TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Măng cụt
1.1.1 Giới thiệu về cây Măng cụt
Măng cụt, được biết đến như “Nữ hoàng trái cây”, là một loại trái cây nhiệt đới phổ biến ở Đông Nam Á Với vị ngọt, mát và hương thơm đặc trưng, măng cụt được ưa chuộng và có giá trị thương phẩm cao Đây là một trong những loại quả tiềm năng xuất khẩu của Việt Nam.
Măng cụt, hay còn gọi là mangosteen trong tiếng Anh, mangoustanier trong tiếng Pháp, và Sơn Trúc Tử trong tiếng Trung Quốc, là một loại trái cây nổi tiếng với nhiều tên gọi khác nhau Tên khoa học của nó là Garcinia mangostana L., trong đó "Garcinia" được đặt theo tên của nhà thực vật học Laurence Garcia, người đã nghiên cứu cây cỏ tại Ấn Độ vào thế kỷ XVIII Tên "Mangostana" và "mangosteen" đều có nguồn gốc từ từ Mã Lai "mangustan", cho thấy sự liên kết văn hóa giữa các quốc gia Tên gọi măng cụt ở Việt Nam và Thái Lan cũng có sự tương đồng đáng chú ý.
Bảng 1.1 Phân loại của Măng cụt [7]
Chi Garcinia bao gồm một số loài cây gần gũi, chủ yếu phân bố ở vùng Đông Ấn Trong số đó, Garcinia cambogia và Garcinia cowa nổi bật với quả “cowa-mangosteen” lớn hơn, có màu vàng apricot Ngoài ra, Garcinia indica, hay còn gọi là “Cocum-Conca”, cho quả chua và hạt màu tím, thường được sử dụng để làm giấm và ép lấy dầu.
Cây Măng cụt, nhờ khả năng thích nghi với khí hậu nóng ấm, được trồng phổ biến ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ và đồng bằng sông Cửu Long Tuy nhiên, số lượng trồng ở miền Trung là hạn chế, và cây này không được thấy ở miền Bắc.
Cây Măng cụt là loại cây tiểu mộc có chiều cao từ 6 đến 25 mét, lá không rụng và tăng trưởng chậm Các cành của cây mọc đối xứng, tạo thành tán hình chóp cân đối Khi bị tổn thương, cây tiết ra một chất nhựa màu vàng.
Lá cây có hình bầu dục hoặc ellip, mọc đối và có cuống ngắn, với kích thước dài từ 9-25 cm và rộng từ 4,5-10 cm Bề mặt lá dày, dai, màu lục sậm và hơi bóng ở mặt trên, trong khi mặt dưới có màu lục vàng và xám xịt Gân lá rõ ràng màu xanh, và lá mới có màu hồng.
Hoa có kích thước 4-5 cm, dày thịt, có thể là hoa đực hoặc hoa lưỡng phái trên cùng một cây Chúng thường mọc thành chùm từ 3-9 hoa ở đỉnh nhánh, với 4 đài hình trứng bầu dục và cánh hoa màu xanh có đóm đỏ bên ngoài, màu vàng đỏ bên trong Hoa có nhiều tiểu nhụy, trong đó tiểu nhụy đầy phấn hoa có khả năng thụ phấn, trong khi tiểu nhụy không khả năng thụ phấn Những hoa lưỡng tính thường mọc đơn lẻ hoặc thành cặp trên ngọn nhánh, cánh hoa có thể viền màu vàng xanh hoặc chủ yếu màu đỏ, và nở rất nhanh.
Quả có hình cầu, kích thước tương đương trái cam trung bình, với phần cuống mang đại hoa và núm nhụy ở đầu Vỏ quả bắt đầu màu xanh nõn chuối, sau đó chuyển sang đỏ và cuối cùng là tím sẫm khi chín, có đường kính từ 3,4 cm đến 7,5 cm Lớp vỏ dày từ 6 đến 10 mm, mặt cắt ngang màu đỏ, vị đắng và chứa nhiều chất mủ vàng cùng dung dịch nước ép màu tím Bên trong có từ 4 đến 8 múi hình tam giác màu trắng như tuyết, thịt quả ngọt mềm, trong khi một số trái có thể không hạt hoặc chứa từ 1 đến 5 hạt phát triển đầy đủ.
Hạt có hình dáng thuôn dài như quả trứng, hơi dẹt, kích thước khoảng 2,5 cm chiều dài và 1,6 cm chiều rộng Bên ngoài hạt được bao bọc bởi lớp thịt trắng, có vị hơi chua và hương vị chua rõ ràng, nổi bật với sự thơm ngon tuyệt vời.
Hình 1.1 Măng cụt (Garcinia mangostana L) 1.1.3 Công dụng
Vỏ quả Măng cụt đã được sử dụng từ lâu trong y học Trung Quốc và Ấn Độ với nhiều công dụng như trị tiêu chảy, kiết lỵ, đau bụng, làm khô vết thương, chống nhiễm trùng da, trị mụn trứng cá và chữa lở loét mãn tính Nước sắc từ vỏ quả còn được dùng làm dung dịch vệ sinh phụ nữ Nghiên cứu cho thấy các hợp chất trong vỏ quả Măng cụt có khả năng kìm hãm sự phát triển khối u, chống oxi hóa và kháng lại một số vi khuẩn như Staphylococcus aureus và Shigella dysenteriae.
flexneri, Escherichia coli, Vibrio cholerae [11]
Măng cụt đã trở nên phổ biến tại Mỹ, với nước ép Măng cụt trở thành một trong ba sản phẩm bán chạy nhất vào năm 2007 Loại trái cây này được người tiêu dùng ưa chuộng vì khả năng bổ sung dinh dưỡng từ thực vật, góp phần cải thiện và nâng cao sức khỏe.
Lớp thịt quả ăn được chỉ chiếm khoảng 1/3 khối lượng quả, với các số liệu từ Thái Lan cho thấy trong 100 g thịt quả ăn được có khoảng 79,2 g nước, 0,5 g chất đạm, một lượng nhỏ chất béo, 19,8 g chất đường và bột, 0,3 g chất xơ cùng 11 mg canxi.
17 mg P; 0,9 mg Fe; 4,2 àg Vitamin A; 66 mg Vitamin C Năng lượng trung bỡnh khoảng 340 kJ/100g
Măng cụt chứa nhiều hợp chất hóa học đa dạng, bao gồm tannin, nhựa (resin), pectin và đặc biệt là các dẫn xuất xanthon thuộc nhóm phenolic Các xanthon trong vỏ quả Măng cụt đã được xác định, trong đó có α-mangostin và β-mangostin.
Mangosteen contains several important compounds, including γ-mangostin, isomangostin, and normangostin, alongside various xanthones such as trioxyxanthon and pyranoxanthon Additionally, it features dihydroxy methyl butenyl xanthon, trihydroxy methyl butenyl xanthon, and pyrano xanthenon Other notable substances identified in mangosteen include garcinone A, B, C, D, E, mangostinon, garcimangoson A, B, C, gartanin, egonol, epicatechin, procyanidin, and benzophenon glucosid, although these are present in very low concentrations.
Hợp chất xanthon và một số dẫn xuất xanthon quan trọng trong vỏ quả Măng cụt [7], [8], [12], [13]
Xanthon là một hợp chất với khả năng chống oxi hóa vượt trội, mạnh hơn cả vitamin E và C Nó có cấu trúc phẳng với các vòng 6 carbon liên kết bằng nhóm carbonyl và nguyên tử oxi, tạo thành khung xương chính của phân tử Khung xương này được kết nối với các mạch bên khác nhau, hình thành nhiều loại xanthon với các đặc tính vật lý, hóa học và sinh học đa dạng.
Hình 1.2 Cấu trúc khung xương của phân tử xanthon
Măng cụt là loại thực vật nổi bật với hàm lượng dẫn xuất xanthon cao nhất, trong đó có hơn 60 loại xanthon được phát hiện, chủ yếu tập trung ở vỏ quả Đặc biệt, -mangostin là dẫn xuất xanthon chiếm tỷ lệ cao nhất, dao động từ 0,02-0,2% trọng lượng khô của quả, tiếp theo là -mangostin.
