Nghiên cứu hoàn thiện que thử phát hiện nhanh virut rubella

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

2.1.1 Hóa chất và kháng thể

- Dung dịch hạt nano vàng: Phòng thí nghiệm Proteomic thuộc Trung tâm

Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học thuộc trường Đại học Bách Khoa điều chế hạt nano vàng

- Các hóa chất dùng trong điện di polyacrylamide: Acrylamide, Tris–HCl,

- Thang chuẩn protein được sử dụng có tên: “GangNam-STAIN Prestained

Protein Ladder” của hãng iNtRON Biotechnology gồm có 12 băng, kích thước thang chuẩn từ 10 kDa đến 245 kDa

- Gel sắc kí: protein A-Sepharose của hãng GE Healthcare

- Đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0.2g; Na2HPO 4

1.44g; KH 2 PO 4 0.24g Dẫn H2O đến 100 ml

- Dung dịch BSA (Sigma, Mỹ)

- Dung dịch thuốc thử Bradford

- Huyết thanh thỏ kháng virus Rubella do Trung tâm Nghiên cứu sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế (POLYVAC) cung cấp

- Kháng thể dê tinh sạch kháng kháng thể thỏ (Arista Biologicals, Mỹ)

2.1.2 Các vật liệu chế tạo que thử và kiểm tra

- Miếng cộng hợp (Hãng Biotech - Conjugate pad ZC J2, size 21x20 cm)

- Miếng thấm mẫu (Hãng Biotech - Sample pad FM Y2)

- Vỏ nhựa (Xuất xứ Trung Quốc)

- Miếng thấm hút (Hãng Biotech –Absorbent pad H5076, size 20x30 cm)

Tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa, các thiết bị hiện đại được sử dụng nhằm phục vụ cho các nghiên cứu chuyên sâu trong lĩnh vực sinh học và công nghệ thực phẩm Các thiết bị này không chỉ hỗ trợ trong việc phát triển các sản phẩm sinh học mà còn nâng cao chất lượng nghiên cứu và đào tạo cho sinh viên.

- Máy AUTOKUN (Sản xuất tại Ấn Độ, phân phối bởi công ty BCE Việt

- Máy CAMAG (Sản xuất tại Thụy Sĩ, phân phối bởi công ty BCE Việt

- Kim tiêm (phụ kiện đi kèm theo máy CAMAG)

- Lò lai phân tử (UVP Hybrid, Mỹ)

- Cân kỹ thuật TE 612 (Sartorius, CHLB Đức)

- Cân phân tích CPA 324S (Sartorius, CHLB Đức)

- Tủ cấy vô trùng Class II Type A2 (ESCO)

- Tủ lạnh sâu – 20 o C (Sanyo, Nhật Bản)

- Tủ lạnh sâu – 80 o C (Sanyo, Nhật Bản)

- Máy đo pH (Mettler Toledo)

- Máy ly tâm Eppendorf (Eppendorf 5415C, CHLB Đức)

- Máy votex Delta Mixer (Taitex, Nhật Bản.)

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tinh sạch kháng thể kháng Rubella bằng protein A Để tinh sạch kháng thể kháng Rubella, chúng tôi sử dụng sắc ký ái lực đặc hiệu protein A trên hệ thống AKTA FPLC với quy trình như sau:

- Gel protein A - sepharose được nhồi vào cột sắc kí Mono TM với thể tích là

- Cột được cân bằng với 10 lần thể tích cột ở tốc độ 1ml/phút bằng đệm

- Bơm 2ml huyết thanh thỏ chứa kháng thể kháng virut Rubella vào cột với tốc độ bơm 1ml/phút

- Rửa cột bằng đệm 50mM Tris-HCl, pH 7.2 với thể tích gấp 40 lần thể tích cột Nhằm loại bỏ các protein không bám cột

- Kháng thể đi ra khỏi cột bằng dung dịch 0.1M Glycine, pH 2.7

- Trung hòa dịch đi ra khỏi cột bằng đệm 1M Tris-HCl, pH 9.0

Kháng thể tinh sạch sẽ được pha trộn với đệm Tris-HCl và glycine, sau đó được rửa bằng dung dịch PBS với pH 7.4 Quá trình này sử dụng cột Amicon Ultra-4 30K (Millipore, Mỹ) và ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 20 phút Quy trình này cần được lặp lại 3 lần để đảm bảo hiệu quả tối ưu.

