Đánh giá thực trạng phơi nhiễm e coli mang gen kháng kháng sinh phân lập từ thịt lợn tiêu thụ tại hà nội

TỔNG QUAN

Escherichia coli và E coli sinh beta-lactamase phổ rộng ESBL

1.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Escherichia coli

Escherichia, hay còn gọi là Escherich, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1885 và bao gồm nhiều loài, trong đó E.coli là quan trọng nhất E.coli là trực khuẩn Gram âm, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, có khả năng hiếu kị khí tuỳ tiện, lên men nhiều loại đường và sinh hơi Loài này sở hữu ba nhóm kháng nguyên: kháng nguyên O với gần 160 yếu tố, kháng nguyên K được chia thành ba loại A, B và L, cùng kháng nguyên H với hơn 50 yếu tố Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli được phân loại thành nhiều tuýp huyết thanh khác nhau, mỗi tuýp được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K.

Trong đường tiêu hoá, E.coli chiếm khoảng 80% các vi khuẩn hiếu khí Nhưng

E.coli cũng là vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết E.coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương [39]

Vi khuẩn hội sinh và gây bệnh E coli có thể phân loại thành bốn nhóm chính khác nhau: A, B1, B2 và D dựa vào 3 gen đánh dấu chính là chuA, yjaA và

TspE4.C2 [26] Gần đây dữ liệu từ phân tích giải trình tự gen đa điểm (loci)

Phân tích multilocus sequence typing cho thấy có 4 nhóm chính của E.coli, được chia thành 7 nhóm nhỏ hơn: A0, A1, B1, B22, B23, D1 và D2 Ở người, chủng E.coli nhóm A chiếm ưu thế với tỷ lệ 40,5%, tiếp theo là nhóm B2 với 25,5%, trong khi các nhóm B1 và D chỉ chiếm khoảng 17% mỗi nhóm Đối với động vật, E.coli nhóm B1 là phổ biến nhất với 41%, tiếp theo là nhóm A (22%), B2 (21%), và nhóm D ít phổ biến nhất với 16%.

Vi khuẩn E coli A và B1 thường là các vi khuẩn hội sinh không mang gen độc tính, tồn tại trong ruột già của người và động vật, cũng như trong môi trường Ngược lại, nhóm B2 và nhóm D thường là những chủng gây bệnh, mang gen mã hóa độc lực, gây ra các bệnh ngoài đường ruột như nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhiễm khuẩn máu và viêm não.

6 nhóm E.coli trên người và động vật phụ thuộc vào khí hậu, chế độ ăn uống, khối lượng cơ thể, và cấu trúc ruột của vật chủ

1.1.2 Kháng sinh và vi khuẩn kháng kháng sinh

Kháng sinh là các hợp chất có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn ngay cả ở nồng độ thấp, thông qua việc can thiệp vào các phản ứng sinh học ở cấp độ phân tử.

Vi sinh vật kháng thuốc là hiện tượng mà vi khuẩn có thể phát triển ngay cả khi có sự hiện diện của thuốc hoặc hóa chất ức chế chúng ở nồng độ thông thường Kháng thuốc được chia thành hai loại chính: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc thu được.

Kháng thuốc tự nhiên là đặc điểm riêng biệt của từng chủng vi sinh vật đối với một số loại kháng sinh cụ thể, và tính chất này đã tồn tại trước khi kháng sinh được sử dụng Điều này liên quan đến phổ tác dụng của kháng sinh, đặc trưng cho từng loài Kháng thuốc tự nhiên được xác định bởi thông tin di truyền có sẵn trong nhiễm sắc thể.

Về mặt sinh hoá có cơ chế quan trọng: đó là tính thấm của tế bào và sự thiếu vắng phân tử đích

Kháng thuốc xuất hiện do chọn lọc tự nhiên trong các chủng vi sinh vật nhạy cảm khi tiếp xúc với kháng sinh Vi sinh vật trở nên kháng thuốc khi chúng có khả năng phát triển với nồng độ kháng sinh cao hơn so với quần thể gốc Khi mức độ kháng thuốc gia tăng, chúng có thể thoát khỏi các phương pháp điều trị, dẫn đến tình trạng kháng thuốc lâm sàng Về mặt di truyền, sự kháng thuốc có thể xảy ra do đột biến gen nhiễm sắc thể hoặc do tiếp nhận gen plasmid, dẫn đến kháng thuốc plasmid.

Cơ chế kháng thuốc có thể được tóm tắt trong hình 1.1 như sau:

Hình 1.1 Cơ chế tác động và kháng thuốc

Kháng sinh có khả năng ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn bằng cách ngăn chặn sự hình thành bộ khung peptidoglycan (murein) Điều này dẫn đến việc vi khuẩn không có vách tế bào, làm cho chúng trở nên dễ bị tiêu diệt Các kháng sinh như nhóm beta-lactam và vancomycin là ví dụ điển hình cho cơ chế này.

Kháng sinh gây rối loạn chức năng của màng nguyên sinh chất, làm giảm khả năng thẩm thấu chọn lọc của tế bào Khi màng sinh chất bị tác động, các thành phần trong bào tương vi khuẩn sẽ bị thoát ra ngoài, trong khi nước từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào tế bào, dẫn đến sự chết của vi khuẩn Ví dụ điển hình cho tác động này là polymyxin và colistin.

Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên các tiểu phần của riboxom ở vi khuẩn Cụ thể, kháng sinh gắn vào tiểu phần 30S, như streptomycin, ngăn cản hoạt động của ARN thông tin hoặc ức chế chức năng của ARN vận chuyển, ví dụ như tetracycline Ngoài ra, kháng sinh gắn vào tiểu phần 50S, chẳng hạn như erythromycin và chloramphenicol, cản trở sự liên kết và hình thành chuỗi acid amin, từ đó làm giảm khả năng tạo ra các phân tử protein cần thiết cho tế bào sống.

