Nghiên cứu chế tạo nano bạc và khả năng kháng khuẩn của nó

TỔNG QUAN VỀ HẠT NANO BẠC VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG SINH HỌC

Cơ sở khoa học của công nghệ nano

Công nghệ nano dựa trên những cơ sở khoa học chủ yếu sau:

Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển sang tính chất lượng tử diễn ra khi vật liệu có kích thước nano, nơi mà số lượng nguyên tử ít hơn Trong các vật liệu vĩ mô với khoảng 10^12 nguyên tử, các hiệu ứng lượng tử thường bị trung bình hóa và có thể bỏ qua các dao động ngẫu nhiên Ngược lại, ở các cấu trúc nano, các tính chất lượng tử trở nên rõ ràng và đáng chú ý hơn.

Hiệu ứng bề mặt đóng vai trò quan trọng khi vật liệu có kích thước nanomet, vì tỷ lệ nguyên tử trên bề mặt chiếm một phần lớn so với tổng số nguyên tử Điều này dẫn đến những tính chất đặc biệt của vật liệu ở kích thước nanomet, khác biệt hoàn toàn so với vật liệu ở dạng khối.

Kích thước tới hạn là giới hạn kích thước mà tại đó các tính chất vật lý và hóa học của vật liệu bắt đầu thay đổi đáng kể Khi vật liệu nhỏ hơn kích thước này, tính chất của nó sẽ hoàn toàn khác biệt Vật liệu nano, với kích thước tương đương với kích thước tới hạn, thể hiện những tính chất đặc biệt hấp dẫn.

Bảng 1: Độ dài tới hạn của một số tính chất của vật liệu [3]

Lĩnh vực Tính chất Độ dài tới hạn

(nm) Tính chất điện Bước sóng điện tử 10-100

Quãng đường tự do trung bình không đàn hồi 1-100

Tính chất từ Độ dày vách đômen 10-100

Quãng đường tán xạ spin 1-100

Tính chất quang Hố lượng tử 1-100 Độ dài suy giảm 10-100 Độ sâu bề mặt kim loại 10-100

Tính siêu dẫn Độ dài liên kết cặp Cooper 0,1-100 Độ thẩm thấu Meisner 1-100

Tính chất cơ Tương tác bất định xứ 1-1000

Bán kính khởi động đứt vỡ 1-100

Sai hỏng mầm 0,1-10 Độ nhăn bề mặt 1-10

Xúc tác Hình học topo bề mặt 1-10

Siêu phân tử Độ dài Kuhn 1-100

Miễn dịch Nhận biết phân tử 1-10

Ứng dụng của công nghệ nano trong sinh học và y học

Công nghệ nano, với nhiều tính năng độc đáo và kích thước tương đương các phân tử sinh học, đang được đầu tư nghiên cứu mạnh mẽ, đặc biệt trong lĩnh vực y sinh Những ứng dụng nổi bật của công nghệ nano trong y sinh ngày càng được phát triển và triển khai rộng rãi.

Chẩn đoán hiện đại sử dụng các hạt nano như hạt nano vàng, nano từ và chấm lượng tử để đánh dấu các phân tử sinh học và vi sinh vật Phương pháp này cho phép phát hiện các chuỗi gen thông qua cơ chế bắt cặp bổ sung của DNA hoặc cơ chế bắt cặp giữa kháng nguyên và kháng thể, mang lại độ chính xác cao trong việc xác định các thành phần sinh học.

- Vận chuyển thuốc: Cung cấp thuốc cho từng tế bào cụ thể bằng cách sử dụng các hạt nano nhằm tiết kiệm thuốc và tránh các tác dụng phụ.

Công nghệ nano có khả năng hỗ trợ cơ thể trong việc tái sản xuất và sửa chữa các mô bị hư hỏng thông qua việc sử dụng các giàn cấu trúc từ vật liệu nano kết hợp với các yếu tố tăng trưởng.

Hình 1: Hạt nano vàng sử dụng trong truyền dẫn thuốc.

Hạt nano bạc

1.2.1 Giới thiệu về bạc kim loại

Cấu hình electron của bạc: 1s 2 2s 2 2p 6 3s 2 3p 6 3d 10 4s 2 4p 6 4d 10 5s 1

Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm

Bán kính ion bạc: 0,23 nm

Bảng 2: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích [14]

Kích thước của hạt nano Ag (nm) Số nguyên tử chứa trong đó

Bạc nano là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất lớn, có những đặc tính độc đáo sau [14] :

- Tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi, có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi xa, chống tĩnh.

