VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Địa điểm thực hiện đồ án
Phòng thí nghiệm Hóa sinh và Vi sinh thuộc Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật TP HCM là địa điểm nghiên cứu và phát triển hàng đầu trong lĩnh vực thực phẩm.
Vật liệu sử dụng cho nghiên cứu
The study utilized various chemical compounds including sodium alginate from Xilong Chemical (China), gelatin from Zungbunzlauer (France) with a moisture content of 11.90 ± 0.09% and a protein content of 87.31 ± 0.05%, calcium chloride from Guangdong Guanghua (China), glucose from Xilong Chemical (China), pepton from Xilong Chemical (China), and hydrochloric acid from Xilong Chemical (China) A buffer solution was prepared with a pH of 7.0, consisting of 8 g of sodium chloride, 0.2 g of potassium chloride, 1.44 g of sodium hydrogen phosphate, and 0.24 g of potassium dihydrogen phosphate, all sourced from Xilong Chemical (China).
2.2.2 Chủng vi sinh vật sử dụng và môi trường Đối tƣợng nghiên cứu là Saccharomyces boulardii phân lập từ chế phẩm đông khô Bioflora TM của Biocodex, Pháp Môi trường Hansen (trong 100 ml môi trường chứa glucose 10 g, pepton 1g, KH2PO4 0.3 g, MgSO4.7H2O 0.2 g, cloramphenicol 40 ppm) Môi trường giả lập dịch dạ dày (0.08M HCl, 0.2% NaCl, pH 1.5) Môi trường giả lập dịch ruột (0.05 M KH2PO4 , pH 7.25, 0.6% muối mật)
Phương pháp phân tích thu nhận kết quả
Xác định số lƣợng tế bào nấm men bằng cách đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri bằng kỹ thuật trải đĩa có môi trường Hansen [44]
Để xác định pH của dung dịch đệm, sử dụng máy đo pH Eutech Instruments pH 510 Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đối lưu theo tiêu chuẩn AOAC 1984, thực hiện ở nhiệt độ 105°C cho đến khi đạt khối lượng không đổi Hàm lượng protein gelatin được xác định thông qua phương pháp Micro-Kjeldahl Công thức xác định độ ẩm được áp dụng trong quá trình này.
Trong đó: wf, w i lần lượt là khối lượng của nguyên liệu trước và sau quá trình sấy (AOAC,
2.3.3 Phương pháp thống kê và xử lí số liệu
Dựa trên kết quả 3 lần thí nghiệm lặp lại Xử lý kết quả bằng phần mềm Excel versions 2010 và IBM SPSS Statistics 20
Hoạt hóa S.boulardii được thực hiện ở nhiệt độ 30°C trong 24 giờ trong 10 ml môi trường Hansen, sau đó chuyển toàn bộ sang bình chứa 100 ml môi trường Hansen nuôi cấy trong cùng điều kiện Quá trình nhân giống diễn ra trong điều kiện hiếu khí, sử dụng thiết bị khuấy từ với tốc độ 300 vòng/phút Huyền phù sau quá trình lên men được ly tâm và chia thành nhiều bình, mỗi bình chứa một lượng nhất định.
Quy trình ly tâm cho 100 ml huyền phù được thực hiện như sau: đầu tiên, huyền phù được ly tâm một lần ở tốc độ 4000 rpm trong 15 phút Sau đó, 100 ml nước muối sinh lý (0.9% NaCl ở 40°C) được thêm vào, trộn đều với cặn ly tâm và ly tâm lại với tốc độ tương tự Quy trình rửa tế bào S boulardii diễn ra hai lần, lần đầu với nước muối sinh lý và lần thứ hai với 100 ml nước cất, cuối cùng thu được sinh khối để chuẩn bị cho vi bao.
Quá trình vi bao bắt đầu bằng cách chuẩn bị 2g alginate hòa tan trong 25ml nước vô trùng ở nhiệt độ khoảng 45°C và khuấy đều ở tốc độ 120 rpm Sau đó, dung dịch này được tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút và làm nguội đến nhiệt độ phòng Tiếp theo, pha sinh khối S.boulardii từ 25ml dung dịch vào 25ml nước cất vô trùng Sau khi trộn dung dịch alginate với dung dịch huyền phù, bổ sung thêm 0.75% w/v gelatin và đồng nhất ở 5°C Cuối cùng, sử dụng kim tiêm để tạo giọt và bơm trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0.75%, để ổn định trong 60 phút.
