Tổng quan các vấn đề nghiên cứu
Tổng quan về protease
Theo Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế, protease là enzyme có khả năng xúc tác quá trình thủy phân các liên kết peptide (-CO-NH-) trong chuỗi polypeptide.
Trong những năm gần đây, giá trị thương mại toàn cầu của enzyme công nghiệp đã vượt qua 500 triệu USD, với enzyme thủy phân chiếm khoảng 75% tổng giá trị Đặc biệt, protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất, chiếm tới 60% lượng enzyme được tiêu thụ trên toàn thế giới (Nguyễn Thị Thảo và cs, 2004) [16].
Protease là enzyme thiết yếu cho sự sống, có mặt rộng rãi trong nhiều sinh vật, bao gồm vi sinh vật như vi khuẩn, nấm và virus, cũng như thực vật như đu đủ, dứa, sung vả và động vật như gan, dạ dày.
Hội Hóa sinh quốc tế đã thành lập Tiểu ban Enzyme (EC) nhằm đưa ra cách phân loại thống nhất các enzyme dựa trên loại phản ứng Hệ thống phân loại này chia enzyme thành sáu lớp chính, đánh số từ 1 đến 6, với mỗi lớp có mã số cố định Mỗi enzyme được phân loại và đặt tên bằng mã bốn chữ số, trong đó số đầu tiên chỉ lớp, số thứ hai chỉ lớp phụ, số thứ ba chỉ phân lớp phụ và số thứ tư chỉ số thứ tự của enzyme Theo phân loại của Tiểu ban enzyme, protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).
Sơ đồ phân loại protease
Sơ đồ trên cho thấy protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Exopeptidase: dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hailoại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Endopeptidase: dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase đ ược chia thành bốn nhóm:
Serine là nhóm enzyme chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động, đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác Nhóm enzyme này được chia thành hai loại nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật, thể hiện sự đa dạng và chức năng quan trọng trong các quá trình sinh học.
Chymotrypsin, trypsin, and elastase are metalloproteinases that belong to the serine protease family This group includes subtilisin, with notable types such as subtilisin Carlsberg and subtilisin BPN These enzymes typically exhibit strong activity in alkaline conditions and demonstrate a relatively broad substrate specificity.
Cysteine là các protease có nhóm –SH trong trung tâm hoạt động, bao gồm protease thực vật như papain và bromelin, cũng như một số protease động vật và ký sinh trùng Các cystein protease thường hoạt động hiệu quả ở pH trung tính và có độ đặc hiệu cơ chất rộng.
Aspartic protease chủ yếu thuộc nhóm pepsin, bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin và renin Những enzyme này có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động hiệu quả ở pH trung tính.
Metallo protease là một nhóm enzyme protease được phát hiện ở vi khuẩn, nấm mốc và các vi sinh vật bậc cao hơn Những enzyme này thường hoạt động hiệu quả trong môi trường pH trung tính, nhưng hoạt tính của chúng sẽ giảm đáng kể khi tiếp xúc với EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid hoạt động ở pH 2-4.
- Protease trung tính hoạt động ở pH 7-8.
- Protease kiềm hoạt động ở pH 9-11 [16].
Công nghệ enzyme, một trong bốn bộ phận cơ sở của công nghệ sinh học, đã phát triển mạnh mẽ tại nhiều quốc gia, bắt đầu từ các enzyme thủy phân như protease và amylase Trong đó, protease chiếm khoảng 50% tổng lượng enzyme được sử dụng, trong khi carbohydrase chỉ chiếm 28% và phần còn lại là các enzyme khác.
Protease được sử dụng rộng rãi trong sản xuất xà phòng và ngành công nghiệp thực phẩm Gần đây, xu hướng phát triển các kỹ thuật thân thiện với môi trường đã dẫn đến việc ứng dụng protease trong xử lý da và nhiều quá trình sinh học khác Bên cạnh đó, nhu cầu toàn cầu về enzyme cho các ứng dụng đặc thù đang tăng lên, với protease cũng được áp dụng trong y tế và ngành dược phẩm để sản xuất thuốc.
2.1.2.1.Ứng dụng protease trong công nghiệp sản xuất xà phòng
Trong ngành công nghiệp sản xuất xà phòng, kem mỹ phẩm và thuốc đánh răng, protease đóng vai trò quan trọng trong việc làm mịn da, làm sạch răng và tẩy mồ hôi, vết bẩn Vào thập niên 60, khoảng một nửa số loại bột giặt ở châu Âu và châu Mỹ chứa protease, chiếm khoảng 25% tổng lượng enzyme sử dụng toàn cầu Hiện nay, tất cả protease dùng trong sản xuất bột giặt trên thị trường đều là serine protease được chiết xuất từ các chủng Bacillus Ngoài ra, một loại protease kiềm tính được phát hiện ở Conidiobolus coronatus cũng phù hợp với bột giặt thương mại tại Ấn Độ.
2.1.2.2.Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da
Quá trình xử lý da bao gồm các bước ngâm nước, tẩy lông, làm mềm, tẩy vôi và nhuộm Da và lông chủ yếu được cấu tạo từ protein, và nhiều phương pháp xử lý hiện tại sử dụng hóa chất nguy hiểm như Na2SO3, gây ô nhiễm môi trường nước Việc áp dụng enzyme thay thế hóa chất trong quá trình loại bỏ lông và làm mềm da không chỉ giảm thiểu ô nhiễm mà còn tiết kiệm năng lượng Hiện nay, trypsin được sử dụng kết hợp với protease từ Bacillus và Aspergillus để làm mềm da hiệu quả.
Protease là một loại enzyme quan trọng, có tác dụng trong việc điều trị các vấn đề về tim mạch, tiêu mủ vết thương, thông đường hô hấp và chống viêm Ngoài ra, protease còn giúp tăng cường quá trình tiêu hóa protein và là thành phần thiết yếu trong nhiều loại thuốc da liễu và mỹ phẩm.
2.1.2.4 Cácứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
Protease đã được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm từ lâu, phục vụ nhiều mục đích như sản xuất pho mát, làm bánh nướng, sản xuất bia, chế biến cá, sản xuất dịch thủy phân đậu và làm mềm thịt.
Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis thuộc giới Bacterice, ngành Firmicutes, lớp Bacilie, bộ Bacillales, họ Bacillanceae và giốngBacillus Loài này được Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [52].