Kháng sinh có khả năng ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic bằng cách ngăn cản sự sao chép ADN mẹ, dẫn đến việc tạo ra ADN con Các nhóm kháng sinh như quinolon hoạt động bằng cách can thiệp vào enzym sao chép ADN, trong khi một số loại khác gắn kết với ARN-polymerase, từ đó ngăn chặn quá trình tổng hợp RNA.

Rifampicin và các chất ức chế tổng hợp như sulfamid và trimethoprim có vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự hình thành nucleotide bằng cách ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa cần thiết.

Giảm sự tích tụ thuốc có thể được thực hiện bằng cách giảm tính thấm của thuốc hoặc tăng cường dòng chảy hoạt động của thuốc ra khỏi bề mặt tế bào Một số loài vi khuẩn sử dụng các máy bơm trong màng tế bào để bơm kháng sinh ra ngoài trước khi chúng có thể gây hại Những máy bơm này thường được kích hoạt bởi một chất nền cụ thể liên kết với kháng sinh, như trong trường hợp kháng fluoroquinolone.

1.1.3 Cấu trúc và phân nhóm β-lactam

Vòng β-lactam là cấu trúc chính của nhiều loại kháng sinh, bao gồm bốn nhóm chính: penicillin, cephalosporin, carbapenem và monobactam Hầu hết các kháng sinh này hoạt động bằng cách ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào vi khuẩn.

Hình 1.2 C ấu trúc vòng β -lactam

Gánh nặng và thực trạng vi khuẩn sinh ESBL

1.2.1 Gánh n ặng bệnh tật do vi khuẩn kháng thuốc sinh ESBL

Tổ chức Y tế Thế giới đã cảnh báo rằng kháng thuốc kháng sinh đang trở thành một mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe toàn cầu, với ước tính hơn 700.000 ca tử vong hàng năm do vi khuẩn kháng thuốc.

Hình 1.7 Ước tính số ca tử vong mỗi năm do vi khuẩn kháng kháng sinh so với các căn nguyên gây chết khác [11]

Việc sử dụng thuốc kháng sinh trong nông nghiệp để tăng trưởng và phòng chống dịch bệnh có ảnh hưởng lớn đến sản xuất vật nuôi, an toàn thực phẩm và sức khỏe con người Tại Mỹ, vào năm 2015, chỉ 62% tổng số kháng sinh được bán để sử dụng cho động vật sản xuất thực phẩm là dành cho y học cho người, trong khi khoảng 70% kháng sinh còn lại được sử dụng cho động vật.

Tại Mỹ, có 16 loại kháng sinh quan trọng được sử dụng trong điều trị cho động vật Sự gia tăng sử dụng kháng sinh trong phòng ngừa và điều trị bệnh cho con người trên toàn cầu đã đạt gần 40% từ năm 2000 đến 2010.

Nông nghiệp chiếm hơn 75% lượng kháng sinh sử dụng hàng năm ở Châu âu và Mỹ; tuy nhiên ở 24 quốc gia EU, việc sử dụng đã giảm 12% từ năm 2011 đến năm

Tình trạng kháng kháng sinh đang gia tăng, đặc biệt là với vi khuẩn kháng carbapenem, điều này đã được báo cáo bởi Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) và Trung tâm Phòng ngừa và Kiểm soát Dịch bệnh Châu Âu (ECDC) Vi khuẩn kháng thuốc không chỉ xuất hiện ở người mà còn trong động vật và thực phẩm, làm tăng mối lo ngại về đa kháng thuốc (MDR) Việc theo dõi tình trạng kháng carbapenem trong các nguồn gốc này là rất cần thiết Ngoài ra, sự lan rộng của kháng colistin, một trong những kháng sinh cuối cùng để điều trị nhiễm trùng đa kháng thuốc, cũng đang trở thành vấn đề toàn cầu nghiêm trọng.

Vi khuẩn kháng thuốc đang gây ra cái chết cho ít nhất 50,000 người mỗi năm tại châu Âu và Mỹ, cùng với hàng trăm nghìn ca tử vong ở các khu vực khác, tạo ra một gánh nặng lớn cho hệ thống y tế Đặc biệt, trong 15 quốc gia châu Âu, hơn 10% các ca nhiễm trùng máu do chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) gây ra, với tỷ lệ kháng thuốc gần 50%.

Theo dự báo về tác động của vi khuẩn kháng thuốc trong tương lai, nếu tình trạng kháng thuốc tiếp tục gia tăng cùng với sự phát triển kinh tế đến năm 2050, mỗi năm sẽ có khoảng 10 triệu người tử vong do vi khuẩn kháng thuốc.

1.2.2 Sự phổ biến E.coli sinh ESBL trên thế giới

Cho đến những năm 1990, các enzyme beta-lactamase phổ rộng (ESBL) chủ yếu được xác định là SHV hoặc TEM Tuy nhiên, vào cuối thập kỷ đó, sự xuất hiện của ESBL và AmpC beta-lactam đã gia tăng toàn cầu Hiện nay, enzyme CTX-M đã trở thành loại phổ biến nhất trong các ESBL Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự gia tăng của E.coli mang ESBL.

ESBL/AmpC ở động vật làm thực phẩm, và các chủng có liên quan từ các động vật gần gũi với con người

Hình 1.8 Phân b ố của các nhóm gen bla CTX-M trên th ế giới [36]

Các nhóm gen kháng kháng sinh thường gặp bao gồm blaCTX-M-1, blaCTX-M-14, blaCTX-M-15, blaSHV-12 và blaCMY-2 Gen blaCTX-M-14 là một trong những loại beta-lactam phổ biến nhất ở động vật gần gũi với con người và gia cầm tại châu Á (30-33%), trong khi tỷ lệ này ở châu Âu chỉ khoảng 4-7% Gen blaCTX-M-15 chủ yếu được phát hiện ở gia cầm châu Âu với số lượng ít, nhưng tỷ lệ ở động vật gần gũi với con người là 15% và ở bò/lợn là 8% Tại châu Á và Mỹ, gen blaCTX-M-15 có mặt trong tất cả các nhóm nghiên cứu Gen blaCTX-M-1 rất phổ biến ở động vật tại châu Âu, với tỷ lệ 28% ở thịt gia cầm và 72% ở gia súc và lợn, nhưng ít được báo cáo ở các khu vực khác.

