TỔNG QUAN
MỐI LIÊN QUAN GIỮA IDO1 VÀ BỆNH UNG THƯ
1.1.1 Indoleamin-2,3-dioxygenase và con đường kynurenin
Indoleamin-2,3-dioxygenase (IDO) là một enzym nội bào có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát quá trình giáng hóa tryptophan thông qua con đường kynurenin Enzym này được mã hóa bởi gen IDO, nằm trên nhiễm sắc thể số 8.
Cơ thể động vật không thể tự tổng hợp tryptophan và hoàn toàn phụ thuộc vào thực phẩm để có được dưỡng chất này Các phân tử tryptophan sau khi được hấp thu sẽ tham gia vào quá trình tổng hợp protein trong các tế bào hoặc chuyển hóa thành serotonin.
[11, 44] Ngoài ra, một phần lớn tryptophan bị giáng hóa thông qua con đường kynurenin (hình 1.1) [11]
Bước đầu tiên trong quá trình giáng hóa tryptophan theo con đường kynurenin là sự tạo thành N-formylkynurenin, đây là bước kiểm soát quan trọng trong quá trình này Hai enzym chính tham gia vào quá trình này là tryptophan-2,3-dioxygenase (TDO) và indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) TDO chỉ có mặt trong tế bào gan của con người và chỉ chuyển hóa L-tryptophan, trong khi IDO có thể chuyển hóa cả D và L-tryptophan và phân bố ở động vật cũng như nấm IDO bao gồm hai loại enzym là IDO1 và IDO2, trong đó IDO2 có hoạt tính thấp hơn nhiều so với IDO1, chỉ khoảng 3-5% và chủ yếu được biểu hiện trong tế bào đuôi gai.
Trong cơ thể, IDO1 xuất hiện ở nhiều loại tế bào và cơ quan, đặc biệt là trong hệ bạch huyết ngoại vi, bao gồm tế bào nội mô, tế bào trình diện kháng nguyên (APC), nguyên bào sợi, đại thực bào, tế bào đuôi gai (DC) và cả tế bào ung thư Nghiên cứu cho thấy có sự chênh lệch đáng kể trong biểu hiện của IDO1.
Tỉ lệ kynurenin/tryptophan gần đây đã được xem như một chỉ số quan trọng trong việc dự đoán tiên lượng và tiến triển của ung thư, so sánh giữa các mô ung thư và mô khỏe mạnh.
Các tế bào ung thư có kháng nguyên bề mặt khác biệt so với tế bào bình thường, giúp hệ miễn dịch nhận diện và kích hoạt phản ứng miễn dịch Đồng thời, các khối u cũng phản ứng lại với hệ miễn dịch của cơ thể.
IDO1 ban đầu được cho là có tác dụng chống ung thư, nhưng ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy nó có thể thúc đẩy sự phát triển của ung thư IDO1 được sản xuất bởi các tế bào trình diện kháng nguyên, làm cạn kiệt tryptophan trong tế bào ung thư và ức chế sự phát triển của chúng Tuy nhiên, khoảng một thập kỷ trước, các nghiên cứu chỉ ra rằng IDO1 được biểu hiện quá mức ở 50% các khối u và có sự khác biệt giữa các loại ung thư Đặc biệt, trong ung thư cổ tử cung, sự phiên mã mARN và biểu hiện của IDO1 cao hơn nhiều so với cổ tử cung bình thường và các loại ung thư khác IDO1 có liên quan đến quá trình thay đổi đáp ứng miễn dịch, một trong những yếu tố gây ra ung thư.
Hình 1.2 Sự phát triển ung thư bởi quá trình thay đổi đáp ứng miễn dịch
Hệ miễn dịch trong giai đoạn đầu của quá trình thay đổi đáp ứng miễn dịch có khả năng loại bỏ hoàn toàn các tế bào bị đột biến, từ đó ngăn chặn nguy cơ ung thư.
Trong giai đoạn này, tế bào NK và tế bào T sản xuất các cytokine như IFN-γ, kích hoạt tế bào DC để sinh ra IDO1 với nồng độ thấp IDO1, thông qua con đường kynurenin, làm cạn kiệt tryptophan ở tế bào ung thư, từ đó ức chế sự phát triển của chúng.
Giai đoạn phát triển của tế bào ung thư bao gồm sự cân bằng giữa số lượng tế bào ác tính được sinh ra và bị tiêu diệt Mặc dù tế bào ung thư vẫn bị kiểm soát, nhưng chúng dần tích lũy các đột biến, dẫn đến việc mất khả năng sinh miễn dịch Cuối cùng, một số tế bào ung thư có thể thoát khỏi hệ thống miễn dịch, hiện tượng này được gọi là dung nạp miễn dịch Ở giai đoạn này, IDO1 được biểu hiện rõ, chủ yếu từ các tế bào ung thư và các tế bào miễn dịch khác như tế bào DC, tế bào ức chế có nguồn gốc dòng tủy (MDSC), và đại thực bào liên quan đến khối u (TAM).
Tăng cường biểu hiện của IDO1 và sự tích tụ kynurenin có thể ức chế hoạt động của tế bào diệt tự nhiên (NK) và tế bào T, đồng thời thúc đẩy sự biệt hóa thành các tế bào T điều hòa, biến đổi tế bào DC thành tế bào hỗ trợ dung nạp miễn dịch và kích hoạt các tế bào ức chế có nguồn gốc dòng tủy (MDSC).
IDO1 gây ra sự kiệt quệ tryptophan ở tế bào T, dẫn đến ức chế tăng trưởng và bắt giữ tế bào ở pha G1, đồng thời kích thích quá trình apoptosis Trong khi đó, các tế bào T CD4+ chưa trưởng thành được biệt hóa thành tế bào T điều hòa.
Tỉ lệ cao các tế bào T điều hòa đã được phát hiện trong các khối u, hạch bạch huyết và máu của bệnh nhân ung thư có tiên lượng xấu.
Nghiên cứu về ức chế in vivo của IDO1 đối với tế bào NK vẫn còn hạn chế, nhưng các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng L-kynurenin có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào NK in vitro bằng cách ngăn chặn sản sinh IL-2.
Tế bào MDSC được kích hoạt tương tự như tế bào T điều hòa, có vai trò ức chế đáp ứng miễn dịch của tế bào T đối với khối u, và đã được chứng minh liên quan đến ung thư, bao gồm việc thúc đẩy sự phát triển và di căn Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng IDO góp phần vào sự tích lũy của các tế bào MDSC, dẫn đến tình trạng dung nạp miễn dịch.
CẤU TRÚC CỦA IDO1 VÀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ IDO1
Tính đến năm 2019, đã có 35 cấu trúc tinh thể phức hợp của IDO1 được ghi nhận, bao gồm các cơ chất, chất gắn và các chất ức chế khác nhau.
