PHAN HUY đức TỔNG hợp và THỬ tác DỤNG KHÁNG UNG THƯ của một số dẫn CHẤT n ACYLHYDRAZON MANG KHUNG 4 OXOQUINAZOLIN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

TỔNG QUAN

Quá trình chết tự nhiên của tế bào (apoptosis)

Vào năm 1965, John Kerr đã mô tả hiện tượng "sự co ngót hoại tử" (shrinkage necrosis) khi nghiên cứu tế bào gan chuột bị co rút do thiếu máu ở tĩnh mạch cửa – gan Hiện tượng này khác biệt so với các dạng hoại tử trước đây Đến năm 1972, ông đã đặt tên cho quá trình này là apoptosis, coi đây là một giai đoạn quan trọng trong chu trình tế bào Khi tế bào hoặc chức năng sinh lý nào đó bị hủy hoại, chúng sẽ được loại bỏ qua quá trình chết được điều hòa, nhường chỗ cho các tế bào khỏe mạnh.

Trong quá trình apoptosis, tế bào trải qua hai giai đoạn chính Đầu tiên, tế bào co lại trong khi màng tế bào vẫn giữ nguyên, nhưng nội quan bên trong bị cô đặc và phân mảnh Giai đoạn tiếp theo là tế bào bị thực bào bởi các đại thực bào, giúp ngăn chặn sự giải phóng nguyên sinh chất ra môi trường, bao gồm cả các tác nhân gây viêm Ngược lại, trong quá trình hoại tử, tế bào sẽ trương phồng và dẫn đến nứt vỡ màng tế bào, làm giải phóng các thành phần tế bào ra ngoài.

Enzym caspase

Caspase là một họ protease cystein quan trọng trong quá trình apoptosis Nghiên cứu cho thấy việc ức chế caspase bằng zVAD-fmk, một chất ức chế mạnh, có thể khiến tế bào chuyển sang con đường hoại tử thay vì chết tự nhiên.

Hiện tại, đã phát hiện 14 loại caspase ở động vật có vú, được phân loại thành 3 nhóm nhỏ dựa trên sự tương đồng và đặc hiệu cơ chất Nhóm I bao gồm các caspase tham gia vào phản ứng viêm, trong khi nhóm II và nhóm III liên quan đến quá trình apoptosis Ngoài ra, còn có 3 caspase chưa được định danh.

Hình 1.2: Phân loại các caspase có mặt trong tế bào

Caspase được tổng hợp dưới dạng tiền enzym (zymogen) và được hoạt hóa thông qua phản ứng cắt mạch peptid Cấu trúc tinh thể của caspase 1 và caspase 3 cho thấy enzym hoạt động là phức hợp gồm 4 đơn phân, bao gồm 2 đơn vị lớn và 2 đơn vị nhỏ Nghiên cứu cho thấy một số caspase, như caspase 3 và caspase 9, có vai trò quan trọng trong sự phát triển hệ thần kinh, trong khi caspase 8 liên quan đến sự phát triển hệ tim mạch và chức năng tạo máu.

1.2.2 Vai trò của các enzym caspase trong chu trình chết tự nhiên Để khởi động được quá trình chết tự nhiên của tế bào, các tế bào phải được nhận kích thích từ hai con đường chính: con đường nội sinh và con đường ngoại sinh Cả hai con đường này đều thông qua các enzym caspase và được chia thành hai nhóm nhỏ:

- Nhóm enzym khởi phát: gồm caspase 2, 8, 9, 10

- Nhóm enzym thi hành: gồm caspase 3, 6, 7

Hình 1.3: Hai con đường kích hoạt quá trình apoptosis 1.2.2.1 Con đường nội sinh

Con đường nội sinh, hay còn gọi là con đường thông qua ti thể trong quá trình apoptosis, là sự kết hợp của các kích thích nội tại từ bên trong tế bào, phụ thuộc vào các tác nhân được giải phóng bởi ti thể và được khởi động bởi tín hiệu âm tính và dương tính Tín hiệu âm tính xuất phát từ sự thiếu hụt các cytokine, hormone và các yếu tố sinh trưởng trong môi trường giữa các tế bào, dẫn đến việc các phân tử tiền apoptosis như PUMA, NOXA và BAX chuyển từ trạng thái ức chế sang kích hoạt, khởi động quá trình chết tự nhiên Ngược lại, tín hiệu dương tính là những kích thích từ bên ngoài, như tình trạng giảm oxy huyết (hypoxia) và các tác nhân tự nhiên như phóng xạ, các phân tử oxy gốc hoạt động, virus và nhiều tác nhân độc hại khác, tác động trực tiếp lên việc khởi động apoptosis.

Caspase 9 khởi động con đường nội sinh thông qua việc liên kết với yếu tố kích hoạt enzym protease (APAF1), làm lộ ra vùng tổ hợp caspase (CARD) Trong tế bào bình thường, APAF1 tồn tại ở dạng bất hoạt và gấp khúc, dẫn đến việc vùng CARD bị khóa lại.

Khi apoptosis được kích thích qua các tín hiệu dương và âm, màng ti thể biến đổi và mở các kênh chuyển tiếp (MPT) Sự mở này cho phép các protein tiền apoptosis như cytochrom C, Smac/Diablo và HtrA2/Omi thoát ra, kích hoạt quá trình chết tế bào Qua các giai đoạn trung gian, phức hợp apoptosom được hình thành, dẫn đến việc kích hoạt procaspase 9 và cuối cùng là procaspase 3.

Con đường ngoại sinh được kích hoạt qua thụ thể TNF hay thụ thể gây chết, nhờ vào các phối tử gây chết do tế bào diệt tự nhiên hoặc đại thực bào sản sinh Khi liên kết thụ thể - phối tử hình thành, con đường này được kích hoạt thông qua chuyển hóa procaspase 8 thành caspase 8 Nghiên cứu trên chuột đã chứng minh vai trò kiểm soát của caspase 8 đối với con đường ngoại sinh, khi cho thấy caspase 8 không phản ứng với các phối tử gây chết khi thiếu hụt loại caspase này.

Các hợp chất có hoạt tính hoạt hóa caspase 3

Trong 14 loại caspase ở động vật có vú, caspase 3 đóng vai trò then chốt trong giai đoạn bắt đầu thực thi apoptosis bởi vì vị trí ở cửa ngõ cuối cùng kết nối con đường ngoại sinh và con đường nội sinh Do đó, nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tăng cường chuyển hóa procaspase 3 thành caspase 3, nhằm khởi động apoptosis [9], [46], [47], [57]

1.3.1 Hợp chất được nghiên cứu đầu tiên PAC -1

PAC-1 là hợp chất đầu tiên được K S Putt và cộng sự nghiên cứu, có khả năng kích hoạt procaspase sau khi sàng lọc gần 20.500 hợp chất phân tử nhỏ Tác dụng của PAC-1 lên giai đoạn tiền apotosis trên các dòng tế bào là do sự tác động trực tiếp và nhanh chóng lên procaspase-3.

Hình 1.4: Quá trình hoạt hóa procaspase-3 bởi hợp chất PAC-1

Năm 2009, Q P Peterson đã làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của PAC-1, chỉ ra rằng sự hình thành phức hợp vòng với ion kẽm là yếu tố quan trọng cho hoạt tính của nó.