(2) và -mangostin (3), chiếm khoảng 0,016-0,07% Hàm lượng của các chất gacinone, đặc biệt là garcinone E (47) chiếm khoảng 0,01-0,035%
Bảng 1.2: Những dẫn xuất xanthon từ các phần khác nhau của cây Măng cụt
STT Tên chất Bộ phận STT Tên chất Bộ phận
1 α-Mangostin Quả, rễ, hạt, áo hạt 35 Thân
3 γ-Mangostin Quả, rễ 37 1-Isomangostin Quả
4 Fuscaxanthon C Rễ 38 11-Hydroxy-1- isomangostin Quả
Assiguxanthon-B trimethyl ete Thân 41 Mangostenon D Quả
8 Cowagarcinon B Thân, rễ 42 Garcimangoson C Quả
12 Garcinon D Quả, rễ 46 Garcinon B Quả
19 6-Deoxy-7- demethylmangostanin Quả 53 Tovophyllin B Quả
20 Mangostanin Quả, thân 54 Trapezifolixanthon Quả
Quả, hạt, áo hạt 57 BR-xanthon B Quả
24 Xanthon I Quả, hạt, áo hạt, rễ 58 Mangostenon A Quả
Hoạt tính sinh học của mangostin và các dẫn xuất xanthon khác
1.3 Hoạt tính sinh học của mangostin và các dẫn xuất xanthon khác
Vỏ quả Măng cụt chứa mangostin và các dẫn xuất xanthon, nổi bật với nhiều hoạt tính sinh học như kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxi hóa, kháng viêm và chống ung thư Cơ chế hoạt động của những hợp chất này đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu từ các nhà khoa học.
Mangostin và các dẫn xuất xanthon trong vỏ quả Măng cụt có khả năng diệt khuẩn mạnh, đặc biệt là đối với vi khuẩn P acnes, tác nhân chính gây mụn trứng cá, với nồng độ MIC là 1,95 µg/ml Ngoài việc gây mụn, P acnes còn liên quan đến nhiều bệnh viêm nhiễm khác như nhiễm trùng khớp, viêm màng trong tim, và viêm tủy xương Đáng chú ý, vi khuẩn này cũng được phát hiện ở tuyến tiền liệt, có thể liên quan đến nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt.
Mangostin có khả năng hạn chế sự phát triển của một số vi khuẩn kháng kháng sinh, đặc biệt là S aureus kháng methicillin và Enterococci kháng vancomycin Nghiên cứu của Iinuma và cộng sự (1996) cho thấy mangostin có thể làm giảm sự phát triển của S aureus kháng methicillin, hiệu quả này được tăng cường khi kết hợp với vancomycin Theo nghiên cứu của Sakagami và cộng sự (2005), mangostin có khả năng chống lại Enterococci kháng vancomycin với nồng độ MIC là 6,25 µg/ml và S aureus kháng methicillin với nồng độ MIC từ 6,25-12,5 µg/ml Những hoạt tính sinh học này của mangostin đóng góp quan trọng vào việc kiểm soát nhiễm trùng do các vi khuẩn này gây ra.
Vỏ quả măng cụt chứa mangostin và các dẫn xuất xanthon, có khả năng hỗ trợ cơ thể chống lại một số bệnh do vi khuẩn, đồng thời giúp ngăn ngừa nguy cơ bùng phát dịch bệnh do vi sinh vật kháng kháng sinh.
Các hợp chất xanthon được chiết xuất từ vỏ quả Măng cụt có khả năng kháng một số loại nấm gây hại cho thực vật như F oxysporum, A tenuis và D oryzae, góp phần giảm thiệt hại cho mùa màng Bên cạnh đó, α-mangostin cũng cho thấy hiệu quả kháng lại nấm C albicans, một loại nấm gây bệnh răng miệng ở người và động vật, với nồng độ MIC 1000 µg/ml.
MFC 2000 µg/ml Cơ chế kháng nấm của mangostin và các dẫn xuất xanthon vẫn chưa được làm rõ Các nghiên cứu cho rằng các hợp chất này có thể tấn công vào cấu trúc và chức năng của tế bào nấm, đặc biệt là ergosterol, lipid quan trọng nhất trong màng tế bào nấm, mà không có trong màng tế bào động vật.
Bệnh viêm mũi dị ứng, hen suyễn và viêm da liên quan đến đáp ứng miễn dịch được điều chỉnh bởi kháng nguyên đặc hiệu ở tế bào T-CD4, bạch cầu ái toan và tế bào mast Phản ứng viêm diễn ra qua hai giai đoạn: giai đoạn sớm với sự tham gia của histamine và serotonin, và giai đoạn muộn với các phân tử prostaglandin, lymphokine và monokine.
Nghiên cứu của Nakatani và cộng sự (2002) đã chỉ ra rằng cao chiết xanthon từ vỏ quả Măng cụt có khả năng ức chế sự giải phóng histamine và tổng hợp prostaglandin E2 Điều này cho thấy vỏ quả Măng cụt có tiềm năng trong việc sản xuất thuốc chống dị ứng và kháng viêm.
Nghiên cứu năm 2010 đã chỉ ra rằng -mangostin và -mangostin có khả năng ức chế tác động của lipopolysaccharide (LPS) trong plasma của người béo phì, ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen liên quan đến phản ứng viêm và kháng insulin ở đại thực bào Hai dẫn xuất xanthon từ vỏ quả măng cụt này có thể làm giảm khả năng kích thích biểu hiện interleukin-6 và yếu tố gây hoại tử (TNF).
1.3.4 Hoạt tính chống oxi hóa
Gốc tự do là sản phẩm tự nhiên của các quá trình sinh lý và sinh hóa trong cơ thể Khi số lượng gốc tự do tăng cao, hệ thống chống oxi hóa không còn đủ khả năng để bảo vệ tế bào, dẫn đến sự phá hủy protein, DNA và chất béo Điều này gây tổn thương tế bào, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất, làm tăng tốc độ lão hóa và có thể dẫn đến ung thư.
Williams và cộng sự (1995) đã chỉ ra rằng mangostin có khả năng thu dọn các gốc tự do, giúp ngăn chặn sự phá hủy LDL (lipoprotein mật độ thấp) trong ống nghiệm LDL rất dễ bị tấn công bởi các gốc tự do, dẫn đến sự biến đổi thành các dạng khác nhau, gây ra bệnh xơ vữa động mạch và tăng tích lũy cholesterol.
15 trong máu [24] Từ nghiên cứu này cho thấy mangostin có thể được sử dụng làm thuốc trong chống xơ vữa động mạch, giảm tỷ lệ bệnh tim mạch ở người
Nghiên cứu của Sun và cộng sự (2009) cho thấy mangostin có khả năng trung hòa các gốc hydroxyl tự do và superoxide anion, đồng thời ức chế sự hình thành MDA (malondialdehyde) trong quá trình nuôi cấy tế bào bạch cầu.
1.3.5 Hoạt tính chống ung thư Đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng chống ung thư của mangostin và các dẫn xuất xanthon có trong Măng cụt Matsumoto và cộng sự
Nghiên cứu năm 2004 đã chỉ ra rằng mangostin kích thích quá trình chết theo chu trình của tế bào ung thư máu HL60 thông qua hoạt động của caspase-9 và caspase-3, trong khi caspase-8 không bị ảnh hưởng Điều này gợi ý rằng mangostin có thể tác động gián tiếp lên các quá trình chuyển hóa trong ty thể, dẫn đến sự chết theo chu trình của tế bào Sau 1-2 giờ điều trị bằng mangostin, các dấu hiệu rối loạn chức năng ty thể như sự căng phồng, mất màng ty thể, suy giảm năng lượng ATP và tích tụ gốc tự do đã xuất hiện Tuy nhiên, không có dấu hiệu cho thấy mangostin ảnh hưởng đến protein BCL-2 và hoạt động của MAP-kinase, cho thấy mangostin ưu tiên tấn công ty thể ở giai đoạn sớm trong quá trình gây chết tế bào ung thư máu HL60.