- Không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao, không có phụ gia hóa chất.

Có khả năng phân tán ổn định trong nhiều loại dung môi, bao gồm dung môi phân cực như nước và dung môi không phân cực như benzene và toluene.

- Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường.

- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp.

- Ổn định ở nhiệt độ cao.

1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc

Bạc và các hợp chất của nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn, virus, tảo và nấm, nhưng khác với các kim loại nặng như chì và thủy ngân, bạc không gây độc hại cho con người.

Từ xa xưa, bạc đã được sử dụng để phòng bệnh nhờ vào tính kháng khuẩn của nó Người cổ đại thường lưu trữ nước và rượu dấm trong các bình bạc Đến thế kỷ 20, việc đặt một đồng bạc trong chai sữa trở thành phương pháp phổ biến để giữ cho sữa tươi lâu hơn Ngoài ra, từ đầu thế kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX, bạc và các hợp chất của nó được ứng dụng rộng rãi trong điều trị vết bỏng và khử trùng.

Sau khi thuốc kháng sinh ra đời và phát huy hiệu quả, người ta đã ít chú ý đến tác dụng kháng khuẩn của bạc Tuy nhiên, trong những năm gần đây, với sự gia tăng các chủng vi sinh kháng thuốc, sự quan tâm đến khả năng diệt khuẩn và ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là ở dạng hạt nano, đã trở lại mạnh mẽ.

1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn của bạc

Hình 2: Tác động của ion bạc lên vi khuẩn.

Các đặc tính kháng khuẩn của bạc xuất phát từ tính chất hóa học của các ion Ag +, cho phép chúng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn Sự liên kết này ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào, dẫn đến việc làm tê liệt vi khuẩn Nếu các ion bạc được loại bỏ khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoạt động của vi khuẩn sẽ bị ảnh hưởng đáng kể.

Vi khuẩn có khả năng phục hồi, và do động vật không có thành tế bào, chúng ta không bị ảnh hưởng khi tiếp xúc với các ion này.

Ion bạc (Ag+) tác động lên màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh, sau đó xâm nhập vào bên trong tế bào và tương tác với nhóm sunfuahydrin – SH của enzym chuyển hóa oxy Sự tương tác này làm vô hiệu hóa enzym, dẫn đến việc ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn.

Hình 3: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn

Các ion bạc có khả năng liên kết với các base của DNA, giúp trung hòa điện tích của gốc phosphate, từ đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA.

Hình 4: Ion bạc liên kết với các base của DNA

1.2.4 Các phương pháp chế tạo hạt nano kim loại

Phương pháp ăn mòn laze sử dụng chùm tia laze có bước sóng ngắn để tác động lên vật liệu khối trong dung dịch chứa chất hoạt hóa bề mặt Quá trình này giúp tạo ra các hạt, mang lại hiệu quả cao trong việc xử lý bề mặt vật liệu.

7 nano được tạo thành với kích thước khoảng 10 nm và được bao phủ bởi chất hoạt hóa bề mặt.

Phương pháp khử hóa học là kỹ thuật sử dụng các tác nhân hóa học để chuyển đổi ion kim loại thành kim loại Để đảm bảo các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ, phương pháp tĩnh điện được áp dụng để tạo ra bề mặt hạt nano có cùng điện tích, giúp chúng đẩy nhau Ngoài ra, phương pháp bao bọc bằng chất hoạt hóa bề mặt cũng được sử dụng Kích thước của các hạt nano thu được qua phương pháp này thường dao động từ 10 nm đến 100 nm.

Phương pháp khử vật lý sử dụng các tác nhân như điện tử và sóng điện từ năng lượng cao, bao gồm tia gamma, tia tử ngoại và tia laser, để chuyển đổi ion kim loại thành kim loại Dưới tác động của những tác nhân này, dung môi và các phụ gia trong dung môi trải qua nhiều quá trình biến đổi, tạo ra các gốc hóa học có khả năng khử ion thành kim loại hiệu quả.