B subtilis là trực khuẩn Gram dương, hình que, sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, dễ tìm thấy trong đất và trong các chất hữu cơ bị thối rửa Loài này có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại b ào như protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase và dextranase [3] Nhiều nghiên cứu đã lựa chọn B subtilis làm nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp protease ngoại bào [53, 63, 64].
Vào năm 1998, Kunst và cộng sự đã xác định được hệ gen của loài B subtilis với khoảng 4.225 gen, trong đó có khoảng 4.100 gen mã hóa protein, bao gồm 192 gen thiết yếu Các gen này chủ yếu liên quan đến các quá trình chuyển hóa tế bào, với khoảng 50% gen tham gia vào thông tin sống, 20% liên quan đến tổng hợp vỏ tế bào và hình dáng tế bào, trong khi 10% còn lại liên quan đến năng lượng tế bào.
Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là kiềm tính và trung tính, được sản xuất từ vi sinh vật thuộc chi Bacillus, với loài B subtilis là phổ biến nhất Các serine protease của B subtilis hoạt động hiệu quả ở pH kiềm, đặc hiệu với amino acid th ơm hoặc kỵ nước ở phía -COOH của liên kết bị thủy phân và bị ức chế bởi disopropyl fluophosphate (DFP) Ngược lại, các metallo protease của loài này hoạt động tốt ở pH trung tính, với đặc điểm là đặc hiệu ở amino acid kỵ nước hoặc có kích thước lớn.
NH2 của liên kết bị thủy phân và bị kìm hãm bởi EDTA [20].
Các chế phẩm protease từ B subtilis, giống như các protease tách từ vi sinh vật khác, đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong lĩnh vực chế biến thực phẩm.
Công nghệ DNA tái tổ hợp
Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời vào những năm 1970 nhờ sự tiến bộ trong các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử Công nghệ này cho phép phân lập, phân tích và thao tác trên các gen, từ đó mở ra nhiều lĩnh vực mới trong sinh học như công nghệ sinh học, phát triển thuốc mới, y học phân tử và liệu pháp gen.
Việc phát hiện các enzyme hạn chế (restriction endonuclease) vào những năm 1970 đã đánh dấu một bước tiến quan trọng trong phân tích DNA, cho phép cắt các phân tử DNA để tạo ra các đoạn DNA tái tổ hợp mới Quá trình này, được gọi là tạo dòng gen, đã mở ra một kỷ nguyên mới trong việc thao tác, phân tích và khai thác các phân tử nucleic acid.
Tạo dòng gen đã dẫn đến nhiều phát minh quan trọng và cung cấp hiểu biết về cấu trúc, chức năng và sự điều hòa hoạt động của gen Các phương pháp xây dựng thư viện gen đã được phát triển và hiện nay là nền tảng cho nhiều thí nghiệm hóa sinh và sinh học phân tử Mặc dù phản ứng chuỗi polymerase (PCR) cho phép phân tích nhanh hơn, kỹ thuật tạo dòng gen vẫn giữ vai trò quan trọng và cần thiết trong nhiều trường hợp.
Công nghệ DNA tái tổ hợp là một tập hợp các kỹ thuật phân tử nhằm định vị, phân lập và biến đổi các đoạn DNA, cho phép phối hợp DNA từ hai nguồn khác nhau Ví dụ, gen từ hai loại vi khuẩn có thể được kết hợp, hoặc gen người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn Hiện nay, công nghệ này, còn được gọi là công nghệ di truyền hay kỹ thuật gen, bao gồm nhiều phương pháp để phân tích và tái tổ hợp hầu hết mọi trình tự DNA.
Mục đích của việc tạo dòng và biểu hiện gen là sản xuất các sản phẩm có giá trị thương mại với số lượng lớn Tuy nhiên, sự biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn thường gặp khó khăn, do đó cần thiết kế các vector biểu hiện phù hợp để đạt được mức độ biểu hiện cao Tại Việt Nam, đã có những thành tựu đáng chú ý trong nghiên cứu gen, như việc thiết kế và biểu hiện protein lai GnRH-TBK trong E coli Protein này kết hợp hormone kích dục tố với protein bất hoạt lớp 1 (trichobakin), có kích thước 813 bp được tạo ra bằng kỹ thuật PCR Tổ hợp gen được đưa vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO và biểu hiện trong chủng E coli BL21 (DE3) Kết quả từ điện di SDS-PAGE và Western blot cho thấy gen lai biểu hiện ổn định với khối lượng phân tử 30 kDa, phù hợp với tính toán lý thuyết.
Năm 2003, Nguyễn Quỳnh Anh và cộng sự đã thành công trong việc tạo dòng và biểu hiện gen VP19, mã hóa cho protein vỏ của virus WSSV gây hội chứng đốm trắng ở tôm sú tại Việt Nam Phân tích trình tự gen cho thấy gen VP19 dài 366 bp, mã hóa cho 122 amino acid Đáng chú ý, gen VP19 của WSSV gây bệnh trên tôm sú tại Việt Nam có độ đồng nhất cao về DNA và protein so với các gen VP19 đã được công bố trước đó Gen VP19 đã được chuyển vào vector biểu hiện pEZZ.
Protein A-VP19, được biểu hiện từ gen VP19 trong tế bào chủ E coli HB101, đang được tinh chế và tiết ra môi trường nuôi cấy Protein này sẽ được sử dụng làm nguyên liệu để phát triển kháng thể chống lại VP19 và cải thiện phương pháp phát hiện nhanh WSSV trên tôm sú, góp phần vào công tác giám sát và phòng ngừa dịch bệnh do WSSV tại Việt Nam.
Tình hình nghiên c ứu protease trong nước và trên thế giới
2.4.1 Các nghiên cứu về tách chiết, đặc điểm vàứng dụng của protease
2.4.1.1 Protease từ nguồn thực vật
Protease là enzyme quan trọng có nguồn gốc từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm thực vật, động vật và vi sinh vật Việc khai thác protease từ thực vật thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như thổ nhưỡng và khí hậu Một số loại protease thực vật phổ biến bao gồm papain, bromelain, keratinase và ficin.