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của hợp chất PAC-1

1.3.2 Các hợp chất tương tự của PAC-1

1.3.2.1 Các dẫn chất của acylhydrazon

Sau khi nghiên cứu về hoạt tính và cơ chế tác dụng của hợp chất PAC-1, nhiều dẫn xuất của nó đã được phát triển để tạo ra thư viện các hoạt chất có khả năng kích hoạt procaspase 3 Nổi bật trong số đó là công trình của D C Hsu và cộng sự, họ đã xây dựng thành công một thư viện gồm 837 hợp chất.

Năm 2014, F Wang và cộng sự đã nghiên cứu hợp chất WF-210, cho thấy hiệu quả điều trị vượt trội so với PAC-1 Kết quả thử nghiệm cho thấy IC50 của WF-210 dao động từ 0,08 đến 2,8 àM, với độ nhạy cảm của các dòng tế bào đối với WF-210 gấp 22 lần so với PAC-1 Đồng thời, độc tính của WF-210 đối với tế bào thường thấp hơn 2,6 lần, với IC50 trung bình là 412,34 àM so với 158,29 àM của PAC-1.

Hình 1.6: Công thức cấu tạo của hợp chất WF-210

Năm 2015, F Wang đã phát hiện hợp chất WF-208 (3) với hoạt tính tiềm năng trên tế bào HL-60, đạt giá trị IC50 là 0,08 µM, cao gấp 26,3 lần so với PAC-1.

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của hợp chất WF-208 1.3.2.2 Các dẫn chất khác

Ngoài acylhydrazon, nhiều nghiên cứu đã phát triển các dẫn xuất khác như diarylure, benzothiazol và oxadiazol Để cải thiện hoạt tính của PAC-1, Gong và cộng sự đã tổng hợp một loạt dẫn xuất diarylure dựa trên cấu trúc sorafenib Nhóm diarylure đã được chứng minh có khả năng ức chế nhiều loại kinase, bao gồm VEGFR, ODGFR và B-Raf.

Hình 1.8: Công thức cấu tạo của Sorafenib và các dẫn xuất của nó có hoạt tính thử hoạt hóa caspase 3

Các năm sau đó, Gong và cộng sự tiếp tục phát triển các hợp chất hoạt hóa caspase

Nghiên cứu dựa trên khung benzothiazol cho thấy nhiều dẫn xuất của nó có hoạt tính tương đương hoặc tốt hơn so với PAC-1 Cụ thể, nhóm thế R’ benzyloxy làm tăng hoạt tính, trong khi khung coumarin lại cho hiệu quả thấp hơn Đặc biệt, nhóm semicarbazol có khả năng thay thế nhóm hydrazon trong PAC-1 mà vẫn duy trì được hoạt tính.

Hình 1.9: Công thức cấu tạo của các dẫn xuất semicarbazol mang khung benzothiazol

Một số dẫn chất mang khung quinazolin có hoạt tính kháng ung thư

Quinazolin là một hợp chất dị vòng bicyclic chứa nitơ, bao gồm một vòng benzen và một vòng pyrimidin liên kết qua hai carbon Hợp chất này có bốn dạng đồng phân chính: quinazolin, quinoxalin, cinnolin và phtalazin, tùy thuộc vào vị trí của nitơ trong cấu trúc Một dẫn xuất quan trọng của quinazolin là quinazolinon, bao gồm các dạng 4(3H)-quinazolinon và 2(1H)-quinazolinon khi kết hợp với nhóm carbonyl.

Hình 1.10: Công thức cấu tạo của quinazolin và các đồng phân

Quinazolinon và quinazolin nổi bật với khả năng kết hợp với các hợp chất có hoạt tính khác, tạo ra các hoạt chất nâng cao hiệu quả và giảm kháng thuốc, bao gồm kháng sinh, kháng sốt rét, kháng viêm, hạ huyết áp, và đặc biệt là tác dụng chống ung thư sẽ được phân tích chi tiết sau đây Một số hoạt chất đã được FDA phê duyệt trở thành thuốc, như được thể hiện trong hình 1.12.

Hình 1.11: Hai dẫn xuất quan trọng của quinazolin

1.4.1 Tác dụng ức chế protein kinase

Protein kinase là một nhóm enzym quan trọng trong cơ thể người, điều hòa chu trình tế bào, phân bào và sự sinh sản của tế bào Sự đột biến hoặc biểu hiện bất thường của protein kinase có thể dẫn đến sự hình thành tế bào ung thư Do đó, phát triển các dẫn chất nhắm vào kinase là cần thiết trong nghiên cứu thuốc mới chống ung thư Một số kinase đích quan trọng bao gồm kinase của thụ thể tyrosin và kinase serin/threonin.

Hình 1.12: Một số phân tử thuốc có chứa khung quinazolin đã được FDA chấp thuận

Vào năm 2010, Garofalo và cộng sự đã tổng hợp một loạt dẫn xuất amid, acid carbamic và ure của các hợp chất 4-anilinoquinazolin nhằm điều trị ung thư tiền liệt tuyến, với khả năng ức chế cả hai thụ thể VEGFR và EGFR Việc đưa nhóm diethylamino vào phân tử đã cải thiện tính chất dược lý và hóa lý, bao gồm độ tan, hoạt tính sinh học và khả năng xuyên màng tế bào Kết quả thử nghiệm cho thấy thay thế nhóm anilin bằng các nhóm alkyl hoặc aryl ure có thể tăng cường khả năng chọn lọc đối với VEGFR, trong khi việc thay thế nhóm ure bằng nhóm acid carbamic có thể dẫn đến ức chế đồng thời VEGFR và EGFR.

Tiếp đó vào năm 2013, Conconi và cộng sự cũng đã tổng hợp 18 dẫn chất khác nhau

Các hợp chất 19, 20, 21 và 22, mang khung quinazolin với mạch nhánh anilin, đã được thử nghiệm hoạt tính trên hai dòng tế bào ung thư: A431 (có biểu hiện quá mức gen EGFR) và NIH3T3 (không biểu hiện EGFR) (hình 1.14) [6].

Hình 1.13: Các dẫn chất được sàng lọc bởi Garofalo

Kết quả thử nghiệm MTT cho thấy 6 dẫn chất có hoạt tính vượt trội trên tế bào A431 so với chất chứng Trong số đó, 3 dẫn chất 23, 24 và 25 (hình 1.15) thể hiện hoạt tính tương đương trên tế bào NIH3T3, cho thấy khả năng hoạt động tốt trên cả hai dòng tế bào Cả 3 dẫn chất này đều thuộc một dãy dẫn chất nhất định.

Vòng dioxi đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính của các phân tử, với giá trị IC50 trên 3 dòng tế bào MCF-7, HT-29 và HeLa thấp hơn 6-10 lần so với chất chứng.

Hình 1.14: Các dẫn chất được sàng lọc bởi Conconi

Hình 1.15: Các dẫn chất có hoạt tính cao trên cả hai dòng tế bào

1.4.2 Tác dụng ức chế quá trình polymer hóa tubulin

Tubulin là một loại protein quan trọng trong phát triển thuốc chống ung thư, với nhiều vùng liên kết với phân tử thuốc Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng colchicin và các dẫn xuất của nó có khả năng ức chế sự trùng hợp của tubulin thành vi ống Tuy nhiên, colchicin có nhiều hạn chế do độc tính cao, dẫn đến sự chú trọng vào việc phát triển các hợp chất nhắm đến tubulin an toàn hơn.

Hình 1.16: Các dẫn xuất được nghiên cứu hoạt tính ức chế tubulin

Nghiên cứu của nhóm Chillin về các dẫn chất ức chế tyrosin kinase cho thấy một số dẫn chất 19 có khả năng ức chế đồng thời phản ứng trùng hợp hóa tubulin Để xác định cấu trúc nào có thể ức chế cả TK và tubulin hoặc chỉ ức chế chọn lọc tubulin, nhóm đã tiến hành sàng lọc các dẫn chất biphenyl aminoquinazolin vào năm 2014, trong đó có việc thay thế một trong hai hợp phần benzen bằng một dị vòng.

