TỔNG QUAN
Tổng quan về cây riềng ấm
Cây riềng ấm (Alpinia zerumbet) là một loại cây được sử dụng rộng rãi mọc ở vùng nhiệt đới (Yob và CS, 2011) [13], đại diện cho một loài thuộc nhóm
Alpinia (Ghosh H và cs, 2013) [14] Alpinia là chi lớn nhất thuộc họ
Zingiberaceae, được phân loại bởi Charles Plumier, và được đặt theo tên của
Prospero Alpino là một nhà thực vật học nổi tiếng người Ý sống vào thế kỷ XVI Cây mà ông nghiên cứu có chiều cao tương đối lớn, trung bình từ 2-3 mét, với rễ to và mập Lá cây có phiến lớn, dài khoảng 25 cm.
Cây có chiều cao 70cm, với chiều rộng từ 6-10cm và cuống dài 2-5mm Mép lá cao 1,2cm, tạo thành chùm hoa lớn với màu sắc trắng và hồng Cụm hoa ở ngọn rũ xuống dài từ 20-40cm, trục hoa phủ đầy lông; lá bắc cong, dài 20-30mm, tạo thành bao trắng với chóp hồng Đài hoa cao 2cm, cánh hoa tạo nên vẻ đẹp thu hút.
2,5cm, môi dài 3,5cm, vàng có sọc đỏ; nhị dài khoảng 25mm; bầu vàng, đầy lông Quả to, đường kính 2cm, đỏ, có lông Hoa tháng 3-4, quả tháng 7-10 [5]
Phân loại thực vật học của cây riềng ấm:
Tên khoa học: Alpinia Zerumbet (Pers)
Cây riềng ấm Hoa riềng ấm Quả riềng ấm
Cây Riềng ấm, thuộc chi Alpinia, mang lại nhiều lợi ích sức khỏe như kháng khuẩn, chống ký sinh trùng, diệt côn trùng, và chống ung thư Ngoài ra, chúng còn có tác dụng chống đông máu, chống viêm, giảm đau, chống dị ứng, bảo vệ thần kinh và chống oxy hóa (Ghosh H và cs, 2013) [14] Một số loại cây trong chi Alpinia cũng hỗ trợ điều trị viêm xương khớp và lão hóa (Altman, 2011) [15].
Cây riềng ấm Alpinia zerumbet được nghiên cứu với nhiều đặc tính hứa hẹn, bao gồm khả năng chống ung thư dạ dày (Hadizadeh và cs, 2014) và tiểu đường (Rajasekar và cs, 2014) Cây này chứa nhiều thành phần hoạt tính sinh học cao như kavain (kavalactone), acid chlorogenic, acid ferulic, quercetin, epicatechin, catechin và kaempferol, góp phần vào tiềm năng ứng dụng trong y học.
Trên thế giới cây riềng ấm (Alpinia zerumbet) được xem là một loài thảo dược quý, được người dân ở một số nước như Nhật Bản, Trung Quốc, Indonesia,
Philippines được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh tim mạch, hỗ trợ chữa lành vết loét và ngăn ngừa nhiễm khuẩn (Lahlou Saad et al., 2002; Makise et al., 2014; Victorio Cristiane et al., 2009).
Hiện nay, lá và thân rễ của cây Alpinia zerumbet được sử dụng chủ yếu trong ẩm thực và công nghiệp chế biến thực phẩm Chúng không chỉ là gia vị mà còn được dùng để sản xuất nước giải khát, thuốc, dược phẩm và mỹ phẩm Đặc biệt, tất cả các bộ phận của Alpinia zerumbet đều có thể ăn được và hoàn toàn không gây độc.
Alpinia zerumbet rất giàu chất hóa học có tác dụng sinh học, với cấu trúc phức tạp thuộc hai nhóm: kavalacton và không kavalacton (polyphenol, tinh dầu)
Các đặc tính hoạt tính sinh học của riềng ấm bao gồm khả năng chống oxy hóa, chống viêm, chống nấm và kháng khuẩn Lá của cây riềng ấm rất giàu tinh dầu, chủ yếu là monoterpen và terpen, trong khi các bộ phận khác như thân cây, thân rễ và hoa cũng chứa tinh dầu nhưng với số lượng ít hơn nhiều.