Bromelain được phân lập đầu tiên từ quả dứa bởi Marcano (Venezuela) năm 1891 Năm
Bromelain, được nghiên cứu bởi Chittenden và các cộng sự vào năm 1982, là một protease thực vật có nguồn gốc từ enzyme Hiện nay, bromelain được sử dụng rộng rãi trong y học, đặc biệt để điều trị các chấn thương thể chất ở vận động viên, các vấn đề tiêu hóa, viêm tĩnh mạch, viêm xoang, vết thương sau phẫu thuật, viêm khớp và bệnh gút Enzyme này thuộc loại cystein protease với biên độ pH hoạt động từ 3-10, nhưng pH tối ưu nằm trong khoảng 5-8 tùy thuộc vào cơ chất, và nhiệt độ tối ưu là từ 50-60 độ C Nhiệt độ bất hoạt của bromelain là 70 độ C, thấp hơn so với papain.
Lê Thị Thanh Mai và cộng sự (2007) đã nghiên cứu khả năng làm mềm thịt của bromelain từ phế liệu dứa trong sản xuất dứa đóng hộp Nghiên cứu xác định điều kiện tối ưu để làm mềm thịt bò có kích thước 1-1,5 cm×4,0 cm×3,5 cm (cao×dài×rộng) bằng dung dịch enzyme bromelain với nồng độ 19,5-33,2 MCU/ml/cm², và thời gian ngâm miếng thịt bò trong dung dịch enzyme là 5 phút.
Phạm Thị Trân Châu và cộng sự (1993) đã tiến hành nghiên cứu về các protease ở một số loài rong biển thuộc ba ngành: rong đỏ (Rhodophyta), rong nâu (Phaeophyta) và rong lục (Chlorophyta) Nghiên cứu cũng xác định hoạt độ thủy phân protein tại các pH 4,5; 6,5 và 8,1 Kết quả cho thấy có 30 loài rong biển có hoạt độ phân giải casein cao nhất ở pH 6,5, từ đó dự đoán rằng protease trung tính chiếm ưu thế ở các loài rong được nghiên cứu.
Papain là một loại protease thực vật truyền thống, được chiết xuất từ trái đu đủ (Carica papaya) và nổi bật với khả năng bền nhiệt, chịu được nhiệt độ lên đến 70°C trong 30 phút ở pH 7 Dưới dạng bột, papain có thể chịu được 100°C trong 3 giờ, với nhiệt độ tối ưu từ 60-70°C và pH lý tưởng giữa 5 (đối với gelatin) và 7 (đối với casein, hemoglobin, albumin trứng) Nghiên cứu của Dương Thị Hương Giang và cộng sự (2006) đã chỉ ra quy trình tách chiết và điều chế papain từ nhựa đu đủ xanh, đồng thời áp dụng papain thô để thủy phân bánh đậu nành, tạo ra sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao cho chăn nuôi.
Vào năm 2000, Adam và nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra sự hiện diện của nhiều loại protease trong lục lạp của tế bào thực vật Các enzyme trong lục lạp đóng vai trò quan trọng trong việc di chuyển các peptide Tuy nhiên, sự di chuyển oxy có thể gây hại cho protein, dẫn đến sự giảm giá trị của chúng, đồng thời làm mất đi một số thành phần hóa học hoặc cấu trúc phân tử của các protein phức tạp.
Việc điều chỉnh các protease ở lục lạp là cần thiết để phản ứng với sự thay đổi điều kiện sống Quá trình phân giải chuỗi protein diễn ra khi protease cắt đứt các protein trong lục lạp, giúp loại bỏ các peptide có thể gây ảnh hưởng xấu đến protein Nhiều loại protease trong lục lạp đã được xác nhận và tạo dòng, với hy vọng rằng protease tái tổ hợp có thể thay thế vai trò của chúng trong lục lạp.
Nhiễm khuẩn đường ruột do giun tròn là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khỏe hàng triệu người và gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi (Stepek và cs, 2004) Hiện nay, thuốc trừ giun là phương pháp chính để kiểm soát bệnh này Các enzyme phân giải protein, với độc tính thấp, đã được sử dụng trong các loại thuốc truyền thống để tiêu diệt giun tròn trong nhiều thập kỷ Nhiều loại cysteine protease từ thực vật như đu đủ, dứa và vả đã được chiết xuất và sử dụng như một nguồn protease phong phú, thay thế cho thuốc trừ giun trong điều trị nhiễm khuẩn đường ruột ở người và động vật.
Nghiên cứu về protease nguồn gốc thực vật cho thấy enzyme này xuất hiện ở nhiều loài thực vật và phân bố trong các mô khác nhau Tại Việt Nam, các tác giả chủ yếu tập trung vào việc tách chiết và khảo sát tính chất của chế phẩm protease từ dứa và đu đủ.
2.4.1.2 Protease từ nguồn động vật
Hầu hết các protease động vật là trypsin dịch tụy, chymotrypsin, pepsin v à rennin đã được nghiên cứu kỹ tính chất lý hóa, hoạt độ và cấu trúc phân tử [3].
Năm 1993, Phạm Thị Trân Châu và cộng sự đã công bố nghiên cứu về protease của đầu tôm biển Để phục vụ cho nông nghiệp, vào năm 1995, Phạm Thị Trân Châu và Trịnh Hồng Thái đã tiến hành tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của protease sâu xanh.
Raju và cs (1997) đã nghiên cứu thủy phân thịt phế thải trong công nghiệp thuộc da với nguồn enzyme thu nhận từ ruột gà [56].
Trần Quốc Hiền và Lê Việt Mẫn (2006) đã nghiên cứu việc thu nhận enzyme từ ruột cá basa (Pangasius bocourti), tập trung vào quá trình tách chiết và tinh sạch protease Nghiên cứu này nhằm biến phụ phẩm từ ngành thủy sản thành sản phẩm có giá trị gia tăng, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế cho nhà sản xuất và giảm thiểu ô nhiễm môi trường do phế liệu thủy sản.
Năm 2007, Phan Thị Bích Trâm và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về protease từ trùn quắn (Pheretima posthuma) Kết quả cho thấy thời gian tối ưu cho quá trình tự thủy phân để đạt hoạt tính protease cao nhất là 4 ngày Nhiệt độ tối ưu cho quá trình này cũng được xác định trong nghiên cứu.