Nồng độ kháng thể tinh sạch sau khi cô thu được sẽ được xác định bằng phương pháp Bradford Để kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể, chúng tôi sẽ sử dụng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12% kết hợp với nhuộm Coomassie Brilliant Blue.

2.2.2 Phương pháp điện di SDS – PAGE Điện di trên gel polyacrylamide là kỹ thuật để phân tách các protein theo tính linh động trong điện tích của chúng (phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi polypeptide, khối lượng phân tử, cấu trúc protein, các biến đổi sau dịch mã và các yếu tố khác,…)

- Lắp khung bản gel bằng kính có kích thước 10 cm x 10 cm x 0,1 cm vào giá cố định

- Trộn đều hóa chất theo tỷ lệ, hàn đáy, tra gel tách vào trước

- Đổ lớp nước (hoặc Isopropanol) lên phía trên gel tách tránh sự oxi hóa hoặc bay hơi của gel, đợi gel tách khô (khoảng 30 phút – 60 phút)

- Sau khi gel tách khô, đổ nước và tra gel cô lên phía trên và cài lược tạo giếng

Tránh tạo bọt khí khi thực hiện quá trình điện di Sau khi đợi khoảng 30 phút cho gel cô đông, hãy lắp bản gel vào bể điện di Đổ dung dịch điện di đầy buồng và đảm bảo ngập chân bản gel Cuối cùng, rút lược và rửa giếng để hoàn tất quy trình.

Mẫu biến tính được tra vào các giếng với thể tích đồng nhất, sử dụng cường độ dòng điện 1 mA cho gel cô và 2 mA cho gel tách Thời gian quan sát vạch điện di nên dừng lại sau khoảng 1 giờ để đạt được kết quả phù hợp.

Nhuộm gel bằng Comassive Brilliant Blue là một quá trình quan trọng trong phân tích protein Đầu tiên, cần nhẹ nhàng gỡ bản gel và cố định bản gel bằng dung dịch cố định trong 5 phút Sau đó, tiến hành nhuộm gel với dung dịch nhuộm và lắc nhẹ cho đến khi vạch protein hiện rõ.

Phương pháp xác định hàm lượng protein này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện tới 1 µg protein với quy trình đơn giản và không tốn nhiều thời gian Một trong những ưu điểm lớn của phương pháp này là khả năng ít bị ảnh hưởng bởi các hóa chất trong nghiên cứu protein, đặc biệt là amoniumsulfate.

Phương pháp xác định protein sử dụng sự thay đổi bước sóng hấp thu của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong môi trường acid, thuốc nhuộm có màu đỏ cam với bước sóng cực đại 465 nm, nhưng khi kết hợp với protein, màu chuyển sang xanh dương và hấp thu cực đại ở 595 nm Để xác định lượng protein trong mẫu, cần xây dựng đường chuẩn từ dung dịch protein chuẩn đã biết nồng độ Sau khi trộn dung dịch protein với thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền trong 1 giờ Sử dụng máy quang phổ kế để đo độ hấp thụ (ODx), từ đó xác định lượng protein trong mẫu, đồng thời thực hiện đối chứng với HCl (ODo).

Giá trị OD được tính bằng công thức OD = ODx – ODo Để xác định lượng protein trong mẫu dung dịch, ta sử dụng đường chuẩn từ giá trị OD trên trục tung, từ đó suy ra nồng độ protein tương ứng trên trục hoành.

2.2.4 Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng

Nghiên cứu này tập trung vào việc gắn kháng thể kháng Rubella lên bề mặt hạt nano vàng thông qua phương pháp hấp phụ vật lý Sau khi tinh sạch, kháng thể được nhỏ vào dung dịch chứa hạt nano vàng ở pH phù hợp, kết hợp với Bovine Serum.

Albumin (BSA) được thêm vào dung dịch để lấp đầy các vị trí trống trên bề mặt hạt nano sau khi các phân tử kháng thể đã gắn kết Vai trò của BSA là ngăn chặn sự bắt cặp không đặc hiệu trên bề mặt hạt vàng, từ đó đảm bảo phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể diễn ra hiệu quả.

