TỔ NG QUAN
Tổng quan về acid chlorogenic
Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của acid chlorogenic [66]
Trọng lượng phân tử: 354, 31 g/mol
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (1S,3R,4R,5R)-3-[(E)-3-(3,4- dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy-1,4,5-trihydroxycyclohexane-1-carboxylic acid
3-(3,4-Dihydroxycinnamoyl) quinic acid 3-Caffeoylquinic acid
Acid chlorogenic (CGA) là một chất rắn dạng bột màu trắng hoặc hơi ngả vàng, có khả năng tan trong nước và các dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd, và dimethylformamid Chất này có tính bền vững cao, và điều kiện bảo quản tối ưu là ở nhiệt độ 4°C.
Nhiệt độ nóng chảy: 205 – 209°C; Độ hòa tan: 40 mg/mL ở 25°C [66]
CGA, một hợp chất axit phenolic tự nhiên, chủ yếu có trong chiết xuất cà phê và trà xanh, sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quan trọng Nó hoạt động như một chất chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống viêm, đồng thời giúp quét gốc tự do và bảo vệ một số cơ quan trong cơ thể.
CGA có khảnăng bảo vệ gan bằng cách bảo vệ cơ thể khỏi các tổn thương do hóa chất hoặc lipopolysacarid gây ra [37]
Năm 2017, Tajik và các cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu tổng quan về tác dụng tiềm năng của CGA đối với các dấu ấn sinh học của bệnh lý mãn tính trên động vật và con người in vivo Nghiên cứu chỉ ra rằng CGA đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chuyển hóa glucose và lipid, cùng với các rối loạn liên quan khác Hơn nữa, CGA còn cho thấy tiềm năng trong việc chống tiểu đường, chống béo phì và chống ung thư.
Nghiên cứu của Zhang và cộng sự năm 2003 đã chỉ ra rằng CGA có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ, đặc biệt là khả năng dọn gốc hydroxyl (ãOH) với hằng số tốc độ dọn gốc tự do là 7,73 x 10^9 M −1 sec −1 Hơn nữa, CGA cũng đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ trong các tình trạng oxy hóa bệnh lý do paraquat gây ra trên chuột, khi mà hoạt động của hồng cầu, glutathion peroxidase và catalase ở gan tăng lên do sử dụng paraquat, nhưng CGA lại giúp giảm thiểu những phản ứng này.
Năm 2013, Ong và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của CGA đến sự dung nạp glucose, độ nhạy insulin và quá trình chuyển hóa lipid trong mô hình chuột Lepr db/db Kết quả cho thấy CGA kích hoạt phosphoryl hóa AMPK, làm tăng tổng hợp GLUT4, giảm hình thành G6Pase, từ đó ức chế tổng hợp axit béo và tân tạo đường, đồng thời cải thiện vận chuyển glucose ở cơ.
Nghiên cứu cho thấy CGA có khả năng kích thích bài tiết insulin từ tế bào INS-1E và tăng cường hấp thu glucose trong tế bào cơ L6 Ngoài ra, CGA trong chiết xuất hạt cà phê cũng được chứng minh có tác dụng giảm huyết áp tự nhiên ở chuột và người bị tăng huyết áp thông qua các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, có đối chứng.
1.2.4 M ộ t s ố phương pháp xác đị nh acid chlorogenic
CGA là hợp chất hóa học quan trọng được định tính và định lượng trong nhiều mẫu dược liệu trên toàn thế giới Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường được áp dụng để xác định hàm lượng CGA, với các điều kiện sắc ký khác nhau Một số nghiên cứu liên quan đã được tổng hợp trong bảng 1.4 dưới đây.
