việc định tính nhóm chất mà chưa đi sâu vào thử nghiệm hoạt tính cụ thể của từng phân đoạn.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là lá cây Sum liên, được thu tại Lào Cai năm 2018, được giám định tên khoa học là Adinandra lienii Hien & Yakovlev, họ Ngũ liệt

(Pentaphylacaceae) Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Bảo tàng thực vật (HNU), Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Số hiệu tiêu bản HNU024655, HNU024656)

Hình 2.1 Adinandra lienii Hien & Yakovlev

Phương tiện nghiên cứu

• Trang thiết bị, hóa chất chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc

- Dung môi, hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập gồm: n-hexan, ethyl acetat, ethanol, methanol, dichloro methan đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

- Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (silica gel, 240-430 mesh, Merck, Đức), Sephadex LH-20, silica gel pha đảo (RP18 YMC), Diaion HP20

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) như 1H NMR, 13C-NMR và DEPT được thực hiện trên máy Bruker AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ khối lượng (ESI-MS) được phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS Agilent 1260, áp dụng phương pháp phun mù điện tử tại Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

• Trang thiết bị, hóa chất thử hoạt tính sinh học:

- Đĩa 96 giếng (SPL Life Sciences, Hàn Quốc)

- Ống ly tâm 1.5 ml, 2 ml, máy ly tâm (Universal 320R)

- Đĩa nuôi cấy đã xử lý bề mặt

- Buồng đếm tế bào (Fisher Hoa Kỳ)

- Máy đọc ELISA (ELISA Bio-Rad machine, Mỹ)

- Nồi hấp khử trùng, tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II, tủ lạnh sâu -25 o C, -80 o C

- Kính hiển vi (Zeizz), máy quang phổ (Genios, Tecan), bình nito lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

- Thiết bị: máy quang phổ BIOTEK – USA

- Hóa chất: enzym -glucosidase (CAS No 9001-42-7, Sigma), p-Nitrophenyl-- D-glucopyranosid (CAS No 3767-28-0, Sigma), 4-Nitrophenol (CAS No 100-02-

7, Sigma), Dimethyl sulfoxid (CAS No 67-68-5, Sigma).

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu

Mẫu nghiên cứu được xử lý bằng cách làm khô và xay nhỏ trước khi tiến hành chiết xuất Quy trình ngâm chiết được thực hiện 4 lần với dung môi methanol ở nhiệt độ thường, mỗi lần kéo dài 24 giờ Sau đó, dịch chiết từ 4 lần ngâm được gộp lại và tiến hành cất để loại bỏ dung môi.

Dưới áp suất giảm, dung môi được loại bỏ, và cặn dịch chiết được phân bố với nước Tiếp theo, các phân đoạn được chiết lần lượt bằng n-hexan và ethyl acetat Các dịch chiết của các phân đoạn này được tập trung và cất để loại bỏ dung môi, thu được cặn tương ứng Cuối cùng, phân đoạn nước sẽ được xử lý qua cột Diaion với hệ dung môi MeOH/H2O.

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất sử dụng trong nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Phân tích và tách các dịch chiết từ cây được thực hiện thông qua nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột Các chất hấp phụ được sử dụng trong quá trình này có thể là silica gel, sephadex LH-20, silica gel pha đảo (RP18 YMC) và Diaion HP20, kết hợp với các hệ dung môi phù hợp để đạt hiệu quả tối ưu trong việc tách biệt các thành phần.

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn (Merck 60 F254,

Merck 60 F254S), dung môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số hệ dung môi như n-hexan/EtOAc, CH2Cl2/EtOAc, H2O-MeOH, quan sát với ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 và 365 nm, hoặc bằng thuốc thử H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi hiện màu

Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230 -

400 mesh) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như n- hexan/EtOAc, CH2Cl2/EtOAc với tỉ lệ thích hợp

Sắc ký Sephadex LH-20, silica gel pha đảo (RP18 YMC) được rửa giải bằng dung môi MeOH, hỗn hợp MeOH/CH2Cl2, hỗn hợp H2O-MeOH,…

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập

Cấu trúc của các hợp chất được xác định thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm phổ khối (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H).

13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC)

2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.3.4.1.Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid) là một kỹ thuật so màu, dựa trên việc đo độ giảm màu vàng của MTT Trong quá trình này, MTT tham gia vào phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào, dẫn đến sự hình thành các tinh thể formazan.

Có thể sử dụng dung môi hữu cơ như isopropanol để phá hủy màng tế bào và hòa tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học của dung dịch ở bước sóng 570nm.