Gen blaCTX-M-1 từ E coli chỉ chiếm 7% ở người tại châu Âu Tuy nhiên, hai nghiên cứu gần đây từ Hà Lan cho thấy blaCTX-M-1 là loại enzyme beta-lactamase mở rộng (ESBL) phổ biến nhất ở người khỏe mạnh, gia cầm và thịt gà bán lẻ.

Vi khuẩn sinh ESBL đã gia tăng một cách nhanh chóng trên toàn cầu trong một thập kỷ qua (Hình 1.9) [17]

Hình 1.9 M ức độ phổ biến của vi khuẩn sinh E coli sinh ESBL trên toàn thế gi ới[37]

Từ năm 2001 đến 2014, tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL ở Châu Âu và Châu Mỹ chỉ tăng nhẹ, duy trì dưới 10%, trong khi đó, Châu Phi và khu vực Tây Thái Bình Dương có tỷ lệ cao hơn, khoảng 25-50% Đặc biệt, khu vực Đông Nam Á, Ấn Độ và Trung Quốc ghi nhận tỷ lệ đáng báo động lên đến 60-70% vào năm 2011, với vi khuẩn E.coli chiếm ưu thế và gen CTX-M là phổ biến nhất.

1.2.3 T hực trạng vi khuẩn sinh ESBL ở Việt Nam

Theo báo cáo năm 2008-2009 của Bộ Y tế Việt Nam, phối hợp với Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng kháng sinh (GARP-Viet Nam) và Đơn vị Nghiên cứu lâm sàng ĐH Oxford, tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Gram âm trong các mẫu lâm sàng là rất cao.

Hình 1.10 T ỉ lệ kháng sinh của các chủng Gram âm tại Việt Nam [38]

Năm 2009, một nghiên cứu cho thấy 30-70% vi khuẩn gram âm từ bệnh viện kháng lại kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 và 4, trong khi khoảng 40-60% kháng với aminoglycoside và fluoroquinolon Đặc biệt, gần 40% chủng Acinetobacter có dấu hiệu giảm nhạy cảm với imipenem.

Tình hình kháng thuốc ESBL trong bệnh viện tại Việt Nam giai đoạn 2009-2011 cho thấy 48,1% mẫu E.coli và 39,5% mẫu Klebsiella pneumoniae dương tính với ESBL Trong số 132 chủng Enterobacteriaceae được phân lập, các beta-lactamase phổ biến nhất là blaCTX-M-27 (37,6%), blaCTX-M-15 (23,5%), blaCTX-M-14 (13,2%) và blaCTX-M-55 (12,3%) Nghiên cứu cũng ghi nhận 72 chủng vi khuẩn E.coli.

Klebsiellapneumoniae được thu thập ở bệnh viện Chợ Rẫy và bệnh viện Thống Nhất,

Hồ Chí Minh ghi nhận hơn 80% mẫu vi khuẩn kháng từ 4 đến 6 loại kháng sinh Hai gen blaCTX-M-15 và blaCTX-M-27 là phổ biến nhất, chúng nằm trên plasmid có kích thước từ 50-170 kb, cho phép khả năng chuyển gen.

Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh tại Việt Nam, đặc biệt là vi khuẩn E.coli sinh ESBL với loại CTX-M, đang ở mức cao từ các nguồn thực phẩm, động vật và con người Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các gen kháng kháng sinh trên plasmid có khả năng chuyển gen, làm tăng nguy cơ lan rộng vi khuẩn kháng kháng sinh trong cộng đồng.

Sự lây lan của vi khuẩn kháng sinh qua chuỗi thực phẩm

1.3.1 Cơ chế Sự lan truyền của vi khuẩn kháng thuốc trong chuỗi thực phẩm Động vật, sản phẩm thủy sản và rau quả được coi là nguồn dự trữ lớn của vi khuẩn kháng thuốc, vì chuỗi sản xuất thực phẩm là một hệ sinh thái bao gồm các hốc sinh thái khác nhau, nơi lượng lớn thuốc kháng sinh được sử dụng và nhiều vi khuẩn cùng tồn tại [26] Có hai con đường chính liên quan đến sự tiến hóa và phát triển của vi khuẩn kháng thuốc Đầu tiên, sự kháng thuốc có thể được khởi nguồn bởi một kiểu hình đã tồn tại từ trước trong các quần thể vi khuẩn tự nhiên Trong quá trình tiến hóa, các vi khuẩn tích lũy các đột biến trong các gen hiện có (trong nhiễm sắc thể hoặc plasmid) và truyền các gen kháng thuốc sang các tế bào ở thế hệ kế tiếp thông qua chuyển gen dọc (Vertical genetic transfer), dẫn đến đề kháng bẩm sinh Con đường thứ hai liên quan đến sự trao đổi gen bên trong và giữa các loài vi khuẩn [26] Hiện tượng này được gọi là chuyển gen theo chiều ngang (HGT – Horizontal genetic transfer) thông qua các yếu tố di truyền di động: chẳng hạn như plasmid, transposon, trình tự chèn và thực khuẩn thể Các vật liệu di truyền như vậy được chuyển qua con đường tiếp hợp (chuyển DNA từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận thông qua tiếp xúc tế bào với tế bào và được hỗ trợ bởi yếu tố sinh sản gọi là pili), chuyển đổi (DNA trần có trong môi trường được tiếp nhận bởi người nhận tế bào), và tải nạp (một thực khuẩn hoạt động như vector và chèn DNA vào tế bào nhận) [26] Sự lưu hành đồng thời của vi khuẩn kháng kháng sinh và vi khuẩn không kháng thuốc trên cùng một vật chủ tạo cơ hội để chia sẻ vật liệu di truyền giữa các chủng vi sinh vật Việc truyên gen kháng thuốc thường thông qua các yếu tố di truyền di động (Mobile genetic elements) thúc đẩy khả năng lan truyền nhanh chóng của các chủng kháng đa thuốc (16) Dưới áp lực chọn lọc của kháng sinh, sự lây truyền của vi khuẩn kháng thuốc được thúc đẩy xuyên suốt chuỗi thực phẩm (hình 1.11)