Bảng 1.4 Một sốphương pháp xác định acid chlorogenic
STT Mục tiêu nghiên cứu Phương pháp Điều kiện sắc ký TLTK
Xác định protocatechuic, syringin, axit chlorogenic, axit caffeic, liriodendrin và isofraxidin trong bột dược liệu Acanthopanax senticosus
+ Cột: Agilent SB-C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm)
+ Cột bảo vệ: C18 (5 μm) + Pha động: Axit phosphoric 0,05% : ACN (0,01 phút – tỷ lệ 94 : 6 tt/tt, 50 phút – tỷ lệ 65 : 35 tt/tt) + Nhiệt độ cột: 35°C
+ Tốc độ dòng: 0,9 ml/phút + Detector DAD: 200 – 370 nm + Kết quả: Thời gian lưu pic CGA khoảng 15,5 phút
2 Định lượng CGA trong một số dược liệu Thái
+ Cột sắc ký: Inertsil ODS-3 C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm)
+ Cột bảo vệ: ReproSil-Pur ODS-3 C18 (4 mm x 10 mm) + Pha động: Nước chứa 0,2% axit phosphoric, pH 1,46 (dung môi A) và methanol (dung môi B) + Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
+ Thể tích tiêm: 5 μl + Nhiệt độ cột: 30°C
Bước sóng phát hiện là 325 nm, cho thấy hàm lượng CGA cao nhất được tìm thấy trong nụ hoa Lonicera japonica, lá Melissa officinalis và hạt Coffea canephora với nồng độ tương ứng là 9,900 ± 0,004 và 19,88 ±.
Xác định hàm lượng CGA trong bột dược liệu
+ Cột sắc ký: Phenomenex Luna C18 (2) (4,6 mm x 250 mm, cỡ hạt 5 μm, cỡ lỗ 100 Å) + Pha động: ACN : axit phosphoric 0,5% (11,5 : 88,5 tt/tt)
+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút + Bước sóng xác định: 327 nm + Kết quả: Thời gian lưu pic CGA khoảng 15,7 phút và hàm lượng CGA trong bột dược liệu đạt 0,24%
Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn CGA từ Kim ngân hoa
+ Cột sắc ký: Phenomenex RP 18 (250 mm x 5 mm, 5 μm) + Pha động: Acetonitril : axit phosphoric 0,4% (13 : 87 tt/tt) + Tốc độ dòng: 1ml/phút
+ Thểtích tiêm: 20 μl + Bước sóng phát hiện: 327 nm
5 Định lượng đồng thời loganin và axit chlorogenic
+ Cột sắc ký: Ascentis C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 àm) + Pha động: nước chứa 0,1% acid phosphoric (A) : ACN (B)
(20 : 80 tt/tt) + Tốc độ dòng: 1 ml/phút + Detector UV/VIS, bước sóng phát hiện đối với loganin và acid chlorogenic lần lượt là 236 nm và 327 nm
+ Kết quả: Hàm lượng CGA dao động từ 0,07% đến 0,29% và hàm lượng loganin dao động từ0,03% đến 0,26%
Ngũ gia bì chân chim
+ Cột sắc ký: Phenomenex C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm) + Pha động: Axit acetic 0,1% : ACN (70:30 tt/tt)
+ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
+ Thể tích tiêm: 10 μm + Bước sóng hiện phát: 320 nm + Kết quả: Thời gian lưu pic CGA khoảng 6,7 phút
Nhận xét: Thông qua một số nghiên cứu định tính, định lượng CGA nêu trên, có thể thấy được trong các phân tích HPLC,
CGA thường được phát hiện ở bước sóng 320 – 327 nm, với hệ dung môi pha động chủ yếu là hỗn hợp dung dịch acid phosphoric (kênh A) và ACN (kênh B) Tùy thuộc vào mẫu nghiên cứu, tỷ lệ dung môi và thời gian lưu pic CGA sẽ khác nhau, dẫn đến sự khác biệt rõ rệt trong hàm lượng CGA ở các mẫu dược liệu.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus xanthii strumarii) được thu mua từ một số tỉnh của Việt Nam và gửi về Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu từ tháng 11/2019 để xây dựng phương pháp và đánh giá chất lượng Sau khi thu thập, dược liệu tươi được sấy khô ở nhiệt độ 60°C, xay nhỏ và bảo quản trong túi bóng kín ở nơi khô ráo, thoáng mát.
Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Ké đầu ngựa lưu trữ tại Viện Dược liệu
Bảng 2.1 Danh sách các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu thập
STT Ký hiệu mẫu Nguồn gốc mẫu Ngày lấy mẫu
Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị
- Chất chuẩn: Acid chlorogenic hàm lượng 99,60% (nguyên trạng); SKS:
711211 của AK Scientific, TnC, Mỹ
- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN, acid phosphoric) của hãng Merck, Đức
- Các dung môi, hoá chất dùng để xử lý mẫu: MeOH, acid formic của Trung
Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.)