Hình 2.3 Phản ứng oxi hóa khử trong phương pháp MTT

• Chuẩn bị các dòng tế bào:

Tế bào ung thư được nuôi cấy in vitro bằng phương pháp Mosmann, sử dụng dòng tế bào ở 37 độ C trong môi trường RPMI 1640 hoặc DMEM Môi trường nuôi cấy có bổ sung 10% huyết thanh nhau phôi bò (FBS), cùng với 100U/ml penicillin và 100mcg/ml streptomycin, được duy trì trong tủ nuôi cấy CO2 5% trong thời gian 48 giờ.

Tế bào được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường RPMI 1640 hoặc DMEM ở

Nghiên cứu được thực hiện ở nhiệt độ 37 độ C, với môi trường 5% CO2, bổ sung 10% FBS, penicillin (100 đơn vị/mL) và streptomycin sulphate (100 µg/mL) Tế bào được nuôi cấy trong giếng phiến 96 với thể tích 200 µL, mật độ 2-5 x 10^5 tế bào/giếng tùy thuộc vào loại tế bào Sau 24 giờ, tế bào được xử lý với hợp chất pha sẵn ở các nồng độ khác nhau trong DMSO Sau 72 giờ, phản ứng được thực hiện với 0.5 mg/mL MTT, ủ trong 4 giờ ở 37 độ C và 5% CO2 Cuối cùng, môi trường trên bề mặt được loại bỏ, và kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol, sau đó độ hấp thụ được đo ở 570 nm.

Ellipticin được sử dụng làm đối chứng dương

Tính giá trị CS % (% Cell Survival)

Giá trị CS phản ánh khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử Những mẫu có giá trị CS ≤ 50% được xem là có hoạt tính.

Giá trị CS(%) được tính theo công thức:

𝐶𝑆% = [OD (mẫu thử) – OD (ngày 0)

OD (DMSO) – OD (ngày 0) × 100] ± 𝜎 Trong đó: OD: mật độ quang; σ: độ lệch tiêu chuẩn

2.3.4.2.Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa

• Nguyên lí của phép thử:

Thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxi hóa dựa trên hoạt tính bắt gốc tự do DPPH:

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một chất tạo ra gốc tự do, thường được sử dụng để sàng lọc khả năng chống oxy hóa của các hợp chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua sự giảm màu sắc của DPPH, và được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 517 nm.

• Cách tiến hành và tính toán kết quả

Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong methanol (MeOH) Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng

22 độ Để thời gian phản ứng 30 phút ở 37 0 C, đọc mật độ hấp phụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Biotek ở bước sóng 517 nm

% bẫy gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:

SC% = [(OD trắng – OD mẫu thử)/ODtrắng]x100(%)

EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3

2.3.4.3.Phương pháp thử hoạt tính ức chế α-glucosidase

• Nguyên lí của phép thử

Dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-Nitrophenyl--D-glucopyranosid nhờ tác động của enzyme  - glucosidase, qua đó giải phóng sản phẩm là p-Nitrophenol có màu vàng

Phản ứng giữa α-glucosidase và α-D-Glucose tạo ra sản phẩm p-Nitrophenol, với độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo tại bước sóng 410 nm sau 30 phút Lượng p-Nitrophenol sinh ra là chỉ số phản ánh hoạt độ của enzyme α-glucosidase.

Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase được thực hiện trên đĩa 96 giếng, trong đó mẫu thử được pha loãng bằng DMSO và nước deion thành nhiều nồng độ khác nhau Các nồng độ trong phản ứng được sử dụng là 128, 32, 8 và 2 µg/ml, với acarbose được dùng làm chất tham khảo.

Các thành phần phản ứng bao gồm phosphate buffer 100 mM pH 6,8, -glucosidase 0,2 U/ml, mẫu thử và p-nitrophenyl -D-glucopyranosid 2,5 mM Đối với mẫu đối chứng, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ 37 o C và sau 30 phút, phản ứng được dừng lại bằng Na2CO3 Độ hấp thụ của phản ứng được đo trên máy BIOTEK tại bước sóng 410 nm (A).

Khả năng ức chế enzyme - glucosidase của mẫu thử được xác định bằng công thức Độ ức chế (%) = [A(đối chứng) – A(mẫu thử)]/A(đối chứng) x 100%

IC50 (half maximal inhibitory concentration) là nồng độ chất thử ức chế 50% hoạt động của enzyme -glucosidase, được tính bằng phần mềm Tablecurve.

