Nghiên cứu xây dựng bộ phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát hiện đột biến gen f8 gây bệnh hemophilia a

TỔ NG QUAN

B ệ nh Hemophilia A

Bệnh Hemophilia, hay còn gọi là bệnh rối loạn đông máu, là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương Bệnh này bao gồm ba loại chính: hemophilia A do thiếu yếu tố VIII, hemophilia B do thiếu yếu tố IX, và hemophilia C do thiếu yếu tố XI Trong đó, hemophilia A là loại phổ biến nhất, chiếm khoảng 80-85% trường hợp, hemophilia B chiếm từ 15-20%, và hemophilia C có tỉ lệ rất thấp, chủ yếu gặp ở người Do Thái.

Bệnh Hemophilia A là một bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính, do gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X, gây ra sự giảm nồng độ hoạt tính của yếu tố VIII trong máu.

Bệnh máu khó đông, hay Hemophilia, đã được biết đến từ thời kỳ cổ đại, với những ghi chép trong văn tự của người Do Thái từ thế kỷ II trước Công nguyên, trong đó Tamud đã mô tả trường hợp trẻ em tử vong do chảy máu quá nhiều sau khi cắt bao quy đầu Tuy nhiên, báo cáo y tế đầu tiên về đột biến gây bệnh Hemophilia A được ghi nhận vào năm 1803 tại Nam Phi bởi Otto, người đã mô tả một gia đình có triệu chứng này kéo dài qua ba thế hệ.

Bệnh rối loạn đông máu, còn được gọi là bệnh Hoàng gia, đã ảnh hưởng đến các gia đình hoàng gia Anh, Đức, Nga và Tây Ban Nha từ thế kỷ XIX và XX, do nữ hoàng Anh Victoria mang gen bệnh này Năm 1872, William Leg đã mô tả chi tiết về đặc điểm lâm sàng của bệnh Hemophilia Năm 1937, nghiên cứu xác định thiếu hụt yếu tố VIII là nguyên nhân gây bệnh Hemophilia đã được thực hiện, và đến năm 1944, Pavlosky đã phát hiện rằng máu của bệnh nhân Hemophilia A có thể điều trị triệu chứng rối loạn đông máu cho bệnh nhân Hemophilia khác Năm 1952, yếu tố IX được xác định, dẫn đến sự phân biệt giữa hai loại Hemophilia A và B, và vào năm 1971, bệnh Hemophilia đã được phân biệt với bệnh von Willebrand.

Giữa năm 1982 và 1984, gen mã hóa yếu tố VIII đã được xác định và giải trình tự, đóng vai trò quan trọng trong các phương pháp phát hiện đột biến bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện nay.

1.1.3 Dịch tễ học bệnh Hemophilia A

Theo ước tính của Liên đoàn Hemophilia Thế giới, số người mắc bệnh

Hemophilia trên thế giới khoảng 400,000 người năm 2010 Trong đó, còn tới 75% chưa được chẩn đoán và điều trị đầy đủ [4] Tại Việt Nam, có khoảng 6000 người bị Hemophilia [6]

Hemophilia A là bệnh di truyền lặn chủ yếu ảnh hưởng đến nam giới, trong khi phụ nữ thường là người mang gen bệnh Người mẹ mang gen có khả năng truyền bệnh cho 50% con trai, dẫn đến tỉ lệ mắc bệnh cao hơn ở nam Tỉ lệ mắc Hemophilia A dao động từ 1:5000 đến 1:10000 bé trai Tại Việt Nam, tỉ lệ mắc bệnh này khá cao, khoảng 25-60 trên 1 triệu người.

Hiện nay, cả nước chỉ có khoảng 2.200 bệnh nhân được phát hiện và quản lý thường xuyên, chiếm gần 40% tổng số Điều này cho thấy tỷ lệ bệnh nhân chưa được chẩn đoán và điều trị vẫn ở mức cao Tại Trung tâm Hemophilia, tình hình này cần được cải thiện để nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cho bệnh nhân.

Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương hiện đang quản lý và điều trị khoảng 1.200 bệnh nhân, trong đó bệnh Hemophilia A chiếm 85%, Hemophilia B chiếm 13,16%, và phần còn lại là những bệnh nhân mắc các rối loạn đông máu khác Trung bình mỗi ngày, viện tiếp nhận từ 80 đến 100 bệnh nhân đến điều trị nội trú và ngoại trú.

1.1.4 Triệu chứng lâm sàngvà phân loại mức độ bệnh

Triệu chứng lâm sàng thường gặp bao gồm chảy máu kéo dài ở các khớp như cổ tay và cổ chân, xuất huyết dưới da, chảy máu nội tạng, và khó khăn trong việc cầm máu.

Chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời là yếu tố quyết định giúp người bệnh có thể sống một cuộc sống bình thường, trong khi chẩn đoán muộn có thể dẫn đến biến chứng nghiêm trọng, bao gồm tàn tật hoặc tử vong sớm Phụ nữ mang gen bệnh có khoảng 50% nguy cơ có nồng độ yếu tố VIII thấp, dẫn đến khả năng chảy máu khó cầm sau chấn thương, phẫu thuật hoặc sinh đẻ, và họ cũng có khả năng truyền gen bệnh cho thế hệ sau.

Nồng độ yếu tố VIII trong máu của người bình thường là 200 ng/mL, và mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào nồng độ này Dựa vào nồng độ yếu tố VIII, người ta phân chia thành ba mức độ khác nhau: nặng, trung bình và nhẹ.

Mức độ nặng của bệnh hemophilia A được xác định khi nồng độ yếu tố VIII thấp hơn 1% (dưới 1 IU/dl hoặc 0.01 IU/ml) Bệnh nhân thường gặp phải xuất huyết tự nhiên, không liên quan đến chấn thương, và tình trạng này thường được phát hiện sớm trong giai đoạn trẻ tập đi.

Mức độ trung bình của nồng độ yếu tố VIII dao động từ 1-5% (1-5 IU/dl, 0.01-0.05 IU/ml), khiến bệnh nhân dễ bị chảy máu tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ, và triệu chứng bệnh thường xuất hiện muộn hơn.

(3) Mức độ nhẹ: nồng độ yếu tố VIII từ 5-40% (5-40 IU/dl, 0.05-0.40 IU/ml), chảy máu thường chỉ xuất hiện sau chấn thương nặng hoặc sau phẫu thuật [4] [8]

Mục tiêu chính của việc điều trị bệnh hemophilia A là dự phòng chảy máu

Khi bệnh nhân gặp tình trạng chảy máu cấp, việc bổ sung yếu tố đông máu là cần thiết để đạt được nồng độ đủ để cầm máu Liều lượng yếu tố đông máu cần sử dụng sẽ được tính toán dựa trên vị trí và mức độ chảy máu, cũng như mục đích điều trị.

Cơ sở di truy ề n y ế u t ố VIII

1.2.1 Con đường đông máu và vai trò của yếu tố VIII Đông máu là một quá trình máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc do sự chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan Các sợi fibrin sẽ trùng hợp với nhau tạo ra mạng lưới fibrin giam giữ các thành phần của máu và máu sẽ đông lại Cục máu đông hình thành sẽ có tác dụng bịt kín chỗ tổn thương [9]

Quá trình đông máu bao gồm 5 giai đoạn chính: giai đoạn cầm máu ban đầu, giai đoạn co mạch tại chỗ, giai đoạn tạo nút tiểu cầu, giai đoạn đông máu huyết tương và giai đoạn tiêu sợi huyết, với sự tham gia của 12 yếu tố đông máu.

- Yếu tố III: Prothrombin của mô hoặc các yếu tố mô

- Yếu tố IV: Ion Canxi

- Yếu tố VIII: Yếu tố chống Hemophilia A

- Yếu tố IX: Yếu tố chống Hemophilia B

- Yếu tố X: Yếu tố Stuart

- Yếu tố XI: Yếu tố tiền thromboplastin huyết tương (Yếu tố chống Hemophilia C)

- Yếu tố XII: Yếu tố Hageman

- Yếu tố XIII: Yếu tốổn định Fibrin

Hình 1.1Các giai đoạn chính của quá trình đông máu

Giai đoạn cầm máu đầu tiên bao gồm sự co mạch tại chỗ, được thực hiện nhờ các sợi cơ trơn thông qua cơ chế phản xạ thần kinh và cơ chế thể dịch.

Sau khi co mạch tại chỗ, tiểu cầu dính vào lớp dưới nội mạc qua yếu tố von Willebrand tại vị trí thành mạch bị tổn thương Tại đây, tiểu cầu được hoạt hóa và giải phóng các chất như ADP, serotonin, thromboxan A2, thúc đẩy quá trình ngưng tập tiểu cầu, hình thành các nút tiểu cầu giúp cầm máu tạm thời.