Năm 2006, Sugimoto và các cộng sự lần đầu tiên công bố cấu trúc của IDO1 thông qua phức hợp giữa IDO1 và 4-phenylimidazol (PI), đánh dấu bước tiến quan trọng trong nghiên cứu về IDO1.
Cấu trúc bậc 1 của IDO bao gồm 403 acid amin, trong khi cấu trúc bậc 3 của IDO1 được hình thành từ hai vùng khác biệt: một vùng lớn và một vùng nhỏ Vùng lớn chứa 13 chuỗi xoắn α và 2 chuỗi xoắn 310, trong đó chuỗi xoắn Q tạo liên kết phối trí với nguyên tử sắt của nhân hem qua vòng imidazol của His346 Trung tâm hoạt động của enzym nằm trong vùng lớn, chủ yếu được cấu thành từ 4 chuỗi xoắn G, I, Q và S, với hai “pocket” kỵ nước.
Vùng A nằm trên nhân hem và vùng B bên cạnh, trong khi các chuỗi xoắn K-L và N tương tác với nhân hem và kết nối hai vùng của protein Vùng nhỏ của protein, được hình thành bởi 5 chuỗi xoắn α và 3 chuỗi xoắn 310, bao phủ phía trên hai "pocket" Một cầu nối từ các acid amin 250-267 kết nối hai vùng này Vùng nhỏ của IDO1 chủ yếu có chức năng cấu trúc, không tham gia vào quá trình xúc tác chuyển hóa tryptophan.
Hình 1.4 Cấu trúc của phức hợp IDO1 và PI
1.2.2 Cấu trúc chung các chất ức chế IDO1
Nghiên cứu của Sugimoto năm 2006 chỉ ra rằng nguyên tử nitơ trong vòng imidazol của phân tử PI phối trí với nguyên tử sắt trong nhân hem ở trung tâm hoạt động, trong khi vòng phenyl nằm sâu bên trong "pocket" A phía trên nhân hem Dựa vào các acid amin cấu thành pocket A, có thể hình thành các liên kết hydro tại trung tâm hoạt động, bao gồm Cys129-SH, Ser167-OH, Gly262-CO và Ala264.
NH và nhóm 7-propionat của nhân hem Thông qua thí nghiệm làm đột biến các acid
Sugimoto đã đưa ra giả thuyết rằng hai acid amin Phe226 và Arg231 có vai trò quan trọng trong khả năng xúc tác chuyển hóa tryptophan của IDO1 Nghiên cứu của Tojo vào năm 2014 về cấu trúc tinh thể của phức hợp IDO1 với Amg-1 cho thấy hợp chất này không chỉ chiếm "pocket" A mà còn chiếm cả vào các vùng khác của IDO1.
“pocket” B (hình 1.5b) Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các chất có thể gắn vào cả hai
“Pocket” cho hoạt tính ức chế IDO1 hiệu quả hơn so với các chất chỉ gắn vào “pocket” A Khám phá của Tojo về tương tác π-π và tương tác tĩnh điện với các nhóm thế tại Phe226 và Arg231, nằm ở “pocket” B, đã củng cố giả thuyết của Sugimoto.
Hình 1.5 (a) Cấu trúc tinh thể phức hợp IDO1 và PI; (b) Cấu trúc tinh thể phức hợp
IDO1 và Amg-1; (c) Cấu trúc của PI và Amg-1
Dựa trên nghiên cứu docking giữa IDO1 và các chất ức chế khác nhau, Rửhrig đã phát triển một mô hình cấu trúc lý tưởng cho các chất ức chế IDO1 Mô hình này cần đáp ứng các đặc điểm quan trọng để tối ưu hóa hiệu quả ức chế enzyme IDO1.
Hình 1.6 Mô hình cấu trúc các chất ức chế IDO1
- Một nhân thơm với ít nhất 2 vòng để chiếm vào vị trí “pocket” A
- Một nguyên tử với cặp electron tự do (ví dụ như oxy, nitơ, lưu huỳnh) có thể tạo liên kết phối trí với nguyên tử Fe của nhân hem
- Một vòng thơm chiếm vào vị trí “pocket” B với các nhóm thế có thể tạo tương tác Van de Waals với Phe226 và Arg231
- Các nhóm thế khác trong phân tử tạo liên kết hydro với Cys129, Ser167, Gly262, Ala264 và 7-propionat của nhân hem.
MỘT SỐ CHẤT ỨC CHẾ IDO1 ĐÃ ĐƯỢC NGHIÊN CỨU
1.3.1 Hoạt tính ức chế IDO1 của một số nhóm chất
Trong thập kỷ qua, IDO đã trở thành một mục tiêu triển vọng trong điều trị ung thư thông qua cơ chế điều chỉnh hệ miễn dịch Nhiều hợp chất có cấu trúc đa dạng đã được đưa vào các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng.
1.3.1.1 Các dẫn chất mang khung indol
Hình 1.7 Công thức một số chất ức chế IDO1 mang khung indol
Vào năm 1967, L-tryptophan ở nồng độ cao được phát hiện có khả năng ức chế hoạt động của IDO1, trong khi D-tryptophan gần như không có tác dụng Kể từ đó, các chất ức chế IDO1 có cấu trúc indol, đặc biệt là 1-methyltryptophan (1-MT) với hằng số ức chế (Ki) là 34 nM, đã được nghiên cứu nhiều L-1-MT cho thấy hoạt tính ức chế IDO1 mạnh hơn D-1-MT Mặc dù D-1-methyltryptophan hay indoximod không phải là chất ức chế tối ưu của IDO1, nhưng nó vẫn có hoạt tính kháng ung thư qua các cơ chế khác Nghiên cứu của Richard Metz chỉ ra rằng indoximod ở nồng độ khoảng 70 nM có khả năng phục hồi sự ức chế mTOR ở tế bào T do thiếu hụt tryptophan Indoximod đã được thử nghiệm lâm sàng cho nhiều loại ung thư và phối hợp với các thuốc chống ung thư khác.
Hợp chất mới (2) được phát hiện gần đây là một chất ức chế chọn lọc IDO1 với giá trị IC50 là 0,15 àM, cho thấy tiềm năng cao trong việc nghiên cứu các dẫn chất indol, trong đó có những hợp chất có giá trị IC50 đạt 7 àM.
1.3.1.1 Các dẫn chất mang khung imidazol
Sau khi khám phá cấu trúc tinh thể của IDO1 và PI, PI được xác nhận là một chất ức chế IDO1 yếu với IC50 = 48 àM Các nhà khoa học đã dựa vào cấu trúc của PI để thiết kế các chất ức chế IDO1 có khung imidazol Dẫn chất imidazolisoindol (3), hay navoximod, cho thấy hoạt tính ức chế IDO1 với IC50 = 75 nM và tác dụng chọn lọc trên IDO1 gấp 20 lần so với TDO Nhiều dẫn chất imidazol khác cũng được phát hiện với hoạt tính tốt, có IC50 trong khoảng 6 – 8 àM Dẫn chất imidazolthiazol kết hợp với cầu nối carbamid (4) đạt giá trị IC50 là 77 nM, trong khi hợp chất (5) dựa trên cấu trúc của navoximod có IC50 là 38 nM.