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ

Chiết xuất, phân lập các hợp chất

3.1.1 Xử lý mẫu và chiết xuất

Lá cây Sum liên (A lienii) được phơi khô và xay nhỏ (2,5 kg), sau đó ngâm chiết với MeOH ở nhiệt độ phòng trong 4 lần, mỗi lần 10 lít trong 24 giờ Dịch chiết được cất dưới áp suất giảm để thu cặn MeOH, sau đó hòa với 1 lít nước cất và chiết phân bố lần lượt bằng n-hexan và ethyl acetat Qua quá trình cất, thu được cặn n-hexan (78 g) và ethyl acetat (114 g) Phần dịch nước còn lại được khai triển qua cột Diaion với hệ dung môi MeOH/H2O theo tỉ lệ 0-100%, cho ra 2 phân đoạn A (50% + 70%) và B (100%).

3.1.2 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat

Cặn ethyl acetat (114 g) được đưa lên cột silica gel pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexan/EtOAc (0-100% EtOAc) để thu được 12 phân đoạn (E1-E12)

Phân đoạn E8 (8,9 g) được tách trên cột silica gel với dung môi CH2Cl2/EtOAc (9:1), tạo ra 10 phân đoạn từ E8.1 đến E8.10 Trong đó, phân đoạn E8.5 (166 mg) được tinh chế qua sắc ký silica gel với dung môi n-hexan/EtOAc (3:1), thu được hợp chất AL6 (5,4 mg) Phân đoạn E8.10 (4,5 g) tiếp tục được tách trên cột silica gel, rửa giải bằng dung môi CH2Cl2/MeOH (9:1), cho ra 10 phân đoạn từ E8.10.1 đến E8.10.10, trong đó phân đoạn E8.10.7 (126 mg) được tách với dung môi n-hexan/aceton (8:2), thu được chất AL1 (8,3 mg) Phân đoạn E9 (6,4 g) cũng được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng dung môi CH2Cl2/MeOH (9:1), tạo ra 5 phân đoạn từ E9.1 đến E9.5, trong đó phân đoạn E9.4 (780 mg) được tách qua cột silica gel pha đảo với dung môi MeOH/H2O (1:3), thu được chất AL2 (36 mg).

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat

3.1.3 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn nước

Phân đoạn A 40g tiến hành khai triểnqua cột silica gel với hệ dung môi EtOAc/Aceton (tỉ lệ 0-100% aceton) thu được 7 phân đoạn ký hiệu từ F1-7

Phân đoạn F1 (3,4 g) được tinh chế qua cột sephadex bằng dung môi MeOH, tạo ra ba phân đoạn F1.1 đến F1.3 Tiếp theo, phân đoạn nhỏ F1.1 (112 mg) được tinh chế qua cột silica gel với dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH (tỉ lệ 0-10% MeOH), thu được chất AL3 (8,1 mg).

Phân đoạn F2 (2,6 g) đã được tinh chế qua cột sephadex bằng dung môi MeOH, tạo ra 4 phân đoạn F2.1 đến F2.4 Trong đó, phân đoạn F2.2 (148 mg) tiếp tục được tinh chế qua cột silicagel với dung môi Aceton/H2O (tỉ lệ 0-20% aceton), cho ra 3 phân đoạn F2.2.1 đến F2.2.3 Cuối cùng, phân đoạn F2.2.3 (65 mg) được tinh chế qua cột silicagel với dung môi CH2Cl2/MeOH (tỉ lệ 0-20% MeOH) và thu được chất AL4.

(7,3 mg) Phân đoạn F2.3 (158 mg) được tinh chế qua cột silicagel pha đảo với hệ dung môi MeOH/H2O (tỉ lệ 0-50% MeOH) thu được 2 phân đoạn ký hiệu F2.3.1 và

F2.3.2 Phân đoạn F2.3.2 (46 mg) tiếp tục tinh chế qua cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (tỉ lệ 0-20% MeOH) thu được chất AL5 (16 mg)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn nước

Xác định cấu trúc hợp chất phân lập

3.2.1 Xác định cấu trúc hợp chất AL1

Hình 3.3 Cấu trúc hợp chất AL1

Hợp chất AL1 thu được là chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z [M+H] + 291 gợi ý AL1 có công thức phân tử C15H14O6 (M)1)

Phổ 1 H NMR của AL1 cho các tín hiệu đặc trưng của hợp chất flavanol với tín hiệu hai 2 proton vòng thơm ở vị trí meta tại δH 5,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,95 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 3 proton thuộc hệ ABX tại δH 7,00 (1H, d, J = 1,5 Hz, H- 2′), 6,82 (1H, dd, J = 1,5; 6,5 Hz, H-6′), 6,79 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-5′) và các tín hiệu thuộc vòng pyran tại δH 4,83 (1H, br s, H-2), 4,19 (1H, m, H-3), 2,88 (1H, dd, J 14,0; 4,0 Hz, H-4a), 2,75 (1H, dd, J = 14,0; 2,5 Hz, H-4b)