Nghiên cứu của Nakagawa và cộng sự (2007) cho thấy rằng -mangostin có khả năng gây biến dạng và tiêu diệt tế bào ung thư ruột kết DLD-1 ở nồng độ 20 mol Trong môi trường nuôi cấy có chứa -mangostin, không có hoạt động của các caspase trong tế bào, và các endonuclease-G được giải phóng từ ty thể kèm theo sự giảm điện thế màng Hàm lượng phospho-Erk1/2 (MAP kinase) tăng lên ở giai đoạn sớm sau 1 giờ điều trị, sau đó giảm và lại tăng ở giai đoạn muộn Đồng thời, hàm lượng phospho-Akt giảm mạnh sau 6 giờ điều trị, trong khi hàm lượng microRNA-143 điều khiển ngược âm quá trình dịch mã của Erk5 tăng dần cho đến 24 giờ điều trị.
Tình hình nghiên cứu xanthon
Trong những năm gần đây, nghiên cứu về Măng cụt và xanthon đã gia tăng đáng kể, với số lượng báo khoa học liên quan ngày càng nhiều Cụ thể, từ năm 1980 đến 2008, đã có 158 báo cáo được truy xuất từ các cơ sở dữ liệu như Pubmed, Science Direct, Google Scholar và Scirus Đặc biệt, từ năm 2008 đến 2013, số lượng bài báo đã tăng lên tới 454, cho thấy sự quan tâm ngày càng lớn đối với Măng cụt và các hợp chất xanthon.
Cho đến nay, α-mangostin, một hợp chất xanthon có trong cây Măng cụt, đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học Hợp chất này lần đầu tiên được tách chiết từ nhựa cây Măng cụt vào năm 1930 và được mô tả là một hợp chất màu vàng Năm 1958, Yates và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu cấu trúc của α-mangostin, mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới cho hợp chất này.
18 mangostin [32] Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu các tác dụng sinh học của hợp chất mangostin được công bố
Nghiên cứu của Williams và cộng sự (1995) cho thấy mangostin có khả năng bảo vệ lipoprotein mật độ thấp (LDL) khỏi sự tấn công của các gốc tự do, từ đó giúp hạn chế nguy cơ xơ vữa động mạch do biến đổi của LDL.
Nghiên cứu của Iinuma và cộng sự (1996) cho thấy mangostin có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn S aureus kháng methicillin Điều này cho thấy mangostin có thể trở thành một loại thuốc tự nhiên hữu ích trong việc kiểm soát các bệnh viêm nhiễm do vi khuẩn kháng kháng sinh, góp phần ngăn chặn tình trạng dịch bệnh mất kiểm soát.
Nghiên cứu của Gopalakrishnan và cộng sự (1997) chỉ ra rằng các hợp chất xanthon, đặc biệt là mangostin, có khả năng ngăn chặn các loại nấm gây hại cho cây nông nghiệp như F oxysporum, A tenuis và D oryzae.
Nakatani và cộng sự (2002) đã chỉ ra rằng cao chiết xanthon từ vỏ quả Măng cụt có khả năng ức chế giải phóng histamine và tổng hợp prostaglandin E2, từ đó mangostin thể hiện tác dụng chống viêm và chống dị ứng Bên cạnh đó, Matsumoto và cộng sự (2004) cũng đã chứng minh rằng mangostin tác động lên quá trình chết theo chu trình của tế bào ung thư máu HL60, liên quan đến các hoạt động sinh hóa trong ty thể, với việc mangostin ưu tiên tấn công ty thể để gây ra sự chết theo chu trình ở giai đoạn sớm của các tế bào này.
Nghiên cứu của Sakagami và cộng sự (2005) cho thấy mangostin có khả năng chống lại vi khuẩn Enterococci kháng vancomycin với nồng độ MIC là 6,25 µg/ml Kết quả này một lần nữa khẳng định phát hiện của Iinuma và cộng sự (1996) về khả năng chống lại S aureus kháng methicillin với nồng độ MIC từ 6,25 đến 12,5 µg/ml.
Nghiên cứu của Nakagawa và cộng sự (2007) cho thấy rằng -mangotin có khả năng gây biến dạng và tiêu diệt tế bào ung thư ruột kết DLD-1 ở nồng độ 20 mol, thông qua việc tác động lên ty thể và làm giảm điện thế màng ty thể Bên cạnh đó, Sun và cộng sự (2009) cũng đã chỉ ra rằng mangostin đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân oxy hóa bằng cách trung hòa các gốc tự do.
α-mangostin, một hợp chất chiết xuất từ vỏ quả măng cụt, đã cho thấy khả năng ức chế sự hình thành MDA và gây chết tế bào ung thư trong nghiên cứu trên tế bào bạch cầu K562 Nghiên cứu của Shibata và cộng sự (2011) chứng minh rằng α-mangostin có thể tiêu diệt tế bào ung thư vú trong mô hình chuột bằng cách tiêm tế bào di căn BJMC3879luc2 mang đột biến p53 Hợp chất này kích thích quá trình chết theo chu trình ở giai đoạn giữa, ngăn chặn pha G1 và ức chế pha S trong chu kỳ tế bào, từ đó cho thấy α-mangostin có tiềm năng trong việc hạn chế sự phát triển và di căn của tế bào ung thư.
Mangostin sở hữu nhiều đặc tính sinh học nổi bật, bao gồm khả năng chống oxi hóa, chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn và kháng nấm Những nghiên cứu này mở ra tiềm năng ứng dụng mangostin trong việc phát triển thuốc để phòng ngừa và điều trị bệnh ở con người.
Măng cụt đã được sử dụng trong các bài thuốc dân gian để điều trị bệnh nhiễm trùng, đặc biệt là vỏ quả của nó, được ứng dụng trong sản xuất thuốc trị bệnh tiêu chảy Tuy nhiên, nghiên cứu và khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ Măng cụt vẫn chưa được chú trọng Đến nay, chỉ có một số ít nghiên cứu được công bố, chủ yếu tập trung vào việc tách chiết và khảo sát các đặc tính kháng khuẩn, chống viêm.
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự (2004) chỉ ra rằng polyphenol trong vỏ quả Măng cụt có khả năng ức chế sự sinh acid của vi khuẩn gây sâu răng S mutans Trương Văn Châu và cộng sự (2004) phát hiện các chất phenol trong dịch chiết ethanol và methanol từ vỏ quả Măng cụt có tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn P aeruginosa và S aureus Đào Hùng Cường và cộng sự (2009) đã tinh sạch và xác định năm dẫn xuất xanthon từ dịch chiết vỏ Măng cụt bằng dung môi ethanol thông qua phổ IR và LC-MS Tiếp theo, Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự (2010) đã phát triển chế phẩm XGC chứa các xanthon từ vỏ quả Măng cụt, chứng minh hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gram dương S mutans và S aureus.
Vào năm 2010, Đỗ Thị Tuyên và cộng sự đã tách thành công α-mangostin từ dịch chiết ethanol của vỏ quả Măng cụt bằng phương pháp sắc ký cột Hoạt chất α-mangostin tinh sạch này cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn B subtilis XL62, mở ra triển vọng ứng dụng trong điều trị ung thư phổi và ung thư máu.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp chiết xuất xanthon từ vỏ Măng cụt
Chiết là quá trình tách biệt và phân ly các chất bằng cách chuyển một chất hòa tan từ một pha lỏng sang một pha lỏng khác mà không hòa tan nó.
Mục đích của quá trình chiết làm giàu là chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu từ một thể tích lớn dung môi sang một thể tích nhỏ dung môi khác, nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu.
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng
2.1.1 Phương pháp chiết lỏng-lỏng
2.1.1.1 Cơ sở của quá trình chiết [37]
Sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hòa tan lẫn nhau là kết quả của tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng Điều này cho thấy rằng sự phân bố này phụ thuộc vào khả năng hòa tan của các thành phần trong từng pha.
Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst:
KA = CA/CB KA : Hằng số phân bố
Mục đích chính của việc chiết bằng dung môi là sơ bộ tinh chế hợp chất trong các chất lỏng A và B, trong đó nồng độ các chất hòa tan không hòa tan lẫn nhau.
Các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây thường có độ phân cực khác nhau, nhưng các thành phần tan trong nước thường bị bỏ qua Việc lựa chọn dung môi cho quá trình chiết là rất quan trọng; dung môi cần phải hòa tan các chất nghiên cứu, dễ loại bỏ, có tính trơ, không độc hại và khó bốc cháy Trước khi sử dụng, dung môi nên được cất sạch để đảm bảo hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi có tính phân cực cao hơn so với các hydrocarbon Các dung môi thuộc nhóm rượu được cho là có khả năng thấm tốt hơn vào màng tế bào, do đó, quá trình chiết xuất bằng những dung môi này sẽ mang lại hiệu quả cao hơn trong việc thu được sản phẩm.
22 lớn các thành phần trong tế bào
Cloroform có khả năng phân cực thấp hơn, cho phép nó rửa sạch các chất nằm ngoài tế bào Các ancol có khả năng hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cũng như các hợp chất phân cực trung bình và thấp, do đó khi chiết xuất bằng ancol, các chất này sẽ được hòa tan đồng thời Dung môi cồn trong nước, đặc biệt là dung dịch methanol, thường được coi là có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết xuất sơ bộ.
Sau khi chiết dung môi được tách ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá
30 ÷ 40 o C, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn
2.1.2 Phương pháp chiết rắn-lỏng [37]
Chiết soxhlet, một kỹ thuật cổ điển do nhà hóa học Franz Ritter Von Soxhlet phát triển, ban đầu được thiết kế để tách chất béo nhưng hiện nay đã được ứng dụng rộng rãi trong việc chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học Quy trình này sử dụng dung môi thích hợp để bốc hơi, ngưng tụ và tiếp xúc với vật liệu rắn, nhằm tách chất mục tiêu trong thiết bị chuyên dụng Tuy nhiên, với những hạn chế như làm việc gián đoạn, năng suất thấp và thời gian chiết dài, chiết soxhlet hiện chủ yếu được sử dụng trong nghiên cứu, phân tích và so sánh với các kỹ thuật hiện đại khác.
2.1.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm (maceration)
Quá trình chiết với kỹ thuật này bao gồm các bước cơ bản: đầu tiên, vật liệu được nghiền nhỏ để tăng diện tích tiếp xúc với dung môi; sau đó, dung môi thích hợp được trộn đều với vật liệu trong bình chiết Tiếp theo, dung môi chứa chất mục tiêu sẽ được tách ra khỏi bã, và bã sẽ được ép để thu hồi triệt để chất mục tiêu Cuối cùng, dung môi chứa chất mục tiêu sẽ được lọc để làm sạch Phương pháp này thường kết hợp với khuấy đảo để tăng cường quá trình khuếch tán của chất tan và làm mới dung môi trên bề mặt vật liệu, từ đó nâng cao hiệu suất chiết Ưu điểm của phương pháp này là chi phí thấp, đơn giản, dễ thực hiện và không yêu cầu thiết bị phức tạp, rất phù hợp cho việc chiết tách các hợp chất nhạy cảm.
23 cảm nhiệt nhưng có nhược điểm là thời gian chiết tách dài và có hạn chế về hiệu suất chiết
Kỹ thuật chiết xuất này bao gồm việc ngâm vật liệu trong dung môi mà không cần khuấy đảo Khi nồng độ chất tan trong vật liệu và dung môi gần đạt trạng thái cân bằng, dung môi sẽ được chiết rút từ từ ra khỏi bình chiết, đồng thời dung môi mới được đưa vào để tiếp tục chiết xuất chất mục tiêu Phương pháp này có thể thực hiện đơn giản hoặc theo cách phân đoạn, trong đó dịch chiết loãng được sử dụng làm dung môi cho vật liệu mới Mặc dù kỹ thuật này dễ áp dụng, nhưng thời gian chiết xuất dài và tiêu thụ nhiều dung môi.
2.1.3 Chiết tách bằng phương pháp siêu âm [37]
Phương pháp chiết siêu âm là một kỹ thuật hiện đại được nhiều nhà khoa học nghiên cứu, giúp phá vỡ cấu trúc tế bào và cải thiện hiệu quả chuyển khối Phương pháp này mang lại nhiều lợi ích nổi bật.
Khả năng phá hủy tế bào nhanh, mạnh hơn so với các phương pháp truyền thống
Giảm công đoạn xử lý nguyên liệu đầu vào
Giảm thời gian chiết xuất
Không cần gia nhiệt mà vẫn không làm giảm hiệu suất của quá trình chiết xuất
Giảm chi phí tách chiết
Dễ dàng thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho kết quả có tính lặp lại cao phù hợp với việc chuyển qui mô
2.1.4 Chiết tách bằng dung môi có hỗ trợ enzym
Kỹ thuật chiết xuất có enzym hỗ trợ (enzyme-assisted extraction method) là phương pháp sử dụng enzym để nâng cao hiệu quả chiết xuất các thành phần giá trị từ sản phẩm thiên nhiên Phương pháp này áp dụng các loại enzym có khả năng phân hủy đặc hiệu cấu trúc bao quanh tế bào thực vật, giúp tăng cường sự tiếp xúc giữa dung môi và chất chiết Trước đây, kỹ thuật này được xem là bí quyết công nghệ và thường được giữ kín bởi các nhà sản xuất.
Kỹ thuật chiết xuất có enzym hỗ trợ đã được khoa học làm sáng tỏ, mở rộng phạm vi ứng dụng và trở thành công cụ quan trọng trong hóa học xanh Phương pháp này cho phép phát triển công nghệ mới với hóa chất thân thiện với môi trường, đồng thời tiết kiệm năng lượng và chi phí.
Enzym là các protein do tất cả sinh vật sống sản xuất, đóng vai trò là chất xúc tác sinh học cho nhiều phản ứng sinh hóa thiết yếu Chúng không chỉ tăng tốc độ phản ứng mà còn có khả năng phân hủy sinh học Trong chiết xuất nguyên liệu thực vật, enzym giúp phá vỡ thành tế bào, từ đó giải phóng và chiết xuất hiệu quả các hợp chất hoạt tính sinh học bên trong Quá trình này dựa trên khả năng thủy phân của enzym, làm giảm tính toàn vẹn của thành tế bào Khi enzym và cơ chất liên kết, hình dạng enzym thay đổi, tối ưu hóa sự tương tác và phá vỡ liên kết Nghiên cứu cho thấy các yếu tố như nhiệt độ, thời gian chiết, pH, nồng độ enzym và kích thước hạt ảnh hưởng đến quá trình xúc tác Phương pháp chiết xuất này giúp giảm thời gian, tiết kiệm dung môi và nâng cao hiệu suất cũng như chất lượng sản phẩm Để đạt hiệu quả cao, việc lựa chọn enzym phù hợp với nguyên liệu và điều kiện hoạt động là rất quan trọng.
Phương pháp sắc ký [29]
Sắc ký là một phương pháp hiệu quả và phổ biến, được ứng dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là các hợp chất thiên nhiên.
2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử trong hỗn hợp phân bố giữa pha động và pha tĩnh dựa vào tính chất như tính bị hấp phụ và tính tan Mỗi chất có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh, dẫn đến sự khác biệt trong tốc độ di chuyển của chúng qua hệ sắc ký Trong quá trình pha động di chuyển qua các lớp pha tĩnh, quá trình hấp phụ và phản hấp phụ diễn ra liên tục Kết quả là, các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn so với những chất có tương tác yếu hơn, từ đó cho phép tách biệt các chất qua quá trình sắc ký.