Nghiên cứu cho thấy protease trong trùn quắn có cấu trúc phức tạp, với 10 phân đoạn enzyme khác nhau có khối lượng phân tử dao động từ 24 kDa đến 58,3 kDa Điều kiện tối ưu để hoạt động của enzyme là ở nhiệt độ 55 độ C và pH từ 8 đến 10 Phương pháp tinh sạch bằng kết tủa acetone, kết hợp với sắc ký trao đổi ion và tương tác kỵ nước, cùng với phân tích điện di SDS đã được sử dụng để xác định thành phần này.
Do việc thu nhận protease từ nội tạng động vật không mang lại hiệu quả kinh tế cao, nghiên cứu về loại enzyme này gần đây đã giảm sút so với protease từ thực vật và vi sinh vật.
2.4.1.3 Protease từ nguồn vi sinh vật
Các protease vi sinh vật có thể được thu nhận từ vi khuẩn và nấm (Rahman và cs, 2003)
Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là kiềm tính và trung tính, được sản xuất từ vi sinh vật thuộc chi Bacillus, với Bacillus subtilis là loài phổ biến nhất.
64, 69], Bacillus stearothermophilus [63]; Bacillus thuringiensis [9] đã được nghiên cứu tính chất lý hóa, tạo dòng và biểu hiện gen protease.
Năm 1971 đánh dấu bước mở đầu quan trọng cho những nghiên cứu về protease kiềm ở
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Tạodòng gen sản xuất protease trong vi khuẩn E coli.
- Phân tíchkhả năng sinh tổng hợp protease trong vi khuẩn E coli tái tổ hợp.
Nội dung nghiên c ứu của đề tài
Chúng tôi đã tách gen mã hóa protease từ chủng Bacillus subtilis tự nhiên được phân lập từ vỏ tôm Sau đó, gen protease này được đưa vào vector biểu hiện và biến nạp vào chủng vi khuẩn E coli thương mại.
- Phântích biểu hiệncủa gen protease trong vi khuẩn E coli tái tổ hợp.
- Thu nhận chếphẩm proteasecủa E coli tái tổ hợpvà khảosát một số tính chấtcủa chế phẩm liên quan đến việcứngdụng trong chếbiến thực phẩm.
Địa điểm, thời gian và phương pháp nghiên cứu
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu được thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 3/2009 tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen, thuộc Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế.
Phương pháp nghiên cứu
4.2.1 Phân lập DNA và khuếch đại gen protease trung tính ởB subtilis C10
DNA tổng số của chủng B subtilis C10 được phân lập theo phương pháp của Sambrook và cộng sự, sau đó được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại gen protease thông qua phản ứng PCR Các cặp mồi xuôi và ngược được thiết kế dựa trên gen protease trung tính nprE (mã số: K01985) từ cơ sở dữ liệu NCBI.
Bảng 4.1 Trình tự nucleotide của hai cặp mồi đ ược thiết kế cho đoạn mã hóa (CDS) và đoạn hoàn chỉnh (FLS) của gen protease trung tính npr E
Các cặp mồi Trình tự Đoạn hoàn chỉnh:
NPF-F (mồi xuôi)* 5’-CACCCACATGACACTTGACTCATCTTGAT -3’(29 mer) NPF-R (mồi ngược) 5’-GAATTCGTCTATCAATTATGTGGAC -3’ (25 mer) Đoạn mã hóa:
NPC-F (mồi xuôi)* 5’-CACCGTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGTT -3’(31 mer) NPC-R (mồi ngược) 5’-TTACAATCCAACAGCATTCCA -3’ (21 mer)
Trình tự CACC được bổ sung ở đầu 5’ nhằm tạo dòng định hướng cho sản phẩm PCR trong vector Bốn nucleotide này được thiết kế dựa trên trình tự phần nhô ra GTGG của vector pET200/D-TOPO (5741 bp, Invitrogen).
Thành phần phản ứng PCR bao gồm 1,25 đơn vị Pfu polymerase (BioRad), 5 µL dung dịch đệm Pfu polymerase, 200 µM deoxynucleotide (hỗn hợp dNTP), 10 pmol mồi cho mỗi loại, 1,5 mM MgSO4, 40 ng DNA tổng số của chủng B subtilis C10, và nước cất khử trùng được bổ sung đến thể tích cuối cùng là 50 µL.
Phản ứng khuếch đại DNA được thực hiện trong máy luân nhiệt iCycler (BioRad) với quy trình: 95°C trong 5 phút, sau đó 30 chu kỳ gồm 95°C trong 1 phút, 50-55°C trong 1 phút và 72°C trong 1 phút, kết thúc với 72°C trong 5 phút và giữ mẫu ở 4°C Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% ở 100V trong đệm 1×TAE Gel agarose được nhuộm trong dung dịch EtBr (0,5 µg/L) trong 15 phút và hình ảnh điện di được phân tích bằng hệ thống Gel Documentation của BioRad.
Gen protease trung tính nprE có cấu trúc đơn giản với tổng chiều dài 1916 bp, trong đó đoạn mã hóa dài 1566 bp Sơ đồ cấu trúc bao gồm vùng ngược hướng (A) và vùng cùng hướng (B) Peptide tín hiệu nằm trong khoảng nucleotide 161-250, trong khi peptide hoàn chỉnh được xác định từ nucleotide 824-1723.
4.2.2 Tạo dòng và phân tích trình tự gen protease trung tính
The PCR product is extracted from a 0.8% agarose gel and purified using the Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Kit (Promega) It is then ligated into the pET/200D TOPO vector using a reaction volume of 6 μL, which includes 1 μL of the purified PCR product, 1 μL of the vector, and 1 μL of salt solution, with sterile distilled water added to reach a total volume of 6 μL The mixture is gently mixed and incubated at 25°C for 5 minutes.
Sản phẩm phản ứng gắn được biến nạp vào tế bào E coli BL21 Star TM (DE3) thông qua phương pháp sốc nhiệt, sử dụng dung dịch bao gồm 3 μL phản ứng gắn, 50 μL tế bào khả biến và 250 μL môi trường SOC Để chọn lọc tế bào tái tổ hợp, phương pháp đĩa thạch bổ sung kanamycin được áp dụng, với dung dịch sau biến nạp được cấy trải trên đĩa petri có môi trường LB bổ sung 50 μg/ml kanamycin và ủ ở 37°C qua đêm Vector pET/200D TOPO không có khả năng tự đóng vòng, do đó, những tế bào E coli sống sót trên môi trường LB chứa 50 μg/ml kanamycin đều mang vector pET/200D TOPO gắn sản phẩm PCR, với vector này có chứa gen kháng kanamycin (Champion TM pET200 Directional TOPO ® Expression Kit, Invitrogen).