Hình 1.8 Công thức một số chất ức chế IDO1 mang khung imidazol
Tập đoàn Incyte (Mỹ) đã tiến hành nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính và phát hiện ra rằng các dẫn xuất N-hydroxyamidin là những chất ức chế IDO1 tiềm năng.
Hình 1.9 Công thức một số chất ức chế IDO1 thuộc nhóm N-hydroxyamidin
Hợp chất (6) có giá trị IC50 là 67 nM khi thử nghiệm trên IDO1, đã khởi đầu cho một loạt N-hydroxyamidin mới Hợp chất này giảm sự hình thành kynurenin trong huyết tương hơn 50%, nhưng có sinh khả dụng đường uống rất hạn chế Nghiên cứu tối ưu hóa sau đó đã dẫn đến sự phát triển của hợp chất (7).
Epacadostat, còn được biết đến với tên gọi 10, là chất ức chế IDO1 tiến xa nhất trong các thử nghiệm lâm sàng Hợp chất này có khả năng ức chế chọn lọc IDO1 với IC50 đạt 73 nM, và có tính chọn lọc cao hơn 1000 lần đối với IDO1 so với IDO2 và TDO.
1.3.2 Hoạt tính ức chế IDO1 của các chất mang khung indazol
Các dẫn chất indazol hiếm gặp trong tự nhiên, nhưng các hợp chất tổng hợp mang khung cấu trúc này lại có nhiều tác dụng dược lý đa dạng, bao gồm chống viêm, chống loạn nhịp, kháng nấm, kháng khối u, kháng khuẩn và kháng HIV.
Năm 2016, Wang và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất mới mang khung 1H-indazol tại vị trí 4 và 6, đồng thời thử nghiệm hoạt tính ức chế IDO1 ở ba nồng độ khác nhau Kết quả cho thấy hợp chất (8) có hoạt tính ức chế IDO1 tốt nhất với giá trị IC50 là 5.3 µM Qua nghiên cứu docking và mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các dẫn chất, Wang đã rút ra kết luận quan trọng.
- Khung indazol nằm ở “pocket” A tương tác trực tiếp với nhân hem cần thiết cho hoạt tính
- Nguyên tử brom ở vị trí số 6 làm tăng hoạt tính do tạo tương tác kỵ nước với Tyr126, Phe164, Leu234
Cầu nối 4-amin giữa khung indazol và vòng benzen mang lại hoạt tính vượt trội hơn so với cầu nối 4-ether nhờ vào sự hình thành liên kết hydro với nhóm propionat của nhân hem Tuy nhiên, khi cầu nối này được kéo dài thêm một nhóm CH2, hoạt tính sẽ giảm sút.
- Vòng benzen nằm ở pocket B tạo ra tương tác π - π với Phe226 và nhóm thế para-hydroxy tạo tương tác tĩnh điện với Arg231 làm tăng hoạt tính
Hình 1.10 Các chất ức chế IDO1 mang khung indazol
Một năm sau, Manna và các cộng sự đã tổng hợp thành công các dẫn chất 1H-indazol mới có nhóm thế tại vị trí số 3 với cầu nối carbohydrazid Trong số đó, hai hợp chất (9) và (10) thể hiện hoạt tính ức chế IDO1 nổi bật nhất, với giá trị IC50 lần lượt là 720 nM và 770 nM.
Năm 2020, nhóm nghiên cứu do PGS TS Trần Phương Thảo và Ths Ngô Xuân Hoàng tại Đại học Dược Hà Nội đã tổng hợp thành công một loạt các dẫn chất mang khung 6.
11 aminoindazol trong đó có một số hợp chất có khả năng ức chế IDO1 và cả kháng tế bào ung thư (hình 1.11) [10]
Hình 1.11 Các chất ức chế IDO1 mang khung 6-aminoindazol
MỘT SỐ PHẢN ỨNG LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT
Phản ứng tạo amid giữa acid carboxylic và amin thường yêu cầu chuyển đổi acid carboxylic thành các dẫn xuất có hoạt tính hóa học mạnh hơn, như acyl halogenid, anhydrid acid, ester hoạt động hoặc acyl imidazol.
Sơ đồ 1.1 Quá trình tạo amid từ acid carboxylic 1.4.1.1 Phản ứng tạo amid từ acyl halogenid
Các halogen thường dễ dàng rời khỏi phản ứng cộng ái nhân giữa acyl halogenid và amin, làm tăng khả năng tạo amid Trong số các acyl halogenid, acyl clorid là loại phổ biến nhất Tác nhân thường được sử dụng để chuyển đổi acid carboxylic thành acyl clorid là SOCl2, nhờ vào tính bay hơi dễ dàng và khả năng loại bỏ dư lượng qua chưng cất, cùng với chi phí thấp Cơ chế hình thành acyl clorid từ SOCl2 sẽ được trình bày chi tiết trong bài viết.
Sơ đồ 1.2 Cơ chế tạo acyl clorid từ acid carboxylic bằng SOCl 2
Trong quá trình tạo acyl clorid, như được thể hiện trong sơ đồ 1.2, có sự hình thành một lượng acid hydrocloric Acid này có khả năng phản ứng với amin được thêm vào, dẫn đến việc giảm hiệu suất hình thành amid Để khắc phục tình trạng này, có thể sử dụng một lượng tương ứng các base hữu cơ như DMAP.
Để trung hòa lượng HCl tạo thành trong phản ứng amid hóa acid benzoic với diethylamin sử dụng SOCl2, cần thêm Et3N và DIPEA Nghiên cứu cho thấy hiệu suất phản ứng giảm từ 86% xuống 31% khi không có Et3N Phản ứng tạo amid diễn ra qua hai giai đoạn: đầu tiên là tạo acyl clorid từ acid carboxylic, sau đó acyl clorid phản ứng với amin để tạo amid Tuy nhiên, có thể thực hiện quá trình này theo phương pháp tổng hợp one-pot.
Phản ứng amid hóa one-pot với SOCl2 và TEA trong DCM mang lại nhiều ưu điểm, bao gồm quy trình thực hiện đơn giản, điều kiện phản ứng ở nhiệt độ phòng và thời gian ngắn Phương pháp này cho phép nâng quy mô dễ dàng và đạt hiệu suất cao khi sử dụng amin bậc 2 hoặc bậc 3 mà không cần tinh chế thêm Đặc biệt, phản ứng này không làm thay đổi cấu hình của các trung tâm lập thể trong phân tử chất tham gia.