2.2.2 Phân loại các phương pháp sắc ký
Trong phương pháp sắc ký, pha động bao gồm các lưu thể ở trạng thái khí hoặc lỏng, trong khi pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Các phương pháp sắc ký chủ yếu được phân loại dựa trên cách tiến hành sắc ký.
Sắc ký cột là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, sử dụng chất hấp phụ là pha tĩnh như silicagel với kích thước hạt khác nhau, bao gồm pha thường và pha đảo như YMC, ODS, và Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột, thường là cột thủy tinh, và độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến số đĩa lý thuyết và khả năng tách Kích thước hạt nhỏ hơn sẽ tăng số đĩa lý thuyết và khả năng phân tách, nhưng cũng làm giảm tốc độ chảy Nếu trọng lực không đủ lớn, có thể xảy ra hiện tượng tắc cột, buộc phải sử dụng áp suất, như áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
1 Nhồi cột khô: theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp lên cột khi còn khô, sau đó dùng vật mềm gõ nhẹ lên thành cột mục đích để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để rửa giải
2 Nhồi cột ướt: theo cách này, chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết
Khi chuẩn bị cột, cần chú ý không để xuất hiện bọt khí, vì điều này có thể gây ra hiện tượng chạy rối và làm giảm hiệu quả tách Ngoài ra, cột cũng phải đảm bảo không bị nứt, gãy hay rò rỉ.
2.2.3.2 Sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tích dung dịch chất phân tích di chuyển trên lớp mỏng chất hấp phụ, có thể là vô cơ hoặc hữu cơ Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, dẫn đến việc dừng lại ở các vị trí khác nhau Silicagel tráng trên đế nhôm hoặc đế thủy tinh là chất hấp phụ thường được sử dụng trong SKLM Trong quá trình hấp phụ, có sự tranh giành giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ trên bề mặt chất hấp phụ, và khi đạt được cân bằng, mỗi chất tan sẽ nằm ở vị trí riêng biệt trên bản mỏng.
Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất [38]
Phương pháp phổ khối lượng (MS) dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử khi bị bắn phá bởi chùm ion bên ngoài Phổ MS cung cấp các đỉnh ion mảnh, giúp xác định cơ chế phân mảnh và tái dựng cấu trúc của hợp chất Hiện nay, có nhiều loại phổ khối lượng khác nhau, với các phương pháp chính được đề cập dưới đây.
1 Phổ khối lượng va chạm điện tử EI-MS: dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV
2 Phổ phun mù điện tử ESI-MS: phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là peak ion phân tử và các peak đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ
3 Phổ bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp FAB-MS: với việc bắn phá nguyên tử nhanh, do đó phổ thu được cũng thường là các peak ion phân tử
4 Phổ khối lượng phân giải cao HR-MS: cho phép xác định các peak ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao
Hiện nay, việc kết hợp các phương pháp sắc ký với phổ khối lượng như GC-MS (sắc ký khí – khối phổ) và LC-MS (sắc ký lỏng – khối phổ) ngày càng trở nên phổ biến Những phương pháp kết hợp này đặc biệt hữu ích trong việc phân tích thành phần của hỗn hợp chất, đặc biệt là trong lĩnh vực dược phẩm để phân tích thuốc.
2.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [38]
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một phương pháp hiện đại và hiệu quả nhất để xác định cấu trúc của các hợp chất Bằng cách kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc phân tử, bao gồm cả cấu trúc lập thể.
Nguyên lý cơ bản của các phương pháp phổ NMR, bao gồm phổ proton và phổ carbon, là sự cộng hưởng của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác động của từ trường bên ngoài Sự cộng hưởng này được thể hiện qua độ dịch chuyển hóa học (chemical shift, δ) Bên cạnh đó, đặc trưng của phân tử còn được xác định thông qua tương tác spin giữa các hạt nhân từ.
Phổ 1 H-NMR: trong phổ 1 H-NMR, độ dịch chuyển hóa học δ của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 12 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai
Đặc trưng hóa học của nguyên tử và từng phần của nó có thể được xác định thông qua độ dịch chuyển hóa học δ và tương tác spin Những yếu tố này giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cấu trúc hóa học của hợp chất.
Phổ 13 C-NMR cung cấp tín hiệu cho các nguyên tử cacbon, với mỗi nguyên tử cộng hưởng ở một từ trường riêng biệt, tạo ra các tín hiệu phổ khác nhau Thang đo của phổ 13 C-NMR được tính bằng ppm, với dải đo rộng từ 0 đến 230 ppm.
Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)
Phổ DEPT cung cấp thông tin phân loại các loại cacbon khác nhau trong hợp chất hữu cơ Trong phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn không xuất hiện, trong khi tín hiệu của CH và CH3 nằm ở một phía, còn CH2 nằm ở phía đối diện trên phổ DEPT 135 Đặc biệt, trên phổ DEPT 90, chỉ có tín hiệu của các nhóm CH xuất hiện.
2.3.3 Đo điểm chảy (MP) [38] Đối với chất rắn kết tinh thì điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan trọng, nó là tiêu chuẩn để đo mức độ tinh khiết của hợp chất Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chênh lệch không quá 0,5 o C thì có thể xem sản phẩm kết tinh đã tinh khiết Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp rất xa so với điểm chảy lý thuyết thì chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết và phải tinh chế, kết tinh lại
Việc xác định điểm chảy của hợp chất là rất quan trọng, vì nó cho phép đưa ra những nhận định sơ bộ về tính chất của hợp chất đó Thông qua việc so sánh với các tài liệu có sẵn, người nghiên cứu có thể rút ra kết luận chính xác hơn về hợp chất cần phân tích.
Các phương pháp nghiên cứu vỏ quả cây Măng cụt
2.4.1 Các phương pháp tách chiết hợp chất
Sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức) Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 368 nm, hoặc bằng cách sử dụng dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sau đó sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi xuất hiện màu.
Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (Silicagel 240430 mesh, Merck) hoặc pha đảo (YMC-RP18)
2.4.2 Các phương pháp xác định thông số vật lý và cấu trúc hóa học
Điểm nóng chảy được đo bằng máy đo điểm chảy Mel-Temp 3.0
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi bằng máy Bruker AM500 FT-NMR spectrometer với chất nội chuẩn là TMS
Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo trên máy AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap.
Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính [39]
Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
2.5.1 Nguyên tắc p-Nitrophenyl-α-D-Glucopyranoside ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ α-D-Glucose + p-Nitrophenol Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP Vì vậy có thể đo độ hấp thu của PNP ở 400nm để xác định lượng glucose sinh ra So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có chất ức chế và mẫu không có chất ức chế để xác định % ức chế Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50 Điều kiện phản ứng: T7 o C, pH = 6,8
Chuẩn bị các dung dịch thử chuẩn (enzym, chất nền, các dung dịch đệm, chất ức chế…)
Trộn lẫn các dung dịch gồm: đệm pH 6,8; enzym; chất ức chế với thể tích đã định trước
Hoạt hoá hỗn hợp ở 37 o C trong thời gian Ta
Thêm chất nền, duy trì phản ứng ở 37 o C, trong thời gian Tr
Kết thúc phản ứng bằng đệm pH 9,6
Đo độ hấp thu A ở 400nm, dựa vào đường chuẩn để xác định lượng glucose sinh ra, từ đó xác định % ức chế và suy ra chỉ số IC50
2.5.3 Thử hoạt tính của ba hợp chất phân lập được từ vỏ quả Măng cụt
Chuẩn bị mẫu chất ban đầu trong DMSO ở nồng độ 10 mg/ml Tra vào đĩa
Trong thí nghiệm, 96 giếng được sử dụng với 10 μL mẫu tương ứng với dãy nồng độ, phản ứng với 45 μL enzym α-glucosidase (10 U/ml) và ủ trong 5 phút Tiếp theo, 45 μL PNP-glycoside (5 mM) được thêm vào và hỗn hợp được ủ trong 30 phút ở 37°C Hoạt động của enzym được xác định bằng cách đo lượng sản phẩm p-nitrophenol từ PNP-glycoside.