Chọn khuẩn lạc E coli BL21 Star TM (DE3) đã được biến nạp và nuôi cấy trong 10 mL môi trường LB có 50 mg/L kanamycin ở 37°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút để tăng sinh khối, sau đó tiến hành tách chiết DNA plasmid.
Sử dụng enzyme cắt hạn chế SacI để xác định plasmid tái tổ hợp và tiến hành phân tích trình tự bằng phương pháp đánh dấu huỳnh quang dideoxy-terminator trên hệ thống 3130 ABI của Applied Biosystem.
4.2.3 Biểu hiện của gen protease trung tính
Tế bào E coli BL21 Star TM (DE3) chứa vector sản phẩm PCR của gen protease trung tính được nuôi cấy ở 37°C với tốc độ 200 vòng/phút đến khi đạt OD600 là 0,5 Sau đó, bổ sung IPTG 0,5 mM và nuôi ở 25°C Sinh khối tế bào được thu nhận qua ly tâm 5 phút ở 6.000 vòng/phút, lấy mẫu mỗi giờ trong 7 giờ Tế bào được phá vỡ bằng siêu âm trong 3 phút, và protease tái tổ hợp được thu hồi bằng đệm chiết (Tris.HCl 0,02 M; NaCl 0,5 M; imidazol 0,05 M, pH 7,4) với tỷ lệ 1:4.
Sự biểu hiện của gen protease trung tính được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12% không có SDS, thực hiện ở điện thế 60 volt trong 2 giờ 30 phút Sau đó, gel được nhuộm bằng Coomassie Blue R-250 và hình ảnh thu được được phân tích bằng phần mềm Quality One (ver 4.1, BioRad).
4.2.4.Ảnh hưởng của một số nhân tố lên khả năng sản xuất enzyme protease trung tính ngoại bào
Môi trường YJ (20 g/L glycerol; 15 g/L tryptone; 20 g/L yeast extract; 2,5 g/L
Môi trường nuôi cấy khởi đầu được sử dụng bao gồm K2HPO4.12H2O, 0,16 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 0,25 g MgSO4.7H2O và 50 mg/L kanamycin với pH 7,0 (Yang và cs 2008) Quá trình nuôi cấy lắc được thực hiện trong bình tam giác 100 mL chứa 10 mL môi trường ở nhiệt độ 37 oC và tốc độ 200 vòng/phút.
Khi mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy đạt giá trị OD600 từ 0,5 đến 6, các tế bào sẽ được giữ ở 4 độ C trong 2 giờ để ngừng sinh trưởng trước khi thêm chất cảm ứng (Mierendorf và cs 2000) [47].
Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) được thêm vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ từ 0.05 đến 1 mM nhằm kích thích sản xuất protease trung tính ngoại bào Tế bào được nuôi ở nhiệt độ từ 14 đến 25 độ C để tối ưu hóa quá trình sản xuất enzyme này.
24 giờ sau khi cảm ứng, vai trò của ion Ca 2+ trong việc duy trì hoạt độ của protease trung tính đã được xác định ở nhiều nồng độ khác nhau, từ 5 đến 500 mM.
* Xác định nhanh hoạt tính protease
Kết quả nghiên cứu
Tạo dòng gen sản xuất protease
5.1.1 Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số từ chủng B subtilis C10 được tách chiết và điện di trên gel agarose 0,8% với đệm 1× TAE Sau đó, gel được nhuộm với EtBr và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (Gel Documentation, BioRad) Kết quả được trình bày trong hình 5.1.
Hình 5.1.Điện di DNA tổng số trên agarose 0,8% M: chuẩn kích thước DNA (lamda/HindIII), đường 1 và 2: DNA tổng số tách từ chủngB subtilis C10.
Nồng độDNA tổng số đượcxác định bằngmáy quang phổ(SmartSpec3000, BioRad)đạt 4 μg/μL đường 1 và 5,73μg/μL đường2.Độtinhsạchcủa DNA đượcxác địnhởbướcsóngλ260/280 nm cho kếtquả tương ứng là 1,68 và 1,72.
Mẫu DNA tổng số từ chủng B subtilis C10 cho thấy một dải băng sáng rõ nét ở phía trên của bản gel, không có vạch phụ nào Các mẫu DNA này nguyên vẹn và không bị đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu của Đỗ Thị Bích Thủy và cộng sự (2006) cho thấy dịch chiết protease ngoại bào từ chủng B subtilis C10 có hoạt độ mạnh và hoạt động hiệu quả trong khoảng pH trung tính đến kiềm Do đó, hai cặp mồi (NPF-F/NPF-R) và (NPC-F/NPC-R) đã được thiết kế dựa trên hai vùng của gen protease trung tính, bao gồm đoạn hoàn chỉnh và đoạn mã hóa, nhằm khuếch đại gen mã hóa protease Kết quả được trình bày trong hình 5.2.
Hình 5.2 minh họa sản phẩm PCR được khuếch đại bằng hai cặp mồi đặc hiệu NPF và NPC M thể hiện chuẩn kích thước DNA (lamda/HindIII), trong đó đường 1 là sản phẩm PCR đoạn mã hóa của gen protease và đường 2 là sản phẩm PCR đoạn hoàn chỉnh của gen protease.
Hai đoạn DNA có kích thước khoảng 1916 bp (NPF-F/NPF-R) và 1566 bp (NPC-F/NPC-R) đã được khuếch đại từ hệ gen B subtilis C10 Kết quả PCR cho thấy gen protease trung tính có thể hiện diện trong hệ gen này, với cả hai cặp mồi đều đặc hiệu cho gen protease trung tính mà không tạo ra sản phẩm phụ.
5.1.3 Tạo dòng sản phẩm PCR
Các sản phẩm PCR mã hóa gen protease có kích thước khoảng 1566 bp được tinh sạch và gắn vào vector pET/200D TOPO Vector tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào vi khuẩn E coli BL21 Plasmid tái tổ hợp được tách chiết và tinh sạch từ vi khuẩn E coli đã biến nạp Để kiểm tra plasmid tái tổ hợp, nó được cắt bằng enzyme hạn chế SacI và sản phẩm cắt được phân tích bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 5.3 Plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đ ược cắt bằng Sac I M: chuẩn kích thước
DNA (lamda/HindIII), đường 1: plasmid cắt bằng SacI.