Phương pháp khử hóa lý là một kỹ thuật trung gian giữa hóa học và vật lý, sử dụng điện phân kết hợp với siêu âm để tạo ra hạt nano Trong khi phương pháp điện phân thông thường chỉ tạo ra màng mỏng kim loại, quá trình này cho phép các nguyên tử kim loại được điện hóa hình thành hạt nano bám lên điện cực âm Khi áp dụng xung siêu âm đồng bộ với xung điện phân, các hạt nano kim loại sẽ tách ra khỏi điện cực và hòa vào dung dịch.

Phương pháp khử sinh học sử dụng vi khuẩn MKY3 để loại bỏ ion kim loại, cụ thể là ion bạc, từ dung dịch Quá trình này không chỉ đơn giản và thân thiện với môi trường mà còn cho phép sản xuất hạt nano bạc với số lượng lớn.

1.2.5 Giới thiệu về hạt nano bạc

Hạt nano bạc, với kích thước từ 1 nm đến 100 nm, sở hữu diện tích bề mặt lớn, giúp chúng có khả năng kháng khuẩn vượt trội so với các vật liệu khối Điều này là nhờ vào khả năng giải phóng nhiều ion Ag + hơn, làm tăng hiệu quả diệt khuẩn.

Hạt nano bạc thể hiện hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt, tạo ra màu sắc đa dạng từ vàng nhạt đến đen trong các dung dịch chứa hạt nano bạc Màu sắc này phụ thuộc vào nồng độ và kích thước của hạt nano.

1.2.5.1 Các phương pháp phân tích hạt nano bạc a) Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua

Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Sự sinh trưởng của quần thể vi sinh vật được phân tích thông qua đường cong sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ hoặc trong hệ thống kín Trong quá trình này, vi sinh vật được nuôi trong thiết bị kín mà không thay đổi môi trường, dẫn đến việc nồng độ chất dinh dưỡng giảm và chất thải tăng lên theo thời gian Khi vẽ đường cong sinh trưởng với trục hoành là thời gian nuôi cấy và trục tung là số logarit của tế bào sống, ta sẽ thấy đường cong này có 4 giai đoạn khác nhau.

Hình 15: Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín

1.3.1.1 Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase)

Khi cấy vi sinh vật vào môi trường mới, giai đoạn đầu tiên là giai đoạn Tiềm phát hay pha Lag, trong đó số lượng tế bào chưa tăng lên ngay lập tức Tuy nhiên, trong giai đoạn này, tế bào sẽ tăng thể tích và khối lượng rõ rệt do sự gia tăng các thành phần mới của tế bào.

Giai đoạn tiềm phát của vi sinh vật có thể kéo dài hoặc ngắn tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật và các đặc điểm của môi trường sống Nếu môi trường có tính chất hóa học khác biệt đáng kể, điều này có thể ảnh hưởng đến thời gian tiềm phát của chúng.

Giai đoạn tiềm phát của vi sinh vật sẽ kéo dài khi được cấy vào môi trường cũ Ngược lại, nếu cấy từ giai đoạn logarit vào môi trường có thành phần tương tự, giai đoạn tiềm phát sẽ được rút ngắn Tuy nhiên, khi cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hoặc giai đoạn tử vong, giai đoạn tiềm phát sẽ lại kéo dài.

1.3.1.2 Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase)

Trong giai đoạn này, vi sinh vật phát triển và phân chia với tốc độ tối đa khi được cung cấp môi trường và điều kiện nuôi cấy phù hợp Nhịp độ sinh trưởng của chúng duy trì ổn định, với các tế bào phân đôi đều đặn Do sự khác biệt giữa các tế bào là rất nhỏ, đường cong sinh trưởng trở nên mượt mà thay vì gấp khúc, phản ánh tốc độ hấp thu chất dinh dưỡng thông qua quá trình chuyển vận protein của vi sinh vật.

Hình 16: Nồng độ chất dinh dưỡng sinh trưởng

Sự hạn chế chất dinh dưỡng có ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng chung của vi sinh vật Khi nồng độ chất dinh dưỡng đạt mức đủ cao, sản lượng chung của vi sinh vật sẽ ổn định và phát triển tốt.

(b)- Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng tới tốc độ sinh trưởng

1.3.1.3 Giai đoạn tử vong (Death Phase)

Sự tiêu hao dinh dưỡng và tích lũy chất thải độc hại gây tổn hại đến môi trường sống của vi sinh vật, dẫn đến sự giảm sút số lượng tế bào sống Đây chính là đặc điểm của giai đoạn tử vong trong chu trình sống của chúng.