Hình 1.11 S ự lan truyền của vi khuẩn kháng thuốc trong chuỗi thực phẩm

Sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc có thể xảy ra qua chuỗi thức ăn thông qua tiếp xúc trực tiếp và gián tiếp Tiếp xúc trực tiếp xảy ra khi con người tiếp xúc với động vật và các chất sinh học như máu, nước tiểu và phân, dẫn đến sự lây lan nhanh chóng của vi khuẩn kháng thuốc Ngoài ra, con người cũng có thể tiếp xúc gián tiếp qua việc tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm như thịt, trứng và sữa Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự hiện diện của vi khuẩn kháng thuốc trong các sản phẩm thực phẩm từ nhiều nguồn động vật khác nhau, bao gồm gia súc, gia cầm và lợn Do đó, cả những người tiếp xúc trực tiếp như nông dân và công nhân chế biến thực phẩm, cũng như người tiêu dùng, đều có nguy cơ nhiễm vi khuẩn kháng thuốc qua chuỗi thực phẩm.

1.3.2 Sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong chuỗi thực phẩm ở Việt Nam

Hiện nay, vi khuẩn đường ruột sinh ESBL đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong cả bệnh viện và cộng đồng Chúng là nguyên nhân chính gây ra các bệnh nhiễm khuẩn như nhiễm khuẩn tiết niệu và nhiễm khuẩn tiêu hóa, với tỷ lệ kháng kháng sinh cao Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng E coli sinh ESBL không chỉ có mặt ở bệnh nhân nội trú mà còn ở bệnh nhân ngoại trú và cả những người khỏe mạnh trong cộng đồng.

Nghiên cứu về vi khuẩn kháng thuốc trong động vật và sản phẩm động vật cho thấy tỷ lệ kháng thuốc rất cao tại các trang trại chăn nuôi Cụ thể, 202 chủng Campylobacter spp từ 343 trang trại lợn và gia cầm ở Đồng bằng sông Cửu Long ghi nhận 100% kháng Erythromycin, 99% kháng Sulfamethoxazole–Trimethoprim, 92% kháng Nalidixic acid và Ofloxacin, cùng 20,8% kháng Ciprofloxacin Thêm vào đó, trong 895 chủng Escherichia coli từ 208 trang trại gia cầm quy mô nhỏ, tỷ lệ kháng Gentamicin là 20% và kháng Ciprofloxacin đạt 32,5% Hiện tượng kháng Ciprofloxacin liên quan trực tiếp đến việc sử dụng Quinolone tại các trang trại.

Nghiên cứu của TS Văn Thị Thu Hảo và Cộng sự (2007) cho thấy 61% mẫu thịt và 18% mẫu thân mềm hai mảnh vỏ bị nhiễm vi khuẩn Salmonella spp Đáng chú ý, 40,7% các chủng vi khuẩn kháng tetracycline, 22,0% kháng ampicillin/amoxicillin, 16,5% kháng axit nalidixic, và 14,3% kháng sulfafurazole và streptomycin Khoảng 50,5% các chủng vi khuẩn phân lập kháng ít nhất một loại kháng sinh, trong khi các chủng Salmonella đa kháng, kháng ít nhất ba loại kháng sinh khác nhau, được phát hiện trong tất cả các loại thực phẩm.

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Anh Đào và Cộng sự (2016) cho thấy tỷ lệ ô nhiễm Salmonella cao trong các mẫu thực phẩm, với 69,7% ở thịt lợn, 65,3% ở thịt gia cầm, 58,3% ở thịt bò, 49,1% ở tôm và 36,6% ở cá nước ngọt nuôi tại các chợ bán lẻ Đặc biệt, các chủng Salmonella này có tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh cao, lên tới 62,2%, trong đó kháng tetracycline chiếm 53,3%, ampicillin 43,8%, chloramphenicol 37,5% và trimethoprim.

23 sulfamethoxazole (31,3%) Các phân lập có khả năng kháng với ba loại chất kháng khuẩn trở lên đã được tìm thấy (41,1%) [28]

Nghiên cứu của Lê Quốc Phong và Cộng sự (2016) cho thấy tỷ lệ E.coli sản xuất ESBL trong thực phẩm bán lẻ đạt 40,6% Các gen mã hóa β-Lactamase thuộc các nhóm CTX-M-1 (50,7%), CTX-M-9 (41,5%), TEM (59,9%) và SHV (2,8%) được phát hiện đơn lẻ hoặc kết hợp Tỷ lệ các chủng ESBL đơn lẻ chứa CTX-M-1 hoặc -9 kết hợp với nhóm TEM lần lượt là 35,2% và 16,2% Nhóm phylogroup B1 là phổ biến nhất trong các phân lập ESBL từ thịt lợn (44,7%), gia cầm (55,9%) và tôm (72,7%), trong khi nhóm B2 ít phổ biến hơn (4,2% và 4,8% đối với phân lập từ thịt lợn và gia cầm).

Tỷ lệ kháng đa thuốc (MDR; kháng với ≥3 nhóm kháng sinh) ở E coli sản xuất ESBL được phân lập từ thực phẩm là 85,9% [23]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 4 năm 2019 đến tháng 2 năm 2020

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu là một số chợ bán lẻ, lò mổ lợn tại Hà Nội và được tiến hành xét nghiệm phân lập vi khuẩn E.coli tại phòng thí nghiệm của khoa Vi sinh vật Thực phẩm và Sinh học Phân tử, Viện Dinh dưỡng

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên là các mẫu thịt lợn mua tại một số chợ bán lẻ, lò mổ lợn tại

Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng:

Thịt lợn tươi là loại thịt được mổ và bày bán trong ngày tại các chợ bán lẻ Người tiêu dùng có thể lựa chọn thịt lợn từ một số lò mổ uy tín ở Hà Nội để đảm bảo chất lượng và độ tươi ngon.