- Nước cất sử dụng là nước cất hai lần đã được deion hoá
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của Shimadzu bao gồm các thành phần chính như hệ bơm binary LC-30AD, detector SPD-M20A DAD, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-30AC và bộ phận ổn nhiệt CTO-10AS Tất cả được điều khiển thông qua phần mềm Labsolution, mang lại hiệu suất và độ chính xác cao trong phân tích.
- Cột sắc ký: Cột silica gel pha đảo C18 (kích thước cột 250 mm x 4,6 mm; kích thước hạt 5 μm)
- Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO)
- Cân phân tích (Precisa XT 220A), độ chính xác 0,00001 g
- Cân kỹ thuật điện tử (Ohaus) độ chính xác 0,01 g
- Cân xác định độẩm (Sartorius, MA – 45)
- Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen, Universal – 320)
- Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm.
Phương pháp nghiên cứ u
Để chuẩn bị dung dịch thử, cần cân chính xác 0,5 g bột dược liệu Ké đầu ngựa đã được rây qua rây số 3, sau đó cho vào bình nón Tiếp theo, thêm 20 ml dung dịch acid formic 5% vào bình.
MeOH 50%, cân khối lượng Sau đó siêu âm (công suất 300W, tần số 40 kHz) trong
40 phút, để nguội, cân lại, bổ sung khối lượng giảm bằng dung dịch acid formic 5% trong MeOH 50% Lắc đều, lọc, thu được dung dịch sắc ký [51]
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn acid chlorogenic, cần cân chính xác khoảng 5,0 mg CGA vào bình định mức 5 ml Sau đó, thêm 3 ml dung dịch MeOH 50% và siêu âm cho đến khi tan hết Định mức dung dịch đến vạch mức bằng methanol 50% để thu được dung dịch chuẩn với nồng độ khoảng 1 mg/ml Cuối cùng, tiến hành pha loãng để tạo ra dung dịch chuẩn CGA trung gian có nồng độ phù hợp.
2.3.3 Xây d ựng phương pháp định lượ ng acid cholorogenic trong Ké đầ u ng ự a 2.3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký
- Khảo sát chương trình pha động: Tiến hành khảo sát chương trỉnh rửa giải gradient với pha động gồm ACN (kênh B) phối hợp với H2O (kênh A)
Các kết quả khảo sát được đánh giá và so sánh dựa trên thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), và hệ số đối xứng (AS) Độ phân giải cần đạt RS ≥ 1,5, trong khi hệ số đối xứng nên nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, với giá trị tối ưu xấp xỉ bằng 1 Thời gian lưu của các chất phân tích không nên quá dài, nhưng cần đảm bảo sự tách biệt rõ ràng giữa các chất.
Tiến hành sắc ký mẫu thử và dung dịch chuẩn CGA bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC kết hợp với detector DAD (Shimadzu) nhằm khảo sát điều kiện sắc ký.
2.3.3.2 Thẩm định phương phápđịnh lượng acid chlorogenic trong Ké đầu ngựa
Sau khi khảo sát điều kiện sắc ký, phương pháp định lượng CGA trong Kê đầu ngựa đã được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC Đặc biệt, độ chọn lọc của phương pháp này đã được đánh giá kỹ lưỡng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
Độ chọn lọc của phương pháp phân tích là khả năng xác định rõ ràng chất cần phân tích trong sự hiện diện của các thành phần khác như tạp chất Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc được thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng, trong đó pic của chất cần phân tích phải tách biệt hoàn toàn với các pic tạp Ngoài ra, trên sắc ký đồ của mẫu trắng, không được xuất hiện pic nào có thời gian lưu trùng khớp với thời gian lưu của mẫu chuẩn.
Để xác định, cần thực hiện chạy sắc ký với dung dịch chuẩn CGA, dung dịch thử và mẫu trắng theo chương trình đã chọn Sau đó, ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích pic để phân tích kết quả.