5 0 C [9] Lọc, rửa 1 lần nước muối sinh lý vô trùng (0.9%) và 1 lần nước cất vô trùng, để ráo => thu được hạt vi bao tươi (mẫu không sấy)
Quá trình sấy: hạt vi bao được sấy đối lưu (45 0 C trong 5 giờ) => hạt sấy
Một phần hạt sấy được đem đi nghiền mịn lọc qua ray có kích thước lỗ No.56 (kích thước mắt lưới 308 m)
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng
2.4.2 Khảo sát đặc tính sinh học
Mục đích thí nghiệm: kiểm tra tính thuần và hình dạng tế bào S.boulardii
Tiến hành thí nghiệm: Giống S.boulardii (100mg) trong gói Bioflo của hãng
Biocodex, Pháp được hoạt hóa 24 giờ ở 30 0 C trong môi trường Hansen Cấy truyền
S.boulardii trên môi trường thạch nghiêng, ủ 24 giờ ở 30 0 C Cấy giống thuần từ ống thạch nghiêng sang đĩa petri môi trường Hansen (ủ 24 giờ, 30 0 C) Sau thời gian ủ, quan sát hình thái tế bào, chọn khuẩn lạc đặc trƣng quan sát trên kính hiển vi [28].Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng
2.4.3 Khảo sát đường cong sinh trưởng của S.Boulardii
Mục đích thí nghiệm: chọn thời điểm thích hợp thu sinh khối cao nhất để kết thúc giai đoạn nhân giống
Tiến hành thí nghiệm bằng cách chuyển giống cấp 1 từ ống thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 10 ml môi trường Hansen lỏng và ủ trong 48 giờ ở 30 °C Sau đó, chuyển giống cấp 2 từ ống nghiệm sang bình cầu 250 ml với thể tích giống 10%, tiếp tục ủ ở 30 °C có khuấy lắc Mỗi giờ, lấy mẫu để trải đĩa kiểm tra mật độ tế bào, sau đó ủ đĩa ở 30 °C trong 48 giờ, đếm số khuẩn lạc và tính mật độ tế bào theo công thức đã định.
N là tổng số khuẩn lạc trên các đĩa, chỉ tính các đĩa có từ 25-250 khuẩn lạc và nồng độ pha loãng liên tiếp n đại diện cho số đĩa ở nồng độ pha loãng f V là thể tích mẫu đưa vào đĩa (ml), và R là độ chính xác.
Dựa vào mật độ tế bào tính được dựng đường cong sinh trưởng của S.boulardii Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng
2.4.4 Vi bao S.Boulardii với Natri Alginate có bổ sung gelatin
Mục đích thí nghiệm: khảo sát ảnh hưởng của gelatin (G) trong sự vi bao S boulardii bằng Natri alginate
23 Áp dụng phương pháp nhỏ giọt dựa trên phương pháp của Krasaekoopt và cộng sự
[33] bổ sung alginate (2%) và CaCl2 (0,75%) [48]
Nghiên cứu này nhằm khảo sát khả năng sống sót của S.boulardii trong hạt vi bao có bổ sung gelatin vào dung dịch alginate Mẫu được chuẩn bị với 0.75% gelatin w/v trong dung dịch alginate đã tiệt trùng, sau đó bổ sung sinh khối S.boulardii (10^8 cfu/ml) theo tỷ lệ 1/2 Dung dịch được đồng nhất ở nhiệt độ 5°C và tạo giọt vào dung dịch CaCl2 0,75%, sau đó ổn định trong 30 phút tại cùng nhiệt độ Sau khi lọc và rửa bằng nước muối sinh lý và nước cất, mẫu được bảo quản ở 35°C (mẫu không sấy) hoặc sấy đối lưu ở 45°C trong 5 giờ, tiếp tục lưu trữ ở 35°C từ 0-12 ngày.
Để xác định mật độ tế bào sống sót sau khi phóng thích từ vi bao, hạt vi bao được thêm vào dung dịch đệm photphate (pH = 7.0 M) với tỷ lệ 1 g hạt vi bao trong 9 ml dung dịch, trong thời gian 60 phút Mẫu đối chứng không bổ sung gelatin được sử dụng để so sánh Mật độ tế bào được kiểm tra sau 0, 3, 6, 9 và 12 ngày.