30 sóng dài 405 nm Tất cả các phản ứng được thực hiện ở 37°C trong 30 phút với ba lần lặp lại
Hoạt tính ức chế của cao chiết được tính theo công thức
Do [glc] tỉ lệ với [PNP] nên
[glc]0: Nồng độ glucose sinh ra khi không sử dụng chất ức chế (mM/l)
[glc]i: Nồng độ glucose sinh ra khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i (mM/l)
[PNP]0: Nồng độ PNP sinh ra khi không sử dụng chất ức chế (mM/l)
[PNP]i: Nồng độ PNP sinh ra khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i (mM/l)
[A]0: Độ hấp thu khi không sử dụng chất ức chế
[A]0: Độ hấp thu khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
Lựa chọn phương pháp chiết tách dịch tổng từ Măng cụt (Garcinia Mangostana L.)
Vỏ quả được tách ra, phơi khô và thái thành miếng nhỏ kích thước từ 1cm đến 2cm, trong bóng mát để tránh ánh nắng trực tiếp và tạp chất Sau khi phơi khô, vỏ quả được nghiền thành bột mịn, thu được 5,1kg bột vỏ quả khô.
3.2 Lựa chọn phương pháp chiết tách dịch tổng từ Măng cụt (Garcinia Mangostana L.)
3.2.1 Chiết tách sử dụng dung môi thông thường a) Lựa chọn dung môi ngâm chiết
Vỏ quả Măng cụt sau khi sấy khô và nghiền nhỏ được sử dụng để chiết xuất bằng 50g mẫu bột với các dung môi khác nhau như methanol, ethanol 95% và nước Quá trình chiết xuất được thực hiện dưới điều kiện siêu âm và gia nhiệt, sử dụng bể siêu âm Ultrasonic 2100 với cường độ siêu âm 75% và nhiệt độ 40°C.
Quy trình khảo sát dung môi chiết để lựa chọn dung môi tối ưu cho quá trình chiết được tiến hành như sau:
Lấy 50g mẫu bột đưa vào 3 bình nón dung tích 1000mL Thêm vào mỗi bình nón 500mL lần lượt các dung môi khác nhau: methanol, ethanol 95% và nước cất
Tiến hành ngâm chiết ba lần, mỗi lần kéo dài 8 tiếng với các dung môi đã chọn Đồng thời, thực hiện thí nghiệm tương tự với ba dung môi này dưới điều kiện gia nhiệt 40°C và rung siêu âm ở cường độ 75% Sau quá trình ngâm, dịch chiết được thu gom và loại bỏ dung môi bằng máy cô quay chân không để thu được các cặn chiết.
Tiến hành cân khối lượng cặn chiết để xác định hiệu quả chiết của quá trình chiết tách
Bảng 3.1 Điều kiện khảo sát lựa chọn dung môi và điều kiện ngâm chiết
Methanol (có siêu âm, gia nhiệt)
Ethanol 95% (có siêu âm, gia nhiệt)
Nước (có siêu âm, gia nhiệt)
Kết quả khảo sát hiệu quả chiết với các dung môi và điều kiện chiết được đưa ra trong bảng 4.1 (chương 4) b) Lựa chọn nồng độ dung môi ngâm chiết
Tiến hành khảo sát tương tự thí nghiệm trên với dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau của hỗn hợp ethanol – nước: 50%, 60%, 70%, 80%, 95%
Điều kiện thực nghiệm được tiến hành tương tự, ngâm chiết 3 lần, mỗi lần 8 tiếng đồng hồ ở nhiệt độ 40°C và cường độ siêu âm 75%
Bảng 3.2 Khảo sát lựa chọn nồng độ dung môi ngâm chiết
Ethanol 50% Ethanol 60% Ethanol 70% Ethanol 80% Ethanol 95%
Thể tích dung môi (mL) 500×3 500×3 500×3 500×3 500×3
Kết quả khảo sát lựa chọn nồng độ dung môi cũng được đưa ra trong bảng 4.2 (chương 4)
3.2.2 Chiết tách có hỗ trợ enzym
Kỹ thuật chiết xuất có enzym hỗ trợ (enzyme-assisted extraction method) đang được giới chuyên môn áp dụng để nâng cao hiệu quả chiết xuất các thành phần giá trị từ sản phẩm thiên nhiên Phương pháp này sử dụng các loại enzym có khả năng phân giải đặc hiệu các cấu trúc bao quanh tế bào thực vật, giúp tăng cường sự tiếp xúc giữa dung môi và chất chiết, từ đó cải thiện hiệu suất chiết xuất.
Enzym sử dụng trong nghiên cứu của luận văn này là :Pectinex Ultra SP-
Enzym L, được sản xuất bởi Novozyme (Đan Mạch), chứa thành phần chính là polygalacturonase, có khả năng thủy phân liên kết 1,4-α-D-galactosiduronic trong axit pectic và các galacturonan khác Hoạt độ của enzym này đạt 3800 PGNU/ml.
Quy trình thực nghiệm bắt đầu bằng việc phối trộn 100g bột vỏ quả Măng cụt với dịch enzym đã điều chỉnh pH, sau đó ủ hỗn hợp ở nhiệt độ lựa chọn trong thời gian cần thiết Sau khi kết thúc quá trình ủ, dung môi hữu cơ được bổ sung để thực hiện ngâm chiết ở nhiệt độ 60°C trong 120 phút Tiếp theo, dịch chiết được lọc qua phễu lọc Buchner để loại bỏ bã và thu hồi dịch chiết sau khi thủy phân bằng enzym Cuối cùng, dung môi được cất đi để thu được dịch cô, và dịch cô A được cân để xác định hiệu suất chiết của quá trình.
Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym đã được nghiên cứu, bao gồm nồng độ enzym (0,25; 0,5; 0,75 và 1 thể tích chế phẩm enzym/100 g nguyên liệu khô), nhiệt độ ủ enzym (40°C; 50°C; 60°C; 70°C), thời gian ủ enzym (15; 30; 45 và 60 phút), pH ủ enzym (pH 4; 5; 6; 7), và dung môi sử dụng để ngâm chiết sau quá trình ủ (ethanol, methanol, nước).
Bảng 3.3: Các thông số ảnh hưởng tới hoạt động của enzym được nghiên cứu
Thông số Điểm khảo sát
Nồng độ enzym (%) 0,25 0,5 0,75 1 pH dung dịch enzym 4 5 6 7
Thời gian ủ enzym 15 phút 30 phút 45 phút 60 phút Dung môi ngâm chiết ethanol methanol Nước a) Khảo sát nồng độ enzym
Vỏ quả Măng cụt được sấy khô và nghiền nhỏ, sau đó thực hiện 4 thí nghiệm với 100g bột vỏ quả phối hợp với 300ml dịch enzym có nồng độ 0,25%, 0,5%, 0,75% và 1% Các thông số khác được giữ cố định, trong đó pH của dung dịch enzym được điều chỉnh ở mức 5, và hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 60°C trong 30 phút Sau khi ủ, bổ sung 1 lít dung dịch ethanol và tiến hành ngâm chiết ở 60°C trong 120 phút Sau đó, dịch chiết được lọc qua phễu Buchner để loại bỏ bã, và dung môi được cất dưới áp suất giảm ở 50°C nhằm thu được dịch cô đặc trong ethanol Cuối cùng, dịch cô A được cân để xác định hiệu suất chiết của quá trình.