Hình 2.1 Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng

Việc tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng được thực hiện theo Zhang et al,

- Dung dịch hạt nano vàng ban đầu OD520 = 10,0 được điều chỉnh tới pH thích hợp khi bổ sung 0,2 M K2CO3

- Kháng thể được thêm vào dung dịch trên, trộn nhanh và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 90 phút

Thêm 10 µl 10% BSA vào dung dịch AuNPs đã gắn kháng thể, khuấy đều và ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng BSA giúp phủ kín bề mặt hạt nano vàng không liên kết với kháng thể, ngăn chặn sự kết hợp không đặc hiệu với kháng nguyên.

Dung dịch được ly tâm ở tốc độ 8000 rpm trong 5 phút tại 4oC, thu được tủa và loại bỏ phần dịch nổi Tủa này chứa các hạt vàng đã gắn kháng thể và được chặn bằng BSA.

- Rửa phần tủa thu được lặp lại 2 lần với 20mM sodium borate chứa 1% BSA, sau đó thu lại bằng li tâm ở 12000 rpm/5 phút, thu tủa, loại bỏ dịch

- Hòa tan trong đệm chứa: 20mM SB; 3% sucrose; 1% BSA

2.2.5 Phương pháp cố định kháng thể trên màng nitrocellulose

Máy CAMAG Linomat được sử dụng để phun kháng thể thỏ kháng virus Rubella với tốc độ 120 nanolit/giây Nồng độ kháng thể phun lên màng là 1 àg/que cho vạch T và 0.1 àg/que cho vạch C.

Màng có ở 2 vị trí phun kháng thể :

+ Kháng thể kháng Rubella ở vị trí kiểm tra (T)

+ Kháng thể kháng kháng thể thỏ ở vị trí đối chứng (C)

Kháng thể được pha trong dung dịch đệm thích hợp, đảo trộn đều và phun lên các vị trí đánh dấu trước

Sau khi phun kháng thể lên 2 vạch trên màng nitrocenllulose, chúng tôi tiến hành sấy khô màng và ghép que thử

2.2.6 Phương pháp chuẩn bị miếng cộng hợp

NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Tinh sạch kháng thể kháng virut Rubella

Huyết thanh thỏ được sản xuất từ Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, cho ra mẫu huyết thanh có hiệu giá miễn dịch đạt 8096UI đối với kháng nguyên Rubella Ngoài IgG, huyết thanh còn chứa nhiều thành phần khác như protein, chất điện giải, kháng thể và hormone Để tinh sạch kháng thể, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký ái lực với Protein A, một protein bề mặt có kích thước phù hợp.

Protein 42 kDa, được phát hiện trong thành tế bào của vi khuẩn Staphylococcus aureus, được mã hóa bởi gen SPA và điều chỉnh bởi cấu trúc liên kết với DNA, độ thẩm thấu tế bào cùng hệ thống ArlS-ArlR Với khả năng liên kết các immunoglobulin (Ig), Protein 42 kDa có năm vùng liên kết Ig tương đồng, gấp lại thành một cấu trúc ba vòng xoắn, cho phép nó tương tác với protein từ nhiều loài động vật có vú, đặc biệt là IgG Nó chủ yếu liên kết với chuỗi nặng trong vùng Fc của hầu hết các Ig, làm cho nó trở thành công cụ phổ biến trong quá trình tinh sạch IgG qua sắc ký ái lực Trong nghiên cứu này, cột Protein A-Sepharose (Invitrogen, Mỹ) được sử dụng để tinh sạch IgG từ huyết thanh thỏ kháng Rubella, với quy trình tinh sạch chi tiết được mô tả trong mục 2.2.1, thực hiện trên hệ thống tinh sạch tự động AKTA FPLC (GE Healthcare, Mỹ).

Cột Mono TM được nhồi Sepharose gel với thể tích 1 ml và được cân bằng bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 7,2 với tỷ lệ 10 lần thể tích cột ở tốc độ 1 ml/phút Tiếp theo, 2 ml mẫu huyết thanh thỏ chứa kháng thể kháng Rubella được đưa lên cột với tốc độ 1,0 ml/phút, sau đó cột được rửa sạch bằng 40 lần đệm 50 mM.