2 mẫu) Đĩa petri chứa huyền phù nấm men đƣợc ủ ở 30 0 C trong 48 giờ
Để xác định mật độ tế bào sống sót sau khi thử nghiệm với dịch giả lập dạ dày, 1g hạt tươi được cho vào 10ml dung dịch giả lập dạ dày (0.08M HCl và 0.2% NaCl, pH=1.5) không có pepsin và ủ ở 37°C trong các khoảng thời gian 0, 30, 60, 90 và 120 phút Đối với hạt khô và hạt khô nghiền, 0,063g được sử dụng trong cùng một thể tích dung dịch và cũng được ủ trong các khoảng thời gian tương tự Cuối cùng, mật độ tế bào được kiểm tra bằng cách trải đĩa.
Khảo sát khả năng sống sót của tế bào trong dịch muối mật được thực hiện bằng cách ngâm các mẫu hạt trong giả lập dạ dày trong 60 phút, sau đó chuyển vào giả lập dịch ruột (0.05 M KH2PO4, pH = 7.25 với 0.6% muối mật) trong các khoảng thời gian 30, 60, 90 và 120 phút.
Mật độ tinh thể được đánh giá thông qua phương pháp nhiễu xạ tia X sử dụng thiết bị Miniflex gonio Meter từ Nhật Bản với bức xạ Cu (30kv × 15mA) Thiết bị hoạt động liên tục với tốc độ 1°/phút, quét trong khoảng 2θ từ 10 đến 90° Để chuẩn bị mẫu, 2g alginate được hòa tan trong 25ml nước cất và tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút Mẫu A bao gồm 25ml nước cất vô trùng thêm vào alginate đã tiệt trùng Mẫu B tương tự mẫu A nhưng có bổ sung gelatin với tỉ lệ 0.75%w/v, trong khi mẫu C là mẫu B với thêm sinh phẩm.
24 khối S.boulardii (thu đƣợc từ 25ml dung dịch sinh khối) 3 mẫu A, B, C đƣợc đồng nhất ở
5 0 C, dùng kim tiêm tạo giọt bơm trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0,75% sau đó để ổn định
60 phút ở 5 0 C [9] Lọc, rửa 1 lần nước muối sinh lý vô trùng (0.9%) và 1 lần nước cất vô trùng, để ráo Đem mẫu đi sấy khô ở 45 trong 5 giờ
Phương pháp tính CFU/g hạt tươi:
N là tổng số khuẩn lạc được đếm trên các đĩa, chỉ tính các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 và nồng độ pha loãng liên tiếp n là số đĩa ở nồng độ pha loãng f, trong khi V là thể tích mẫu được đưa vào đĩa (ml).
Sau đó sẽ đƣợc tính theo log
Sau khi sấy khô, 1g hạt tươi chỉ còn lại 0.063g hạt sấy, tương ứng với 0.063g hạt sấy nghiền Trong thí nghiệm, chúng tôi đã bao gói 50g dung dịch và thu được 38g mẫu T Theo tỷ lệ tam xích, 1g hạt tươi tương đương với 1.3ml dung dịch.
Nghiên cứu này tập trung vào khả năng sống sót của nấm men S.boulardii khi được bao gói bằng gel alginate có bổ sung gelatin trong môi trường giả lập dạ dày và dịch ruột Chúng tôi nhận thấy rằng việc thêm chất bao từ protein giúp bảo vệ tế bào nấm men tốt hơn, điều này được xác nhận qua các nghiên cứu trước đây về bao gói alginate Đặc biệt, chúng tôi cũng chú trọng đến việc lưu trữ mẫu bao gói ở hai điều kiện nhiệt độ 5°C và 30°C để so sánh hiệu quả bảo quản Một điểm mới trong nghiên cứu này là việc nghiền mịn các mẫu hạt bao gói khô nhằm đánh giá khả năng sống sót và bảo quản của chúng.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kiểm tra đặc tính sinh học của S.boulardii
3.1.1 Quan sát hình thái S.boulardii
Khuẩn lạc S boulardii có hình tròn, bờ đều và màu trắng đục, với bề mặt hơi lồi và đường kính từ 6-8 mm, cao khoảng 5-6 mm Tế bào của S boulardii có dạng hình bầu dục.
Hình 3.1: A-Tế bào S.boulardii, B-Khuẩn lạc S.boulardii
3.1.2 Khảo sát đường cong sinh trưởng của S.boulardii
Biểu đồ 3.1 cho thấy mật độ tế bào S.boulardii tăng liên tục, đạt cực đại 8.33 log (cfu/ml) vào giờ thứ 12 Sau thời điểm này, mật độ tế bào bắt đầu giảm dần, S.boulardii chuyển sang pha ổn định và sau đó là pha suy vong Do đó, chúng tôi quyết định dừng quá trình nuôi cấy ở giờ thứ 12 để thu hoạch sinh khối nấm men.