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm có băng khoảng 7307 bp khi plasmid tái tổ hợp được cắt bởi SacI, tương ứng với kích thước vector 5741 bp và đoạn gen CDS khoảng 1566 bp Điều này xác nhận rằng chúng tôi đã chọn được dòng vi khuẩn E coli mang sản phẩm PCR của gen sản xuất protease Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn, cần thực hiện xác định trình tự nucleotide của đoạn DNA đã được gắn vào vector.
5.1.4 Xác định trình tự nucleotide của sản phẩm PCR Để đánh giá chính xác sự khuếch đại gen protease trung tính từ B subtilis C10 (ký hiệu là nprC10), sản phẩm PCR sau khi đ ược tạo dòng trong vector đãđược phân tích trình tự.Kết quả phân tích trình tự gennprC10 trình bàyởhình 5.4.
1 CACATGACAC TTGACTCATC TTGATATTAT TCAACAAAAA CAAACACAGG
61 CAATTTTGTC TAGTTATGTT AGTTTTTGTT GAGTATTCCA GAATGCTAGT
121 AATATAAAGT TTTCAGTATT TTCAAAAAGG GGGATTTATT GTG GGTTTAG
181 GTCTGTTGCT GTCGCTGCTT CGTTTATGAG TTTATCAATC AGCCTGCCAG
241 TGCTGAAGGT CATCAGCTTA AAGAGAATCA AACAAATTTC CTCTCCAAAA
301 GCAATCAGAA CTCTC CGCAC CAAATGACAA GGCTGTCAAG CAGTTTTTGA
361 CAACATTTTT AAAGGTGACC CTTCCAAAAG GCTGAAGCTT GTTGAAAGCA
421 CCTTGGATAC AAGCACTTTC GATATGCGCC TGTCGTTAAC GGAGTGCCAA
481 GCAAGTGATC GTTCACGTCG ATAAATCCGA TAATGTCTAT GCGGTCAATG
541 CAATCAATCT GCTGCAAAAA CAGATAACAG CCAAAAAGTC TCTTCTGAAA
601 ACTCGCTTTC AAAGCTATCG GCAAATCACC AGACGCTGTT TCTAACGGAG
661 CAGCAATAAA GCCGAATTAA AAGCGAT AGA AACAAAAGAC GGCAGCTATC
721 CGACGTGACG ATTCGCTATG TCGAGCCTGA ACCTGCAAAC TGGGAAGTCT
781 CGAAACAGGC AGCATTTTAA AACAGCAAAA TAAAGTAGAA CATGCCGCCG
841 CGGAACAACT CTAAAGGGCG CAACTGTTCC TTTGAACATC TCTTATGAAG
901 TGTTCTAAGA GATCTTTCAA AACCAACAGG CACCCAAATC ATCACATATG
961 CAGACAAAGC CGCCTTCCGG GCACGCTTGT CTCAAGCACA ACGAAAACAT
1021 ATCACAGCGG GCAGCCGTTG ACGCACACTA TAACCTCGGT AAAGTGTACG
1081 TTCAAACTTT AAACGAAACA GCTATGATAA CAAAGGCAGT AAAATCGTTT
1141 CTACGGCACT CAATACAATA ACGCTGCATG GACAGGAGAC CAGATGATTT
1201 CGACGGTTCA TTCTTCTCTC CGCTTTCCGG CTCATTAGAT GTGACAGC GC
1261 ACATGGCGTC ACCCAAGAAA CAGCCAACTT GATTTATGAA AATCAGCCAG
1321 CGAGTCTTTC TCTGACGTAT TCGGG TATTT TAACGATACA GAAGACTGGG
1381 AGACATTACG GTCAGCCAGC CTGCTCTTCG CAGCCTGTCC AACCCTACAA
1441 GCCTGACAAT TACGCCAATT A TAGAAACCT TCCAAACACA GATGAAGGCG
1501 TGTACACACA AACAGCGGAA TTCCAAACAA AGCCGCTTAC AACACCATCA
1561 TGTATCTAAA TCACAGCAAA TCTATTACCG TGCGTTAACA ACGTACCTCA
1621 CACGTTCAAA GATGCCAAGG CAGCTCTCAT TCAGTCTGCC CGTGACCTCT
1681 TGATGCCGCT AAAGTTGAAG CAGCCTGGAA TGCTGTTGGA TTG TAATATT
1741 TGAGATCCCT CAGGCTTTTA TTGTTACATA TCTTGATTTC TCTCTCAGCT
1801 AAAGATGCTG CCATGAGACA GAAAACCGCT CCTGATTTGC ATAAAGAGGG
1861 AAGTGCGCAT TTTATAAAAG CTAATGATTC AGTCCACATA ATTGATAGAC GAATTC
Trình tự nucleotide của đoạn CDS gen npr C10 dài 1566 bp cho thấy những nucleotide khác biệt so với gen nprE, bao gồm CG, GCCG, T, CG, G và CC, được in đậm và gạch chân Dựa trên trình tự nucleotide này, chuỗi amino acid dự đoán cho NPRC10 cũng được xác định, trong đó các amino acid khác biệt so với protease trung tính nprE, như K, P và S, được in đậm và đánh dấu sao.
Kết quả ở hình 5.4 cho thấy đoạn DNA được tạo dòng từ chủngB subtilis C10 có chiều dài
Gen mã hóa protease trung tính có tổng cộng 1566 nucleotide, với vùng mã hóa bắt đầu từ codon GTG tại nucleotide thứ 161 và kết thúc tại codon TAA ở vị trí 1762 Trình tự amino acid của protease này có sự tương đồng cao với sản phẩm của gen nprE, đạt 518/521 amino acid (99%), với chiều dài 521 amino acid và khối lượng phân tử khoảng 57,3 kDa Tín hiệu peptide tương ứng được xác định từ nucleotide vị trí 161 đến 250 (amino acid từ vị trí 1 đến 30), trong khi trình tự hoạt động (mature sequence) bắt đầu từ nucleotide 824 đến 123, tương ứng với amino acid từ 222 đến 521.