- Vòng dioxy đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính, kích thước vòng có thể thay đổi

- Hợp phần anilin benzen là cần thiết để có thể có hoạt tính ức chế đồng thời

- Vòng aryl ngoài cùng có vai trò chọn lọc một trong hai hoạt tính kể trên

Hình 1.17: Các dẫn chất được thiết kế và tổng hợp bởi Wang và cộng sự

Năm 2014, Wang và cộng sự đã tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế tubulin từ hợp chất 27 và 28, dẫn đến việc tổng hợp một loạt các dẫn chất của 4-(N-cycloamino)phenylquinazolin Trong số đó, hợp chất 29 nổi bật với hoạt tính ức chế sinh trưởng ở mức nano mol và khả năng ức chế tubulin đáng kể, với giá trị IC50 chỉ 0,77 àM, so với chất chứng combretastatin A-4 là 0,96 àM.

1.4.3 Tác dụng ức chế protein lysin methyl transferase

Protein lysin methyl transferase G9a được biểu hiện quá mức trong các tế bào ung thư, đóng vai trò quan trọng trong quá trình methyl hóa histon H3 và protein p53 Việc bất hoạt gen của G9a có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bằng cách dimethyl hóa Lys370 và kích hoạt protein p53, từ đó ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư Khung cấu trúc của 2,4-diamino-6,7-dimethoxyquinazolin, với hợp chất đại diện là hợp chất 30, cho thấy khả năng ức chế G9a và GLP hiệu quả.

Liu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc và tác dụng của khung quinazolin, từ đó phát triển hợp chất 31 với khả năng chọn lọc G9a rất tốt.

Hình 1.18: Hai hợp chất mang khung 2,4-diamino-6,7-dimethoxyquinazolin có hoạt tính ức chế G9a và GLP

Năm 2010, Liu đã cải tiến hợp chất bằng cách tối ưu mạch nhánh 7-dimethylaminopropoxy, tạo ra hợp chất 32 có hiệu lực ở mức picomol Mặc dù hợp chất này thể hiện hoạt tính vượt trội trong thử nghiệm in vitro, nhưng hiệu lực trên tế bào lại thấp Do đó, nhóm nghiên cứu đã tiếp tục cải thiện khả năng thấm vào tế bào, đồng thời duy trì hoạt tính in vitro, dẫn đến việc phát triển hai hợp chất mới, 33 và 34.

Hình 1.19: Các dẫn chất được cải thiện hoạt tính in vitro và tính thấm màng tế bào

1.4.4 Tác dụng ức chế topoisomerase I

DNA topoisomerase I (topI) là một enzym thiết yếu trong quá trình nhân đôi, sửa chữa và phiên mã của tế bào Các chất ức chế topoisomerase I đang trở thành một hướng đi mới trong phát triển thuốc chống ung thư Camptothecin, chất ức chế topI đầu tiên được phát hiện, tuy nhiên vẫn tồn tại nhiều hạn chế về độ bền hóa học và khả năng kháng từ tế bào Do đó, nhiều dẫn chất tiềm năng khác để ức chế enzym này đã được nghiên cứu.

Hình 1.20: Các dẫn chất của pyrazol[1,5-a]quinazolin có hoạt tính kháng topisomerase I

Năm 2013, Taliani đã báo cáo một dãy các dẫn chất của pyrazol[1,5-a]quinazolin

Nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt tính ức chế enzyme topI liên quan đến cấu trúc của amin thơm, bao gồm độ dài của nhóm liên kết và vị trí nitơ ở cuối mạch, như thể hiện qua các hợp chất 35, 36 và 37 Đặc biệt, sự có mặt của nhóm imidazol trên chuỗi sẽ làm giảm hoạt tính của các hợp chất này.

NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, thiết bị

Dung môi, hóa chất dùng phân tích, kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn HPLC

Các dung môi và hóa chất cho tổng hợp hóa học được nhập khẩu từ công ty Sigma-Aldrich hoặc Merck, và được sử dụng trực tiếp mà không qua bất kỳ quá trình tinh chế nào.

The article discusses various 2-aminobenzoic acids, including 2-aminobenzoic acid, 2-amino-4-methylbenzoic acid, 2-amino-5-methylbenzoic acid, 2-amino-4,5-dimethoxybenzoic acid, 2-amino-4-fluorobenzoic acid, 2-amino-5-fluorobenzoic acid, 2-amino-5-chlorobenzoic acid, 2-amino-5-bromobenzoic acid, 2-amino-5-nitrobenzoic acid, and 2-amino-4-nitrobenzoic acid These compounds are significant in various chemical and pharmaceutical applications.

Các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, N,N-dimethylformamid (DMF), dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), acid acetic (AcOH), aceton, ethyl acetat,

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

Dụng cụ thủy tinh bao gồm bình cầu đáy tròn với dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong và cốc có mỏ các loại.

- Bình chạy sắc kí Camag

- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh

- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu

- Máy cất quay chân không Buchi R-200

- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm

- Máy Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy

- Máy SHIMADZU FTIR Affinity - 1S để xác định phổ IR

- Máy khối phổ LTQ Orbitrap XL TM để ghi phổ MS, đặt tại khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 MHz được sử dụng để ghi phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR, hiện đang được đặt tại khoa Hóa học thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Nội dung nghiên cứu

(E)-N'-(2-hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (Va)

(E)-N’-(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl) acetohydrazid (Vb)

(E)-N’-(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl) acetohydrazid (Vc)

(E)-2-(6,7-Dimethoxy-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-N’-(2-hydroxy-4- methoxybenzyliden) acetohydrazid (Vd)

(E)-2-(7-Fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-N’-(2-hydroxy-4-methoxybenzyliden) acetohydrazid (Ve)

(E)-2-(6-Fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-N’-(2-hydroxy-4-methoxybenzyliden) acetohydrazid (Vf)

(E)-2-(6-Chloro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-N’-(2-hydroxy-4-methoxybenzyliden) acetohydrazid (Vg)

(E)-2-(6-Bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-N’-(2-hydroxy-4-methoxybenzyliden) acetohydrazid (Vh)

(E)-N’-(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(6-nitro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl) acetohydrazid (Vi)

(E)-N’-(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(7-nitro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl) acetohydrazid (Vj)

- Kiểm tra độ tinh khiết

- Xác định cấu trúc của các hợp chất vừa tổng hợp được

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất vừa tổng hợp được

Nghiên cứu đã thử nghiệm tác dụng độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư, bao gồm tế bào ung thư đại tràng SW620, tế bào ung thư tiền liệt tuyến PC3, và tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ NCI-H23.

- Thử tác dụng hoạt hóa caspase 3.

Phương pháp nghiên cứu

Dựa trên nguyên tắc cơ bản của hóa học hữu cơ, các chất đã được thiết kế và tổng hợp thông qua các phản ứng như phản ứng ngưng tụ vòng quinazolin, phản ứng alkyl hóa, phản ứng hydrazid hóa và phản ứng ngưng tụ imin.

- Phản ứng được theo dõi và kiểm soát bằng sắc kí lớp mỏng (TLC)

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

- Độ tinh khiết của sản phẩm được xác định bằng đồng thời cả sắc kí lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy sau khi sản phẩm được tinh chế

2.3.1.3 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được

Sau khi kiểm tra độ tinh khiết, sản phẩm sẽ được phân tích cấu trúc bằng các phương pháp quang phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton.