[14] Từ những ưu điểm trên, khoá luận đã sử dụng phản ứng amid hoá one-pot bằng SOCl2
Một phương pháp khác để tạo acyl clorid đi từ oxalyl clorid có mặt xúc tác DMF
Cơ chế được trình bày như sau:
Sơ đồ 1.4 Cơ chế tạo acyl clorid với (COCl) 2 có mặt DMF
Oxalyl clorid là một tác nhân clo hóa hiệu quả cho acid carboxylic, thường được sử dụng trong tổng hợp acyl clorid với quy mô nhỏ Mặc dù oxalyl clorid có giá thành cao hơn, nhưng nó vẫn được ưa chuộng trong các phản ứng hóa học nhờ vào tính chất đặc biệt của nó.
Thionyl clorid, khi kết hợp với DMF, có thể xúc tác tạo ra acyl clorid tương tự như oxalyl clorid Tuy nhiên, việc sử dụng DMF ở quy mô lớn không được khuyến khích do sản phẩm trung gian dimethylcarbamoyl clorid có khả năng gây ung thư và tạo ra khí độc như CO.
1.4.1.2 Phản ứng tạo amid với các acyl imidazol
Acyl imidazol có khả năng phản ứng kém hơn acyl clorid, nhưng chúng lại có lợi thế về giá thành rẻ, không sinh ra HCl và giảm thiểu các phản ứng phụ Cơ chế hình thành acyl imidazol được mô tả như sau:
Sơ đồ 1.5 Cơ chế tạo acyl imidazol từ acid carboxylic bằng CDI
Phương pháp này áp dụng cho các acid no, thơm, acid dị vòng, cũng như các acid khó tạo acyl clorid như acid formic và vitamin A Sản phẩm acyl imidazol dễ xử lý, có thể thu được dưới dạng kết tinh hoặc thực hiện phản ứng one-pot Quá trình tạo acyl imidazol diễn ra khi khuấy trộn các acid carboxylic với CDI trong khoảng 1 giờ.
Trong quá trình phản ứng và bảo quản, CDI thường được sử dụng với lượng dư do tính nhạy cảm với ẩm và khả năng thủy phân cao Tuy nhiên, việc sử dụng CDI dư thừa có thể gây ra phản ứng không mong muốn giữa amin và CDI, dẫn đến sự hình thành sản phẩm ure khó tách loại.
Sơ đồ 1.6 Sự tạo thành sản phẩm phụ khi sử dụng CDI
Woodman và các cộng sự đã nâng cao phản ứng amid hóa bằng acyl imidazol thông qua việc bổ sung xúc tác imidazol hydroclorid, cung cấp proton hiệu quả Sự hiện diện của xúc tác này dẫn đến việc hình thành imidazolium, tạo ra nhóm đi ra tốt hơn so với imidazol.
14 làm giảm thời gian phản ứng đi đáng kể Cơ chế của xúc tác acid trong nghiên cứu trên được trình bày như sau [40]:
Sơ đồ 1.7 Cơ chế của sự xúc tác acid khi sử dụng CDI
1.4.2 Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm
1.4.2.1 Một số phương pháp khử nhóm nitro thơm
Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm là một quá trình chuyển hóa quan trọng giúp tạo ra nhóm amino trong phân tử, được ứng dụng rộng rãi trong tổng hợp dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm và các hóa chất khác Dưới đây là một số tác nhân khử hóa nhóm nitro thường gặp, trong đó có hydro hóa.
Hydro hóa là một phản ứng phổ biến để khử nhóm nitro, được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp Để tăng cường khả năng phản ứng, quá trình hydro hóa thường cần sự hỗ trợ của các chất xúc tác Các chất xúc tác này có thể là đồng thể, như FeSO4.7H2O kết hợp với EDTANa2, hoặc dị thể, bao gồm một số kim loại, oxyd kim loại hoặc sulfid.
Nhược điểm lớn nhất của quá trình hydro hóa và các phản ứng khử là tính không chọn lọc khi trong phân tử có các nhóm chức khác có thể bị khử, như nhóm halogen, benzyl và liên kết không no Để giảm thiểu các phản ứng không mong muốn, việc sử dụng các xúc tác phù hợp hoặc điều chỉnh các điều kiện phản ứng là cần thiết Dưới đây là một số ví dụ về khả năng khử chọn lọc nhóm nitro thơm trong các hợp chất có các trung tâm bị khử khác.
Sơ đồ 1.8 Khử hóa chọn lọc nhóm nitrothơm bằng hydro hóa b Khử hóa bằng kim loại
Các kim loại như Al, Fe, Zn, và Sn thường được sử dụng làm nguồn cung cấp electron, kết hợp với các nguồn cung cấp proton như nước, axit axetic (AcOH) và axit clohidric (HCl).
NH4Cl, …) Ví dụ về ứng dụng của phản ứng khử nhóm nitro bằng kim loại như sau [24]:
Sơ đồ 1.9 Khử hóa chọn lọc nhóm nitro thơm bằng kim loại c Khử hóa bằng các nguồn sinh hydro khác
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
Các dung môi và hóa chất sử dụng trong tổng hợp và tinh chế các chất mục tiêu trong nghiên cứu này chủ yếu đến từ các hãng Merck (Đức), AKSci (Mỹ) và Trung Quốc Những hóa chất này được áp dụng trực tiếp mà không cần tinh chế thêm, và thông tin chi tiết được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
TT Tên nguyên liệu Nguồn gốc - Xuất xứ
12 Thionyl clorid (SOCl2) Trung Quốc
22 Bản mỏng silicagel 60 F254 Merck - Đức
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn một cổ dung tích 50 mL, bình cầu đáy tròn
1 cổ dung tích 100 ml, sinh hàn, bình tam giác 250 mL, cốc thủy tinh, phễu lọc, phễu lọc Buchner, bình chiết, ống đong, pipet pasteur
- Cân kĩ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản)
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức)
- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)
- Máy cất quay Buchi R-210 (Thụy Sĩ)
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254
- Đèn tử ngoại với hai bước sóng 254 nm và 365 nm
- Bình khai triển sắc ký
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Smp3 (Mỹ)
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 MHz, sử dụng Tetramethylsilan (TMS) làm chất chuẩn nội, được trang bị tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Máy đo phổ khối lượng Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) - Viện Hóa Sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Máy đo phổ hồng ngoại FTIR Affinity (Nhật Bản) tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tổng hợp 5 dẫn chất propanamid thơm mang khung 6-amino-1H-indazol gồm: + 3-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-phenylpropanamid (Va)
+ 3-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(2-clorophenyl)propanamid (Vb)
+ 3-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(4-bromophenyl)propanamid (Vc)
+ 3-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(4-methoxyphenyl)propanamid (Vd)
+ 3-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(2,4-dimethoxyphenyl)propanamid (Ve)
- Kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp được
- Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được
2.2.2 Thử tác dụng ức chế IDO1
Các dẫn chất mục tiêu sau khi tổng hợp, tinh chế và xác định cấu trúc đã được thử nghiệm khả năng ức chế IDO1 ở nồng độ 1,0 µM, so sánh với chất chứng dương IDO5L bằng bộ kit chuyên dụng của BioVision.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa trên nguyên tắc cơ bản của hóa học hữu cơ, chúng tôi đã tổng hợp thành công các dẫn chất có cấu trúc như dự kiến Các phản ứng được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm nhiều phương pháp khác nhau nhằm đạt được kết quả tối ưu.