Biểu đồ 3.1 đường cong sinh trưởng của S.Bouladii trên môi trường Hasnsen
Vi bao S.boulardii bằng Natri alginate có bổ sung gelatin (G)
3.2.1 Cấu trúc hạt vi bao
Hạt vi bao T có hình tròn, mềm, màu trắng đục với đường kính khoảng 2.5 – 3 mm Phương pháp nhỏ giọt đã được áp dụng thành công để vi bao probiotics (Lactobacillus casei ATCC 393) với kích thước hạt 2.5 mm Nghiên cứu của Parthiban Muthukumarasamy cũng cho thấy hạt vi bao Lactobacillus reuteri có đường kính từ 2-3 mm So với các nghiên cứu trước, đường kính hạt vi bao trong nghiên cứu của chúng tôi lớn hơn, có thể do kích thước đầu mũi ống tiêm và kích thước tế bào nấm men lớn hơn tế bào lactic Ngoài ra, khoảng cách từ ống tiêm đến dung dịch CaCl2 và tốc độ khuấy khi nhỏ giọt cũng ảnh hưởng đến kích thước tế bào Wunwisa Krasaekoopt và cộng sự (2004) đã thực hiện vi bao Lactobacillus acidophilus 547 và Bifidobacterium bifidum ATCC.
Năm 1994, nghiên cứu về Lactobacillus casei 01 đã sử dụng phương pháp nhỏ giọt với ba vật liệu tường là chitosan, natri alginate và poly-L-Lysine kết hợp với alginate Kết quả cho thấy rằng phương pháp vi bao không ảnh hưởng đến sự tồn tại của tế bào Các vật liệu được sử dụng trong thí nghiệm này không làm thay đổi kích thước hạt, với đường kính của hạt không được bao phủ là 1.62 mm, thấp hơn so với đường kính của hạt bao phủ là 1.89 mm trong các vi bao probiotics.
Hạt vi bao có hình dạng tròn, cứng và màu vàng nâu, kích thước khoảng 100-200 µm sau khi được sấy ở nhiệt độ 38°C, theo nghiên cứu của Yoav Bashan và cộng sự (2002) Kích thước đường kính hạt trong nghiên cứu của họ lớn hơn so với kết quả thí nghiệm của chúng tôi, cho thấy rằng việc sấy ở nhiệt độ thấp hơn ít ảnh hưởng đến cấu trúc của hạt vi bao.
Hình 3.2 Hình dạng của hạt bao gói trước sấy (A) và sấy khô (B)
3.2.2 Mật độ tinh thể của hạt bao gói
Mật độ tinh thể của ba mẫu hạt vi bao: hạt bao alginate, hạt bao alginate có bổ sung gelatin và hạt bao S.boulardii bằng alginate có bổ sung gelatin đã được phân tích thông qua mô hình nhiễu xạ tia X Các mẫu được tiếp xúc với bức xạ Cu (30kv × 15mA) tại một góc rộng nhiễu xạ (Miniflex gonio Meter, Nhật Bản) với chế độ quét liên tục 1°/phút trong khoảng 2θ từ 10 đến 90° Kết quả cho thấy, hạt bao có bổ sung các thành phần khác vẫn giữ được trạng thái tinh thể so với mẫu hạt bao alginate đơn thuần Cấu trúc hạt gel alginate có sự biến đổi tinh thể khi bổ sung gelatin, trong khi việc bổ sung S boulardii không làm thay đổi mật độ kết tinh của hạt bao sau quá trình sấy.
Hình 3.3 Cấu trúc tinh thể của mẫu bao gói alginate (A), mẫu bao gói alginate có gelatin
(B) và mẫu bao gói alginate có bổ sung vi sinh vật và geletine (C)
Đánh giá khả năng tồn tại của S boulardii trong môi trường giả lập dịch dạ dày và môi trường giả lập dịch ruột
và môi trường giả lập dịch ruột
3.3.1 Đánh giá khả năng tồn tại của S boulardii trong môi trường giả lập dịch dạ dày
Mật độ tế bào thay đổi đáng kể sau quá trình nuôi cấy và sấy đối lưu Khả năng sống sót của tế bào được phóng thích trong điều kiện giả lập dạ dày giảm dần theo thời gian, với các mẫu được thử nghiệm ở các khoảng thời gian 0, 30, 60, 90 và 120 phút Cụ thể, mẫu ĐC có mật độ tế bào ban đầu là 8.33 (log cfu/g hạt), nhưng sau 30 phút trong dung dịch giả lập dạ dày, mật độ giảm xuống còn 7.65 (log cfu/g hạt), cho thấy sự giảm 1 log Tổng cộng, so với ban đầu, mật độ tế bào đã giảm 3.9 (log cfu/g hạt).