( 1 H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi bằng máy SHIMADZU FTIR Affinity - 1S

Khối lượng phân tử được xác định bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng phương pháp ion hóa phun bụi điện tử (ESI).

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được ghi bằng máy Brucker AV-500 MHz tại Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Cụ thể, phổ 1H-NMR được ghi ở tần số 500 MHz trong dung môi DMSO-d6 với chuẩn nội là TMS, trong khi phổ 13C-NMR được ghi ở tần số 125 MHz.

2.3.2 Thử tác dụng sinh học

2.3.2.1 Thử độc tế bào Độc tính của các hợp chất tổng hợp được được tiến hành tại khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Chúng được đánh giá thông qua 3 dòng tế bào chính bao gồm tế bào ung thư đại tràng (SW620), tế bào ung thư tiền liệt tuyến (PC3), và tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ ở người (NCI-H23) Các dòng tế bào này được mua từ ngân hàng tế bào tại Viện nghiên cứu Sinh học Hàn Quốc (KRIBB)

Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM đạt khoảng 3 x 10^4 tế bào/mL Vào ngày 0, 180 µL dịch tế bào được cho vào các giếng của đĩa 96 giếng và ủ trong môi trường CO2 5% ở 37°C trong 24 giờ Các phân tử tổng hợp được hòa tan trong DMSO và pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng môi trường nuôi cấy 20 µL mẫu được thêm vào từng giếng với nồng độ khác nhau và tiếp tục ủ trong 48 giờ Độc tính của hợp chất được định lượng bằng phương pháp so màu.

Giá trị IC50 là nồng độ của chất có khả năng ức chế 50% sự phát triển của tế bào Kết quả cuối cùng được tính toán dựa trên trung bình của ba lần thử nghiệm, với độ lệch không vượt quá 10%.

IC50 được tính bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0 theo phương pháp Probits

Tác dụng hoạt hóa caspase được thử nghiệm tại khoa Dược trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc và được định lượng bằng bộ kit của Abcam

Tế bào ung thư hạch bạch huyết U937 (nồng độ 5 x 10^5/mL mỗi giếng) được cấy vào đĩa 6 giếng và nuôi cấy trong 24 giờ Sau khi thu hoạch, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS lạnh và xử lý với đệm ly giải cùng bộ kit Chất ly giải tế bào (100 à/50 àL) được trộn với 2 àL đệm phản ứng và 5 àL DEVD-p-NA theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hoạt tính enzyme được định lượng bằng phương pháp huỳnh quang sau 1 giờ ủ.

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Hóa học

Các acylhydrazon mang khung quinazolin-4(3H)-on mục tiêu Va-j được tổng hợp thông qua 4 bước, như sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp các hợp chất Va-j

3.1.1.1 Tổng hợp dẫn chất (E)-N'-(2-hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(4- oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (Va) a Tổng hợp nguyên liệu quinazolin-4(3H)-on (IIa)

Sơ đồ 3.2: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIa

Dẫn chất Nhóm thế Dẫn chất Nhóm thế

Cân 137 mg acid 2-aminobenzoic (Ia) (~1 mmol) vào bình cầu đáy tròn dung tích

Thêm 450 mg formamid vào 50 mL dung dịch và khuấy ở 120ºC trong 3 giờ Sau khi phản ứng kết thúc, để nguội và thêm 40 mL NaHCO3, sẽ thấy có tủa hình thành Tiến hành lọc và rửa tủa nhiều lần bằng nước cất Cuối cùng, sấy khô tủa ở 60ºC trong khoảng 24 giờ để thu được 131,4 mg quinazolin-4(3H)-on (IIa).

Cảm quan: Chất rắn màu nâu trắng

Rf = 0,46 (DCM/MeOH = 9/1) b Tổng hợp nguyên liệu ethyl 2-(4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat (IIIa)

Sơ đồ 3.3: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIIa

Hòa tan 131,4 mg quinazolin-4(3H)-on (IIa) trong 20 mL aceton và thêm K2CO3, khuấy ở 60ºC trong 30 phút Sau đó, cho KI và ethyl cloroacetat vào, khuấy trong 3 giờ Cuối cùng, cất quay để loại aceton, thu được hỗn hợp rắn và chiết 3 lần với DCM, sau đó cô dưới áp suất thấp để thu dịch lỏng màu vàng Sấy dịch ở 60°C.

24 giờ thu được 183,7 mg IIIa

Cảm quan: Chất lỏng màu nâu nhạt

Rf = 0,62 (DCM/MeOH = 9/1) c Tổng hợp nguyên liệu 2-(4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVa)

Sơ đồ 3.4: Phản ứng tổng hợp hợp chất IVb

Pha loãng 183,7 mg ethyl 2-(7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat trong 15 mL ethanol và thêm hydrazin monohydrat vào bình cầu đáy tròn 50 mL Khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng cho đến khi xuất hiện tủa trắng, quá trình này kéo dài khoảng 30 phút Sau đó, lọc và rửa tủa bằng ethanol lạnh, cuối cùng sấy tủa trong điều kiện chân không để thu được 157,1 mg hợp chất IVa.

Cảm quan: Chất rắn màu trắng

Rf = 0,23 (DCM/MeOH = 9/1) d Tổng hợp hợp chất (E)-N'-(2-hydroxy-4-methoxybenzylidene)-2-(4-oxoquinazolin- 3(4H)-yl)acetohydrazide (Va)

Sơ đồ 3.5: Phản ứng tổng hợp hợp chất Va

Phân tán 157,1 mg 2-(4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVa) trong 15 mL ethanol, sau đó thêm từ từ 1 mL acid acetic đặc và 131 mg 2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd vào hỗn hợp Tiến hành đun hồi lưu trong khoảng thời gian cần thiết để hoàn thành phản ứng.

Sau 30 phút, tủa bắt đầu hình thành Tiến hành lọc và rửa tủa bằng ethanol lạnh Sau đó, sấy khô tủa trong điều kiện chân không và tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi DCM/MeOH tỉ lệ 9/1, thu được 210,6 mg sản phẩm.

3.1.1.2 Tổng hợp dẫn chất (E)- N’ -(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(7-methyl- 4- oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (Vb) a Tổng hợp nguyên liệu 7-methylquinazolin-4(3H)-on (IIb)

Sơ đồ 3.6: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIb

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIa với 151 mg hợp chất Ib thu được 147,2 mg hợp chất IIb

Rf = 0,40 (DCM/MeOH = 9/1) b Tổng hợp nguyên liệu ethyl 2-(7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat (IIIb)

Sơ đồ 3.7: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIIb

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIIa với 147,2 mg hợp chất IIb thu được 201,4 mg hợp chất IIIb

25 c Tổng hợp nguyên liệu 2-(7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVb)

Sơ đồ 3.8: Phản ứng tổng hợp hợp chất IVb

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu Iva với 201,4 mg hợp chất IVb thu được 167,2 mg hợp chất IVb

Rf = 0,25 (DCM/MeOH = 9/1) d Tổng hợp hợp chất (E)-N’-(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(7-methyl-4- oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (Vb)

Sơ đồ 3.9: Phản ứng tổng hợp hợp chất Vb

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu Va với 167,2 mg hợp chất IVb thu được 238 mg hợp chất Vb

3.1.1.3 Tổng hợp dẫn chất (E)- N’ -(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(6-methyl-4- oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (Vc)