Phổ 13 C-NMR cho 15 tín hiệu carbon bao gồm 12 tín hiệu vòng thơm δC 95,9- 158,0 ppm trong đó có các tín hiệu carbon gắn với oxy tại δC 158,0 (C-9), 157,7 (C-

7), 157,4 (C-5), 145,9 (C-4′), 145,8 (C-3′), 3 tín hiệu vòng pyran tại δC 79,9 (C-2), 67,5 (C-3) và 29,3 (C-4)

Tín hiệu proton H-2 xuất hiện dưới dạng singlet rộng, cho thấy hai proton H-2 và H-3 nằm cùng một phía Dựa trên dữ liệu phổ NMR, MS và góc quay cực [α] 20 D -70˚ (c 0,20; MeOH), và so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất AL1 được xác định là (-)-epicatechin.

Hình 3.4 Phổ 1 H NMR của hợp chất AL1

Hình 3.5 Phổ 13 C-NMR của hợp chất AL1

Bảng 3.1 Số liệu phổ của hợp chất AL1

(*) CD3OD (**) aceton-d6 (*) CD3OD (**) aceton-d6

(*) Số liệu phổ hợp chất 1, (**) Số liệu phổ tài liệu tham khảo [10]

Hợp chất AL2 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z [M+H] + 275 gợi ý AL2 có công thức phân tử C15H14O5

Phổ 1 H NMR của AL2 cũng cho các tín hiệu của hợp chất flavanol với tín hiệu

2 proton vòng thơm ở vị trí meta tại δH 5,97 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8), 5,94 (1H, d, J

= 2,0 Hz, H-6), 4 proton của hệ A2B2 tại δH 7,33 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,81 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′) và các tín hiệu thuộc vòng pyran tại δH 4,89 (1H, br s, H-2), 4,20 (1H, m, H-3), 2,89 (1H, dd, J = 17,0; 5,0 Hz, H-4a) và 2,76 (1H, dd, J 17,0; 3,0 Hz, H-4b)

Phổ 13 C-NMR của AL2 cho 15 tín hiệu carbon bao gồm 12 tín hiệu vòng thơm và 3 tín hiệu vòng pyran tại δC 79,9 (C-2), 67,4 (C-3) và 29,3 (C-4)

Hợp chất AL2 được xác định là (-)-epiafzelechin dựa trên tín hiệu proton H-2 xuất hiện dưới dạng singlet rộng, cho thấy hai proton H-2 và H-3 ở cùng một phía So sánh số liệu phổ và góc quay cực [α] 20 D -40,5˚ (c 0,11; MeOH) với tài liệu tham khảo [7] đã củng cố nhận định này.

(*) Số liệu phổ hợp chất 1, (**) Số liệu phổ (-)-epifzelechin tài liệu tham khảo

Hợp chất AL3: Thymoquinol 2-O-β-D- glucopyranosid

Hợp chất AL3 thu được dưới dạng chất rắn Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z [M+H] + 329 gợi ý AL3 có công thức phân tử C16H24O7 (M28)

Phổ 1 H-NMR của hợp chất cũng cho thấy tín hiệu của hợp chất glycosid Phần aglycon có 2 tín hiệu proton vòng thơm tại 6.94 (1H, s, H-3) và 6.64 (1H, s, H-6), 3 nhóm methyl gồm 1 singlet tại 2.15 (3H, s, H-7) và 2 doublet tại 1.19 (3H, d, J = 7.0

Tín hiệu của phân tử đường glucose được xác định với proton anomer tại δH 4,72 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1′) và bốn nhóm oxymethin trong khoảng δH 3,33-3,48 (4H, m) Ngoài ra, tín hiệu của nhóm oxymethylen xuất hiện tại δH 3,90 (1H, dd, J=0; 2,0 Hz, H-6′a) và 3,71 (1H, dd, J=0; 5,5 Hz, H-6′b) Hằng số coupling J= 7,5 Hz cho thấy liên kết trong phân tử glucose là liên kết β.