Sau khi bao vi, mật độ tế bào giảm xuống còn 8.3 (log cfu/g hạt), nguyên nhân là do tổn thất trong quá trình tạo hạt vi bao và cấu trúc gel, khiến không thể bao hết số tế bào nấm men Tổn thất này xảy ra do dung dịch vi bao bị dính vào kim tiêm y tế và cốc chứa, cùng với việc lượng dung dịch còn lại ít ở cuối quá trình tạo hạt, dẫn đến việc đẩy dung dịch ra khỏi kim tiêm tạo thành bọt khí Đặc biệt, mẫu T giảm 0.5 (log cfu/g hạt) so với mức ban đầu khi chưa thử trong dịch dạ dày.
Sau quá trình sấy, sản phẩm trải qua sốc nhiệt và mất nước, dẫn đến mật độ tế bào giảm mạnh từ 96.67% độ ẩm ban đầu xuống còn 10.56%, với mật độ tế bào còn 7.32 (log cfu/g hạt) Khi thực hiện thử nghiệm giả lập dạ dày trong 120 phút, mật độ tế bào tiếp tục giảm thêm 0.3 (log cfu/g hạt).
Dưới tác động của lực cơ học, các hạt vi bao khô đã được nghiền nhỏ, dẫn đến việc cấu trúc hạt bị phá vỡ và mật độ tế bào giảm mạnh còn 4.58 (log cfu/g hạt) Khi thử nghiệm trong điều kiện giả lập dạ dày, mật độ tế bào SN tiếp tục giảm 1.14 (log cfu/g hạt).
Theo nhóm tác giả (R.R Mokarram và cộng sự; 2009) cũng tiến hành thử vi bao L. acidophilus và L.rhamnosus bằng alginate trong môi trường giả lập dạ dày (pH=1.5) trong
Sau 120 phút thử nghiệm môi trường giả lập dạ dày, mật độ tế bào của L acidophilus giảm mạnh từ 3.3x10^9 cfu/ml xuống còn 2.8 ± 0.2x10^4 cfu/ml Mẫu monolayer cũng ghi nhận sự giảm từ 2.3 ± 0.4x10^9 cfu/ml xuống 3.9 ± 0.3x10^7 cfu/ml, trong khi mẫu bao gói 2 lớp giảm từ 3.6 ± 0.1x10^9 cfu/ml xuống 1.7x10^8 cfu/ml Tương tự, mật độ tế bào ban đầu của L rhamnosus dao động từ 1.2 ± 0.1x10^9 đến 8.2 ± 0.1x10^9 cfu/ml.
Sau 120 phút thử nghiệm trong môi trường giả lập dạ dày, mật độ tế bào của không vi bao giảm nhanh xuống còn 1.3 ± 0.2x10^3 cfu/ml, trong khi mẫu bao gói 1 lớp giảm còn 2.9 ± 0.3x10^7 cfu/ml và mẫu bao gói 2 lớp giảm xuống 2.7 ± 1.8x10^7 cfu/ml Xu hướng giảm này cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của chúng tôi.
Các mẫu bao gói khô và tươi cho mật độ tế bào cao hơn so với mẫu không vi bao và mẫu đã nghiền nhỏ, nhờ vào cấu trúc gel alginate bao bọc, giúp bảo vệ tế bào hiệu quả.
S.boulardii bên trong nên tế bào ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và các điều kiện khác từ bên ngoài
3 4 5 6 7 8 9 mau khong vi bao mau vi bao tuoi mau vi bao say mau vi bao say nghien
Biểu đồ 3.2 trình bày mật độ tế bào S boulardii sau khi thử nghiệm dịch giả lập dạ dày tại các thời điểm 0, 30, 60, 90 và 120 phút Kết quả được tính toán dựa trên giá trị trung bình (n=3) ± độ lệch chuẩn, với thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn Các chữ cái trong biểu đồ chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Mức độ giảm số lượng tế bào sau 120 phút của mẫu không được bao gói là 3.9.