26 a Tổng hợp nguyên liệu 6-methylquinazolin-4(3H)-on (IIc)

Sơ đồ 3.10: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIc

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIa với 151 mg hợp chất Ic thu được 134,4, mg hợp chất IIc

Rf = 0,37 (DCM/MeOH = 9/1) b Tổng hợp nguyên liệu ethyl 2-(6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat (IIIc)

Sơ đồ 3.11: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIIc

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIIa với 134,4 mg hợp chất IIc thu được 193,2 mg hợp chất IIIc

Rf = 0,62 (DCM/MeOH = 9/1) c Tổng hợp nguyên liệu 2-(7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVc)

Sơ đồ 3.12: Phản ứng tổng hợp hợp chất IVc

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IVa với 193,2 mg hợp chất IIIc thu được 163,1 mg hợp chất IVc

Rf = 0,25 (DCM/MeOH = 9/1) d Tổng hợp hợp chất (E)-N’-(2-hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(6-methyl-4- oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (Vc)

Sơ đồ 3.13: Phản ứng tổng hợp hợp chất Vc

Quy trình tương tự đối với tổng hợp hợp chất Va với 163,1 mg hợp chất IVc thu được 218,7 mg hợp chất Vc

3.1.1.4 Tổng hợp dẫn chất (E)-2-(6,7-Dimethoxy-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)- N’ -(2- hydroxy-4-methoxybenzyliden)acetohydrazid (Vd) a Tổng hợp nguyên liệu 6,7-dimethoxyquinazolin-4(3H)-on (IId)

Sơ đồ 3.14: Phản ứng tổng hợp hợp chất IId

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIa với 197 mg hợp chất Ib thu được 189,5 mg hợp chất IId

Rf = 0,41 (DCM/MeOH = 9/1) b Tổng hợp nguyên liệu ethyl 2-(6,7-dimethoxy-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat (IIId)

Sơ đồ 3.15: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIId

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIIa với 189,5 hợp chất IId thu được 244,5 mg hợp chất IIId

Rf = 0,65 (DCM/MeOH = 9/1) c Tổng hợp nguyên liệu 2-(6,7-dimethoxy-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVd)

Sơ đồ 3.16: Phản ứng tổng hợp hợp chất IVd

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IVa với 244,5 mg hợp chất IIId thu được 200,2 mg hợp chất IVd

Rf = 0,21 (DCM/MeOH = 9/1) d Tổng hợp hợp chất (E)-2-(6,7-Dimethoxy-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-N’-(2-hydroxy-4- methoxybenzyliden)acetohydrazid (Vd)

Sơ đồ 3.17: Phản ứng tổng hợp hợp chất Vd

Quy trình tương tự đối với tổng hợp hợp chất Va với 200,2 mg hợp chất IVd thu được 240,3 mg hợp chất Vd

3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất (E)-2-(7-Fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)- N’ -(2-hydroxy- 4-methoxybenzyliden)acetohydrazid (Ve) a Tổng hợp nguyên liệu 7-fluoroquinazolin-4(3H)-on (IIe)

Sơ đồ 3.18: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIe

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIa với 155 mg hợp chất Ie thu được 147,6 mg hợp chất IIe

Rf = 0,40 (DCM/MeOH = 9/1) b Tổng hợp nguyên liệu ethyl 2-(7-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat (IIIe)

Sơ đồ 3.19: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIIe

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIIa với 147,6 mg hợp chất

IIe thu được 209,3 mg hợp chất IIIe

Rf = 0,70 (DCM/MeOH = 9/1) c Tổng hợp nguyên liệu 2-(7-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVe)

Sơ đồ 3.20: Phản ứng tổng hợp hợp chất IVe

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IVa với 209,3 mg hợp chất IIIe thu được 161,97 mg hợp chất IVe

Rf = 0,23 (DCM/MeOH = 9/1) d Tổng hợp hợp chất (E)-2-(7-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-N’-(2-hydroxy-4- methoxybenzyliden)acetohydrazid (Ve)

Sơ đồ 3.21: Phản ứng tổng hợp hợp chất Ve

Quy trình tương tự đối với tổng hợp hợp chất Va với 161,97 mg hợp chất IVe thu được 236,2 mg hợp chất Ve

3.1.1.6 Tổng hợp dẫn chất (E)-2-(6-Fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)- N’ -(2-hydroxy- 4-methoxybenzyliden)acetohydrazid (Vf)

32 a Tổng hợp nguyên liệu 6-fluoroquinazolin-4(3H)-on (IIf)

Sơ đồ 3.22: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIf

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIa với 155 mg hợp chất If thu được 144,3 mg hợp chất IIf

Rf = 0,36 (DCM/MeOH = 9/1) b Tổng hợp nguyên liệu ethyl 2-(6-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat (IIIf)

Sơ đồ 3.23: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIIf

IIf thu được 200,2 mg hợp chất IIIf

Rf = 0,68 (DCM/MeOH = 9/1) c Tổng hợp nguyên liệu 2-(6-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVf)

Sơ đồ 3.24: Phản ứng tổng hợp hợp chất IVf

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IVa với 200,2 mg hợp chất IIIf thu được 155 mg hợp chất IVf

Rf = 0,27 (DCM/MeOH = 9/1) d Tổng hợp hợp chất (E)-2-(6-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-N’-(2-hydroxy-4- methoxybenzyliden)acetohydrazid (Vf)

Sơ đồ 3.25: Phản ứng tổng hợp hợp chất Vf

Quy trình tương tự đối với tổng hợp hợp chất Va với 155 mg hợp chất IVf thu được 230,8 mg hợp chất Vf

3.1.1.7 Tổng hợp dẫn chất (E)-2-(6-Chloro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)- N’ -(2-hydroxy- 4-methoxybenzyliden)acetohydrazid (Vg)

34 a Tổng hợp nguyên liệu 6-cloroquinazolin-4(3H)-on (IIg)

Sơ đồ 3.26: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIg

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIa với 171,5 mg hợp chất Ig thu được 160,6 mg hợp chất IIg

Rf = 0,43 (DCM/MeOH = 9/1) b Tổng hợp nguyên liệu ethyl 2-(6-cloro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat (IIIg)

Sơ đồ 3.27: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIIg

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIIa với 160,6 mg hợp chất thu được 201,6 mg hợp chất IIIg

Rf = 0,72 (DCM/MeOH = 9/1) c Tổng hợp nguyên liệu 2-(6-cloro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVf)

Sơ đồ 3.28: Phản ứng tổng hợp hợp chất IVg

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IVa với 201,6 mg hợp chất IIIg thu được 179,6 mg hợp chất IVg

Rf = 0,24 (DCM/MeOH = 9/1) d Tổng hợp hợp chất (E)-2-(6-cloro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-N’-(2-hydroxy-4- methoxybenzyliden)acetohydrazid (Vf)

Sơ đồ 3.29: Phản ứng tổng hợp hợp chất Vg

Quy trình tương tự đối với tổng hợp hợp chất Va với 179,6 mg hợp chất IVg thu được 262,8 mg hợp chất Vg

3.1.1.8 Tổng hợp dẫn chất (E)-2-(6-Bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)- N’ -(2-hydroxy- 4-methoxybenzyliden)acetohydrazid (Vh) a Tổng hợp nguyên liệu 6-bromoquinazolin-4(3H)-on (IIh)

Sơ đồ 3.30: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIh

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIa với 216 mg hợp chất Ih thu được 195,8 mg hợp chất IIh