+ Phản ứng N-alkyl hóa với tác nhân alkyl hóa là một alkyl halogenid có mặt xúc tác K2CO3 và KI
+ Phản ứng thủy phân ester trong môi trường kiềm trong dung môi MeOH + Phản ứng acid hóa muối natri của acid hữu cơ bằng dung dịch HCl 5%
+ Phản ứng tạo amid giữa một acid carboxylic và các anilin với tác nhân là thionyl clorid trong dung môi DCM có mặt triethylamin
+ Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm với tác nhân SnCl2.2H2O
- Các phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng
Hỗn hợp sau phản ứng được tinh chế thông qua các kỹ thuật phù hợp với từng giai đoạn, bao gồm chiết phân bố lỏng-lỏng và sắc ký cột.
2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết
Để đảm bảo độ tinh khiết của sản phẩm ở từng giai đoạn, cần thực hiện kiểm tra bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, bao gồm thời điểm dừng phản ứng và sau khi tinh chế Bên cạnh đó, việc đo nhiệt độ nóng chảy cũng là một chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng sản phẩm.
+ Pha tĩnh: bản mỏng silicagel 60 F254 được hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút + Pha động: hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1 và 2:1
- Nhiệt độ nóng chảy: xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy MPA (Mỹ)
2.3.1.3 Khẳng định cấu trúc các hợp chất tổng hợp được
Các chất sau khi tổng hợp và tinh chế sẽ được đánh giá độ tinh khiết và xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR).
2.3.2 Thử tác dụng ức chế IDO1
Sau khi tổng hợp, tinh chế và khẳng định cấu trúc, các dẫn chất mục tiêu được thử hoạt tính ức chế IDO1 với nồng độ 1 µM, so sánh với chất chứng dương IDO5L bằng kit thử của hãng BioVision Quá trình thử nghiệm được thực hiện tại khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.
2.3.2.1 Nguyên tắc thử Đánh giá tác dụng ức chế IDO1 của chất thử và chất chứng dương thông qua xác định lượng sản phẩm N-formylkynurenin tạo thành Khác với các phương pháp thử thông thường dựa trên độ hấp thụ UV, nhóm nghiên cứu sử dụng kit thử hiện đại hơn bằng cách sử dụng một tác nhân tạo huỳnh quang phản ứng chọn lọc với N- formylkynurenin Phản ứng tạo thành một hợp chất phát huỳnh quang khác khi được kích thích bởi bước sóng khả kiến (Ex/Em = 402/488 nm) Phương pháp này đảm bảo thu được kết quả có tín hiệu mạnh và ít nhiễu do không sử dụng các bức xạ có bước sóng ngắn, hạn chế sự hấp thụ của các hợp chất khác trong quá trình thử.
2.3.2.2 Chuẩn bị tác nhân và bảo quản:
- Dung dịch đệm: bảo quản ở 4 o C, tránh ánh sáng Để rã đông ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng
- Dung dịch chống oxy hóa (nồng độ 100 μM): hòa tan chất chống oxy hóa trong 110 μl dung dịch đệm và bảo quản ở -80 o C, tránh ánh sáng
- Cơ chất IDO1 (L-Tryptophan): hòa tan với 110 μl dung dịch đệm để thu được dung dịch có nồng độ 10 mM
- Chất ức chế IDO1 (IDO5L): hòa tan với 55 μl DMSO để thu được dung dịch nồng độ
- Dung dịch tác nhân huỳnh quang hóa: điều chỉnh đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng Đậy nắp và bảo quản ở 4°C sau khi sử dụng
- IDO1 tái tổ hợp ở người: không mở ra đến khi sử dụng, hòa tan với 1,1 ml dung dịch đệm và bảo quản ở -80 o C, sử dụng trong vòng 2 tháng
2.3.2.3 Cách tiến hành và tính kết quả a Chuẩn bị dung dịch chất thử gốc:
Đối với mỗi chất thử, cần pha loãng vào dung môi thích hợp, thường là DMSO, đảm bảo nồng độ cuối của DMSO không vượt quá 0,5% Sau đó, tiếp tục pha loãng bằng dung dịch đệm để tạo ra dung dịch có nồng độ 10 àM.
- Chuẩn bị hỗn hợp trước khi thử: pha loãng dung dịch chống oxy hóa với dung dịch đệm ở trên theo tỉ lệ 1:50
- Pha các mẫu vào các giếng thử theo bảng sau:
Bảng 2.2 Cách pha các dung dịch thử sinh học
Trắng (dung môi) Chất thử Nền Chất chứng dương
Hỗn hợp trước khi thử 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl
Dung dịch chất thử (10 àM) - 10 μl - -
Để tiến hành thí nghiệm, chuẩn bị dung dịch đệm với các thể tích 30 μl, 20 μl, 40 μl và 20 μl, sau đó để yên các giếng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng nhằm cho các chất ức chế tương tác với IDO1 Trong thời gian chờ, pha dung dịch cơ chất IDO1 bằng cách thêm 100 μl dung dịch tryptophan 10 mM vào 900 μl dung dịch đệm Tiếp theo, thêm 10 μl dung dịch này vào mỗi giếng để đạt tổng thể tích 100 μl cho mỗi giếng Cuối cùng, để yên các giếng thử ở 37°C trong 45 phút tại nơi tối để thực hiện đo lường.
Mỗi giếng được thêm 50 μl chất huỳnh quang hóa, sau đó đậy kín và để ở 45°C trong 3 giờ trong môi trường tối Sau khi hoàn tất thời gian ủ, các giếng được làm nguội tự nhiên đến nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 giờ Cuối cùng, cường độ huỳnh quang của các giếng được đo với bước sóng kích thích và phát xạ là 402/488 nm để tính toán kết quả.
Mỗi giếng, kết quả được tính bằng công thức sau:
Trong nghiên cứu này, F đại diện cho cường độ phát huỳnh quang đã loại bỏ nền Giá trị FSC và FTC lần lượt là giá trị của mẫu trắng (dung môi) và mẫu chất thử hoặc chất chứng dương (IDO5L) Dựa trên các giá trị này, chúng tôi tính toán phần trăm ức chế IDO1 của chất thử so với chất chứng dương.
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
HÓA HỌC
Quá trình tổng hợp các chất Va-e trong khóa luận được trình bày theo quy trình chung như sau:
Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung 3.1.1.1 Tổng hợp ethyl 3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)propanoat (II)
Hợp chất trung gian ethyl 3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl) propanoat (II) được tổng hợp bằng cách N-alkyl hóa 6-nitro-1H-indazol (I) với ethyl 3-bromopropanoat.
Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II
- Hòa tan hoàn toàn 650 mg 6-nitro-1H-indazol (4 mmol) vào bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml trong khoảng 30 ml aceton
- Thêm tiếp vào hỗn hợp khoảng 550 mg K2CO3 (4 mmol), sau đó đun hồi lưu hỗn hợp trên ở 60°C trong vòng 3 giờ, thu được hỗn hợp có màu cam đậm
- Sau thời gian trên, thêm 3 đương lượng ethyl 3-bromopropanoat (1,5 ml) vào bình phản ứng, cùng với một lượng nhỏ KI (khoảng 100 mg)
- Tiếp tục đun hồi lưu phản ứng ở 60°C trong vòng 6 giờ, thu được khối phản ứng màu vàng tươi
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:n-hexan tỉ lệ 1:2
- Sau khi phản ứng xảy ra hoàn toàn, toàn bộ khối phản ứng được cô quay dưới áp suất giảm để loại dung môi
- Cắn thu được đem hòa tan bằng 25 ml DCM và đem chiết với 25 ml nước cất Chiết 3 lần, mỗi lần 25 ml DCM
- Gộp các pha dung môi hữu cơ và làm khan bằng Na2SO4 khan
- Cô quay loại dung môi dưới áp suất giảm
- Tinh chế tách riêng 2 đồng phân N1 và N2 alkyl hóa bằng sắc ký cột với hệ pha động EA:n-hexan tỉ lệ 1:10
Cô đã thực hiện quá trình alkyl hóa bằng cách quay loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được hai sản phẩm riêng biệt có màu vàng tươi với tỉ lệ khoảng 1:1 Sản phẩm N1 alkyl hóa được sử dụng cho phản ứng tiếp theo, trong khi sản phẩm N2 alkyl hóa được giữ lại để phục vụ cho các nghiên cứu khác.
- Cảm quan: Chất rắn màu vàng tươi
- Rf = 0,7 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:2)
3.1.1.2 Tổng hợp acid 3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)propanoic (III)
Hợp chất trung gian acid 3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)propanoat (III) được tổng hợp từ hợp chất trung gian II qua hai giai đoạn: đầu tiên là thủy phân ester trong môi trường kiềm bằng NaOH trong dung môi MeOH, sau đó là quá trình acid hóa bằng dung dịch acid hydrochloric 5%.
Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất III
- Phân tán 400 mg ethyl 3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)propanoat (II) (1,5 mmol) trong một lượng khoảng 20 ml methanol trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml
- Cân 120 mg (2 đương lượng) NaOH rắn trong lọ thủy tinh, thêm một lượng tối thiểu nước để hòa tan hết NaOH
- Thêm dung dịch NaOH đặc vừa pha vào bình phản ứng, khuấy trên bếp từ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 giờ thu được hỗn hợp có màu vàng, đục
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:n-hexan = 1:1
- Sau khi phản ứng kết thúc, khối phản ứng được loại dung môi bằng cách cô quay dưới áp suất giảm
Để thực hiện quá trình làm lạnh bình chứa cắn sau khi cô quay, hãy nhỏ từ từ dung dịch HCl 5% vào khối cắn Đồng thời, lắc đều và theo dõi pH bằng giấy chỉ thị cho đến khi đạt được giá trị pH khoảng 3.
- Kết tủa tạo thành được lọc bằng giấy lọc và rửa tủa với nước cất lạnh
- Sấy tủa thu được bằng tủ sấy tĩnh ở nhiệt độ 60 o C ta thu được hợp chất III
- Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt
- Rf = 0,3 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 14:1)
3.1.1.3 Tổng hợp các chất 3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)-N-phenylpropanamid (IVa-e)
Các dẫn chất trung gian amid IVa-e được tổng hợp từ dẫn chất trung gian (III) acid 2-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)propanoic thông qua phản ứng amid hóa với các anilin khác nhau Phản ứng này diễn ra trong dung môi DCM với sự có mặt của thionyl clorid và triethylamin, như được thể hiện trong sơ đồ dưới đây.
Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp của các chất IVa-e a Tổng hợp chất 3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)-N-phenylpropanamid (IVa)
Hợp chất trung gian IVa được tổng hợp từ chất trung gian III thông qua phản ứng với anilin, sử dụng SOCl2 và TEA trong dung môi DCM, như được thể hiện trong sơ đồ dưới đây.
Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất IVa
- Trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml, cân khoảng 120 mg (0,51 mmol) hợp chất (III) vào bình
- Thờm vào bỡnh cầu 55 àl (0,6 mmol) anilin vào bỡnh phản ứng
- Thêm tiếp vào bình phản ứng khoảng 20 ml DCM, lắc đều
Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, đầu tiên, cho 213 àl (1,53 mmol) triethylamin vào bình và lắc đều Tiếp theo, nhỏ từ từ 111 àl (1,53 mmol) thionyl clorid (SOCl2) vào bình, khuấy đều trên máy khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ.
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:n-hexan = 1:1
- Hỗn hợp sau phản ứng được chiết với dung dịch HCl 5% (3 lần x 15 ml dung dịch HCl 5%), thu lấy pha dung môi hữu cơ
- Pha dung môi hữu cơ được chiết tiếp với dung dịch NaHCO3 bão hòa (3 lần x 15 ml dung dịch NaHCO3 bão hòa
- Thu lấy pha hữu cơ và làm khan bằng Na2SO4 khan
- Cô quay loại dung môi dưới áp suất giảm
- Sấy khô cắn trong tủ sấy chân không ở 40 o C thu được chất trung gian IVa
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,60 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1) b Tổng hợp chất N-(2-clorophenyl)-3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)propanamid (IVb)
Hợp chất trung gian IVb được tổng hợp từ hợp chất trung gian III thông qua phản ứng với 2-cloroanilin và SOCl2, có sự hiện diện của TEA trong dung môi DCM.
Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp chất IVb
❖ Tiến hành và xử lý phản ứng: Phản ứng được tiến hành và xử lý tương tự chất IVa, thay thế tác nhân anilin bằng 76,5 mg 2-cloroanilin (0,6 mmol)
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,62 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1) c Tổng hợp chất N-(4-bromophenyl)-3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)propanamid (IVc)
Hợp chất trung gian IVc được tạo ra từ hợp chất trung gian III thông qua phản ứng với 4-bromoanilin và SOCl2, có sự hiện diện của TEA trong dung môi DCM.
Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp chất IVc
❖ Tiến hành và xử lý phản ứng: Phản ứng được tiến hành và xử lý tương tự chất IVa, thay thế tác nhân anilin bằng 103 mg 4-bromoanilin (0,60 mmol)
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,64 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1) d Tổng hợp chất N-(4-methoxyphenyl)-3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)propanamid (IVd)
Hợp chất trung gian IVd được tổng hợp từ chất trung gian III thông qua phản ứng với 4-methoxylanilin và SOCl2, có sự hiện diện của TEA trong dung môi DCM.
Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp chất IVd
❖ Tiến hành và xử lý phản ứng: Phản ứng được tiến hành và xử lý tương tự chất IVa, thay thế tác nhân anilin bằng 74 mg 4-methoxyanilin (0,60 mmol)
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,58 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1) e Tổng hợp chất N-(2,4-dimethoxyphenyl)-3-(6-nitro-1H-indazol-1-yl)propanamid (IVe)
Hợp chất trung gian IVe được tổng hợp từ hợp chất trung gian III thông qua phản ứng với 2,4-dimethoxyanilin và SOCl2, có sự hiện diện của TEA trong dung môi DCM.
Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp chất IVe
❖ Tiến hành và xử lý phản ứng: Phản ứng được tiến hành và xử lý tương tự chất IVa, thay thế tác nhân anilin bằng 92 mg 2,4-dimethoxylanilin (0,60 mmol)
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,60 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)
3.1.1.4 Tổng hợp các chất 3-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-phenylpropanamid (Va-e)
Các hợp chất propanamid thơm có cấu trúc 6-amino-1H-indazol Va-e được tổng hợp từ các hợp chất IVa-e thông qua phản ứng khử nhóm nitro trong môi trường ethanol acid (EA) sử dụng SnCl2.2H2O làm tác nhân và HCl làm xúc tác Phản ứng này thể hiện quy trình tổng hợp hiệu quả các hợp chất mong muốn.
Sơ đồ 3.10 Quy trình tổng hợp của các chất Va-e a Tổng hợp chất 3-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-phenylpropanamid (Va)
Chất Va được tổng hợp từ chất trung gian IVa thông qua phản ứng khử nhóm nitro thơm bằng SnCl2.2H2O, với HCl làm xúc tác trong môi trường EA.
Sơ đồ 3.11 Quy trình tổng hợp chất Va
- Cân 100 mg (0,32 mmol) chất IVa vào bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml
- Thêm vào bình cầu (303 mg - 5 đương lượng) SnCl2.2H2O và một lượng khoảng 10ml ethyl acetat
- Thêm vài giọt dung dịch HCl đặc, lắc đều và để phản ứng xảy ra trên máy khuấy từ trong vòng 8 giờ
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:n-hexan = 1:1
- Sau khi phản ứng hoàn toàn, thêm từ từ dung dịch Na2CO3 đậm đặc vào bình phản ứng đến pH = 10 - 11 để tủa hoàn toàn các muối thiếc clorid
Toàn bộ hỗn hợp trong bình phản ứng được lọc qua phễu lọc Buchner với celite làm chất trợ lọc Sau đó, tủa được rửa bằng EA (3 lần x 15 ml) và thu được dịch lọc.
Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn để thu được pha dung môi hữu cơ Sau đó, làm khan pha hữu cơ bằng Na2SO4 khan và cô quay dung dịch dưới áp suất giảm.
- Sản phẩm thô thu được sau khi cô quay được tinh chế bằng cách sử dụng cột sắc ký lỏng với hệ pha động EA:n-hexan = 40:60
- Cô quay dưới áp suất giảm dịch chạy sắc ký và sấy khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ phòng ta thu được chất Va.
- Cảm quan: chất rắn màu trắng hơi hồng
- Rf = 0,29 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)
- Khẳng định cấu trúc bằng phổ MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở phần phụ lục b Tổng hợp chất 3-(6-amino-1H-indazol-1-yl)-N-(2-clorophenyl)propanamid (Vb)
THỬ TÁC DỤNG ỨC CHẾ IDO1
Kết quả phân tích phổ xác nhận rằng các dẫn chất tổng hợp có cấu trúc đúng như dự kiến Dựa trên điều này, các dẫn chất này được áp dụng để thử nghiệm tác dụng ức chế IDO1.
Các dẫn chất Va-e đã cho thấy khả năng ức chế enzyme IDO1 ở nồng độ 1,0 μmol, với chất đối chứng dương là IDO5L Kết quả ức chế IDO1 được thể hiện bằng phần trăm và được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7 Kết quả thử tác dụng ức chế IDO1 của các dẫn chất Va-e
Chất R % ức chế IDO1 tại nồng độ 1,0 μM
Ở nồng độ 1,0 µM, các chất được khảo sát cho thấy khả năng ức chế IDO1 từ 35% đến 82% Trong số đó, chất Ve có hoạt tính ức chế thấp nhất.
Vc có hoạt tính cao nhất.
BÀN LUẬN
Các dẫn chất Va-e được tổng hợp thông qua các phản ứng như N-alkyl hóa, thủy phân ester, amid hóa và khử hóa nhóm nitro thơm Để đạt được hiệu suất cao nhất, quy trình cho từng phản ứng cần được tối ưu hóa Sản phẩm cuối là amin thơm nhạy cảm với điều kiện môi trường trong quá trình phản ứng, xử lý, tinh chế và bảo quản Do đó, việc kiểm soát chặt chẽ các yếu tố trong quá trình phản ứng là rất quan trọng để nâng cao hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm.
Cơ chế phản ứng được trình bày như sau:
Sơ đồ 3.16 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất II
Cặp electron tự do trên nguyên tử nitơ ở vị trí số 1 có tính ái nhân yếu do liên hợp tạo thành vòng thơm, khiến nó khó tham gia phản ứng thế ái nhân với tác nhân alkyl hóa như alkyl halogenid Tuy nhiên, nguyên tử hydro liên kết với nitơ tại vị trí này có tính acid yếu, cho phép tách ra trong dung dịch và tạo ra một lượng nhỏ anion có tính ái nhân mạnh hơn Để chuyển dịch cân bằng của quá trình này, có thể thêm K2CO3 vào bình phản ứng để trung hòa H+ tách ra.
Phản ứng xảy ra theo cơ chế thế ái nhân SN Cụ thể, phản ứng xảy ra theo hướng
Phản ứng SN2 có ưu thế hơn so với SN1 nhờ việc sử dụng alkyl halogenid bậc 1, tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng thế và tránh hình thành carbocation bậc 1 không ổn định Để tăng tốc độ phản ứng, việc thêm một lượng nhỏ KI giúp tạo ra dẫn xuất alkyl iodid, mạnh hơn so với alkyl bromid trong khả năng alkyl hóa.
Sự cộng hưởng trong vòng thơm indazol cho phép alkyl hóa xảy ra tại một trong hai nguyên tử N của vòng này Tỉ lệ của hai đồng phân phụ thuộc vào các điều kiện của phản ứng.