Sự tử vong của quần thể vi sinh vật diễn ra theo kiểu logarit, với tỷ lệ tế bào chết không đổi theo giờ Tổng số tế bào sống và chết không thay đổi do tế bào chết chưa bị phân hủy Để xác định số lượng tế bào sống, cần pha loãng mẫu và cấy lên thạch đĩa, sau đó đặt trong điều kiện thích hợp để đếm số khuẩn lạc xuất hiện.

Mặc dù hầu hết vi sinh vật chết theo phương thức logarit, nhưng sau khi số lượng tế bào giảm đột ngột, tốc độ chết của tế bào lại chậm lại Nguyên nhân là do một số cá thể sống sót nhờ vào tính đề kháng đặc biệt mạnh mẽ Điều này, cùng với các yếu tố khác, khiến đường cong giai đoạn tử vong trở nên phức tạp.

1.3.2 Xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn

1.3.2.1 Xác định số lượng tế bào

Phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất để xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới kính hiển vi Sử dụng các phòng đếm không chỉ giúp quá trình đếm diễn ra nhanh chóng và dễ dàng, mà còn tiết kiệm chi phí, đồng thời cho phép quan sát kích thước và hình dáng của tế bào.

Để quan sát tế bào vi khuẩn, cần sử dụng phương pháp nhuộm màu hoặc kính hiển vi tương phản pha và kính hiển vi huỳnh quang Phòng đếm có cấu trúc với độ sâu nhất định và được chia thành các ô nhỏ Khi tiến hành đếm số lượng vi khuẩn, ta pha loãng dịch mẫu, đậy lá kính lên trên và thực hiện đếm dưới kính hiển vi.

Phương pháp này có nhược điểm là không thể xác định chính xác với các mẫu có số lượng vi khuẩn quá ít, đồng thời độ chính xác cũng không cao do không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết.

Hình 17: Phòng đếm Petroff-Hauser:

(a)- Mặt nhìn nghiêng của phòng đếm (b)- Giữa phiến kính có phòng đếm với các ô nhỏ

(c) Ở độ phóng đại khoảng x 400-500 tiến hành đếm số lượng vi khuẩn trong các ô nhỏ.

1.3.2.2 Xác định khối lượng tế bào

Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ được đo bằng số lượng tế bào mà còn qua tổng khối lượng tế bào Phương pháp trực tiếp để xác định sự sinh trưởng là đo trọng lượng khô của tế bào, bắt đầu bằng việc ly tâm để thu nhận sinh khối, sau đó rửa và làm khô tế bào trước khi cân Phương pháp này rất phù hợp cho việc xác định sự sinh trưởng của nấm, tuy nhiên, nó tốn thời gian và không mẫn cảm Đối với vi khuẩn, do trọng lượng từng cá thể rất nhỏ, có thể cần ly tâm hàng trăm ml để thu thập đủ số lượng cho việc xác định trọng lượng sinh khối khô.

Phương pháp đo mật độ quang (OD) là một cách nhanh chóng và nhạy bén để xác định nồng độ tế bào trong dịch nuôi cấy Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ vi khuẩn, khi nồng độ đạt 10^7 tế bào/ml, dịch nuôi cấy sẽ trở nên vẩn đục, và độ đục tăng lên khi nồng độ vi khuẩn tăng Độ tán xạ ánh sáng có thể được đo bằng quang phổ kế, với mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ tế bào và giá trị hấp thụ ánh sáng ở mức độ hấp thụ thấp Phương pháp này cho phép xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật khi nồng độ đạt đến mức có thể đo được.

18 nhau thì tổng lượng chất đó trong tế bào có tương quan trực tiếp với tổng sinh khối vi sinh vật [8]

Hình18: Phương pháp đo OD

NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

Phương pháp chế tạo hạt nano bạc

Trong nghiên cứu này, dung dịch nano bạc được cung cấp bởi Viện tiên tiến

Khoa học và Công nghệ (AIST) của Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã nghiên cứu và phát triển dung dịch nano bạc thông qua kỹ thuật khử hóa học Quá trình này sử dụng bức xạ UV kích thích và chất hoạt động bề mặt là axit oleic để tạo ra sản phẩm hiệu quả.