Phổ 13 C-NMR cho 16 tín hiệu carbon gồm 10 tín hiệu carbon của phần aglycon ttrong đó có 6 carbon vòng thơm tại δC 151,8 (C-5), 149,2 (C-2), 138,2 (C-1), 123,2 (C-4), 120,3 (C-3), 3 nhóm methyl tại 23,7 (C-9), 23,5 (C-10), 16,0 (C-7) và 1 nhóm methin tại δC, 27,0 (C-8) Các tín hiệu carbon của phân tử đường gồm tín hiệu carbon anomer tại δC 104,3 (C-1′) cùng với 5 tín hiệu khác δC 78,3 (C-3′), 78,0 (C-5′), 75,2 (C-2′), 71,6 (C-4′), 62, 7(C-6′) Các tín hiệu carbon của đường cũng gợi ý cho phân tử đường glucose

Dựa trên phân tích dữ liệu phổ khối và phổ NMR, công thức của hợp chất monoterpen glycosid chứa vòng thơm đã được gợi ý So sánh với tài liệu đã công bố cho thấy hợp chất AL3 là thymoquinol 2-O-β-glucopyranosid.

(*) Số liệu phổ hợp chất AL3, (**) Số liệu tài liệu tham khảo [14]

Hợp chất AL4: (-)-epiafzelechin 7-O-β-D-glucopyranosid

Hợp chất AL4 thu được dưới dạng chất rắn, phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z [M+H] + 437 gợi ý AL4 có công thức phân tử C21H24O10 (MC7)

Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất AL4 có phần tương tự với phổ của hợp chất AL2 Với phổ 1 H-NMR hợp chất AL4 cũng xuất hiện các tín hiệu proton thơm tương tự hợp chất AL2, trong đó hai tín hiệu proton vòng thơm ở vị trí meta tại δH 6,31 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,10 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 4 proton của hệ A2B2 tại δH 7,33 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-2′, H-6′), 6,81 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-3′, H-5′), các tín hiệu proton nhóm oxymethin tại δH 4,90 (1H, br s, H-2), 4,20 (1H, m, H-3), proton nhóm methylen δH 2,97 (1H, dd, J = 17,0; 3,0 Hz, H-4a) và 2,92 (1H, dd, J = 17,5; 4,5 Hz, H-4b) đây là các proton của vòng pyran Bên cạnh đó là các tín hiệu tại δH: 3,92 (1H, d, J,5; 2,0 Hz, H-6′′a), 3,75(1H, dd, J,0; 5,0 Hz, H-6′′b), 3,36-3,50 (4H, m, H- 2′′, ′3′′, 4′′, 5′′) gợi ý cho một phân tử đường Như vậy dựa trên phổ 1 H- NMR, sự tương đồng của số hiệu phổ hợp chất AL4 và AL2 cùng công thức phân tử gợi ý đây là hợp chất glycosid của hợp chất AL2 (epiafzelechin)

Phổ 13 C NMR của AL4 cho 21 tín hiệu carbon, các tín hiệu của hợp chấy AL4 tương tự với hợp chất AL2 ở các tín hiệu của cấu trúc flavan, các tín hiệu này bao gồm 12 tín hiệu vòng thơm tại δC 158,4 (C-9), 157,9 (C-7), 157,8 (C-5), 157,1 (C-4′), 131,4 (C-1′), 129,1 (C-2′, C-6′), 115,8 (C-3′, C-5′), 102,5 (C-10), 98,5 (C-6), 97,0 (C-

8), ba tín hiệu vòng pyran tại δC 80,0 (C-2), 67,2 (C-3) và 29,3 (C-4), ngoài các tín hiệu trên hợp chấy AL4 cho 6 tín hiệu đặc trưng của đường glucose tại δC 102,5 (C-1′′), 78,2(C-3′′), 78,1 (C-5′′), 74,9 (C-2′′), 71,3 (C-4′′), 62, 5(C-6′′)

Phổ HMBC cho thấy sự tương tác giữa H-1′′ (δH 4,90) và C-7 (δC 157,9) So sánh các số liệu phổ và hằng số vật lý với tài liệu tham khảo [32], chất AL4 được xác định là (-)-epiafzelechin 7-O-β-D-glucopyranosid.

Hình 3.13 Phổ 1H NMR của hợp chất AL4

Hình 3.15 Phổ HMBC của hợp chất AL4

(*) Số liệu phổ hợp chất 1, (**) Số liệu tài liệu tham khảo [32]

Hợp chất AL5: Kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranosid

Chất AL5 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng với công thức phân tử C27H30O15, tương ứng với pic ion giả phân tử m/z [M+H]+ 595 trong phổ khối ESI-MS Phổ 1H NMR cho thấy sự hiện diện của một vòng thơm thế para qua hai tín hiệu tại H 6,93 (2H, d, J = 7,0 Hz) và 8,04 (2H, d, J = 10,0 Hz) Ngoài ra, hai tín hiệu singlet tại H 6,21 (1H, s) và 6,40 (1H, s) đặc trưng cho hai proton H-6 và H-8 ở vòng A của hợp chất flavon Phổ 1H NMR cũng ghi nhận tín hiệu nhóm methyl tại H 1,11 (3H, d, J = 6,5 Hz) và nhiều tín hiệu proton trong khoảng H 3,2-4,0, cùng với tín hiệu của hai proton anomer tại H 5,52 (1H, d, J = 5 Hz) và 5,11 (1H, d, J = 1,5 Hz), cho thấy sự có mặt của hai phân tử đường.