Sau khi tạo nút tiểu cầu, quá trình đông máu huyết tương diễn ra, bao gồm

3 giai đoạn nhỏ: Giai đoạn hình thành thromboplastin hoạt hóa (phức hợp prothrombinase), giai đoạn hình thành thrombin, giai đoạn hình thành fibrin Giai

Quá trình hình thành thromboplastin hoạt hóa, hay phức hợp prothrombinase, diễn ra qua hai con đường nội sinh và ngoại sinh, sử dụng các yếu tố đông máu XII, XI, IX, VIII, X, VII, và V để tổng hợp prothrombinase Sau đó, prothrombinase chuyển prothrombin thành thrombin với sự tham gia của ion canxi Dưới tác dụng của thrombin, các fibrinopeptide A và B được cắt chọn lọc, hình thành fibrin monomer, sau đó các monomer này sẽ trùng hợp thành fibrin polymer Sơ đồ thác đông máu được mô tả trong Hình 1.2.

Hình 1.2Sơ đồ đông máu theo con đường nội sinh và ngoại sinh

1.2.2 Đặc điểm sinh học yếu tố VIII

Yếu tố VIII là một glycoprotein, bao gồm một chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử 80 KDa và một chuỗi nặng có trọng lượng từ 90-200 KDa, được liên kết với nhau bằng cầu nối ion Cu 2+ Cấu trúc của yếu tố VIII được hình thành từ trình tự các axit amin với 6 vùng sắp xếp theo thứ tự A1:A2:B:A3:C1:C2.

Yếu tố VIII chủ yếu được tổng hợp tại gan, với một lượng nhỏ từ thận và tụy Nồng độ bình thường của yếu tố VIII dao động từ 50-200%, và thời gian bán hủy của nó là từ 8-12 giờ Ban đầu, yếu tố VIII được tổng hợp dưới dạng một chuỗi đơn.

Axit amin 2351 được tổng hợp trong lưới nội bào và sau đó được chuyển đến thể Golgi, nơi diễn ra các phản ứng cần thiết để hình thành phân tử heterodimer.

Yếu tố VIII gắn với yếu tố von Willebrand (vWF) giúp bảo vệ yếu tố VIII khỏi sự hoạt hóa bởi yếu tố Xa và sự bất hoạt bởi protein C hoạt hóa, đồng thời ngăn cản yếu tố VIII gắn với phospholipid và tiểu cầu hoạt hóa Thời gian bán hủy của yếu tố VIII thường là 8-12 giờ, nhưng nếu thiếu vWF, thời gian này giảm xuống dưới 2 giờ Yếu tố VIII tương tác với nhiều protein trong tế bào, ảnh hưởng đến biểu hiện, hoạt tính, tính ổn định và chức năng của nó, điển hình là sự tương tác với LMAN1 và MCFD2, hai protein giúp ổn định phức hợp trong tế bào gan.

Yếu tố VIII tồn tại dưới dạng tiền yếu tố không hoạt động và được kích hoạt thông qua quá trình xúc tác của thrombin hoặc yếu tố Xa, khi chúng cắt yếu tố VIII tại các vị trí Arg372, Arg740 và Arg1689 Sự tương tác giữa vùng A2 và phức hợp A1/A3-C1-C2 là bước quan trọng để kích hoạt yếu tố VIII Khi yếu tố VIIIa và yếu tố IXa liên kết trên bề mặt tiểu cầu, chúng tạo thành phức hợp hoạt hóa yếu tố X, làm tăng đáng kể tốc độ hoạt hóa yếu tố X bởi yếu tố IXa.

Khi yếu tố VIII bị thiếu hụt hoặc bất thường, quá trình tạo cục đông sẽ bị chậm lại do sự giảm sản xuất thrombin, dẫn đến cục máu đông kém bền vững và dễ bị tan.

Gen F8, nằm tại vị trí locus 28 trên cánh dài của NST giới tính X (Xq28), là một trong những gen lớn nhất trong cơ thể, với kích thước 186 kb, bao gồm 25 intron và 26 exon, mã hóa cho tiền protein chứa 2,351 axit amin Trong số này, 24 exon có kích thước từ 62-262 bp, trong khi exon lớn nhất là exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp).

Gen F8 có kích thước 186 kb, bao gồm 26 exon, trong đó 24 exon có kích thước từ 69-262 bp, exon 14 và exon 26 có kích thước lần lượt là 3,106 bp và 1,958 bp; exon 26 chứa trình tự 3’UTR, trong khi intron 22 chứa 2 gen F8A và F8B F8 mRNA dài khoảng 9kb và được dịch mã thành tiền protein gồm 2,351 axit amin (267 kDa) Sau đó, tiền protein này được xử lý bằng thrombin để tạo ra protein FVIII dạng kích hoạt, bao gồm chuỗi nặng (90-210 kDa) và chuỗi nhẹ (73 kDa), tạo phức với ion Cu 2+.