Rf = 0.42 (DCM/MeOH = 9/1) b Tổng hợp nguyên liệu ethyl 2-(6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat (IIIh)

Sơ đồ 3.31: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIIh

IIh thu được 248,9 mg hợp chất IIIh

Rf = 0,69 (DCM/MeOH = 9/1) c Tổng hợp nguyên liệu 2-(6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVh)

Sơ đồ 3.32: Phản ứng tổng hợp hợp chất IVh

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IVa với 248,9 mg hợp chất IIIh thu được 211,6 mg hợp chất IVh

Rf = 0,23 (DCM/MeOH = 9/1) d Tổng hợp hợp chất (E)-2-(6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-N’-(2-hydroxy-4- methoxybenzyliden)acetohydrazid (Vh)

Sơ đồ 3.33: Phản ứng tổng hợp hợp chất Vh

Quy trình tương tự đối với tổng hợp hợp chất Va với 211,6 mg hợp chất IVh thu được 288,8 mg hợp chất Vh

3.1.1.9 Tổng hợp dẫn chất (E)- N’ -(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(6-nitro-4- oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (Vi) a Tổng hợp nguyên liệu 6-nitroquinazolin-4(3H)-on (IIi)

Sơ đồ 3.34: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIi

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIa với 182 mg hợp chất Ii thu được 162,4 mg hợp chất IIi

Rf = 0,42 (DCM/MeOH = 9/1) b Tổng hợp nguyên liệu ethyl 2-(6-nitro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat (IIIi)

Sơ đồ 3.35: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIIi

IIi thu được 209,6 mg hợp chất IIIi

Rf = 0,69 (DCM/MeOH = 9/1) c Tổng hợp nguyên liệu 2-(6-nitro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVi)

Sơ đồ 3.36: Phản ứng tổng hợp hợp chất IVi

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IVa với 209,6 mg hợp chất IIIi thu được 179,1 mg hợp chất IVi

Rf = 0,22 (DCM/MeOH = 9/1) d Tổng hợp hợp chất (E)-N’-(2-hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(6-nitro-4- oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (Vi)

Sơ đồ 3.37: Phản ứng tổng hợp hợp chất Vi

Quy trình tương tự đối với tổng hợp hợp chất Va với 179,1 mg hợp chất IVi thu được 246 mg hợp chất Vi

3.1.1.10 Tổng hợp dẫn chất (E)- N’ -(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(7-nitro-4- oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVj) a Tổng hợp nguyên liệu 7-nitroquinazolin-4(3H)-on (IIj)

Sơ đồ 3.38: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIj

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IIa với 182 mg hợp chất Ij thu được 164,3 mg hợp chất IIj

Rf = 0,42 (DCM/MeOH = 9/1) b Tổng hợp nguyên liệu ethyl 2-(7-nitro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetat (IIIj)

Sơ đồ 3.39: Phản ứng tổng hợp hợp chất IIIj

IIj thu được 212 mg hợp chất IIIj

Rf = 0,69 (DCM/MeOH = 9/1) c Tổng hợp nguyên liệu 2-(7-nitro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (IVj)

Sơ đồ 3.40: Phản ứng tổng hợp hợp chất IVj

Quy trình tương tự đối với tổng hợp nguyên liệu IVa với 212 mg hợp chất IIIj thu được 189,2 mg hợp chất IVj

Rf = 0,2 (DCM/MeOH = 9/1) d Tổng hợp hợp chất (E)-N’-(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-2-(7-nitro-4- oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid (Vj)

Sơ đồ 3.41: Phản ứng tổng hợp hợp chất Vj

Quy trình tương tự đối với tổng hợp hợp chất Va với 189,2 mg hợp chất IVj thu được 231,4 mg hợp chất Vj

Bảng 3.1: Hiệu suất toàn phần của các dẫn chất Va-j

Hợp chất R Hiệu suất toàn phần

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết các hợp chất tổng hợp được

Các hợp chất tổng hợp đã được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt độ nóng chảy Kết quả về hệ số Rf và nhiệt độ nóng chảy được trình bày trong bảng 3.2.

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản nhôm tráng sẵn của Merck, sử dụng dung môi DCM:MeOH với tỉ lệ 14:1 và được quan sát dưới đèn tử ngoại (UV) với bước sóng 254 nm Kết quả cho thấy vết thu được có hình tròn, rõ ràng và không có vết phụ nào.

- Đo nhiệt độ nóng chảy:

Các dẫn chất sau khi tinh chế đều ở trạng thái rắn, do đó nhiệt độ nóng chảy được xác định bằng máy đo độ nóng chảy nhiệt điện Kết quả đo cho thấy nhiệt độ nóng chảy của các hợp chất này rất ổn định, chỉ dao động trong khoảng hẹp từ 1°C đến 2°C.

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất tổng hợp được

Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất Va-j bao gồm phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) cùng với phổ carbon.

13 ( 13 C-NMR) Kết quả cụ thể được trình bày trong phần phân tích phổ và phần phụ lục

3.1.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các dẫn chất Va-j được dẫn ra trong bảng 3.3:

Hợp chất R Sắc kí lớp mỏng Nhiệt độ nóng chảy (°C)

Bảng 3.3: Kết quả phân tích phổ IR các hợp chất tổng hợp được

3.1.3.2 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS)

Kết quả phân tích phổ khối lượng của các dẫn chất Va-j được dẫn ra trong bảng 3.4:

Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ khối lượng các hợp chất tổng hợp được

Ghi chú: *: Phổ MS [M+H] + ; **: Phổ MS [M-H] - ; ◊ : HRMS [M-H] - ; $ : HRMS [M+H+CH3CN] +

3.1.3.3 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)

Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của các dẫn chất Va-j được trình bày trong bảng 3.5:

Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ proton các hợp chất tổng hợp được

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 11,99, 11,62 (42%, 58%) (s, 1H, OH); 10,26, 10,20 (s, 1H, CONH); 8,38, 8,29 (s, 1H, N=CH); 8,37 (s, 1H,

Hợp chất R CTPT Khối lượng phân tử m/z

(d, 1H, J = 7,5 Hz, H8); 7,67, 7,46 (d, 1H, J = 8,75 Hz, H6’); 7,59, 7,58 (d, 1H, J = 7,25 Hz, H6); 6,53, 6,52 (dd, J = 8,5, 2,5 Hz, 1H, H5′); 6,482, 6,477 (d, J = 2,5 Hz, 1H, H3’); 5,20, 4,79 (57%, 43%) (s, 2H, NCH2CO); 3,77 (s, 3H, OCH3).