Để loại bỏ các thành phần không bám cột, chúng tôi sử dụng dung dịch Tris-HCl, pH 7,0 Kháng thể (IgG) được thu hồi khỏi cột bằng dung dịch 0,1M glycine, pH 2,7, và ngay lập tức được trung hòa bằng đệm 1M Tris-HCl, pH 9,0 để tránh biến tính Sau đó, đệm Tris-HCl và glycine trong dịch kháng thể được thay thế bằng đệm PBS 1X, pH 7,4 thông qua cột Amicon Ultra-4 30K (Millipore, Mỹ) Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Bradford, và để kiểm tra thành phần protein cũng như độ tinh sạch của kháng thể, chúng tôi thực hiện điện di trên gel polyacrylamide 12% và nhuộm bằng Coomassie.

Briliant Blue Kết quả được thể hiện trên Hình 3.2

Hình 3.1 Phổ điện di protein tinh sạch kháng thể kháng Rubella

1- Thang protein chuẩn (Intron, Hàn Quốc), 2 - Huyết thanh, 3 - Protein không bám cột , 4 - Kháng thể tinh sạch trước cô, 5 - Kháng thể tinh sạch sau cô

Hình 3.1 trình bày kết quả phân tích huyết thanh (kết quả từ giếng 2) cho thấy sự hiện diện của nhiều băng protein, trong đó băng đậm nhất có kích thước khoảng 66 kDa, chính là protein Albumin Albumin là loại protein chiếm tỷ lệ lớn hơn 90% trong huyết thanh.

Một băng đậm thứ hai có kích thước 50 kDa là IgG chuỗi nặng, trong khi băng protein mờ khoảng 25 kDa là IgG chuỗi nhẹ Kết quả từ phân đoạn không bám cột cho thấy không có sự xuất hiện của hai băng này, chứng tỏ IgG đã được giữ lại bởi protein A, trong khi các protein không bám đã bị loại bỏ Tại phân đoạn đẩy bằng glycine, chúng tôi thu được hai băng protein tương ứng với IgG chuỗi nặng và nhẹ, với kích thước 50 kDa và 25 kDa Điều này xác nhận rằng các protein không mong muốn đã hoàn toàn bị loại bỏ, và IgG đã bám đặc hiệu vào cột thông qua protein A Sau khi thay đổi đệm PBS 1X pH 7,4 bằng Amicon Ultra-4 30 kDa, lượng IgG tinh sạch được xác định là 18.03 mg/ml huyết thanh bằng phương pháp Bradford và được bảo quản ở -20 °C.

Nghiên cứu chế tạo que thử

3.2.1 Thi ết lập điều kiện thiết kế que thử

Trong nghiên cứu trước đây thuộc đề tài “Nghiên cứu phát triển que thử nhanh phát hiện sự nhiễm virut Rubella ở người” của tác giả Nguyễn Thị Ánh

Hòa đã thiết kế que thử nhận biết virus Rubella bằng cách sử dụng hai loại kháng thể khác nhau: kháng thể thỏ kháng virus Rubella kết hợp với hạt nano vàng và kháng thể lợn kháng virus Rubella cho vạch kiểm tra (vạch T) Mục tiêu của việc sử dụng hai loại kháng thể này là để hạn chế phản ứng chéo, nâng cao độ chính xác của que thử.

Việc sử dụng hai loại kháng thể sẽ không cần thiết nếu kháng thể từ một loài không có phản ứng chéo với nhau.

Trong một nghiên cứu về virus Rubella, chúng tôi nhận thấy rằng kháng thể thỏ kháng virus này không có phản ứng chéo Do đó, chúng tôi đã cải tiến quy trình thiết kế que thử bằng cách sử dụng kháng thể thỏ kháng virus Rubella, và đánh giá kết quả dựa trên thiết kế ban đầu.

Chúng tôi phát triển que thử theo nguyên lý kẹp sandwich, trong đó mẫu cần kiểm tra (Kháng nguyên Rubella) sẽ được giữ lại ở vạch phản ứng, kẹp giữa hai loại kháng thể Kháng thể đầu tiên là kháng thể đa dòng IgG thỏ chống Rubella, được gắn với các hạt nano vàng dạng keo và cố định trên miếng cộng hợp.