Thành phần polyphenol trong cây riềng ấm chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học mạnh như axid chlorogenic, axid ferulic, quercetin, epicatechin, catechin và kaempferol Nghiên cứu cho thấy polyphenol có tác dụng tích cực trong việc tăng cường hệ miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm và ngăn ngừa xơ vữa động mạch.
Thành phần các hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học cụ thể như sau:
Bảng 1.1: Thành phần hợp chất trong lá Shell Ginger
Nhóm hoạt chất Tên hóa học Bộ phận thực vật Hàm lượng
Lá, thân, thân rễ, quả 80 - 410 mg/g
5,6-Dehydrokawain (DK) Lá, thân, thân rễ, quả 10 - 100 mg/g
Tinh dầu Lá, cánh hoa, rễ 98% Bảo quản ở nhiệt độ 2-10 o C
2.2.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn của chất chuẩn gốc được tạo ra bằng cách cân chính xác 0.0100g chất chuẩn, hòa tan trong methanol và định mức đến 10,00 ml trong bình định mức 10 ml, tạo ra dung dịch chuẩn gốc với nồng độ 1000 pm Để đảm bảo chất lượng, dung dịch này cần được bảo quản ở nhiệt độ -49°C.
Dung dịch chuẩn làm việc được pha chế từ dung dịch chuẩn gốc, tạo thành dãy chuẩn có nồng độ từ 0,5 ppm đến 20 ppm Quá trình này bao gồm việc hút chính xác thể tích dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn trung gian, sau đó pha trộn trong Methanol Để đảm bảo chất lượng, dung dịch chuẩn cần được bảo quản ở nhiệt độ -49°C cho đến khi sử dụng.
2.2.3 Chuẩn bị các dung dịch mẫu placebo
- Mẫu placebo là mẫu không có chất phân tích
Chúng tôi đã lựa chọn phân bã từ lá tươi và bột lá cây riềng ấm sau khi chiết xuất hoàn toàn Acid Ferulic và Acid Chlorogenic để làm mẫu placebo.
- Acid acetic, Acid Phosphoric của Merck-Đức
- Methanol (MeOH),Ethanol (EtOH), Acetonitril (ACN) của Merck- Đức
Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu:
- Hệ thống máy HPLC Waters Alliance gồm bơm Water 2695 và bộ phận bơm mẫu tự động với phần mềm Empower sofiware
- Máy siêu âm Elmasonic S80H (Đức)
- Máy lắc votex Thermolyne Maxi-Mix II Type 37600, M37619-26 (Mỹ)
- Máy ly tâm Hettich Rotofix II (Đức)
- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung mụi; lọc mẫu với màng lọc 0,45àm
- Cân phân tích Sartorius BP 121S (d = 0,1 mg; Max 120 g) (Đức)
- Màng lọc PTFE 0,45 àm của Mỹ
- Ống nghiệm PTFE 15 ml, ống falcol 50 ml
- Các dụng cụ khác: bình định mức 10,00 – 25,00 – 250,00 -500,00 ml; pipet thủy tinh, cốc có mỏ, ống đong, phễu, vial loại 1,5 ml, …
- Xây dựng quy trình chiết xuất Acid Ferulic & Acid Chlorogenictrong lá cây riềng ấm
- Khảo sát điều kiện HPLC để phân tích Acid Ferulic & Acid Chlorogenic
- Thẩm định phương pháp phân tích đã được xây dựng
- Đánh giá hàm lượng Acid Ferulic & Acid Chlorogenic trong 33 mẫu lá tươi và bột lá tươi sau thu hoạch và chế biến
2.3 1 Khảo sát các điều kiện phân tích Acid Ferulic & Acid
Tiến hành phân tích trên máy HPLC có detector là PDA:
Thực hiện phân tích trên cột C18 với tốc độ dòng 1,0 ml/phút và thể tích tiêm 10 µl, bước sóng phát hiện được thiết lập ở 326 nm Nghiên cứu mẫu chuẩn acid chlorogenic (ACG) đã được tiến hành, đồng thời tham khảo một số tài liệu để khảo sát các hệ pha động khác nhau.