Thời gian lưu pic CGA của dung dịch chuẩn và dung dịch thử cần phải tương đương để đảm bảo tính chính xác Đồng thời, pic CGA trong mẫu thử phải hoàn toàn tách biệt với các pic khác trong nền mẫu để đạt được kết quả đáng tin cậy.
Tính thích hợp hệ thống là phép thử đánh giá độ ổn định của toàn bộ hệ thống phân tích, dựa trên các yếu tố như máy móc và thiết bị.
Để xác định tính tương thích hệ thống, tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp với dung dịch chuẩn CGA đã chuẩn bị Ghi lại các giá trị thời gian lưu và diện tích pic, sau đó tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các đáp ứng phân tích Yêu cầu RSD của thời gian lưu và diện tích pic phải nhỏ hơn hoặc bằng 2%.
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ mà trong đó mối quan hệ giữa tín hiệu đo được và nồng độ của chất phân tích thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính.
Đường chuẩn là biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ các chất phân tích Để đánh giá độ chính xác của đường chuẩn, cần xem xét giá trị R² và độ chệch của các điểm nồng độ được sử dụng để xây dựng đường chuẩn (Δ) Yêu cầu đối với R² là phải nằm trong khoảng từ 0,99 đến 1.
Để xác định khoảng tuyến tính trong sắc ký, cần tiến hành phân tích các dung dịch chuẩn với nồng độ thay đổi và khảo sát mối quan hệ giữa tín hiệu đo được và nồng độ Sau khi vẽ đồ thị giữa tín hiệu và nồng độ, cần quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Khoảng tuyến tính thường được khảo sát từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) đến giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) Ngoài ra, cần chú ý đến giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) để đảm bảo độ chính xác trong phân tích.
Giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà hệ thống phân tích vẫn có thể nhận diện tín hiệu khác biệt so với tín hiệu mẫu trắng hoặc tín hiệu nền, mặc dù chưa thể định lượng chính xác.
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử mà có thể xác định được thông qua phương pháp khảo sát, đảm bảo rằng kết quả đạt độ chính xác mong muốn.
KẾ T QU Ả
Kh ảo sát điề u ki ệ n phân tích và quy trình x ử lý m ẫ u
Điều kiện phân tích HPLC và quy trình xử lý mẫu cho việc định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa được xây dựng dựa trên chuyên luận Xanthii Fructus trong Dược điển Trung Quốc (2015) cùng với các tài liệu nghiên cứu liên quan Các thông số phân tích cụ thể sẽ được trình bày chi tiết để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy trong quá trình xác định thành phần này.
- Xử lý mẫu: Cân chính xác 0,5 g bột dược liệu Ké đầu ngựa đã rây qua rây số
3 cho vào bình nón, thêm chính xác 20 ml dung dịch acid formic 5% trong
Sử dụng MeOH 50%, cân khối lượng ban đầu, sau đó tiến hành siêu âm với công suất 300W và tần số 40 kHz trong 40 phút Sau khi làm nguội, cân lại và bổ sung khối lượng đã giảm bằng dung dịch acid formic 5% trong MeOH 50% Cuối cùng, lắc đều và lọc dịch thử qua màng lọc cellulose acetat 0,45 để thu được dung dịch phục vụ cho phân tích HPLC.
Để chuẩn bị mẫu chuẩn CGA, cần cân chính xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn CGA và chuyển vào bình định mức 5 ml Tiếp theo, thêm khoảng 3 ml methanol 50% và siêu âm cho tan hết, sau đó định mức đến vạch mức bằng methanol 50% Kết quả thu được là dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 1 mg/ml Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng bằng methanol 50% theo các tỷ lệ khác nhau để tạo ra các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn.
- Điều kiện phân tích HPLC:
+ Pha tĩnh: Cột Silica gel pha đảo (C18) (250 mm x 4,6 mm, 5 àm)
+ Pha động: Nước chứa 0,1% axit phosphoric (kênh A) và ACN (kênh B) (tỷ lệ 20 : 80 tt/tt)
Tốc độ dòng của hệ thống HPLC được thiết lập ở mức 0,7 ml/phút với thể tích tiêm mẫu là 5 µl Nhiệt độ cột được duy trì ở 25 độ C, trong khi detector UV hoạt động ở bước sóng 327 nm Việc đánh giá lại điều kiện phân tích HPLC và quy trình xử lý mẫu đã được thực hiện tại Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, với kết quả được trình bày trong hình 3.1 và bảng 3.1.