Kháng thể thứ 2 là kháng thể có nguồn gốc như kháng thể thứ nhất được phủ lên vị trí kiểm tra của que thử (vạch T) (Hình 3.2)

Hình 3.2 Thiết kế que thử Rubella (Hao Yang et al(2019))

(KT1: kháng thể thỏ; KT2:kháng thể thỏ; KT3: kháng thể kháng kháng thể thỏ)

Khi que thử tiếp xúc với mẫu, kháng nguyên sẽ di chuyển tới vùng cộng hợp và phản ứng với kháng thể thứ nhất, tạo thành phức hợp kháng nguyên - kháng thể - hạt nano vàng Nhờ lực mao dẫn, phức hợp này di chuyển tới vạch phản ứng, nơi nó bị giữ lại bởi kháng thể thứ hai, khiến kháng nguyên bị kẹp giữa hai kháng thể Dưới tác dụng của ánh sáng và mật độ hạt nano vàng cao, vạch màu xuất hiện, độ đậm nhạt của màu phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên trong mẫu Kháng thể thứ hai dư thừa sẽ tiếp tục di chuyển và bị giữ lại bởi kháng thể thứ ba tại vạch đối chứng, nơi cũng xuất hiện màu do hạt nano vàng Mẫu được coi là dương tính với virus Rubella khi có màu ở cả hai vạch phản ứng và đối chứng; âm tính khi chỉ có màu ở vạch đối chứng Sự xuất hiện màu ở vạch đối chứng đảm bảo que thử hoạt động bình thường Để tối ưu hóa que thử Rubella, chúng tôi đã thiết lập các điều kiện ban đầu.

+ 1àg khỏng thể thỏ khỏng virut Rubella được cộng hợp với 10 àl hạt nano vàng để tạo miếng cộng hợp

+ 1àg khỏng thể thỏ khỏng virut Rubella được cố định lờn màng nitrocellulose (vạch kiểm tra T)

+ Miếng cộng hợp và màng cố định kháng thể được xử lý ở 37 o C trong 30 phút

- Với cỏc điều kiện trờn chỳng tụi nhỏ 100 àl dung dịch virut Rubella đó được hòa tan trong dung dịch SB 20 mM

Trong khoảng thời gian từ 10 đến 15 phút, số lượng hạt nano vàng (màu đỏ) gắn kháng thể ngày càng tăng, làm cho màu sắc của vạch trở nên đậm hơn Điều này cho phép người dùng dễ dàng quan sát sự hoạt động của que thử bằng mắt thường.

Hình 3.3 Kết quả đánh giá khả năng nhận biết virut Rubella trên kháng thể thỏ

Kết quả hình 3.3 cho thấy khi nhỏ 100µl dung dịch SB 20Mm vào mẫu âm, không có dương tính giả xuất hiện, trong khi mẫu dương pha loãng kháng nguyên Rubella đến nồng độ 10^7 hạt virus/ml cho kết quả vạch tín hiệu rõ nét Điều này chứng tỏ rằng việc sử dụng kháng thể thỏ kháng virus Rubella là hợp lệ và không gây phản ứng chéo trong điều kiện thiết lập ban đầu Do đó, chúng tôi đã áp dụng kháng thể thỏ kháng virus Rubella cho việc tạo cộng hợp và phun que trong quá trình tối ưu các điều kiện tiếp theo Để hoàn thiện que thử với chất lượng và độ nhạy cao, chúng tôi đã tiến hành khảo sát và nghiên cứu các yếu tố như điều kiện tạo cộng hợp và điều kiện hấp phụ cộng hợp.

KT - hạt nano vàng lên miếng cộng hợp, cố định kháng thể lên màng nitrocellulose, nồng độ kháng thể phun trên vạch kiểm tra và vạch kiểm chứng