2.1.1 Quy trình công nghệ chế tạo dung dịch nano bạc sử dụng kỹ thuật khử hóa học với bức xạ UV kích thích

2.1.1.1 Hóa chất thí nghiệm sử dụng:

- AgNO3 (bạc nitrat): Độ sạch 99%, Trung Quốc.

- NaOH (natri hydroxyt): Hóa chất thí nghiệm, Trung Quốc.

- NH4OH (amoni hydroxyt): Hóa chất thí nghiệm, Trung Quốc.

- C6H12O6 (đường glucozo): Hóa chất thí nghiệm.

- C17H33COOH (axit oleic): Hóa chất thí nghiệm và hóa chất công nghiệp

Axit oleic, với công thức cấu tạo CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH, là một chất không màu, không mùi và không vị, có nhiệt độ nóng chảy ở 14°C Trong quá trình thủy phân chất béo, axit oleic được thu nhận cùng với các loại axit béo no và không no khác.

- Các bình đựng hóa chất, ống đong, pipet.

- Máy khuấy từ và rung siêu âm để phân tán và làm đồng đều.

- Đèn pin bức xạ UV, công suất 35W.

Hình 19: Sơ đồ quy trình điều chế hạt nano bạc sử dụng kỹ thuật khử hoác học với bức xạ UV kích thích [1]

- Lấy 1.7 g bạc nitrat AgNO3 (dạng muối kết tinh màu trắng) hòa tan trong 100ml nước cất.

- Thêm vào dung dịch 0.62 g natri hydroxyt, NaOH, để tạo kết tủa Ag2O có màu đen.

- Hòa tan kết tủa bằng một lượng vừa đủ amoni hydroxyt, NH4OH, để tạo ra dung dịch phức bạc Ag(NH3)2OH trong suốt.

Thêm axit oleic vào dung dịch và khuấy đều trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để tạo ra một dung dịch đồng nhất với độ nhớt cao.

Thêm 2.0g đường glucozo và khuấy đều trên máy khuấy từ để tiến hành phản ứng khử Sử dụng đèn bức xạ UV trong quá trình khử để kích thích phản ứng và điều chỉnh kích thước hạt nano bạc.

- Phản ứng khử được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 8 giờ.

2.1.2 Cơ chế hình thành hạt nano bạc

Quá trình hình thành hạt nano bạc được giải thích như sau:

Bức xạ UV kích thích các ion [Ag(NH3)2]+ hoạt động, dẫn đến việc các phân tử glucose nhường điện tử cho Ag+, từ đó tạo ra hạt nhân nguyên tử bạc Ag0.

[Ag(NH3)2] + + RCHOH hν Ag 0 + 2NH3 + H + + RCOH nAg 0 (Agn) 0

Các ion Ag+ trong dung dịch hấp phụ lên bề mặt nguyên tử bạc, tạo thành lớp điện tích dương, thu hút các ion RCOO- mang điện tích âm và hình thành lớp bảo vệ đầu tiên Nhóm carboxyl của ion oleate hướng về phía bề mặt bạc, trong khi đầu kị nước hướng ra ngoài Các ion oleate trong dung dịch tiếp tục gắn kết với lớp bảo vệ đầu, tạo thành lớp bảo vệ thứ hai với đầu ưa nước hướng ra ngoài Cấu trúc này giúp các hạt nano bạc phân tán đều trong nước và ngăn chặn hiện tượng kết đám.

Hình 20: Sự hình thành của 2 lớp ion oleate trên bề mặt hạt nano bạc

Ảnh hưởng của nano bạc lên sự phát triển của vi khuẩn

OD (Mật độ quang học) là phương pháp đo nồng độ tế bào trong dung dịch huyền phù Phương pháp này có ưu điểm nổi bật là thực hiện nhanh chóng và không làm hỏng tế bào.

Phương pháp này dựa trên hiện tượng tán xạ ánh sáng khi ánh sáng đi qua dung dịch huyền phù Mức độ tán xạ ánh sáng phụ thuộc vào nồng độ tế bào trong dung dịch; nồng độ tế bào càng cao thì sự tán xạ càng mạnh.

Để xác định nồng độ tế bào, việc đo mật độ quang (OD) là cần thiết Mật độ quang được tính toán dựa trên tỷ lệ giữa cường độ ánh sáng trước và sau khi đi qua mẫu.