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 11,99, 11,62 (43%, 57%) (s, 1H, OH); 11,27, 10,21 (43%, 57%) (s, 1H, CONH); 8,37, 8,28 (s, 1H, N=CH); 8,34, 8,33 (d, J = 1,5 Hz, 1H, H2); 8,05, 8,04 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H5); 7,67, 7,47 (d, J = 8,25 Hz, 1H, H6’); 7,54, 7,53 (s, 1H, H8); 7,40 (d, J = 8,0 Hz, 1H,

H6); 6,52, 6,51 (dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H5′); 6,481, 6,477 (s, 1H, H3’); 5,17, 4,78 (57%, 43%) (s, 2H, NCH2CO); 3,77 (d, J = 3,0 Hz, 3H, OCH3); 2,49 (s, 3H,

OH); 11,26, 10,19 (42%, 58%) (s, 1H, CONH); 8,37, 8,28 (s, 1H, N = CH); 8,31, 8,30 (s, 1H, H2); 7,96 (s, 1H, H5); 7,70 (d, 1H, H7); 7,67, 7,46 (d, J = 8,75 Hz, 1H, H6’); 7,64, 7,62 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H8); 6,53, 6,51 (dd,

J = 8,75, 2,25 Hz, 1H, H5′); 6,478 (s, 1H, H3’); 5,17, 4,78 (58%, 42%) (s, 2H, NCH2CO); 3,76 (s, 3H, OCH3); 2,47 (s, 3H, CH3)

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 11,97, 11,60 (45%, 55%) (s, 1H, OH); 11,28, 10,19 (45%, 55%) (s, 1H, CONH); 8,37, 8,28 (s, 1H, N = CH); 8,27, 8,25 (s, 1H, H2); 7,67, 7,46 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H6′); 7,47 (s, 1H, H5); 7,20 (s, 1H, H8); 6,52 (s, 1H, H5′); 6,48 (s, 1H, H3’); 5,16, 4,77 (55%, 45%) (s, 2H, NCH2CO); 3,94, 3,89, 3,77 (s, 9H, OCH3)

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 11,97, 11,63 (40%, 60%) (s, 1H, OH); 11,24, 10,19 (40%, 60%) (s, 1H, CONH); 8,88, 8,43 (s, 1H, H2); 8,37, 8,29 (s, 1H, N = CH); 8,23 (s, 1H, H8); 7,67, 7,46 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H6′); 7,55–7,53 (m, 2H, H5, H6); 6,53 – 6,50 (m, 1H, H5′); 6,48 (s, 1H, H3’); 5,18, 4,79 (60%, 40%) (s, 2H, NCH2CO); 3,77 (s, 3H, OCH3)

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 11,96, 11,62 (40%, 60%) (s, 1H, OH); 11,24, 10,18 (40%, 60%) (s, 1H, CONH); 8,38 (s, 1H, H2); 8,37, 8,29 (s, 1H, N=CH); 7,85–7,76 (m, 3H, H5, H7, H8); 7,67, 7,46 (60%, 40%)

(d, J = 9,0 Hz, 1H, H6′); 6,53, 6,52 (dd, J = 8,5, 2,5 Hz, 1H, H5′); 6,48, 6,47 (d, J = 2,0 Hz , 1H, H3’); 5,19, 4,80 (60%, 40%) (s, 2H, NCH2CO); 3,77 (s, 3H, OCH3)

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 8,43, 8,41 (s, 1H, H2); 8,37, 8,29 (s, N = CH); 8,113, 8,107 (s, 1H, H5); 7,93–7,90 (m, 1H, H7); 7,79–7,76 (m, 1H, H8); 7,67, 7,46 (60%, 40%) (d, J = 8,5 Hz, H6′); 6,52, 6,51 (dd, J = 8,5, 2,5 Hz, 1H, H5′); 6,48 (s, 1H, H3’); 5,20, 4,81 (60%, 40%) (s, NCH2CO); 3,77 (s, 3H, OCH3)

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 11,98, 11,65 (40%, 60%) (s, 1H, OH); 11,24, 10,20 (40%, 60%) (s, 1H, CONH); 8,43, 8,42 (s, 1H, H2); 8,36, 8,28 (s, 1H, N=CH); 8,25 – 8,24 (m, 1H, H5); 8,03 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H7); 7,71–7,66 (m, 1H, H8); 7,46 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H6′); 6,52, 6,51 (dd, J = 9,0, 2,25 Hz, 1H, H5′); 6,48, 6,47 (s, 1H, H3’); 5,19, 4,80 (~60%, 40%) (s, 2H, NCH2CO); 3,77 (s, 3H, OCH3)

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 11,98, 11,65 (40%, 60%) (s, 1H, OH); 11,19, 10,18 (40%, 60%) (s, 1H, CONH); 8,54, 8,53 (s, 1H, H2); 8,44– 8,43 (m, 1H, H5); 8,38, 8,37 (d, J = 8,0 Hz, H7); 8,35, 8,29 (s, 1H, N=CH); 8,28 (d, J = 8,0 Hz, H8); 7,65, 7,44 (60%, 40%) (d, J = 8,5 Hz, 1H, H6′); 6,50, 6,49 (dd, J = 8,0, 2,0 Hz; 1H, H5′); 6,451, 6,446 (s, 1H, H3’); 5,21, 4,82 (60%, 40%) (s, 2H, NCH2CO); 3,74 (s, 3H, OCH3)

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 11,98, 11,60 (40%, 60%)(s, 1H, OH); 11,12, 10,11 (40%, 60%) (s, 1H, CONH); 8,78–8,76 (m, 1H, H2); 8,53–8,50 (m, 2H, H6, H8); 8,28, 8,20 (s, 1H, N=CH); 7,86, 7,85 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H5); 7,59, 7,37 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H6′); 6,43, 6,42 (dd,

Ghi chú: δ: độ chuyển dịch hóa học (ppm); s: vạch đơn; d: vạch đôi; t: vạch ba; m: vạch đa

3.1.3.4 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon -13

Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 của các dẫn chất Va-j được trình bày ở trong bảng 3.6:

Bảng 3.6: Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C

Thử hoạt tính sinh học

3.2.1 Thử tác dụng độc tính trên tế bào ung thư

Các dẫn chất Va-j đã được thử nghiệm tác dụng độc tính trên ba dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm tế bào ung thư đại tràng SW620, tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3, và tế bào ung thư phổi không phải tế bào nhỏ NCI-H23 Chất chứng PAC-1 được sử dụng cùng với 5-FU là chất đối chiếu dương tính Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng 3.7.

Bảng 3.7: Kết quả thử độc tính tế bào

Chất R MW logP 1 Độc tính (IC 50 2 M)/Dòng tế bào 3

1 Tính toán bằng phần mềm ChemDraw 9.00

2 Nồng độ của chất (àM) ức chế 50 % sự phỏt triển của tế bào, dữ liệu là kết quả trung bình của 3 lần thử nghiệm với độ lệch không quá 10 %;

3 Dòng tế bào: SW620: tế bào ung thư đại tràng, PC3: tế bào ung thư tiền liệt tuyến, NCI-H23: tế bào ung thư phổi không phải tế bào nhỏ ở người; 5-FU: 5-Fluorouracil: chất đối chiếu dương tính

Thông qua việc thử nghiệm độc tính trên một số tế bào ung thư, một số hợp chất đã thể hiện tiềm năng và cần được đánh giá khả năng kích hoạt caspase 3 Kết quả được thể hiện trong biểu đồ 3.1 dưới đây.

Biểu đồ 3.1: Kết quả thử hoạt hóa caspase-3 của một số hợp chất tổng hợp được

Hợp chất Vb Vc Ve Vf Vg Vh Vi PAC-1

Khả năng hoạt hóa caspase 3 (%) 121,8 161,6 33,8 101,5 23,2 121,9 43,7 100

Ghi chú: Được so sánh với chất chứng PAC-1

Bàn luận

Quá trình tổng hợp các dẫn chất Va-j yêu cầu thực hiện nhiều phản ứng khác nhau Do các chất trung gian có chứa các nhóm chức kém bền, việc kiểm soát điều kiện phản ứng là rất quan trọng để ngăn ngừa sự hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn.

3.3.1.1 Phản ứng ngưng tụ tổng hợp các dẫn chất của 4 -oxoquinazolin IIa-j

Sơ đồ 3.42: Cơ chế phản ứng đề xuất phản ứng tạo thành II

Phản ứng bắt đầu khi ái nhân tấn công liên kết đôi C=O của formamid, dẫn đến sự loại bỏ một phân tử nước và hình thành hợp chất I’ Giả thuyết này được củng cố bởi việc phát hiện sản phẩm phụ trên bản mỏng sillicagel, dễ dàng loại bỏ khi phân tán trong NaHCO3 để tinh chế sản phẩm Hợp chất I’ tiếp tục loại bỏ một phân tử nước thứ hai, tạo ra các dẫn xuất của quinazolin II.