Bảng 3.4: Khảo sát lựa chọn nồng độ enzym
Khối lượng mẫu (g) 100 100 100 100 pH dung dịch enzym 5 5 5 5
Nhiệt độ ủ (°C) 60°C 60°C 60°C 60°C Thời gian ủ enzym (phút) 30 30 30 30
Dung môi ngâm chiết Ethanol
Kết quả khảo sát lựa chọn nồng độ enzym được đưa ra trong bảng 4.3 (chương 4) b) Khảo sát pH của dung dịch enzym
Thực hiện 4 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm cân 100g bột vỏ quả phối với
300ml dịch enzym có nồng độ 0,5% thay đổi giá trị pH từ 4,0-7,0 (bước nhảy là
1) điều chỉnh pH bằng axit HCl 0.01N và NaOH 0.01M, đo pH bằng máy đo pH Giữ cố định các thông số còn lại nhiệt độ ủ hỗn hợp 60°C thời gian ủ là 30 phút Kết thúc quá trình ủ với enzym, bổ sung thêm 1 lít dung dịch ethanol thực hiện quá trình ngâm chiết tại nhiệt độ 60°C trong 120 phút Lọc qua phễu lọc Buchner bỏ bã và thu dịch chiết sau khi thủy phân bằng enzym; cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở 50°C để thu được dịch cô toàn phần trong ethanol.Tiến hành cân dịch cô A để xác định hiệu suất chiết của quá trình chiết tách
Bảng 3.5: Khảo sát lựa chọn pH của dung dịch enzym
Khối lượng mẫu (g) 100 100 100 100 pH dung dịch enzym 4 5 6 7
Dung môi ngâm chiết Ethanol
Kết quả khảo sát lựa chọn pH của dung dịch enzym đưa ra trong bảng 4.4 (chương 4) c) Khảo sát nhiệt độ ủ hỗn hợp
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện 4 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm sử dụng 100g bột vỏ quả kết hợp với 300ml dung dịch enzym nồng độ 0,5% được điều chỉnh pH = 5 Các thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ từ 40°C đến 70°C, với bước nhảy 10°C, và thời gian ủ cố định là 30 phút Sau khi ủ với enzym, chúng tôi bổ sung 1 lít dung dịch ethanol và tiến hành ngâm chiết ở nhiệt độ 60°C trong 120 phút Quá trình lọc được thực hiện bằng phễu lọc Buchner để loại bỏ bã và thu dịch chiết sau khi thủy phân enzym Cuối cùng, dung môi được cất dưới áp suất giảm ở 50°C để thu được dịch cô toàn phần trong ethanol, và dịch cô A được cân để xác định hiệu suất chiết tách.
Bảng 3.6: Khảo sát lựa chọn nhiệt độ ủ hỗn hợp thích hợp
Khối lượng mẫu (g) 100 100 100 100 pH dung dịch enzym 5 5 5 5
Dung môi ngâm chiết Ethanol
Kết quả khảo sát lựa chọn nhiệt độ ủ đưa ra trong bảng 4.5 (chương 4) d) Khảo sát thời gian ủ
Thực hiện bốn thí nghiệm, mỗi thí nghiệm sử dụng 100g bột vỏ quả kết hợp với 300ml dịch enzym có nồng độ 0,5% Dung dịch enzym được điều chỉnh về pH 5 và hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 60°C trong các khoảng thời gian khác nhau, từ 15 phút trở lên.
Sau 60 phút ủ với enzym (trong đó bước nhảy là 15 phút), bổ sung 1 lít dung dịch ethanol và ngâm chiết ở nhiệt độ 60°C trong 120 phút Sau đó, lọc qua phễu lọc Buchner để tách bã và thu dịch chiết sau khi thủy phân bằng enzym Cuối cùng, cất dung môi dưới áp suất giảm ở 50°C để thu được dịch cô đặc toàn phần trong ethanol, và tiến hành cân dịch cô A để xác định hiệu suất chiết của quá trình.
Bảng 3.7: Khảo sát lựa chọn thời gian ủ hỗn hợp thích hợp
Khối lượng mẫu (g) 100 100 100 100 pH dung dịch enzym 5 5 5 5
Dung môi ngâm chiết Ethanol
Kết quả khảo sát lựa chọn thời gian ủ đưa ra trong bảng 4.6 (chương 4) e) Khảo sát dung môi ngâm chiết sau quá trình thủy phân
Thực hiện ba thí nghiệm, mỗi thí nghiệm sử dụng 100g bột vỏ quả phối hợp với 300ml dung dịch enzym có nồng độ 0,5% và pH được điều chỉnh về 5, ủ ở nhiệt độ 60°C trong 30 phút Sau khi ủ, bổ sung 1 lít dung môi khác nhau như methanol, ethanol 95% và nước, và tiến hành ngâm chiết ở 60°C trong 120 phút Sau đó, lọc qua phễu Buchner để loại bỏ bã và thu dịch chiết Cuối cùng, cất dung môi để thu dịch cô và cân dịch cô A nhằm xác định hiệu suất chiết tách.
Bảng 3.8: Khảo sát lựa chọn dung môi ngâm chiết
Khối lượng mẫu (g) 100 100 100 100 pH dung dịch enzym 5 5 5 5
Dung môi ngâm chiết methanol Ethanol
Kết quả khảo sát lựa chọn thời gian ủ đưa ra trong bảng 4.7 (chương 4) f) Khảo sát nồng độ dung môi ngâm chiết
Thực hiện 5 thí nghiệm với dung môi ethanol ở các nồng độ 50%, 60%, 70%, 80% và 95%, tiến hành ngâm chiết ở nhiệt độ 60°C trong 120 phút Sau đó, lọc qua phễu Buchner để loại bỏ bã và thu dịch chiết sau khi thủy phân bằng enzym Cuối cùng, cất loại dung môi để thu được dịch cô toàn phần trong ethanol và tiến hành cân dịch cô.
A để xác định hiệu suất chiết của quá trình chiết tách
Bảng 3.9: Khảo sát lựa chọn nồng độ dung môi ngâm chiết
Khối lượng mẫu (g) 100 100 100 100 100 100 pH dung dịch enzym 5 5 5 5 5 5
Dung môi ngâm chiết Ethanol
Kết quả khảo sát lựa chọn nồng độ dung môi ngâm chiết đưa ra trong bảng 4.8 (chương 4)
Điều chế các phân đoạn chiết
Cân 2,0 kg bột nguyên liệu vỏ quả Măng cụt cho vào bình chiết dung tích
Hòa tan 20 lít chế phẩm enzym Pectinex Ultra SP-L (3800 PGNU/ml) của Novozyme vào 6,0 lít nước cất đã axit hóa (pH = 5), sau đó chuyển enzym vào bình chiết chứa bột vỏ quả Măng cụt Đặt bình chiết trong bể ổn nhiệt và khuấy đều ở 60°C trong 30 phút để thủy phân bột nguyên liệu Tiếp theo, ngâm chiết bột vỏ quả Măng cụt (Garcinia mangostana L.) bằng 20,0 lít dung môi ethanol 60% ở 60°C trong 2 giờ Cuối cùng, lọc dịch chiết qua phễu lọc Buchner và cất dưới áp suất giảm ở 50°C để thu dịch cô toàn phần trong ethanol, ký hiệu là dịch cô A (200g, hiệu suất 10% tính theo khối lượng nguyên liệu vỏ quả Măng cụt khô).
Cô A đã chuyển 2 bình chứa dung dịch với dung tích 2000mL, hòa tan mỗi bình với 1L nước và thực hiện quá trình chiết 3 lần bằng 1L dung môi n-hexane Các dịch chiết được thu gom và sau đó được cất loại dung môi bằng máy cô quay chân không, thu được cặn chiết nước (RW1) và cặn chiết n-hexane (RH1).
Cặn chiết nước được hòa tan trong 1L nước và sau đó chiết với 1L ethylacetate Các dịch chiết này được thu gom, loại bỏ dung môi, tạo ra cặn chiết nước lần 2 (RW2) và cặn chiết ethylacetate (RE1).
Quá trình chiết tách xanthon từ vỏ quả Măng cụt sử dụng ethylacetate đã thu được 176,4g cặn chiết với hiệu suất làm sạch đạt 88,02% Sơ đồ quy trình này, bao gồm việc hỗ trợ enzyme và phương pháp làm sạch lỏng - lỏng, được thể hiện trong hình 3.1.