Gen F8 mã hóa protein yếu tố VIII, bao gồm hai chuỗi nặng và nhẹ liên kết với nhau qua ion đồng Cấu trúc của phức hợp này được duy trì ổn định nhờ vào sự tương tác của các liên kết ưa nước và kị nước với yếu tố von Willebrand.

Ca2+ đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc của yếu tố VIII, với chuỗi nặng có đầu N tận bao gồm các vùng A1-A2-B, trong khi chuỗi nặng có vùng C tận bao gồm các vùng A3-C1-C2 Vùng B, được mã hóa bởi một exon lớn, không có sự tương đồng với bất kỳ gen nào đã biết và không cần thiết cho chức năng của yếu tố VIII Do đó, sau quá trình dịch mã, vùng B sẽ bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII.

Các intron có kích thước đa dạng, từ200 bp đến 325 bp, trong đó 6 intron có kích thước lớn nhất là intron 1, 6, 13, 14, 22 và 25 Intron 22 là intron có kích

Các phương pháp chẩn đoán bệ nh Hemophilia A

 Tiền sửgia đình có người mắc bệnh

Chẩn đoán hemophilia A dựa vào tiền sử gia đình và phân tích phả hệ, là công cụ giúp xác định sự di truyền của bệnh qua các thế hệ Hemophilia A là một bệnh di truyền lặn, với gen yếu tố VIII nằm trên nhiễm sắc thể X, không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y Nhờ vào quy luật di truyền của Mendel, phả hệ cho phép xác định khả năng mắc bệnh ở nam giới, cũng như xác định những người phụ nữ mang gen hoặc có khả năng mang gen bệnh.

Hình 1.7Sơ đồ di truyền bệnh Hemophilia A

Nếu một người đàn ông mắc bệnh di truyền kết hôn với một người phụ nữ bình thường, tất cả các con gái của họ sẽ mang gen bệnh, trong khi các con trai sẽ không bị ảnh hưởng.

Khi một người phụ nữ mang gen kết hôn với một người đàn ông bình thường, xác suất sinh con của họ sẽ là 25% con trai bình thường, 25% con trai mắc bệnh, 25% con gái bình thường và 25% con gái mang gen bệnh.

Khi một người phụ nữ mang gen kết hôn với một người đàn ông bị bệnh, xác suất cho mỗi lần sinh con của họ sẽ là 25% con trai bị bệnh, 25% con trai bình thường, 25% con gái bị bệnh và 25% con gái mang gen bệnh.

Người phụ nữ chắc chắn mang gen khi có 1 trong 4 điều kiện sau:

- Có ít nhất hai con trai bị bệnh

- Là con của bệnh nhân hemophilia

- Có 1 con trai bị bệnh và có ít nhất 1 người đàn ông trong họ mẹ bị bệnh

- Có 1 con trai bị bệnh và trong gia đình họ mẹ có ít nhất 1 người được chẩn đoán là mang gen

Người phụ nữ có khả năng mang gen khi có 1 trong 3 điều kiện sau:

- Có 1 con trai bị bệnh và trong gia đình không có ai bị bệnh cũng như mang gen bệnh

- Có ít nhất 1 người đàn ông trong họ mẹ bị bệnh và không có con trai bị bệnh

- Là con của một người mang gen bệnh [8] [15] [16]

Bệnh Hemophilia A đặc trưng bởi triệu chứng chảy máu, thường xuất hiện khi trẻ bắt đầu tập đi với các nốt hoặc điểm tụ máu Ở những trường hợp xuất huyết nhẹ, chảy máu có thể xảy ra khi răng sữa rụng hoặc bị nhổ Đối với mức độ nặng, bệnh nhân thường xuyên bị bầm tím và chảy máu tái phát tại các khớp như đầu gối, mắt cá chân, hông và khuỷu tay Nguy hiểm nhất là chảy máu trong nội tạng, có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng.

Các xét nghiệm cận lâm sàng cần thực hiện:

- Thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1 giờ, chất lượng cục máu đông kém, thời gian Howel kéo dài…

- Định lượng yếu tố VIII giảm hoặc không có

- Yếu tốvon Willerbrand bình thường

- Sốlượng tiểu cầu bình thường

1.3.2 Chẩn đoán mức độ bệnh Hemophilia A theo nồng độyếu tố

Nồng độ yếu tố VIII trong máu của người bình thường là 200 ng/mL, và mức độ bệnh của người bệnh được xác định dựa trên nồng độ này Tùy thuộc vào nồng độ yếu tố VIII, bệnh được phân chia thành ba mức độ: nặng, vừa và nhẹ.

Mức độ nặng của bệnh hemophilia A được xác định khi nồng độ yếu tố VIII dưới 1% (