- Miếng thịt gồm cả da, nạc và mỡ

Tiêu chuẩn loại trừ đối tượng:

- Các loại thịt lợn đặc sản: thịt lợn mán, thịt lợn rừng

- Các loại thịt lợn nhập khẩu, thịt lợn đông lạnh.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu điều tra cắt ngang thu thập mẫu thịt lợn từ các chợ bán lẻ và lò mổ ở

Hà Nội để xét nghiệm nhằm xác định sự lưu hành E coli sinh ESBL.

Cỡ mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu đã tiến hành lấy mẫu thịt lợn ngẫu nhiên từ các chợ bán lẻ và lò mổ tại Hà Nội nhằm xác định tỷ lệ nhiễm E coli trong cộng đồng Cỡ mẫu được xác định dựa trên công thức thống kê phù hợp để đảm bảo tính chính xác của kết quả.

Theo một cuộc điều tra trước đó, ước tính tỷ lệ mẫu thịt nhiễm E coli sinh ESBL tại Việt Nam dao động từ 68,4% đến 78% (H V Le et al., 2015) Nghiên cứu này đã chỉ ra mức độ phổ biến của E coli kháng thuốc trong thực phẩm, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát an toàn thực phẩm.

• - Z = mức độ tin cậy (ở mức 95% hay Z = 1.96)

• - d: Hệ số sai số mong đợi của p, trong nghiên cứu này chúng tôi chọn d = 0,10 Vậy số mẫu cần phải lấy sẽ là 72 mẫu.

Phương pháp chọn mẫu

Chọn mẫu có chủ đích: mẫu thịt lợn mua tại các chợ bán lẻ tại 8 quận nội thành

Hà Nội bao gồm các quận như Hà Đông, Thanh Xuân, Hoàng Mai, Đống Đa, Hai Bà Trưng, Ba Đình, Cầu Giấy, Hoàn Kiếm và có 8 lò mổ lợn hoạt động trên địa bàn thành phố.

Cách lấy mẫu

Các mẫu thịt lợn được lấy theo hướng dẫn của TCVN 7925:2018, quy định phương pháp để phát hiện và định lượng vi sinh vật trên bề mặt thân thịt sau giết mổ Tất cả mẫu đều được mã hóa và vận chuyển ngay đến Phòng vi sinh vật thực phẩm và sinh học phân tử thuộc Viện Dinh dưỡng.

Hóa chất, trang thiết bị và vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

+ Môi trường TBX (Merck, Đức)

+ Môi trường Muller Hinton (OXOID, Anh)

+ Kháng sinh Cefotaxime (Tokyo Chemical Industry, Nhật Bản)

* Vật liệu cho xác định kiểu hình ESBL và đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E coli

+ Môi trường Muller Hinton (OXOID, Anh)

+ Các loại khoanh giấy kháng sinh (OXOID, Anh) để xác định kiểu hình ESBL: cefotaxime (CTX), cefotaxim/acid clavulanic (CTX-C), ceftazidime (CAZ), ceftazidime/acid clavulanic (CAZ-C)

The article discusses various types of antibiotic discs from OXOID (UK) used to determine antibiotic resistance characteristics These include Ampicillin (AMP), Amoxicillin/clavulanic acid (AMC), Aztreonam (ATM), Fosfomycin (FOF), Ciprofloxacin (CIP), Imipenem (IMP), Gentamicin (GM), Meropenem (MEM), Chloramphenicol (C), Cefepime (FEP), Colistin (CT), and Trimethoprim/Sulfamethoxazole (SXT).

+ Chủng chuẩn quốc tế Escherichia coli ATCC 25922

+ Que cấy, tăm bông, đèn cồn

+ Dụng cụ đặt khoanh giấy kháng sinh

+ Hộp lồng nhựa vô trùng đường kính 90mm, 150 mm, thước đo vòng ức chế + Tủ an toàn sinh học cấp 2, tủ ấm

* Vật liệu cho các phản ứng PCR

Các cặp mồi đặc hiệu cho các gen được sử dụng trong phản ứng PCR đã được tham khảo từ các nghiên cứu công bố và tổng hợp bởi Invitrogen (Singapore) cùng với Công Ty Phù Sa (Việt Nam).

+ Bộ kít cho Multiplex PCR (Primerstar, Takara, Nhật bản)

Các chứng dương cho phản ứng PCR được sản xuất từ các chủng E coli được phân lập từ mẫu thực phẩm và bệnh phẩm, mang các gen tương ứng với gen cần tìm Những chứng dương này được cung cấp bởi Viện Y tế công cộng Osaka, Nhật Bản.

+ Thạch agarose (Sigma, Mỹ) dùng trong điện di gen

+ GelRed Nucleic Acid Gel Stain, 10,000X (Biotium)

+ Thang DNA chuẩn 100 bp (Invitrogen)

+ Máy ly tâm, máy voltek

+ Máy ly tâm lạnh (Clinispin, Đức), máy spindown (Eppendorf, Đức)

+ Máy điều nhiệt tự động (Eppendorf, Đức)

+ Bộ điện di ngang (Fisher scientific, Mỹ)

+ Máy chụp ảnh gel (Biorad, Mỹ)

+ Máy PCR Light (Roche, Mỹ)

+Máy dập khoanh giấy kháng sinh

+Máy đo hàm lượng DNA, nanodrop

Sơ đồ phân tích mẫu

Sàng lọc vi khuẩn E coli sinh ESBL Đặc điểm kháng kháng sinh của

Phân loại nguồn gốc phát sinh loài Xác định nhóm gen

CTX-M Phân tích trình tự lặp lại ngắn đa locus

Nội dung nghiên cứu và kỹ thuật xét nghiệm

2.7.1 Phân lập vi khuẩn đứờng ruột có khả năng sinh ESBL trong mẫu thịt a Nguyên lý

Sử dụng thạch Tryptone BileX-glucuronide (TBX) kết hợp với cefotaxime 1 µg/ml là phương pháp hiệu quả để sàng lọc các vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh enzyme ESBL Các bước tiến hành bao gồm chuẩn bị môi trường thạch và thêm cefotaxime để phát hiện vi khuẩn kháng thuốc.