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chiết tách phân đoạn từ vỏ quả Măng cụt
Mẫu bột vỏ quả Măng cụt
Bổ sung 2L nước, chiết n-Hexan (3x2L)
Bổ sung 2L nước, chiết Ethyl acetat (3x2L)
Xử lý nguyên liệu bằng enzym
Ngâm chiết bằng dung môi Ethanol
Nồng độ pectinex Ultra SPL: 0,5%, tỷ lệ nguyên liệu/ dịch enzym: 1/3 pH dịch enzym: 5 Nhiệt độ ủ: 60 o C
Nồng độ dung môi ethanol: 60%
Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi: 1/10 Nhiệt độ chiết: 60 o C
Nghiên cứu điều kiện để nâng cao hàm lượng xanthon
Với mục tiêu nâng cao hàm lượng xanthon, chúng tôi tiếp tục tinh chế phân đoạn ethylacetat bằng sắc ký cột
Cột thủy tinh có đường kính 150mm được nạp chất hấp phụ Silicagel cỡ hạt 230-400 mesh, với khối lượng 5kg, chiếm 2/3 thể tích cột Để ổn định cấu trúc, cột được rửa bằng n-hexane trong 1 giờ Mẫu được nạp lên cột và được thôi bằng hỗn hợp dung dịch n-Hexane: Acetone với các tỷ lệ 40:1, 30:1, 20:1, 10:1 và 1:1, tăng dần độ phân cực Mỗi hệ dung môi được rửa giải 3 lần với 5L dịch rửa giải, thu gom từng phân đoạn, sau đó cất thu hồi dung môi và thu cặn khô Sơ đồ quá trình sắc ký phân đoạn được mô tả rõ ràng.
Hình 3.2 Sơ đồ quy trình sắc ký phân đoạn làm giàu hàm lượng xanthon từ dịch chiết Ethylacetate của vỏ quả Măng cụt
Các cặn khô thu được từ quá trình phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, sau đó xác định hàm lượng xanthon bằng máy sắc ký lỏng cao áp kết hợp khối phổ (LC/MS).
Kết quả hàm lượng xanthon trong các cặn chiết phân đoạn
HA 40:1 HA 30:1 HA 20:1 HA 10:1 HA 1:1
Hình 3.3: Biểu đồ tương quan hàm lượng xanthon tổng trong các phân đoạn sắc ký
Phương pháp sắc ký cột nhồi sử dụng silicagel và hệ dung môi gradient cho phép thu được các cặn chiết riêng biệt cho từng phân đoạn Điều này rất hữu ích trong việc chế tạo các chế phẩm cao chiết với hàm lượng xanthon khác nhau, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả phân tích HPLC/MS cho thấy, các phân đoạn S2 và S3 (với hệ dung môi nHexane: Acetone 40:1 và 30:1) chứa nhiều hợp chất tinh dầu béo có độ phân cực thấp, trong khi hàm lượng xanthon tổng chỉ đạt khoảng 50% Ở các phân đoạn S4, S5 và S6, sau khi loại bỏ hầu hết các thành phần kém phân cực và sử dụng dung môi có độ phân cực trung bình, hàm lượng xanthon tổng đã tăng cao Đặc biệt, phân đoạn S5 có hàm lượng xanthon tổng đạt 95,2% và khối lượng 52,3g, chiếm 18,78% tổng khối lượng cặn chiết ethylacetate, cho thấy đây là phân đoạn lý tưởng để phân lập và tinh chế các xanthon.
Phân lập một số hợp chất từ vỏ quả Măng cụt
Tiến hành sắc kí cột Silicagel pha thường với cặn ethylacetate (176,4g) và rửa giả bằng hệ dung môi Gradient n-hexane/acetone (100/1 – 0/100) đã thu được 5 phân đoạn, được đánh dấu từ G1 đến G5.
Tiến hành sắc kí phân đoạn G2 (1,701g) trên cột Silicagel và rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane/acetone (12/1) thu được 4 phân đoạn nhỏ G2.1 – G2.4
Từ phân đoạn G2.2 (613 mg), tiến hành sắc kí trên cột silicagel với dung môi n-hexan : ethylaxetat (6:1) thu được phân đoạn G2.2.2 (424 mg) Tiếp theo, sắc kí trên cột silicagel với dung môi n-hexan : clorofom : ethylaxetat (6:1:0,5) cho ra phân đoạn G2.2.2’ (90,8 mg) Cuối cùng, sử dụng cột pha đảo và rửa giải bằng dung môi axeton : nước (2:1) đã thu được hợp chất GM1 (45 mg).
Sau khi tách phân đoạn G2.4 (157mg) qua cột Silicagel với hệ dung môi n-hexane/ethylaxetate (8/1), hai phân đoạn G2.4.1 và G2.4.2 (85mg) được thu nhận Tiếp theo, phân đoạn G2.4.2 được tinh chế bằng cột pha đảo YMC-RP-18 sử dụng hệ dung môi methanol/nước/axit fomic (2/1/0,001), từ đó thu được hợp chất GM2 (30 mg).
Hợp chất GM3 (32mg) thu được từ phân đoạn G5 (535 mg) bằng sắc kí trên cột Silicagel với hệ dung môi n-hexane/acetone (5/1)
Hình 3.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ vỏ quả Măng cụt
Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất
• Tinh thể hình kim màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: 165-167°C
• Phổ khối lượng ESI-MS (negative) m/z: 379 [M-H]-
• Phổ 1H-NMR (500MHz, Me2CO-d6) δ (ppm):
13,3 (1H, s, 4-OH); 7,36 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-7); 7,24 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-6); 7,69 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5); 3,68 (2H, d, J = 6,5 Hz, H-11); 5,29 (1H, t, J 7,0 Hz, H-12); 1,66 (3H, s, H-14); 1,85 (3H, s, H-15); 3,45 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-
CC, Silicagel, Gradient n-hexane/acetone (100/1 – 0/100)
CC, YMC-RP-18 methnol/nước/acid fomic (2/1/0,001)
CC, Silicagel n-hexan/cloroform/ethylaetat (6/1/0,5)
CC, YMC-RP-18 Axeton/nước (2/1)
• Phổ 13C-NMR (125MHz, Me2CO-d6) δ (ppm): (Bảng 4)
• Tinh thể hình kim màu vàng Nhiệt độ nóng chảy: 166-168°C
• Phổ khối lượng ESI-MS (negative) m/z: 395 [M-H]-
• Phổ 1H-NMR (500MHz, Me2CO-d6) δ (ppm):
13,2 (1H, s, 4-OH); 11,3 (1H, s, 5-OH); 7,30 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-7); 6,61 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6); 3,44 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-11); 5,21 (1H, m, H-12, ); 6,65 (3H, s, H-14); 1,78 (3H, s, H-15); 3,65 (2H, d, J = 7,0 Hz, H-16); 5,27 (1H, m, H- 17); 6,66 (3H, s, H-19); 1,84 (3H, s, H-20)
• Phổ 13C-NMR (125MHz, Me2CO-d6) δ (ppm): (Bảng 4)
• Chất bột màu vàng nhạt Nhiệt độ nóng chảy: 179-181°C
• Phổ khối lượng ESI-MS (negative) m/z: 409 [M-H]-
• Phổ 1H-NMR (500MHz, Me2CO-d6) δ (ppm):
13,7 (1H, s, 5-OH); 9,5 (1H, s, 2-OH); 6,80 (1H, s, H-1); 6,38 (1H, s, H-8); 3,35 (2H , d, J = 7,0 Hz, H-11); 5,27 (1H, m, J = 7,0 Hz, H-12); 1,78 (3H, s, H-14); 1,63 (3H, s, H-15); 4,12 (2H, d, J = 6,5 Hz, H-16); 5,27 (1H, m, J = 7,0 Hz, H-17); 1,82 (3H, s, H-19); 1,65 (3H, s, H-20)
• Phổ 13C-NMR (125MHz, Me2CO-d6) δ (ppm): (Bảng 4)
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym -glucosidase
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym -glucosidase của các hợp chất đã phân lập được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 3.10 Giá trị IC 50 của các hợp chất đã phân lập đối với enzym - glucosidase