- Khảo sát đặc tính PDA và thời gian lưu của Acid Ferulic & Acid
- Pha động: Acid acetic 1% - ACN
- Khảo sát cột sắc ký sẵn có của phòng thí nghiệm
Cột Agilent ZORBAX SB - C18 (5 àm, 4,6 ì 250 mm)
Cột ODS-P Inertsillđ (250mm x 4.6mm x 5àm
Cột Symmectryđ C18 (250mm x 4.6mm x 5àm
2 3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
- Khảo sát thời gian siêu âm: 15 phút, 30 phút và 60 phút
- Khảo sát nhiệt độ chiết: nhiệt độ thường (25 o C – 30 o C), 40 o C, 50 o C và
- Khảo sát số lần chiết: chiết 1 lần, chiết 2 lần và chiết 3 lần
Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích Acid Ferulic & Acid
Chlorogenic bằng HPLC thẩm định về các tiêu chí sau: a Độ ổn định của hệ thống
Để xác định tính phù hợp của hệ thống, tiến hành tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích peak của các lần tiêm sắc ký để đánh giá độ chính xác Bên cạnh đó, cần tính chọn lọc để đảm bảo độ tin cậy của kết quả phân tích.
- Chuẩn bị các mẫu sau:
Mẫu chuẩn Acid Ferulic & Acid Chlorogenic như mục 3.2.2
Mẫu placebo, mẫu placebo nạp chuẩn
- Tiến hành chạy sắc ký 3 mẫu trên, so sánh các peak trên sắc ký đồ thu được
Trên sắc ký đồ của mẫu placebo, cần đảm bảo rằng tại thời điểm xuất hiện pic của Acid Ferulic và Acid Chlorogenic, không có peak lạ nào xuất hiện Điều này cho thấy khoảng tuyến tính của các hợp chất này được duy trì và không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài.
Chuẩn bị dãy chuẩn với nồng độ tăng dần, trong đó giới hạn dưới được xác định dựa vào giá trị LOQ, còn giới hạn trên được căn cứ vào hàm lượng Acid Ferulic.
Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra sự hiện diện của Acid Chlorogenic trong lá cây riềng ấm Qua quá trình sắc ký, chúng tôi đã xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r để đánh giá mối liên hệ giữa các yếu tố.
- Yêu cầu:đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và 0,995 ≤ r ≤ 1 d Giới hạn phát hiện giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử mà có thể phát hiện nhưng không thể định lượng Trong khi đó, giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử có thể định lượng với độ chính xác và độ đúng phù hợp theo phương pháp đã xây dựng.
Để xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), cần thêm nồng độ giảm dần vào mẫu placebo và xác định giá trị S/N tương ứng LOD được xác định là nồng độ tại đó tín hiệu đo lớn hơn gấp 3 lần nhiễu nền (S/N = 3), trong khi LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu đo lớn hơn gấp 10 lần nhiễu nền (S/N = 10) Thông thường, giá trị LOQ được tính toán dựa trên LOD qua công thức: LOQ = 3 x LOD.
Độ chính xác của quy trình phân tích phản ánh sự thống nhất trong kết quả của nhiều phép đo lặp lại trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được thực hiện dưới các điều kiện đã được mô tả.
Để xác định độ chính xác trong điều kiện định lượng, cần thực hiện 7 phép thử song song trên cùng một mẫu placebo nạp chuẩn, bắt đầu từ việc cân hoặc đong mẫu ở các mức nồng độ thấp, trung bình và cao Sự phân tán của dữ liệu được đánh giá thông qua giá trị RSD (%).
SD = Trong đó: SD là độ lệch chuẩn
RSD% = CV% = × 100 N là số lần thí nghiệm xi là gí trị tính được của lần thí nghiệm thứ i
- Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của Acid Ferulic & Acid Chlorogenic phải không lớn hơn
7,3% tại mức nồng độ 10 ppm, 11,00 % tại mức độ 1 ppm và 15% tại mức độ 100 ppb [6] f Độ thu hồi
Để xác định độ thu hồi của phương pháp, tiến hành nạp chuẩn vào mẫu placebo với ba mức nồng độ: thấp, trung bình và cao Mỗi mức nồng độ sẽ được phân tích lặp lại 7 lần Kết quả thu được sẽ tính tỉ lệ thu hồi của Acid Ferulic và Acid Chlorogenic nạp vào mẫu thử.
- Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 80% - 110% tại mức nồng độ 1000ppm, 500 ppm và 20ppm (AOAC 2016)
2 3.4 Ứng dụng quy trình xác định hàm lượng Acid Ferulic & Acid
Chlorogenic trong lá tươi và bột lá cây riềng ấm
Phương pháp HPLC, sau khi được thẩm định, sẽ được áp dụng để phân tích hàm lượng Acid Ferulic và Chlorogenic trong mẫu lá tươi cũng như bột lá cây riềng ấm.
2.3.5 Nghiên cứu đặc tính kĩ thuật của lá và lựa chọn loại lá thích hợp
Nghiên cứu về đặc tính kỹ thuật của lá riềng ấm đã được thực hiện từ cây riềng ấm, giống cây được thu hoạch và phát triển bởi Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng Giống cây này có nguồn gốc từ Nhật Bản, mang lại những đặc điểm nổi bật trong việc ứng dụng và phát triển nông nghiệp.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3 1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa trên tài liệu tham khảo [19, 23, 24] và điều kiện trang thiết bị trong phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát một số thông số quan trọng trong quá trình chạy sắc ký.
Quy trình phân tích Acid Ferulic
Thực hiện thí nghiệm trên cột C18 với tốc độ dòng 1,0 ml/phút và thể tích tiêm 10 µl, bước sóng phát hiện được thiết lập ở 323 nm Nghiên cứu mẫu chuẩn acid ferulic đã tiến hành khảo sát các hệ pha động dựa trên tham khảo từ một số tài liệu.
- Hệ 1 là Acid acetic 1% trong H 2 0 (A) & ACN (B) , chế độ gradient,
Tăng đều tỷ lệ % B từ 20 – 40%
Duy trì tỷ lệ % B là 40% từ 18 -
- Hệ 2 là Acid acetic 1% trong H 2 0 (A) & (MeOH) , chế độ gradient,
Tăng đều tỷ lệ %B từ 10 – 40%
Duy trì tỷ lệ %B là 40% từ 18 - 25 phút
- Hệ 3: Acid acetic 1% trong H 2 0 (A) và MeCN 80% trong acetic acid 0.1%
Tăng đều tỷ lệ % B từ 10 – 22% –
Duy trì tỷ lệ % B là 40% từ 35-
- Tiến hành phân Acid Ferulic cột C18 với chuẩn Acid Ferulic được pha theo mục 2.2.2
Hình 3.1: khảo sát hệ pha động 1 của Acid Ferulic
Hình 3.2: khảo sát hệ pha động 2 của Acid Ferulic
Hình 3.3: Khảo sát hệ pha động 3 của Acid Ferulic
Trên sắc ký đồ phân tích với hệ pha động 2 và 3, acid ferulic được rửa giải sớm, điều này cho thấy mẫu thử thường bị rửa giải nhanh Do đó, không nên lựa chọn hệ 2 và hệ 3 trong nghiên cứu.
Hệ pha động 1 peak của acid ferulic cân xứng cho thời gian lưu khoảng 13,1 phút, cho thấy sự phù hợp trong việc phân tích acid ferulic Kết quả khảo sát cho thấy hệ pha động 1, gồm acid Acetic 1% trong H2O (A) và ACN (B) với tỷ lệ gradient, là tối ưu để tách chất phân tích trong dung dịch chuẩn acid ferulic.
Quy trình phân tích Acid Chlorogenic
Thực hiện thí nghiệm trên cột C8 với tốc độ dòng 1,0 ml/phút và thể tích tiêm 10 µl, sử dụng bước sóng phát hiện 326 nm Nghiên cứu được tiến hành trên mẫu chuẩn acid chlorogenic, tham khảo từ một số tài liệu để khảo sát các hệ pha động.