Thêm 25 gram mẫu vào 225 ml nước peptone, đồng nhất mẫu Mẫu được cấy ria trên môi trường thạch Tryptone Bile X-glucuronide (TBX) có bổ sung cefotaxime (CTX) với nồng độ 1 àg/ml theo phương phỏp cấy phõn vựng (như hỡnh vẽ) Ủ ở 37 oC ± 1 o C / 24 ± 3h c Nhận định kết quả

Nếu các đĩa có khuẩn lạc mọc, điều này cho thấy mẫu thịt chứa vi khuẩn đường ruột kháng cefotaxime Mẫu với khuẩn lạc màu xanh, được coi là dương tính với vi khuẩn này.

Với mỗi mẫu, chọn 2-3 khuẩn lạc dạng E coli (khuẩn lạc có màu xanh) Những đĩa không có khuẩn lạc mọc kết luận âm tính

Hình 2.1: Hình d ạng E coli mọc trên thạch TBX

2.7.2 Kỹ thuật xác định đặc điểm kháng kháng sinh của E coli sinh ESBL a Nguyên lý

Phương pháp khoanh giấy khuếch tán được sử dụng để kiểm tra độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh Các khoanh giấy tẩm kháng sinh được đặt lên đĩa thạch Muller Hilton, cho phép kháng sinh khuếch tán vào môi trường xung quanh Nếu vi khuẩn nhạy cảm, sẽ không có sự phát triển xung quanh khoanh giấy Đường kính vùng vô khuẩn được đo và mức độ kháng kháng sinh được phân loại theo các mức nhạy cảm (S), kháng (R) và trung gian (I) dựa trên hướng dẫn của CLSI (M100-S25) Thí nghiệm được thực hiện với 12 loại kháng sinh theo hướng dẫn của CLSI (M02-A11).

- Chuẩn bị huyền dịch của các chủng vi khuẩn E coli sinh ESBL trong NaCl 0,9

% tương ứng với độ đục chuẩn 0,5 McFarland

- Trải đều huyền dịch lên đĩa thạch MH bằng tăm bông vô trùng, để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

- Đặt khoanh giấy kháng sinh bằng máy đặt khoanh giấy kháng sinh

- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 15 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch Ủ ấm ở 37 0 C trong vòng 18-24 giờ

- Tất cả các bước trên thực hiện song song với chủng chuẩn Quốc tế

Escherichia coli ATCC 25922 được sử dụng để kiểm tra chất lượng quy trình Kết quả được đánh giá bằng cách đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn của chủng chuẩn So sánh kết quả với chuẩn giới hạn của chủng quốc tế E coli ATCC 25922; nếu nằm trong giới hạn, quy trình được thực hiện đúng Ngược lại, nếu không đạt chuẩn, quy trình có thể chưa đúng hoặc hóa chất sinh phẩm bị hỏng, cần thực hiện lại thử nghiệm.

So sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với tiêu chuẩn đọc kết quả đường kính vùng ức chế đối với vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae được thực hiện theo tiêu chuẩn của CLSI (M100-S25) đối với một số loại kháng sinh thử nghiệm.

Bảng 2.1 trình bày 30 chuẩn kháng sinh, trong đó ghi lại kết quả thử nghiệm với các mức độ nhạy cảm (S), trung gian (I) và kháng (R) cho từng loại kháng sinh.

Bảng 2.1 Đường kính vùng ức chếđối với vi khuẩn thuộc họ

Enterobacteriaceae của một số loại kháng sinh [43]

Tên kháng sinh Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Nhạy cảm (S) Trung gian (I) Kháng (R)

2.7.3 Xác định nhóm gen CTX-M và phân loại nguồn gốc phát sinh loài bằng kỹ thu ật PCR

Để tách DNA, đầu tiên lấy một khuẩn lạc đã thuần chủng và nuôi cấy trong dung dịch canh thang dinh dưỡng LB ở nhiệt độ 37 o C trong 18 đến 24 giờ Tiếp theo, lấy 500 μl canh khuẩn và ly tâm ở tốc độ 10,000 vòng/phút trong 2 phút, sau đó loại bỏ dung dịch và giữ lại cặn Hòa tan cặn bằng 200 μl TE và cho vào bể nhiệt độ ở 100 o C trong 5 phút Sau đó, ly tâm dung dịch ở tốc độ 10,000 vòng/phút trong 2 phút để thu lại dịch làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR Chứng dương là các chủng đã xác định mang gen đích, trong khi chứng âm là nước tinh khiết.

Trình tự mồi cho kỹ thuật PCR phân nhóm CTX-M dựa theo nghiên cứu của (Q

Bảng 2.2 Trình tự mồi cho các nhóm gen CTX-M

(588bp) ctxm1-115F GAATTAGAGCGGCAGTCGGG ctxm1-702R CACAACCCAGGAAGCAGGC blaCTX-M-2

(107bp) ctxm2-39F GATGGCGACGCTACCCC ctxm2-145R CAAGCCGACCTCCCGAAC blaCTX-M-9

(475bp) ctxm9-16F GTGCAACGGATGATGTTCGC ctxm9-490R GAAACGTCTCATCGCCGATC blaCTX-M-8/25

(186bp) ctxm8g25g-533F GCGACCCGCGCGATAC ctxm8g25g-718R TGCCGGTTTTATCCCCG

Sản phẩm PCR sẽ được phân tích bằng phương pháp điện di trên thạch điện di 3% có bổ sung Redgel trong dung dịch đệm TBE 0.5X Các băng xuất hiện với kích thước tương ứng cho từng loại gen sẽ được xác định là dương tính.