Hình 3.1 Sự cộng hưởng xảy ra ở khung indazol
Khảo sát cho thấy, khi thực hiện phản ứng alkyl hóa trong DMF hoặc aceton, tỉ lệ giữa hai sản phẩm N1 và N2 khoảng 5:5 đến 7:3, trong khi trong dioxan tỉ lệ giảm xuống còn 4:6 Đương lượng ethyl bromopropionat cần thêm vào khoảng 2-3 eq, và cần có dư tác nhân alkyl hóa do ethyl bromopropionat dễ bay hơi, dẫn đến hao hụt trong quá trình đun hồi lưu ở nhiệt độ cao Cần chú ý thao tác và xử lý phản ứng vì ethyl 3-bromopropionat là chất kích ứng mắt mạnh Phương pháp sắc ký cột là cách đơn giản và cần thiết để tách riêng hai đồng phân khỏi hỗn hợp, với kết quả phổ 2 chiều cho thấy đồng phân N1 alkyl hóa có Rf lớn hơn.
3.3.1.2 Phản ứng thủy phân ester
Chất III được tạo thành từ chất II thông qua 2 phản ứng: 1) thủy phân ester trong môi trường kiềm; 2) acid hóa muối natri bằng dung dịch HCl tạo acid hữu cơ Phản ứng thủy phân ester trong môi trường kiềm là phản ứng một chiều, có thể xảy ra hoàn toàn trong vòng 1 giờ trong điều kiện êm dịu Cơ chế của phản ứng thủy phân ester trong môi trường kiềm bước đầu xảy ra theo cơ chế cộng ái nhân (AN) Cơ chế của giai đoạn trên được trình bày như sau:
Sơ đồ 3.17 Cơ chế của phản ứng tổng hợp chất III
Tăng tốc độ phản ứng thủy phân ester có thể thực hiện bằng cách nâng nhiệt độ lên 40-45°C Trong môi trường kiềm, sản phẩm thu được là muối acid hữu cơ, do đó không xảy ra phản ứng nghịch tạo ester như trong môi trường acid Dung môi sử dụng là MeOH hoặc EtOH, giúp hòa tan ester và NaOH, đồng thời dễ loại bỏ qua quá trình cô quay dưới áp suất giảm Sau khi loại dung môi, acid được tạo thành bằng cách acid hóa muối natri bằng dung dịch HCl 5%, với acid có mạch 3 carbon gắn với khung indazol sẽ kết tủa trong nước Cần thêm HCl cho đến khi pH đạt 2-3, tránh thêm dư thừa vì nguyên tử N trong vòng indazol có tính base yếu có thể tạo muối trong môi trường acid, làm giảm hiệu suất Acid kết tủa chỉ cần lọc rửa bằng nước để loại bỏ các chất tan khác.
3.3.1.3 Phản ứng amid hóa Đây là phản ứng amid hóa giữa một acid carboxylic và các anilin Để phản ứng xảy ra dễ dàng, acid được chuyển thành một dẫn xuất acid carboxylic hoạt động hơn là halogenid acid cụ thể hơn là clorid acid Clorid acid hình thành là tác nhân phản ứng mạnh, ngay lập tức phản ứng với anilin tạo ra sản phẩm Tác nhân tạo clorid acid được sử dụng là SOCl2 Cơ chế tạo acyl được trình bày theo như sơ đồ sơ đồ 1.2 Các dẫn chất anilin sẽ phản ứng với acyl clorid tạo thành các amid tương ứng (sơ đồ 3.18)
Sơ đồ 3.18 Cơ chế tổng hợp các dẫn chất IVa-e
Thay thế nhóm -OH của acid carboxylic bằng nhóm Cl- làm tăng khả năng phản ứng do nhóm Cl- dễ dàng rời khỏi Phản ứng này diễn ra với hiệu suất cao, dễ xử lý và tinh chế Thionyl clorid là một tác nhân phổ biến và rẻ để tạo clorid acid từ acid carboxylic, nhưng nó là chất lỏng dễ bay hơi và có mùi khó chịu Ngoài ra, phản ứng còn sinh ra một lượng nhỏ khí SO2 và HCl, vì vậy cần thao tác với thionyl clorid trong tủ hút.
40 để tăng hiệu suất tạo clorid acid, nhóm nghiên cứu đã tiến đun hồi lưu acid II trong SOCl2
SOCl2 được sử dụng làm dung môi ở 80°C trong 6 giờ, nhưng việc sử dụng lượng lớn SOCl2 (vài ml) gây phức tạp do tính bay hơi và thời gian xử lý lâu ảnh hưởng đến độ ổn định của clorid acid Điều này dẫn đến phản ứng không hoàn toàn với nhiều chất tham gia dư thừa Để khắc phục, nhóm nghiên cứu đã áp dụng phương pháp tổng hợp one-pot, thực hiện phản ứng trong điều kiện êm dịu với lượng SOCl2 thấp (khoảng 100 µl) và đạt hiệu suất cao hơn SOCl2 nhạy ẩm, vì vậy các chất tham gia phải khan nước hoàn toàn, và acid III thu được sau phản ứng thủy phân cần được sấy khô trước khi sử dụng Phản ứng tạo ra một lượng nhỏ HCl, có thể phản ứng với anilin để hình thành các dẫn xuất muối amoni clorid; do đó, một lượng vừa đủ TEA được thêm vào để trung hòa HCl tạo thành.
Nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm sử dụng tác nhân tạo amid EDC/HOBt bên cạnh thionyl clorid Mặc dù hiệu suất của EDC/HOBt tương đương, nhưng phương pháp này gặp phải nhiều tạp chất, chi phí cao và thời gian phản ứng kéo dài.
3.3.1.4 Phản ứng khử nhóm nitro thơm
Sử dụng tác nhân khử SnCl2/HCl là phương pháp khử nhẹ nhàng cho nhóm nitro, tuy nhiên quá trình này có thể tạo ra nhiều sản phẩm trung gian và không hoàn toàn chuyển đổi nitro thành amin, dẫn đến sự xuất hiện của các tạp chất Để loại bỏ các tạp chất này, cần thực hiện tinh chế bằng sắc ký lỏng Ngoài ra, quá trình phản ứng không sử dụng dung môi alcol nhằm tránh hình thành tạp chất alkoxy Cuối cùng, hỗn hợp phản ứng được kiềm hóa đến pH = 10 để tối ưu hóa kết quả.
Để chuyển các amin từ dạng muối sang dạng base tan trong ethyl acetat, cần thực hiện 11 bước Sản phẩm cuối cùng thu được là một amin thơm có tính khử, dễ bị oxy hóa, do đó cần kiểm soát nhiệt độ trong quá trình xử lý và tinh chế Ngoài ra, lượng acid hydrochloric đặc thêm vào cũng cần được kiểm soát để giảm thiểu quá trình thủy phân liên kết amid trong môi trường acid.
Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp đã được xác định rõ ràng thông qua các phương pháp phân tích phổ, bao gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR và phổ khối lượng.
MS và phổ hồng ngoại IR
Dựa vào kết quả quang phổ hồng ngoại (IR), chúng ta có thể xác định sơ bộ sự hiện diện của các nhóm chức quan trọng trong các phân tử đã tổng hợp, bao gồm nhóm amin thơm (NH2) và amid (CO-NH) (xem phụ lục 16 đến 20).