- Hệ 1 là Acid phosphoric 0.1% trong H 2 0 (A) & ACN (B) , chế độ đẳng dòng với tỷ lệ (87:13)
- Hệ 2 là Acid acetic 1% trong H 2 0 (A) & MeOH (B), chế độ đẳng dòng với tỷ lệ (70:30)
- Hệ 3 là Acid phosphoric 0.1% trong H20 (A) & MeOH (B) , chế độ gradient,
Tăng đều tỷ lệ % B từ 20 – 40%
Duy trì tỷ lệ % B là 40% từ 12 -
- Hệ 4 là Acid phosphoric 0.1% trong H20 (A) & MeOH (B) , chế độ gradient,
Tăng đều tỷ lệ % B từ 20 – 40%
Duy trì tỷ lệ % B là 40% từ 12 -
Hình 3.4: Khảo sát hệ pha động 1 của Acid Chlorogenic
Hình 3.5: Khảo sát hệ pha động 2 của Acid Chlorogenic
Hình 3.6: Khảo sát hệ pha động 3 của Acid Chlorogenic
Hình 3.7: Khảo sát hệ pha động 4 của Acid Chlorogenic
Kết quả khảo sát từ 4 hệ pha động cho thấy sắc ký đồ hình 3.7 thể hiện pic tách tốt và cân xứng, với thời gian lưu của pic acid chlorogenic khoảng.
9,3 phút, nên hệ 4 được chọn để phân tích acid chlorogenic
- Tiến hành phân Acid Chlorogenic cột C8 với chuẩn Acid Chlorogenic được pha theo mục 2.2.2
Kết quả khảo sát phổ PDA của Acid Ferulic ( đỉnh đạt cực đại 323 nm)
Hình 3.8: Phổ PDA của Acid Ferulic Kết quả khảo sát phổ PDA của Acid Chlorogenic ( đỉnh đạt cực đại 326 nm)
Hình 3.9: Phổ PDA của Acid Chlorogenic
3 1.2 Khảo sát cột sắc ký
Chúng tôi đã thực hiện khảo sát trên các cột sắc kí hiện có trong phòng thí nghiệm, với thể tích tiêm 10 µl và bước súng phân tích theo chế độ gradient tỷ lệ pha động đã được khảo sát Các loại cột sắc kí được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm nhiều mẫu khác nhau.
- Cột Agilent ZORBAX SB - C18 (5 àm, 4,6 ì 250 mm)
- Cột ODS-P Inertsillđ (250mm x 4.6mm x 5àm
- Cột Symmectryđ C18 (250mm x 4.6mm x 5àm
Chúng tôi tiến hành chạy cùng một nồng độ chuẩn 5 ppm trên các cột và cho kết quả như sau:
Hình 3.10:Sắc ký đồ chuẩn Acid Ferulic 4.8 ppm của cột Agilent ZORBAX SB-
Hình 3.11:Sắc ký đồ chuẩn Acid Ferulic 4.8 ppm của cột Symmectry® C18
Hình 3.12:Sắc ký đồ chuẩn Acid Ferulic 4.8 ppm của cột ODS-P Inertsill®
Acid Ferulic Cột Zorbax SB_ C18
Acid Ferulic Cột ODS-P Inertsill®
Hình 3.13: Sắc ký đồ chuẩn Acid Chlorogenic 5 ppm của cột Symmectry® C18
Hình 3.14: Sắc ký đồ chuẩn Acid Chlorogenic 20 ppm của cột ODS-P Inertsill®
Hình 3.15: Sắc ký đồ chuẩn Acid Chlorogenic 5 ppm của cột C8
Chúng tôi nhận thấy rằng Acid Ferulic phù hợp với cột Agilent ZORBAX SB - C18 (5 µm, 4,6 mm x 250 mm) dựa trên hai sắc ký đồ, cho ra peak sắc ký ổn định Do đó, cột Agilent ZORBAX SB được chọn cho phân tích Acid Ferulic.
Acid Chlorogenic sử dụng cột Cột Inertsillđ C8 (5 àm, 4,6 ì 150 mm) và chiều
Symmectry® C18 cao peak của cột C8 lớn hơn (tín hiệu nhạy hơn) cột C18 Vì vậy chúng tôi quyết định lựa chọn cột C8 cho phân tích Acid Chlorogenic
3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu
Sau khi tham khảo nhiều báo cáo từ các tác giả quốc tế, chúng tôi tiến hành khảo sát về dung môi chiết, thời gian chiết và nhiệt độ chiết trong quy trình chiết xuất.