Phổ 13 C-NMR của AL5 xuất hiện tín hiệu của 27 nguyên tử cacbon, trong đó có 15 tín hiệu carbon vòng thơm, tín hiệu tại C 179,4 đặc trưng cho nhóm chức carbonyl liên hợp không no, khi so sánh các số liệu phổ 13 C-NMR và 1 H NMR đã phân tích trên cùng với các tài liệu tham khảo có thể xác định hợp chất AL5 là glycosid của keampferol Dựa trên kết quả phổ khối, với phần aglycon xác định là kaempferol, các tín hiệu đặc hiệu trên phổ 13 C-NMR và tín hiệu proton anomer trên phổ 1 H NMR gợi ý cho sự xuất hiện của thành phần đường β-glucose và α-rhamnose trong hợp chất AL5

Trên phổ HMBC, có sự tương tác giữa H-1′′ (H 5,52) và C-3 (c 135,1), cùng với H-1′′′ (H 5,11) và C-2′′ (c 80,0) Dựa vào các số liệu phổ và tài liệu tham khảo [15], hợp chất AL5 được xác định là kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-.

(*) CD3OD (**) CD3OD (*) CD3OD (**) CD3OD

Hợp chất AL6: Acid ursolic

Chất AL6 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z [M+H] + 457, gợi ý cho công thức phân tử là C30H48O3 (M 456)

Phổ 1 H NMR cho các tín hiệu đặc trưng của hợp chất triterpen khung ursan bao gồm tín hiệu 7 nhóm methyl gồm 5 singlet tại δH 1,01 (3H, s, H-27), 0,90 (3H, s, H-23), 0,85 (3H, s, H-24), 0,74 (3H, s, H-26), 0,70 (3H, s, H-25) và 2 doublet tại δH

The NMR analysis revealed signals at 0.86 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-29) and 0.80 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-30), along with an oxymethine group signal at δH 3.12 (1H, m, H-3) and an olefinic proton signal at δH 5.16 (1H, t, J = 6.0 Hz, H-12) The 13C NMR and DEPT spectra identified 30 carbon signals, including a carboxylic group at δC 180.6 (C-28) and two olefinic carbons at δC 138.0 (C-13) and 125.4 (C-12).

1 nhóm oxymethin tại δC 78,8 (C-3) và 7 nhóm methyl tại δC 27,9 (C-23), 23,4 (C-

27), 21,0 (C-30), 16,9 (C-29), 16,8 (C-26), 15,4 (C-25) và 15,2 (C-24) Từ dữ liệu phổ phân tích ở trên, kết hợp so với tài liệu tham khảo [27] cho phép xác định AL6 là hợp chất acid ursolic

(*) Hợp chất phân lập, (**)tài liệu tham khảo [27]

Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây sinh học

3.3.1 Kết quả thử nghiệm gây độc tế bào

Hợp chất AL6 đã được thử nghiệm hoạt tính trên hai dòng tế bào ung thư phổi (LU) và ung thư gan (Hep-G2), cũng như thử nghiệm ức chế α-glucosidase trong nghiên cứu trên loài Adinandra hainanensis Các thử nghiệm được thực hiện trong cùng điều kiện, và hợp chất này đã có các chế phẩm trên thị trường Do đó, nghiên cứu cũng tiến hành trên năm hợp chất phân lập còn lại cùng với phân đoạn dịch chiết ethyl acetat và methanol tổng.

Thử nghiệm độc tính trên tế bào ung thư được thực hiện với ba dòng tế bào: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (Hep G2) và ung thư phổi (LU) Kết quả của các thử nghiệm này được trình bày trong bảng 3.7.

Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào

STT Tên mẫu IC 50 (g/ml)

Hợp chất AL1 cho thấy hoạt tính gây độc tế bào yếu trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô và ung thư phổi với IC50 lần lượt là 107,91±3,05 và 114,90±2,5, trong khi các hợp chất AL2, AL3, AL4, AL5 không có hoạt tính này Cả hai phân đoạn ethyl acetat và methanol tổng đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng thử nghiệm, trong đó phân đoạn ethyl acetat có hiệu quả tốt hơn trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô (KB) và ung thư phổi (LU), nhưng kém hơn so với phân đoạn methanol tổng trên dòng tế bào ung thư gan (Hep G2).