0.5: Mức độ giảm số lượng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt tươi sau khi bao gói
0.3: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii đƣợc khi sấy ở 40 0 C trong 5 giờ
1.14: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii đƣợc khi sấy ở 40 0 C trong 5 giờ và nghiền
3.3.2 Đáng giá khả năng tồn tại của S boulardii trong môi trường dịch ruột
Khảo sát mật độ sống sót của tế bào S boulardii cho thấy sau khi thử nghiệm trong dung dịch giả lập dạ dày trong 60 phút và tiếp tục với giả lập dịch ruột có 0.6% muối mật trong 2 giờ, tất cả các mẫu đều giảm mạnh, đặc biệt là mẫu ĐC với mức giảm 4 log Mẫu T, dù được bao gói, cũng ghi nhận giảm 0.59 log cfu/g hạt, nhưng vẫn cao hơn mẫu ĐC Mẫu S giảm 0.38 log cfu/g hạt so với mật độ ban đầu, trong khi mẫu SN có mật độ ban đầu 4.36 và sau khi thử muối mật giảm xuống còn 1.97 log cfu/g hạt, tức giảm 1.3 log cfu/g hạt.
Theo nghiên cứu của R.R Mokarram và cộng sự (2009), khi thử nghiệm trong môi trường giả lập dịch ruột (0.6% muối mật) trong 2 tiếng đối với Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus rhamnosus, mật độ tế bào tự do của mẫu không vi bao giảm đáng kể so với các mẫu có bao gói Cụ thể, đối với Lactobacillus acidophilus, mật độ tế bào tự do giảm từ 5.6±2.3x10^9 cfu/ml xuống còn 2.2±0.4x10^2 cfu/ml, tương ứng với sự giảm 7.7 log (cfu/g) Trong khi đó, mẫu bao gói 1 lớp giảm từ 5.7±0.8x10^9 xuống còn 7.3±0.7x10^5 cfu/ml, và mẫu bao gói 2 lớp giảm còn 3.4±0.9x10^6 cfu/ml Kết quả này cho thấy xu hướng giảm mật độ tế bào cũng được xác nhận trong nghiên cứu của chúng tôi.
Theo (Murata và cộng sự, 1999) cũng tiến hành thí nghiệm với giả lập dịch ruột cũng cho kết quả tương tự
2 3 4 5 6 7 8 9 mau khong vi bao mau vi bao tuoi mau vi bao say mau vi bao say nghien
Biểu đồ 3.3 Mật độ tế bào S boulardii sau khi thử dịch giả lập dạ dày theo thời gian 0,
Kết quả nghiên cứu cho thấy sự giảm số lượng tế bào sau 120 phút ở mẫu đối chứng không được bao gói, với giá trị trung bình (n=3) ± độ lệch chuẩn Thanh sai số biểu thị giá trị độ lệch chuẩn, và các chữ cái chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05).
0.59: Mức độ giảm số lượng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt tươi sau khi bao gói S.boulardii
0.38: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii đƣợc khi sấy ở 40 0 C trong 5 giờ
1.3: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii đƣợc khi sấy ở 40 0 C trong 5 giờ và nghiền
Khảo sát mật độ tế bào theo thời gian lưu trữ của hạt bao gói
Mật độ tế bào theo thời gian lưu trữ ở nhiệt độ các mẫu ĐC, T, S, SN thể hiện sự giảm dần qua biểu đồ 3.2 Sau 12 ngày lưu trữ, mẫu ĐC có xu hướng giảm nhanh nhất, với mức giảm 2.1 (log cfu/g hạt), trong khi mẫu T và S chỉ giảm 1.2 (log cfu/g hạt) Mẫu SN, bắt đầu với mật độ tế bào 4.58, sau 12 ngày còn 3.58 (log cfu/g hạt), tức giảm 1 log Điều này cho thấy quá trình bao gói ở nhiệt độ 5 ít ảnh hưởng đến tế bào, dẫn đến sự tương đồng giữa mẫu ĐC và T Tuy nhiên, mẫu S và SN giảm mật độ tế bào do sốc nhiệt và mất nước trong quá trình sấy, cùng với tác động cơ học trong quá trình nghiền hạt làm giảm mật độ tế bào ở mẫu SN Ở hình B, mẫu ĐC cũng ghi nhận giảm 2.2 (log cfu/g hạt) sau 12 ngày.