Trong phản ứng này, formamid không chỉ là dung môi mà còn là tác nhân phản ứng Chất ban đầu I có độ tan rất thấp trong formamid ở nhiệt độ phòng, nhưng khả năng hòa tan tăng lên khi được gia nhiệt Do đó, cần bổ sung dư lượng formamid (10 đương lượng) để cải thiện khả năng hòa tan của chất I.

3.3.1.2 Phản ứng alkyl hóa tổng hợp các ester IIIa-j

Sơ đồ 3.43: Cơ chế phản ứng đề xuất phản ứng tạo thành III

Quá trình chuyển hóa hợp chất II thành hợp chất III diễn ra thông qua phản ứng Finkelstein, nhằm làm yếu liên kết C-Cl Phản ứng này tận dụng độ tan của KI lớn hơn KCl để đạt được hiệu quả tối ưu.

Phản ứng trong dung môi aceton cho thấy cân bằng nghiêng về phía sản phẩm theo nguyên lý Le Chatelier Liên kết C-I yếu hơn C-Cl, tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng thế ái nhân SN2 tại carbon tứ diện Phản ứng này được xác định là N-alkyl hóa, với độ dịch chuyển hóa học trên phổ 13-C của carbon bên cạnh nhóm C=O ester nằm trong khoảng 45 – 55 ppm; nếu là O-alkyl hóa, giá trị này sẽ nằm trong khoảng 70 ppm Để tối ưu hóa phản ứng, cần sử dụng dung môi aceton với tỉ lệ 20:1 nhằm phân tán chất rắn tốt hơn, do hợp chất II có độ tan thấp trong aceton.

3.3.1.3 Phản ứng hydrazid hóa tổng hợp các acylhydrazid IVa-j

Sơ đồ 3.44: Cơ chế phản ứng đề xuất phản ứng tạo thành IV

Phản ứng bắt đầu khi hydrazin tấn công liên kết đôi C=O của ester hợp chất III, tạo ra trung gian carbon tứ diện Trung gian này sau đó loại bỏ một phân tử ethanol để hình thành hợp chất IV Tuy nhiên, do hydrazin có hai nitơ với khả năng ái nhân, phản ứng có thể xảy ra hai lần, dẫn đến sản phẩm phụ Để giảm thiểu phản ứng không mong muốn, hydrazin monohydrat được sử dụng với 5 đương lượng và quá trình lọc rửa bằng ethanol giúp loại bỏ sản phẩm phụ Hợp chất IV, là acylhydrazin, kém bền với nhiệt và có thể phân hủy thành khí nitơ, vì vậy cần sấy tủa thu được ở tủ sấy chân không tại nhiệt độ phòng.

Hình 3.1: Công thức cấu tạo của sản phẩm phụ có thể được tạo thành

3.3.1.4 Phản ứng ngưng tụ tổng hợp các acylhydraz on Va-j

Sơ đồ 3.45: Cơ chế phản ứng đề xuất phản ứng tạo thành V

Phản ứng bắt đầu khi cặp electron tấn công ái nhân vào nguyên tử nitơ của hợp chất IV, làm phá vỡ liên kết đôi C=O của benzaldehyd Quá trình này dẫn đến việc hình thành hợp chất trung gian carbon tứ diện Sau khi loại bỏ một phân tử nước, sản phẩm cuối cùng là hợp chất V.

3.3.2 Kh ẳng đị nh c ấ u tr ú c

Cấu trúc của các chất tổng hợp được xác định thông qua các phương pháp phân tích như phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon-13 (NMR).

Phổ IR chỉ ra sự có mặt của một số nhóm chức và liên kết thông qua các dải hấp phụ đặc trưng:

Phổ đồ IR cho thấy rõ dải đỉnh khoảng 3226 cm -1 của dao động hóa trị liên kết O-H, thấp hơn so với dải dao động thông thường từ 3500 đến 3200 cm -1 Nguyên nhân có thể là do liên kết hydro giữa O-H và nhóm C=N gần kề.

- Hầu hết phổ đồ đều thể hiện dải đỉnh của dao động hóa trị liên kết N-H (trừ Va và Vj) dao động trong khoảng 3161 – 3181 cm -1

Dao động của các liên kết O-H và N-H có thể biến mất trong một số phổ đồ, điều này có thể do quá trình đo bằng phương pháp dập viên với KBr, dẫn đến sự trao đổi cation giữa ion H+ và ion K+.

- Các đỉnh từ 2837 – 3034 cm -1 đặc trưng cho các dao động hóa trị của liên kết H-

Ccp2 và liên kết H-Csp3.

- Các đỉnh của dao động hóa trị liên kết C=O trong miền 1691 – 1722 cm -1

- Các đỉnh của dao động hóa trị liên kết C=N trong miền 1645 – 1670 cm -1

- Các đỉnh của dao động hóa trị và dao động uốn cong của liên kết C=N trong miền

3.3.2.2 Ph ổ kh ối lượ ng (MS)

Phổ khối lượng độ phân giải cao (HRMS) cung cấp công thức phân tử chính xác cho các hợp chất Kết quả từ phổ HRMS, được trình bày trong bảng 3.5, cho thấy các dẫn chất tổng hợp phù hợp với công thức phân tử dự kiến.

Kết quả phổ HRMS (365,1232) trong hình 3.2 cho thấy rằng công thức phân tử C19H18O4N4 (khối lượng chính xác M-H: 365,1250) là phù hợp nhất với hợp chất Vb.

Hình 3.2: Phổ HRMS của hợp chất Vb

Hình 3.3: Phổ MS âm của hợp chất Vg

Mặc dù một số hợp chất chỉ được phân tích bằng phép đo khối lượng (MS), nhưng phương pháp này không thể xác định công thức chính xác của phân tử Phân tích các mảnh m/z có thể cung cấp thông tin bổ sung, như minh họa trong phổ MS âm của hợp chất Vg (hình 3.3) Đỉnh m/z 384.8 có thể được kết luận là một mảnh phân tử quan trọng.

Hợp chất Vg có 57 đỉnh phân mảnh với cường độ yếu đến rất yếu Ngoài ra, tỉ lệ của hai đồng vị 35Cl/37Cl được quan sát phù hợp với tỉ lệ tự nhiên của chúng.

3.3.2.3.Ph ổ c ộng hưở ng t ừ h ạ t nhân proton ( 1 H-NMR)

Nhìn chung, phổ đồ NMR của các chất tổng hợp được có một số đặc điểm sau:

- Các đỉnh của proton linh động thường nằm trong khoảng 10 – 12 ppm, đỉnh của

OH nằm ở trường thấp hơn so với đỉnh của CONH do độ âm điện của O lớn hơn kéo theo việc làm giảm mật độ điện tích nằm trên hydro

Các proton trong nhân thơm của benzaldehyd nằm trong vùng 6,5 – 9 ppm, với xu hướng cao hơn so với proton trong nhân quinazolin Điều này có thể được giải thích bởi lực hút điện tử mạnh từ các dị tố trong nhân.

Hình 3.4: Sự có mặt của hai cấu dạng trên phổ đồ dẫn chất Vi

Định dạng
Số trang	124
Dung lượng	4,91 MB