Hình 2.2 PCR phát hi ện nguồn gốc gen kháng kháng sinh

• Trình tự mồi cho kỹ thuật phân loại nguồn gốc loài được dựa theo nghiên cứu của (Clermont, Bonacorsi and Bingen, 2000)

Bảng 2.3 Trình tự mồi phân loại nguồn gốc phát sinh loài

Nhóm gen Tên mồi Trình tự mồi chuA chuA 1 5’-GACGAACCA ACGGTCAGGAT-3’ chuA 2 5’-TGCCGCCAGTACC AAAGACA-3’

- Sử dụng enzyme Ex Taq tạo hỗn hợp phản ứng

- Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên thạch điện di 1,5% có bổ sung Redgel trong dung dịch đệm TAE 1X

- Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel

Khi thực hiện PCR để xác định nguồn gốc phát sinh loài, các chủng vi khuẩn có sự xuất hiện của các band có kích thước tương đương với chứng dương (bao gồm 3 band) sẽ được ghi nhận và phân tích kết quả.

Hình 2.3 Sơ đồ phân tích kết quả cho kỹ thuật PCR phân lo ại nguồn gốc phát sinh loài

2.7.4 Phân tích mối liên quan di truyền của các chủng E coli sinh ESBL bằng kỹ thuật Phân tích trình tự lặp lại ngắn đa locus (Multilocus Variable-Number Tandem Repeat Analysis) a Nguyên lý

Phương pháp MLVA (Multi-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis) dựa trên tính đa hình của các chuỗi nucleotide lặp lại biến thiên (VNTRs) trên các locus phân tán của nhiễm sắc thể vi khuẩn Phương pháp này được sử dụng để phân tích mức độ tương đồng di truyền của các vi sinh vật cụ thể, thông qua việc phát hiện số lượng bản sao khác nhau của các lặp lại trình tự ngắn trong bộ gen VNTR có tính đa hình cao, với sự thay đổi về số lượng đơn vị lặp lại và sự không đồng nhất giữa các trình tự, cho phép đánh giá mức độ gần gũi di truyền giữa các vi sinh vật.

Phương pháp MLVA (Multi-Locus Variable-number tandem repeats Analysis) cho phép phân tích sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn bằng cách chọn lọc một số locus có tỷ lệ đột biến và tính đa dạng cao Các locus này được khuếch đại thông qua phản ứng chuỗi polymerase (PCR), sau đó sản phẩm PCR được giải trình tự hoặc ước tính kích thước bằng phương pháp điện di Kết quả thu được sẽ được so sánh với các đoạn DNA tham chiếu, từ đó suy ra số đơn vị lặp lại tại mỗi quỹ tích Thông tin này tạo thành một mã dễ dàng so sánh với cơ sở dữ liệu tham chiếu, đảm bảo quá trình xét nghiệm được hài hòa và chuẩn hóa.

Bảng 2.4 Phân tích trình tự lặp lại ngắn đa locus (Caméléna et al., 2019)

Tất cả 7 vùng VNTR đã được khuếch đại bằng phương pháp PCR đa mồi với thể tích 50 μl, sử dụng bộ PCR đa kênh Qiagen Quy trình này bao gồm 5 μl chiết xuất DNA và các mồi ở nồng độ được chỉ định trong Bảng 2.4 Điều kiện chạy PCR bao gồm bước biến tính ở 95°C trong 15 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ biến tính ở 94°C.

Quá trình thực hiện bao gồm ba bước kéo dài: 30 giây ở 55°C, 90 giây ở 72°C và một bước kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 10 phút Nồng độ của các mồi được điều chỉnh để đảm bảo cường độ đồng nhất cho tất cả các đoạn trong quá trình điện di trên gel Điện di được thực hiện trong gel agarose tiêu chuẩn 3% nhuộm gel red trong 75 phút với điện áp 100V Mỗi gel được xếp hai bên bởi hai làn được nạp bằng thang DNA GeneRuler 100-bp từ Thermo Scientific.

Hình 2.4 Phân tích trình tự lặp lại ngắn đa locus của các chủng E coli sinh ESBL

KẾ T QU Ả

Sự lưu hành của của vi khuẩn E.coli sinh ESBL trong mẫu thịt lợn

Mẫu thịt lợn được xử lý theo tiêu chuẩn ISO 16649-1:2018 sẽ được kiểm tra sự hiện diện của E coli kháng TBX bằng môi trường Tryptone Bile X-glucuronide agar (TBX) có bổ sung 1μg/ml cefotaxime Khuẩn lạc màu xanh sẽ xuất hiện trên thạch, cho thấy sự có mặt của vi khuẩn này.

TBX được tính là dương tính có chứa E coli kháng TBX

Bảng 3.1 Thống kê kết quả phân lập mẫu E coli kháng TBX

Biểu hiện mẫu Số lượng (n) Tỷ lệ (%)

E coli (khuẩn lạc màu xanh) 62 86,8 %

Không có vi khuẩn mọc 2 2, 1%

Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 72 mẫu thịt lợn thu thập từ các chợ đầu mối và bán lẻ, có đến 86,8% mẫu bị ô nhiễm với vi khuẩn E Coli kháng CTX Ngoài ra, 11,1% mẫu nhiễm vi khuẩn đường ruột khác kháng CTX, trong khi 2,1% mẫu không có vi khuẩn đường ruột kháng CTX Những phát hiện này tương đồng với nghiên cứu của Q P Le và cộng sự.

Năm 2015, H V Le và cộng sự cùng với Nguyen et al (2021) đã nghiên cứu về việc phát hiện khuẩn lạc xanh trên thạch TBX Đối với mỗi mẫu, hai khuẩn lạc được chọn để kiểm tra khả năng sản sinh enzyme ESBL thông qua kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán, bao gồm các kháng sinh CTX, CTX-C, CAZ và CAZ-C, như đã trình bày trong phần phương pháp.