Quy trình phân tích acid ferulic
Cân 0,2 g mẫu bột hoặc 2 g mẫu lá tươi vào bình nón 50ml
Thêm 30ml NaOH 0.2 - 1M, trộn đều
Lắc 4h trên máy lắc ngang hoặc siêu âm 1-3h ở 40 0 C -60 0 C
Trung hoà NaOH bằng HCl đặc pH = 3-4-5 (khoảng 1ml)
Thêm 15 ml ethanol, vortex 1 phút
Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 50ml
Định mức vừa đủ 50 ml bằng ethanol
Lọc qua màng lọc 0,45 àm và bơm vào HPLC
Quy trình phân tích Acid Chlorogenic:
Mẫu lá đã đồng nhất
Cân chính xác khoảng 1g (lá tươi) – 0,5g (bột lá) mẫu vào ống falcol 50 ml
Votex, siêu âm 30 phút (duy trì ở nhiệt độ phòng)
Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút
Định mức đến 100 ml bằng dung môi chiết
Lọc giấy lọc vào ống faclo 50 ml
Lọc qua màng loạc 0,45 àm vào vial, chạy mỏy HPLC
3.2.1 Khảo sát thời gian siêu âm
Chúng tôi tiến hành khảo sát đến thời gian siêu âm trong quy trình chiết
Acid Ferulic, để có thể lựa chọn được mức thời gian siêu âm thích hợp
Thực hiện theo quy trình chiết mẫu như mục 4.2 với 1 lần chiết và điều kiện phân tích như mục 4.1.1
Kết quả khảo sát thời gian siêu âm được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.1:Nồng độ Acid Ferulic tìm thấy với các mức thời gian siêu âm khác nhau
Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa thời gian siêu âm 120 phút và 180 phút trong cả mẫu lá và mẫu bột Đối với mẫu tươi và bột, lượng chất chiết ra sau 60 phút thấp hơn so với 120 phút và 180 phút Vì vậy, thời gian siêu âm 120 phút được chọn làm tối ưu cho quy trình chiết.
3 2.2 Khảo sát nhiệt độ siêu âm
Chúng tôi tiếp tục khảo sát nhiệt độ siêu âm đối với Acid Ferulic, để lựa chọn mức nhiệt độ siêu âm phù hợp nhất
Tiến hành chiết mẫu như mục 4.2 với 1 lần chiết và thời gia siêu âm đã lựa chọn tại mục 4.2.1; điều kiện phân tích như mục 4.1.1
Kết quả được trình bày trong bảng 3.4
Bảng 3.2: Nồng độ Acid Ferulic tìm thấy với các mức nhiệt độ siêu âm khác nhau
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi mở nhiệt độ chiết xuất ở mức 50°C và 60°C, hàm lượng chất chiết ra từ mẫu lá tươi và mẫu bột lá cao hơn so với mức nhiệt độ 40°C và nhiệt độ thường Do đó, chúng tôi quyết định thực hiện quá trình chiết xuất cả hai mẫu ở nhiệt độ 50°C.
3 2.3 Khảo sát số lần chiết
Sau khi đã lựa chọn được thời gian và nhiệt độ, chúng tôi tiếp tục khảo sát số lần chiết
Quy trình chiết dùng để khảo sát số lần chiết
Cân 0,2 g mẫu bột hoặc 2 g mẫu lá tươi vào bình nón 50ml
Thêm 30ml NaOH 0.2 - 1M, trộn đều
Trung hoà NaOH bằng HCl đặc pH = 4 (khoảng 1ml)
Thêm 15 ml ethanol, vortex 1 phút
Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 50ml
Định mức vừa đủ 50 ml bằng ethanol
Lọc qua màng lọc 0,45 àm và bơm vào HPLC
Tiến hành chiết và phân tích ba mẫu độc lập cho mỗi trường hợp, bao gồm chiết một lần, hai lần và ba lần, theo quy trình chiết đã được mô tả trong sơ đồ Các điều kiện phân tích được tuân thủ theo mục 2.1.1, thời gian chiết được lựa chọn theo mục 2.2.1, nhiệt độ chiết theo mục 2.2.2, và dung môi chiết theo mục 2.2.3.