T, mật độ tế bào khi ở nhiệt độ phòng là 8.3 (log cfu/g hạt), sau thời gian lưu trữ giảm1.34 log còn 6.96 (log cfu/g hạt) Với mẫu S, SN mật độ tế bào giảm 1.28 và 1.32 (log cfu/g hạt).Đối với mẫu S mức độ giảm mật độ tế bào diễn ra tương đối chậm hơn so với các mẫu khác, số tế bào bắt đầu giảm nhẹ sau khi ngâm 30 phút trong dịch dạ dày và giữ ổn định khi ngâm trong 90 phút, đến khi ngâm trong 120 phút thì mới tiếp tục giảm So với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) thì khả năng sống sót sau khi ngâm hạt bao trong môi trường giả lập dạ dày trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn Nguyên nhân có thể được giải thích là do mật độ tế bào S boulardii ban đầu trong nghiên cứu của chúng tôi là không quá cao (8.33 – 8.3 log cfu/g hạt)
Năm 2009, Xiao Yan Xi và cộng sự đã vi bao L.casei ATCC 393 bằng gelatin-alginate với tỷ lệ 2:1 theo phương pháp nhỏ giọt và làm khô bằng khí thổi ở 4 độ C Kết quả cho thấy tỷ lệ tế bào sống của L.casei ATCC 393 đạt 2.83x10^7 (cfu/g), tương đương với 7.45 log cfu/g Tuy nhiên, sau 1 tuần lưu trữ, số lượng tế bào sống giảm còn 6.32 x 10^5 (cfu/g), tương đương 5.8 log cfu/g.
[34] Như vậy xu hướng tế bào giảm nêu trên cũng được quan sát trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi
Kết quả lưu trữ mẫu ở nhiệt độ tủ lạnh 5 độ C và nhiệt độ phòng 30 độ C cho thấy mật độ tế bào giảm dần theo thời gian.
Lưu trữ mẫu ở nhiệt độ 5 độ C giúp giảm mật độ tế bào ít hơn so với nhiệt độ phòng Sự ổn định của các hạt bao phụ thuộc vào nhiệt độ bảo quản và hoạt động của nước, với nhiệt độ bảo quản thấp thường mang lại sự ổn định tốt hơn, tùy thuộc vào loại vật liệu lõi bọc.
3 4 5 6 7 8 9 mau khong vi bao mau vi bao tuoi mau vi bao say mau vi bao say nghien thoi gian (ngay)
2 3 4 5 6 7 8 9 mau khong vi bao mau vi bao tuoi mau vi bao say mau vi bao say nghien
Biểu đồ 3.4 trình bày mật độ tế bào S boulardii theo thời gian lưu trữ ở các nhiệt độ 5°C và 30°C Các mẫu được khảo sát bao gồm không vi bao, hạt tươi, hạt sấy và hạt sấy nghiền, với thời gian lưu trữ là 0, 3, 6, 9 và 12 ngày Kết quả cho thấy sự biến đổi mật độ tế bào theo từng điều kiện lưu trữ khác nhau.
Mức độ giảm số lượng tế bào sau 12 ngày lưu trữ ở 5°C của mẫu đối chứng không được bao gói được ghi nhận với giá trị trung bình là 39 (n=3) ± độ lệch chuẩn Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn, và các chữ cái chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05).
1.2: Mức độ giảm số lượng tế bào sau 12 ngày lưu trữ ở 5 0 C của mẫu hạt tươi sau khi bao gói S.boulardii
1.2: Mức độ giảm số lượng tế bào sau 12 ngày lưu trữ ở 5 0 C của mẫu hạt sau khi bao gói
S.boulardii đƣợc khi sấy ở 40 0 C trong 5 giờ
1: Mức độ giảm số lượng tế bào sau 12 ngày lưu trữ ở 5 0 C của mẫu hạt sau khi bao gói
S.boulardii đƣợc khi sấy ở 40 0 C trong 5 giờ và nghiền
2.2: Mức độ giảm số lượng tế bào sau 12 ngày lưu trữ ở 30 0 C của mẫu đối chứng, mẫu không đƣợc bao gói
1.34: Mức độ giảm số lượng tế bào sau 12 ngày lưu trữ ở 30 0 C của mẫu hạt tươi sau khi bao gói S.boulardii
1.28: Mức độ giảm số lượng tế bào sau 12 ngày lưu trữ ở 30 0 C của mẫu hạt sau khi bao gói
S.boulardii đƣợc khi sấy ở 40 0 C trong 5 giờ
1.32: Mức độ giảm số lượng tế bào sau 12 ngày lưu trữ ở 30 0 C của mẫu hạt sau khi bao gói
S.boulardii đƣợc khi sấy ở 40 0 C trong 5 giờ và nghiền
ngày lưu trữ của hạt bao gói