47 Đối chứng dương Ellipticin có hoạt động ổn định trong tất cả các thử nghiệm

3.3.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

Hợp chất AL4 không có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, trong khi các hợp chất và phân đoạn khác đều cho thấy hoạt tính ở mức độ khác nhau Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.8.

Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH Tờn mẫu EC 50 (àg/ml) Tờn mẫu EC 50 (àg/ml)

Cắn MeOH tổng 31,32±0,96 Hợp chất AL3 197,94±2,74

PĐ Ethyl acetat 23,21±1,35 Hợp chất AL4 >256

Hợp chất AL1 6,20±0,34 Hợp chất AL5 232,45±2,56 Hợp chất AL2 40,60±0,43 Quercetin 9,97±0,25

3.3.3 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế α-glucosidase

Trong thử nghiệm ức chế α-glucosidase, tất cả các hợp chất tham gia đều không cho thấy hoạt tính Tuy nhiên, hai phân đoạn đã thể hiện hoạt tính với giá trị IC50 thấp hơn đáng kể so với chất đối chứng dương acarbose Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.9.

Bảng 3.9 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế α-glucosidase

TT Tờn mẫu Giỏ trị IC 50 (àg/ml)

BÀN LUẬN

Kết quả quá trình chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc

Nghiên cứu đã phân lập thành công 6 hợp chất tự nhiên tinh khiết từ dịch chiết của loài Adinandra lienii Dựa trên các dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc hóa học của các hợp chất này đã được xác định Các hợp chất bao gồm: AL1 (-)-epicatechin, AL2 (-)-epiafzelechin, AL3 thymoquinol 2-O-β-D-glucopyranosid, AL4 (-)-epiafzelechin 7-O-β-D-glucopyranosid và AL5 kaempferol 3-.

O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid, AL6 acid ursolic

This article presents the first report on the isolation of compounds from the species Adinandra lienii The isolated compounds include derivatives from two groups: terpenes and flavonoids Notably, compounds AL2, AL3, AL4, and AL5 are being reported for the first time from the genus Adinandra Additionally, compound AL1 (-)-epicatechin has been isolated from A nitida, while compound AL6, ursolic acid, has been isolated from A hainanensis This marks a significant advancement in the study of the genus.

Adinandra chứa các hợp chất AL2, AL4, AL5 với khung cấu trúc quen thuộc, tương tự như các hợp chất flavan-3-ol và flavonol.

Như vậy, cho tới nghiên cứu này các hợp chất phân lập từ chi Adinandra phần lớn là triterpen và flavonoid

Kết quả thử nghiệm tác dụng sinh học

• Thử nghiệm gây độc tế bào

Trong nghiên cứu này, hợp chất AL1 (-)-epicatechin là hợp chất duy nhất thể hiện hoạt tính, nhưng chỉ ở mức độ thấp trên hai trong ba dòng tế bào Mặc dù kết quả khiêm tốn, nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng (-)-epicatechin có tác dụng đáng kể đối với một số dòng tế bào ung thư, bao gồm khả năng gây tổn thương DNA và thúc đẩy quá trình apoptosis trong tế bào bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính ở chuột với liều 40 mg/kg trong 22 ngày Hơn nữa, (-)-epicatechin cũng đã được chứng minh có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư hạch Hodgkin, tế bào Jurkat T, và tế bào ung thư tuyến tiền liệt, với các cơ chế hoạt động đa dạng.

Hợp chất AL6 acid ursolic chưa được thử nghiệm, nhưng các nghiên cứu trước đây trên hai dòng tế bào Hep G2 và LU cho thấy hoạt tính gây độc yếu Mặc dù vậy, một số báo cáo đã chỉ ra rằng hợp chất này có khả năng ức chế tế bào ung thư thông qua việc kích hoạt con đường STAT3.

Acid ursolic có khả năng làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư và kích thích quá trình apoptosis Nó cũng ức chế sự biểu hiện JNK và hoạt hóa IL-2 của tế bào JURKAT, dẫn đến giảm sự tăng sinh và hoạt động của tế bào Ngoài ra, acid ursolic còn được sử dụng để tổng hợp các hợp chất có hoạt tính chống ung thư mạnh hơn.

Phân đoạn ethyl acetat và methanol cho thấy tổng hoạt tính ở mức độ thấp, nhưng hoạt tính của phân đoạn ethyl acetat vẫn cao hơn đáng kể so với (-)-epicatechin, đặc biệt trong dòng tế bào LU Hoạt tính này có thể được gây ra bởi các hợp chất khác chưa được phân lập.