Commented [LTH1]: Trích dẫn dạng số

Bảng 3.2 Kết quảxác đinh vi khuẩn sinh ESBL bằng pp khoanh giấy kháng sinh

Kết quả bảng 3.2 cho thấy đa số (87%) vi khuẩn E coli sàng lọc trên thạch TBX bổ sung CTX 1àg/ml là vi khuẩn E coli sinh ESBL.

Tỷ lệ vi khuẩn E.coli mang gen CTX-M đa kháng thuốc

Các chủng vi khuẩn E.coli sinh ESBL đã được kiểm tra tính đa kháng với 12 loại kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Kết quả cho thấy tỷ lệ kháng với kháng sinh Ampicillin đạt 100% Đối với các kháng sinh như Chloramphenicol, Trimethoprim/Sulfamethoxazole, Gentamicin, Aztreonam và Cefepime, tỷ lệ kháng dao động từ 24-62% Các kháng sinh betalactam khác có tỷ lệ kháng thấp hơn, với 9% kháng Amoxicillin/clavulanic acid, 11.5% kháng Cefoxitin và 19.9% kháng Ciprofloxacin Đáng chú ý, 10.3% số chủng E.coli phân lập được kháng Colistin, kháng sinh cuối cùng dùng để điều trị vi khuẩn gram âm kháng đa thuốc, điều này tương đồng với các nghiên cứu gần đây cho thấy sự phổ biến của vi khuẩn gram âm kháng colistin trong thực phẩm.

E Coli sinh ESBL Số lượng Tỷ lệ (%)

Tổng số chủng E coli kháng CTX 167 100

Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã phát hiện và phân lập được hai chủng vi khuẩn E coli kháng betalactam thế hệ ba, cụ thể là carbapenem (imipenem và meropenem) Kháng sinh thuộc lớp carbapenem thường được sử dụng để điều trị các trường hợp vi khuẩn kháng thuốc sinh ESBL Mặc dù tỷ lệ kháng thuốc còn thấp, nhưng sự lưu hành của vi khuẩn này vẫn đáng lưu ý.

E coli kháng Carbapenem trong thực phẩm là tín hiệu đáng lo ngại với sức khỏe cộng đồng

Bảng 3.3: Đặc tính đa kháng thuốc của các chủng phân lập

AMP AMC ATM FOX CIP IMP GM MEM C FEP CT SXT

TỶ LỆ % K HÁ NG TH UỐ C

Tỷ lệ kháng thuốc ở các chủng E Coli phân lập (n

Kháng Nhạy cảm Trung gian

Số nhóm KS không nhạy cảm Số chủng Tỷ lệ %

Kết quả nghiên cứu cho thấy 62,3% (104 chủng) các chủng phân lập đều có tính đa kháng, với 18,6% kháng lại 6 loại kháng sinh trở lên Đặc biệt, một chủng đã được phát hiện kháng 10 loại kháng sinh, bao gồm cả colistin và carbapenem.

Đặc điểm các gen mã hóa sinh ESBL ở các chủng E.coli sinh ESBL

Chúng tôi đã chọn 146 chủng E coli sinh ESBL điển hình trong tổng số 167 chủng đã phân lập để xác định đặc điểm gen mã hóa các ESBL Phương pháp PCR đa mồi được sử dụng để tiến hành xác định kiểu gen.

Kết quả nghiên cứu cho thấy 60,3% số chủng E coli sinh ESBL mang gen blaTEM, trong khi 19,2% mang gen blaCTX-M-1, 25,3% mang gen blaCTX-M-9, 8,2% mang gen BlaCTX-M-8/25 và 2% mang 2 gen blaSHV Đặc biệt, có 42 chủng không phát hiện thấy mang các gen mã hóa sinh CTX nói trên.

Bảng 3.4 Tỷ lệ xuất hiện các kiểu gen mã hóa sinh ESBL của E coli sinh

ESBL Kiểu gien mã hóa CTX-M Số lượng (n = 146) Tỷ lệ (%)

Do vi khuẩn E coli sinh ESBL có thể mang một hoặc nhiều gen mã hóa sinh

Kết quả nghiên cứu cho thấy 30,6% chủng E coli sinh ESBL mang 1 gen mã hóa, trong khi 32,25% chủng mang 2 gen, và 8,8% chủng có đồng thời 3 gen mã hóa sinh ESBL.

Hình 3.2 T ỷ lệ chủng phân lập mang nhiều hơn 1 gen kháng betalactamase

Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E coli sinh ESBL

Phân tích đặc điểm nhóm phát sinh loài của các chủng E.coli sinh ESBL từ mẫu thực phẩm cho thấy sự hiện diện của cả 4 nhóm phát sinh loài Nhóm D chiếm tỷ lệ cao nhất với 54,5%, tiếp theo là nhóm A với 27,6%, nhóm B1 đạt 12,2% và nhóm B2 có tỷ lệ thấp nhất là 5,7%.

Hình 3.3 T ỷ lệ các nhóm phát sinh loài của các chủng E coli sinh ESBL

% TỔ NG S Ố CH ỦN G PH ÂN LẬ P

Mang 1 gene kháng thuốc Mang 2 gene kháng thuốc Mang 3 gene kháng thuốc

12.2 5.7 Đặc điểm phân nhóm phát sinh loài của các chủng E coli sinh ESBL (n 6)

41 Đánh giá mức độ kháng kháng sinh của các nhóm phát sinh loài của các chủng

E.coli sinh ESBL cho thấy: Các chủng này đều kháng AMP và CTX với tỷ lệ 100%

Tỷ lệ đa kháng (kháng với trên 3 loại kháng sinh) của nhóm B1 và B2 là 88.2% và 77.7% cao hơn hẳn so với 2 nhóm còn lại A và D là 65% và 55% (p