A- Sắc ký đồ HPLC mẫu chuẩn CGA
B- Sắc ký đồ HPLC mẫu thửKé đầu ngựa
C - Sắc kí đồHPLC phân tích CGA trong dược liệu Ké đầu ngựa
Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC phân tích acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa
Bảng 3.1 Các thông số đánh giá đối với acid chlorogenic
STT Thông sốđánh giá Giá trị
2 Diện tích pic (ứng với dung dịch chuẩn có nồng độ 13 àg/ml) 3565529
4 Hệ sốkéo đuôi pic (As) 1,223
Các thông số độ phân giải RS đạt 1,685, vượt mức tối thiểu 1,5, trong khi hệ số kéo đuôi của pic AS là 1,223, nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 Điều này cho thấy điều kiện phân tích HPLC này là phù hợp cho việc phân tích CGA trong dược liệu Kê đầu ngựa.
Thẩm định phương pháp phân tích
3.2.1 Tính ch ọ n l ọ c c ủa phương pháp
Phân tích ba mẫu bao gồm dung dịch CGA chuẩn, dung dịch mẫu thử và dung dịch mẫu thử có thêm chuẩn đã được thực hiện theo điều kiện phân tích HPLC đã nêu ở mục 2.3.3.2 Kết quả thu được được đánh giá thông qua các sắc ký đồ tương ứng như hình dưới đây.
Hình 3.2 Sắc ký đồđánh giá tính chọn lọc của phương pháp
2-Mẫu thử dược liệu Ké đầu ngựa;
3-Mẫu thử dược liệu Ké đầu ngựa thêm chuẩn CGA)
Trên sắc ký đồ, thời gian lưu của CGA trong ba mẫu là tương đương, cho thấy tính đồng nhất trong phân tích Điểm CGA không bị trùng với các điểm khác, điều này khẳng định tính riêng biệt của hợp chất Diện tích pic CGA cũng được ghi nhận, góp phần vào việc đánh giá chất lượng mẫu.
CGA trong mẫu thử tăng lên tương ứng với lượng chuẩn thêm vào, cho thấy sự tương quan rõ ràng với diện tích pic CGA trong mẫu thử Điều này chứng minh rằng phương pháp và hệ thống sắc ký có tính đặc hiệu cao.
Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3.2, với kết quả đánh giá dựa trên giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại mẫu chuẩn CGA có nồng độ 13 àg/ml Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quảđánh giá tính thích hợp hệ thống
Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s)
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu đều nhỏ hơn 2%, cho thấy các điều kiện sắc ký và hệ thống HPLC được lựa chọn là phù hợp Điều này đảm bảo độ ổn định trong phân tích định lượng CGA trong dược liệu Kê đầu ngựa.
3.2.3 Xác đị nh kho ả ng tuy ế n tính và xây d ựng đườ ng chu ẩ n
Chuẩn bị một dãy dung dịch CGA với nồng độ tăng dần từ 20 àg/ml đến 160 àg/ml, sau đó tiến hành phân tích HPLC theo các điều kiện đã nêu trong mục 2.3.3.2 Kết quả khảo sát mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ CGA được trình bày trong bảng 3.3, với phương trình đường chuẩn được thể hiện trong hình 3.3.
Bảng 3.3 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của pic CGA
Nồng độ (àg/ml) Diện tớch pic
Nồng độ tính lại từ đường chuẩn (àg/ml) Độ chệch (%)
Phương trình đường chuẩn (trong khoảng từ20 àg/ml đến 160 àg/ml) Y = 176579.X + 10 6
Hình 3.3 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ CGA và diện tích pic
Đường chuẩn được đánh giá dựa trên hệ số tương quan R và độ chệch giữa nồng độ tìm lại được và nồng độ thực Kết quả trình bày trong bảng 3.3 cho thấy độ chệch (∆) tại các nồng độ đều nằm trong giới hạn cho phép (