Biểu hiện gen protease trong vi khuẩn E coli
5.2.1 Phân tích biểu hiện của gen protease bằng điện di SDS
Tế bào E coli BL21(DE3) mang vector pET200/D -TOPO chứa gen mã hóa protease nprC10 được nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycin 50 mg/l, lắc ở 200 vòng/phút tại 37 °C Khi OD600 đạt 0,5, IPTG được thêm vào với nồng độ 0,5 mM để kích thích sản xuất protease Mẫu tế bào được thu thập từ 1 đến 7 giờ sau khi cảm ứng và sự biểu hiện của protein tái tổ hợp được phân tích bằng SDS-PAGE.
Hình 5.5 thể hiện kết quả điện di SDS-PAGE của protein tổng số từ dịch chiết tế bào E coli Trong đó, WM là chuẩn khối lượng phân tử protein từ 97-14 kDa ĐC1 đại diện cho protein của E coli không mang vector tái tổ hợp và không được cảm ứng IPTG, trong khi ĐC2 là protein của E coli có vector tái tổ hợp nhưng cũng không được cảm ứng IPTG Các mẫu từ 1 đến 7 là protein của E coli có mang vector tái tổ hợp và được cảm ứng IPTG với nồng độ 0,5 mM trong khoảng thời gian từ 1 đến 7 giờ.
Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy sự khác biệt trong dịch chiết protein tổng số nội bào của các mẫu tế bào thu tại các thời điểm khác nhau sau khi được cảm ứng bằng IPTG, với các đường từ 1-7.
Bài viết đề cập đến sự xuất hiện của một băng protein đậm với khối lượng phân tử khoảng 61 kDa, bao gồm vùng mã hóa gen protease có 521 amino acid (57,3 kDa) và phần DNA chứa đuôi ái lực "histidin" của vector pET200/D TOPO với 35 amino acid (3,7 kDa) Sản phẩm protease này không được phát hiện trong protein tổng số của E coli mang vector tái tổ hợp không được cảm ứng IPTG (ĐC2) và E coli không mang vector tái tổ hợp có cảm ứng IPTG (ĐC1).
Hệ thống biểu hiện vector pET/200D TOPO với gen sản xuất protease đã hoạt động ổn định, tạo ra một loại protein mới với băng protein đậm Protein này có khối lượng phân tử tương ứng với tính toán của protein dung hợp.
Bằng điện di SDS-PAGE, chúng tôi xác định sự hiện diện của một băng protein mới, cần nghiên cứu xem băng protein này có phải là protease tái tổ hợp với chức năng sinh học hay không Protease là enzyme có khả năng thủy phân protein Để khẳng định chắc chắn hơn về hoạt tính của sản phẩm protease tái tổ hợp, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp vòng phân giải casein và phản ứng Anson cải tiến.
5.2.2 Xác định nhanh hoạt tính của protease
Lấy 50 àl dịch chiết nội bào vi khuẩnBL21 Star TM (DE3) mang vector plasmid tỏi tổ hợp và chủngBL21 Star TM (DE3) không biến nạp cho vào lỗ khoan theo thứ tự là số 1 và số 2 của đĩa thạch có môi trường chứa 0,8% agar và 0,1% casein.Ủ đĩa thạch ở 50 0 C trong 5 giờ Sau đó, nhuộm bằng dung dịch amidoblack 10B 0,1% để đánh giá hoạt tính protease, kết quả thể hiện ở hình 5.6.
Hình 5.6 Hoạt động của protease trung tính thể hiện trênđĩa thạch chứa casein 0,1%.(1): Chứa
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 50 µL dịch chiết nội bào từ vi khuẩn E coli BL21 Star TM (DE3) biến nạp được cảm ứng bằng IPTG để kiểm tra sự sản xuất protease Kết quả cho thấy ở vị trí (1) xuất hiện vòng phân giải màu trắng khi nhuộm bằng thuốc nhuộm amidoblack 10B, điều này chứng tỏ rằng chủng vi khuẩn tái tổ hợp của chúng tôi mang gen sản xuất protease, được kích thích bởi IPTG, và sản phẩm protease này có khả năng phân giải protein, cụ thể là casein.
5.2.3 Phân tích hoạt độ của protease
Tế bào vi khuẩn E coli BL21 Star TM (DE3) mang vector tái tổ hợp được nuôi cấy và cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở 25 oC Sau quá trình này, các tế bào được tách chiết để thu protein tổng số và xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến.
Hình 5.7 Hoạt độ riêng protease tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau sau khi cảm ứng bằng IPTG.
S p e c if ic a c ti v it y o f p ro te a s e ( u n it s /m g ) Ho ạ t đ ộ ri ê n g c ủ a p ro te a s e ( u /m g )
Sau 4 giờ cảm ứng bằng IPTG với nồng độ 0,5 mM ở nhiệt độ 25 oC, dịch chiết nội bào của E coli đạt hoạt độ riêng cao nhất khoảng 0,11 unit/mg, như thể hiện trong đồ thị hình 5.7.
Protease dung hợp mà chúng tôi thu được có khả năng thủy phân casein Gen protease đã được tái tổ hợp với vector pET/200D TOPO và được chuyển vào vi khuẩn E coli BL21 (DE3), cho thấy hoạt động tốt với quá trình phiên mã và dịch mã ổn định, tạo ra sản phẩm protease có hoạt tính sinh học.
Khảo sát ảnh hưởng của một số nhân tố l ên khả năng sản xuất protease
Quá trình nuôi cấy khởi đầu của tế bào E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp được tiến hànhở
Tại nhiệt độ 37°C, quá trình sinh trưởng của tế bào E coli tái tổ hợp diễn ra từ 1 đến 24 giờ, với pha lag kéo dài khoảng 4 giờ, pha sinh trưởng từ 4 đến 21 giờ và pha chết Pha sinh trưởng ổn định ngắn và khó xác định, trong khi mật độ tế bào liên tục tăng từ 4 đến 24 giờ, đạt giá trị OD600 là 7,15 Các thí nghiệm đánh giá sự biểu hiện của protease trung tính được thiết kế dựa trên đặc điểm sinh trưởng này.