3.2.2 Nghiên c ứu tạo điều kiện cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng

3.2.2.1 Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp Để gắn kháng thể kháng Rubella lên bề mặt hạt nano vàng, nhóm nghiên cứu lựa chọn hấp phụ vật lý Quá trình hấp phụ bị ảnh hưởng rất nhiều bởi pH của môi trường Sự thay đổi pH dẫn đến sự thay đổi về bản chất của chất bị hấp phụ, các nhóm chức bề mặt, thế oxi hóa – khử, dạng tồn tại của hợp chất,… Người ta biết rằng các kháng thể sẽ hấp thụ trên bề mặt vàng bởi các tương tác ion và tương tác kỵ nước khi pH được duy trì xung quanh điểm đẳng điện của kháng thể Theo nghiên cứu trước đây cũng cho thấy kháng thể (IgG) có giá trị điểm đẳng điện nằm trong khoảng 6,5 – 9,5 Ở pH thấp hơn 6 và cao hơn 10, các hạt nano vàng bị kết tụ lại không còn ở trạng thái keo trong dung dịch Ngược lại, trong khoảng pH phù hợp, dung dịch cộng hợp vàng – kháng thể có màu đỏ tía Để xác định giá trị pH thích hợp đối với kháng thể kháng Rubella được sử dụng trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng tạo cộng hợp ở các điều kiện pH khác nhau gồm 6,5; 7,5; 8,5; 9,5

Hình 3.4 Màu sắc dịch cộng hợp tại các giá trị pH khác nhau sau khi bổ sung NaCl

Khi bổ sung NaCl 1M vào dung dịch cộng hợp, màu sắc dịch cộng hợp ở pH 6.5, 7.5, 8.5 là đỏ tía, cho thấy kháng thể liên kết tốt với hạt nano vàng Tại pH 9.5, dịch cộng hợp chuyển sang màu tím, cho thấy sự tồn tại của hạt nano vàng không liên kết với kháng thể, dẫn đến hiện tượng oxi hóa Để xác định giá trị pH tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành thử nghiệm tại các giá trị pH đã khảo sát.

Hình 3.5 Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng pH= 6.5 pH= 7.5 pH= 8.5 pH= 9.5

Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu âm có dấu hiệu dương tính giả tại các giá trị pH 6,5, 7,5 và 9,5, trong khi ở pH 8,5, mẫu âm không xuất hiện dương tính giả và mẫu dương thể hiện rõ nét Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn pH 8,5 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

3.2.2.2 Xác định hàm lượng kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng

Kháng thể thỏ đóng vai trò quan trọng trong việc bắt giữ kháng nguyên hạt virut Rubella và kết nối kháng nguyên với hạt nano vàng Nồng độ kháng thể ảnh hưởng lớn đến độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử, cũng như chi phí sản xuất que thử thành phẩm Do đó, việc tối ưu nồng độ kháng thể là cần thiết để đảm bảo rằng ngay với lượng kháng thể tối thiểu, tín hiệu vẫn rõ ràng Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm với các nồng độ kháng thể thỏ là 1,0μg, 3,0μg, 5,0μg và 7,0μg cho phản ứng cộng hợp trên que thử Bên cạnh đó, chúng tôi cũng khảo sát giá trị pH và bổ sung NaCl trong quá trình thí nghiệm.

1M vào các dịch cộng hợp với nồng độ kháng thể khác nhau

Hình 3.6 Màu sắc dịch cộng hợp tại các nồng độ kháng thể khác nhau sau khi bổ sung NaCl

Kết quả cho thấy dịch cộng hợp ở các nồng độ khác nhau đều có màu đỏ tía, không có sự khác biệt đáng kể về màu sắc, chứng minh rằng hạt nano vàng đã liên kết tối đa với kháng thể Để xác định lượng kháng thể phù hợp cho thử nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành tạo cộng hợp và thử que kiểm tra.

Hình 3 7 Xác định hàm lượng kháng thể cộng hợp với AuNPs thích hợp

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tối ưu hóa các điều kiện để phát triển que thử có độ nhạy cao nhất Cụ thể, lượng kháng nguyên được lựa chọn là 5 x 10^5 hạt virus/ml, thấp hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Thị Ánh.

Khi kiểm tra que thử với nồng độ virus là 10^7 hạt/ml, kết quả cho thấy vạch tín hiệu rõ nét khi nhỏ kháng nguyên ở nồng độ 3,0 μg/phản ứng Ở nồng độ 5,0 μg, vạch tín hiệu cũng được ghi nhận.

Ở nồng độ 7,0 μg, vạch tín hiệu không cho thấy sự tăng cường (Hình 3.7) Do đó, lượng kháng thể 3,0 μg được chọn để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.