Hình 4.2 IC 50 các phân đoạn, hợp chất trong thử nghiệm gây độc tế bào

• Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

Nhiều nghiên cứu cho thấy gốc tự do là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh tật ở con người như tiểu đường, bệnh tim mạch, Parkinson, và Alzheimer Sử dụng các chất chống oxy hóa trong chế độ ăn uống hoặc dưới dạng thực phẩm bổ sung có thể tăng cường khả năng bảo vệ cơ thể chống lại gốc tự do, từ đó giúp giảm thiểu tác động của bệnh tật Chất chống oxy hóa không chỉ cải thiện chất lượng cuộc sống mà còn ngăn ngừa và trì hoãn sự khởi phát cũng như phát triển của bệnh, góp phần tiết kiệm chi phí điều trị Việc tìm kiếm các nguồn nguyên liệu tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa để loại bỏ gốc tự do vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu.

Nghiên cứu cho thấy hợp chất AL1 và AL2 có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH cao, với AL1 có giá trị EC50 là 6,20±0,34 µg/ml, cao hơn quercetin (9,97±0,25 µg/ml) Các nghiên cứu trước đây cũng xác nhận hoạt tính chống oxi hóa của hai hợp chất này Sự hiện diện của AL1 và AL2 giải thích cho hoạt tính đáng kể của phân đoạn ethyl acetat và dịch MeOH tổng Trong khi đó, ba hợp chất còn lại từ phân đoạn nước thể hiện hoạt tính yếu hơn.

Phân đoạn EA Phân đoạn MeOH Hợp chất AL1

Mặc dù các hợp chất AL4 và AL5 cũng là các dẫn chất flavonoid, thậm chí hợp chất

Hợp chất AL4 có cấu trúc aglycon tương tự như AL2, một hợp chất có hoạt tính cao, do đó, việc đánh giá hoạt tính của các hợp chất này có thể chưa chính xác Trong số sáu chất được phân lập, có bốn chất là flavonoid, và kết quả thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH cho thấy loài A lienii là nguồn cung cấp tiềm năng các hợp chất chống oxy hóa.

Hình 4.3 EC 50 các phân đoạn, hợp chất trong thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH

• Hoạt tính ức chế α-glucosidase

Enzyme α-glucosidase đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân tinh bột và disaccharid thành đường đơn, giúp cơ thể hấp thu glucose ở ruột non Việc ức chế enzyme này ở bệnh nhân đái tháo đường týp 2 có thể làm giảm mức đường huyết sau bữa ăn Do đó, các thuốc ức chế α-glucosidase như acarbose, miglitol và voglibose được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh nhân tiểu đường tuýp 2.

Với sự gia tăng nhanh chóng của căn bệnh này, việc tìm kiếm các hoạt chất điều trị trở nên cấp thiết Do đó, công tác sàng lọc các hợp chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase vẫn đang diễn ra liên tục.

Trong nghiên cứu về hoạt tính ức chế α-glucosidase, hai phân đoạn đã cho thấy hoạt tính ức chế mạnh mẽ với IC50 thấp hơn khoảng 4 lần so với đối chứng dương acarbose (42,80±0,39 và 40,24±0,34 so với 164,08±2,89 của acarbose) Tuy nhiên, các hợp chất phân lập khác không cho thấy hoạt tính ức chế tương tự.

Nghiên cứu về hợp chất acid ursolic (AL6) cho thấy hoạt tính ức chế α-glucosidase của nó rất cao với IC50 đạt 67,46 ± 1,73 àM, vượt trội so với acarbose (191,29 ± 1,87 àM) [3] Hàm lượng lớn AL6 trong các phân đoạn dịch chiết của Adinandra lienii có thể là nguyên nhân chính giải thích cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao trong các thử nghiệm.

Hợp chất AL1 (-)-epicatechin, mặc dù không có hoạt tính ức chế α-glucosidase, đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh tiểu đường, bao gồm việc tăng cường độ nhạy cảm với insulin và giảm tình trạng kháng insulin.

Kết quả thử nghiệm cho thấy loài Sum không phải là nguồn nguyên liệu tiềm năng để phân lập các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào hoặc ức chế α-glucosidase, do hầu hết các hợp chất và phân đoạn đều cho tác dụng yếu Tuy nhiên, hoạt tính chống oxy hóa, đặc biệt là khả năng bắt gốc tự do DPPH, đã cho kết quả khả quan Do đó, cần thực hiện thêm nghiên cứu trên các mô hình thử nghiệm khác và định lượng các hợp chất flavonoid để đánh giá đầy đủ và chính xác tác dụng này.

Định dạng
Số trang	138
Dung lượng	8,15 MB