- Kết quả đánh giá dựa vào hàm lượng tìm thấy ở dịch chiết khi chạy máy với số lần lặp lại n = 3, được tổng hợp ở bảng 3.5
Bảng 3.3: Nồng độ Acid Ferulic tìm thấy với các số lần chiết khác nhau
Nhận xét: Để đạt hiệu quả lượng chất chiết ra cao nhất chúng tôi sẽ tiến hành chiết là 2 lần với cả bột và lá
Từ kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi xây dựng quy trình xử lý mẫu và điều kiện HPLC như sau:
Quy trình phân tích acid ferulic
Cân 0,2 g mẫu bột hoặc 2 g mẫu lá tươi vào bình nón 50ml
Thêm 30ml NaOH 0.2 - 1M, trộn đều
Trung hoà NaOH bằng HCl đặc pH = 4 (khoảng 1ml)
Thêm 15 ml ethanol, vortex 1 phút
Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 50ml
Định mức vừa đủ 50 ml bằng ethanol
Lọc qua màng lọc 0,45 àm và bơm vào HPLC
Quy trình phân tích Acid Chlorogenic:
Mẫu lá đã đồng nhất
Cân chính xác khoảng 1g (lá tươi) – 0,5g (bột lá) mẫu vào ống falcol 50 ml
Votex, siêu âm 30 phút (duy trì ở nhiệt độ phòng)
Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút
Định mức đến 50 ml bằng dung môi chiết
Lọc giấy lọc vào ống faclo 50 ml
Lọc qua màng loạc 0,45 àm vào vial, chạy mỏy HPLC
3 4.1 Độ ổn định của hệ thống
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn Acid Ferulic & Acid Chlorogenic như mục
2.2.2 Tiêm lặp lại 6 lần với điều kiện sắc ký như mục 3.3
- Xác định các thông số mỗi lần tiêm mẫu: thời gian lưu, diện tích peak của chất phân tích Kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng sau
Bảng 3.4 Độ ổn định của hệ thống Acid Ferulic
Lần Mẫu nạp chuẩn Acid Ferulic t R Diện tích
Nhận xét: độ lệch chuẩn tương đối RSD% các thông số phân tích của
Acid Ferulic đều dưới 2,00%, điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp, có thể ứng dụng phân tích mẫu trong thực tế
Bảng 3.5 Độ ổn định của hệ thống Acid Chlorogenic
Lần Mẫu nạp chuẩn Acid Chlorogenic t R Diện tích
Nhận xét: độ lệch chuẩn tương đối RSD% các thông số phân tích của
Acid Chlorogenic đều dưới 2,00%, điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp, có thể ứng dụng phân tích mẫu trong thực tế
- Tiến hành chuẩn bị các mẫu:
+ Chuẩn Acid Ferulic & Acid Chlorogenic như mục 2.2.2
+ Mẫu placebo như mục 2.2.3 Sau đó tiến hành chiết mẫu như mục 3.3
+ Mẫu placebo nạp chuẩn: tiến hành như mục 2.2.3, sau đó tiến hành nạp chuẩn và chiết mẫu như mục 3.3 thực hiện 1 lần phân tích
Các mẫu sau khi chuẩn bị xong sẽ tiến hành sắc ký như mục 3.3
Hình 3.16: Sắc ký đồ của chuẩn Acid Ferulic 48 ppm
Hình 3.17: Sắc ký đồ của mẫu placebo Acid Ferulic
Hình 3.18: Sắc ký đồ của mẫu placebo nạp chuẩn Acid Ferulic
Hình 3.19: Sắc ký đồ của chuẩn Acid Acid Chlorogenic 5 ppm
Hình 3.20: Sắc ký đồ của mẫu placebo Acid Chlorogenic
Hình 3.21: Sắc ký đồ của mẫu placebo nạp chuẩn Acid Chlorogenic
Nhận xét cho thấy rằng trên sắc ký đồ, tại thời gian lưu của Acid Ferulic (13,1 phút) và Acid Chlorogenic (9,3 phút), mẫu placebo không có pic nào xuất hiện Trong khi đó, sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu placebo nạp chuẩn lại có pic rõ nét với thời gian lưu trùng nhau Điều này chứng tỏ rằng phương pháp khảo sát và lựa chọn có tính chọn lọc cao.
3 4.3 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn
Trong phân tích định lượng, khi nồng độ chất phân tích tăng đến một giới hạn nhất định, mối quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ không còn duy trì tính tuyến tính Khoảng nồng độ chất phân tích mà vẫn giữ được tính tuyến tính với chiều cao hoặc diện tích peak được gọi là khoảng tuyến tính.
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích peak sắc ký vào nồng độ của Acid Ferulic và Acid, dựa trên các điều kiện chạy HPLC đã được lựa chọn.