Khảo sát khả năng sống sót của S boularddi trong môi trường giả lập dạ dày sau 12 ngày lưu trữ của hạt bao gói
Sau 12 ngày lưu trữ ở nhiệt độ 5 và 30 , chúng tôi tiến hành thử các mẫu trong dung dịch giả lập dạ dày trong 120 phút Mật độ tế bào của các mẫu đều giảm mạnh so với mẫu 0 ngày Đầu tiên ở nhiệt độ lưu trữ 30 , mật độ tế bào mẫu ĐC là 1.72 (log cfu/g hạt) giảm 6.58 (log cfu/g hạt), tiếp theo đến mẫu hạt tươi giảm 2.35(log cfu/g hạt) so với 0 ngày còn 5.95 (log cfu/g hạt), S và SN còn 5.68 (log cfu/g hạt) và 2.42 (log cfu/g hạt) tường đương với giảm 1.68 và 2.16 (log cfu/g hạt) Với các mẫu lưu trữ ở tủ lạnh, mẫu ĐC giảm còn 1.85 (log cfu/g hạt) so với mật độ tế bào ở 0 ngày giảm rõ rệt 6.48 (log cfu/g hạt), mẫu
T so với 0 ngày giảm 2.27 (log cfu/g hạt), S còn 5.8 giảm 1.52 (log cfu/g hạt) so với mẫu S
Sau 12 ngày lưu trữ, số lượng tế bào sống sót trong mẫu hạt tươi và hạt sấy giảm từ 2.05 (log cfu/g hạt) xuống còn 2.53 (log cfu/g hạt) Kết quả cho thấy khả năng sống sót của tế bào ở cả hai nhiệt độ lưu trữ vẫn cao nhất sau thời gian này.
41 dieu kien luu tru 0gio/0ngay 5do C/12ngay 30do c/12 ngay
0 2 4 6 8 10 khong vi bao hat tuoi hat say hat say nghien
Biểu đồ 3.5 trình bày mật độ tế bào S boulardii sau 120 phút thử nghiệm giả lập dạ dày, dựa trên mẫu không vi bao, hạt tươi, hạt khô và hạt sấy nghiền sau 12 ngày lưu trữ Kết quả được tính toán từ giá trị trung bình (n=3) ± độ lệch chuẩn, với thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn Các chữ cái trong biểu đồ chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05).
Khảo sát khả năng sống sót của S boularddi trong môi trường giả lập dịch ruột sau 12 ngày lưu trữ của hạt bao gói
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng sống sót của S boulardii sau 12 giờ trong môi trường giả lập dịch ruột trong 120 phút Kết quả cho thấy tất cả các mẫu lưu trữ đều giảm mạnh so với mẫu 0 ngày, và mức giảm nhiều hơn so với thử nghiệm trong môi trường giả lập dịch dạ dày Nhiệt độ lưu trữ ở 5°C giúp bảo quản các mẫu ĐC, T, S, SN tốt hơn, với mật độ tế bào sau 120 phút thử nghiệm môi trường dịch ruột của mẫu ĐC lưu trữ ở 5°C còn 1.75 (log cfu/g hạt), trong khi mẫu ĐC ở 30°C giảm còn 1.68 (log cfu/g hạt) Đối với các mẫu lưu trữ trong tủ lạnh, mật độ tế bào của mẫu T, S, SN lần lượt là 5.98, 5.7, 2.48 (log cfu/g hạt), trong khi mẫu lưu trữ ở nhiệt độ phòng có mật độ tế bào của mẫu T.
S, SN là 5.8, 5.57 và 2.39 (log cfu/g hạt) Trong các mẫu thì S là mẫu giảm mật độ ít nhất Chúng tôi cho nhận thấy rằng sau một khoảng thời gian lưu trữ thì tác động của nhiệt độ, ánh sáng, hoạt độ nước ảnh hưởng đến cấu trúc màng bao làm cho kết cấu của gel alginate và gelatin trở nên yếu, lượng nước thoát ra càng nhiều (mẫu T), điều này dẫn đến việc làm giảm khả năng bao bọc và bảo vệ tế bào bên trong
43 dieu kien luu tru 5do C/12ngay 30do c/12 ngay
0 1 2 3 4 5 6 7 khong vi bao hat tuoi hat say hat say nghien
Biểu đồ 3.6 trình bày mật độ tế bào S boulardii trong điều kiện giả lập dịch ruột sau 120 phút, được thực hiện trên các mẫu không vi bao, hạt tươi, hạt sấy và hạt sấy nghiền sau 12 ngày lưu trữ Kết quả được tính toán dựa trên giá trị trung bình (n=3) ± độ lệch chuẩn, với thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn Các chữ cái trong biểu đồ chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) giữa các mẫu, với các ký hiệu a, b, c, d thể hiện các mức độ khác nhau.