Hình 5.8.Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn E coli BL21(DE3) tái tổ hợp
5.3.1.Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Ảnh hưởng của nhiệt độ cảmứng lên hoạt độ thủy phân của enzyme được xác định bằng cách nuôi cấy tế bào E coli tái tổ hợp trong môi trường YJ ở 14 đến 25 o C, tốc độ lắc 200
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 vòng/phút sau 20 giờ cảmứng (Bảng 5.1) Môi trường nuôi cấy được bổ sung 0,1 mM IPTG khi giá trị OD600 đạt đến 1.
Bảng 5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên biểu hiện của protease trung tính ngoại bào
Nhiệt độ cảm ứng ( o C) Hoạt độ chung (u/ml) Hoạt độ riêng (u/mg)
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo Duncan’s test (p < 0.05).
Kết quả từ bảng 5.1 cho thấy enzyme protease được tiết ra môi trường ngoại bào ở tất cả các mức nhiệt độ kiểm tra, với hoạt độ cao nhất đạt được ở 20 oC, cụ thể là 0,25 u/ml cho hoạt độ chung và 0,44 u/mg cho hoạt độ riêng Ngược lại, hoạt độ cao nhất của protease nội bào chỉ đạt 0,06 u/ml và 0,04 u/mg Đáng chú ý, khoảng 80% enzyme protease sau khi tổng hợp đều được tiết ra môi trường ngoại bào.
5.3.2.Ảnh hưởng của thời gian cảmứng
Sau khi bổ sung IPTG vào môi trường, protein tái tổ hợp mới được tổng hợp, nhưng lượng protein không tỷ lệ thuận với thời gian cảm ứng (Xu và cs 2006) Thời gian cảm ứng tối ưu được xác định bằng cách đo hoạt độ của protease ngoại bào mỗi giờ trong khoảng từ 4 đến 24 giờ, với điều kiện 0,1 mM IPTG ở 20°C và OD600 = 1 Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 5.2.
Bảng 5.2.Ảnh hưởng của thời gian cảmứng lên biểu hiện của protease trung tính ngoại bào
Hoạt độ protease trong môi trường ngoài bào tăng từ 4 đến 19 giờ, đạt giá trị cực đại là 0,28 u/ml cho hoạt độ chung và 0,52 u/mg cho hoạt độ riêng Tuy nhiên, cả hai loại hoạt độ này đều giảm mạnh sau 19 giờ cảm ứng.
5.3.3.Ảnh hưởng của nồng độ IPTG Đối với các vector biểu hiện chứa T7lac promoter, nồng độ IPTG cần phải được tối ưu vì chúngđóng vai trò quan trọng trong việc biểu hiện của protein tái tổ hợp cũng như gây độc cho sự sinh trưởng của tế bào (Li và cs 2004) [44] Trong thí nghiệm này, IPTG được thử nghiệmở các nồng độ từ 0,05 đến 1 mM, tế bào được nuôi cấyở 20 o C và mật độ tế bào ban đầu tương ứng với OD600 = 1, hoạt độ của enzyme được xác định 19 giờ sau khi cảmứng và kết quả được trình bày trong bảng 5.3 Hoạt độ chung đạt cao nhất là 0,27 u/ml tại nồng độ IPTG là 0,1 mM (hoạt độ riêng là 0,54 u/mg)
Bảng 5.3.Ảnh hưởng của nồngđộ IPTG lên biểu hiện của protease trung tính ngoại bào
Nồng độ IPTG (mM) Hoạt độ chung (u/ml) Hoạt độ riêng (u/mg)
5.3.4.Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên sản xuất protease
Sinh khối tế bào lớn trước khi cảm ứng là yếu tố quan trọng để tối ưu hóa khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp Việc kích hoạt tổng hợp protein tái tổ hợp dư thừa phụ thuộc vào thời điểm cảm ứng và mật độ tế bào phù hợp Nghiên cứu của Gupta và cộng sự (2009) chỉ ra rằng mật độ tế bào ảnh hưởng đến sản xuất protease ngoại bào, được xác định khi bổ sung 0,1 mM IPTG ở các giai đoạn khác nhau của pha sinh trưởng, với mật độ tế bào từ 0,5 đến 6 Hoạt độ protease ngoại bào được đo sau 19 giờ cảm ứng ở nhiệt độ 20°C.
Bảng 5.4 Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên biểu hiện của protease trung tính ngoại bào
Mật độ tế bào (OD 600 ) Hoạt độ chung (u/ml) Hoạt độ riêng (u/mg)
Hoạt độ riêng của enzyme protease thay đổi từ 0,36 u/mg đến 1,01 u/mg trong các thời điểm cảm ứng khác nhau Hoạt độ cao nhất được ghi nhận vào giữa pha sinh trưởng, với giá trị OD600 đạt 2 Tuy nhiên, sự khác biệt về hoạt độ riêng trong khoảng OD600 từ 1 đến 2,5 không có ý nghĩa thống kê Đáng chú ý, hoạt độ thủy phân của enzyme giảm nhanh khi mật độ tế bào đạt 3 hoặc cao hơn trước khi cảm ứng, tức là vào cuối pha sinh trưởng.
5.3.5.Ảnh hưởng của nồng độ Ca 2+ lên sản xuất protease ngoại bào
Calcium đóng một vai trò hết sức quan trọng trong sự ổn định của enzyme protease [17,
23, 51] Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng Ca 2+ để kiểm tra vai trò của các kim loại hóa trị
Khi mật độ tế bào đạt 2 tại OD600, protease ngoại bào được sản xuất bằng cách thêm Ca 2+ với các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 500 mM) vào môi trường cảm ứng cùng với IPTG Hoạt động của enzyme được xác định sau 19 giờ cảm ứng ở nhiệt độ 20 o C.
Bảng 5.5 Ảnh hưởng của Ca 2+ lên sự ổn định của hoạt độ trung tính protease ngoại bào
Nồng độ Ca 2+ (mM) Hoạt độ chung (u/ml) Hoạt độ riêng (u/mg)
Kết quả từ Bảng 5.5 cho thấy ion Ca 2+ có khả năng nâng cao hoạt tính thủy phân của enzyme protease tái tổ hợp, với hoạt độ riêng đạt cực đại 1,83 u/mg (hoạt độ chung 0,86 u/ml) khi bổ sung Ca 2+ ở nồng độ 10 mM Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu khi bổ sung Ca 2+ ở nồng độ từ 5 đến 50 mM (p