- A λ là mật độ quang tại bước sóng λ.

- I 0 là cường độ sáng trước khi qua mẫu.

- I là cường độ sáng sau khi qua mẫu.

Người ta sử dụng bước sóng λ = 600 nm để xác định nồng độ tế bào theo công thức sau:

[Số tế bào/ml] = A600x(Hệ số chuyển đổi)x(Hệ số pha loãng)

Hệ số chuyển đổi được mặc định là 5x10 8

Không giống như phương pháp đo

- Máy quang phổ kế Beckman Coulter DU 730 (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)

Hình 21: Máy quang phổ kế Beckman Coulter DU 730

- Tủ nuôi cấy vi sinh vật (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà

2.2.3 Các bước tiến hành thí nghiệm

- Lấy 12,5g bột LB (Luria-Bertani) pha với 0.5 ml nước cất, đun nóng cho bột tan hết.

- Rót dung dịch LB vào 10 bình tam giác, mỗi bình 30 ml Các bình được chia thành 2 nhóm M1 và M2.

- Đem khử trùng các bình ở nhiệt độ 180 0 C.

- Đưa vào mỗi bình 1 ml dung dịch E coli (Viện vi sinh vật và công nghệ sinh học – ĐHQG Hà Nội)

Cho từng lượng dung dịch chưa hạt nano bạc 100 ppm vào các bình với thể tích lần lượt là 0 ml, 1.5 ml, 3.0 ml, 4.5 ml, 6.0 ml và 7.5 ml để tạo ra các dung dịch có nồng độ hạt nano bạc tương ứng là 0 àg/ml, 5 àg/ml, 10 àg/ml, 15 àg/ml và 25 àg/ml.

Hình 22: Các bình nuôi cấy

- Ủ các bình trong tủ lắc ở nhiệt độ 30 0 C trong vòng 30 phút.

- Lấy 100 ml dung dịch ở mỗi bình đem đo OD ở bước sóng λ = 600 nm.

- Lặp lại các bước trên 10 lần

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân tích dung dịch nano bạc

Hình 23: Dung dịch chứa hạt nano bạc ở các nồng độ khác nhau

Phân tích phổ UV-VIS của dung dịch 100ppm cho thấy đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 422nm, xác nhận sự hiện diện của các hạt nano bạc trong dung dịch.

Hình24: Phổ UV-VIS của dung dịch nano bạc nồng độ 100 ppm

Phân tích từ ảnh TEM cho thấy các hạt nano trong dung dịch có hình dạng cầu với kích thước trung bình khoảng 9-10 nm Sự phân tán đồng đều của các hạt nano bạc mà không có hiện tượng kết đám chứng tỏ hiệu quả của việc sử dụng axit oleic làm chất hoạt động bề mặt.

Hình 25: Ảnh TEM của mẫu dung dịch nano bạc

3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển của vi khuẩn khi có mặt của dung dịch nano bạc

Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn E coli bằng phương pháp đo OD, ta có bảng kết quả sau:

Bảng 3: Kết quả đo OD

KẾT QUẢ ĐO OD 0(μg/ml) 5(μg/ml) 10(μg/ml) 15(μg/ml) 25(μg/ml)

Đường cong sinh trưởng của mẫu với nồng độ hạt nano 0 (μg/ml) không có hạt nano bạc cho thấy hình dạng tương tự như giai đoạn logarit trong lý thuyết Trong giai đoạn này, vi khuẩn phát triển nhanh chóng nhờ vào môi trường nuôi cấy thuận lợi, dẫn đến sự phân chia tế bào đều đặn Sau 11 giờ, mật độ vi khuẩn trong mẫu đạt khoảng giá trị tối ưu, phản ánh sự tăng trưởng mạnh mẽ của chúng.

Hình 26: Đường cong sinh trưởng của E coli khi không có mặt của nano bạc

Hình 27: Đường cong sinh trưởng của E coli khi có sự xuất hiện của nao bạc a) Nồng độ 5(μg/ml) b) Nồng độ 10(μg/ml)

OD c) Nồng độ 15(μg/ml) d) Nồng độ 25(μg/ml)

Hình 28: Đường cong sinh trưởng của E coli trong tất cả các mẫu

Từ hình 27, các mẫu có chứa nano bạc cho thấy pha lag kéo dài bất thường và pha chỉ số gần như không xuất hiện, cho thấy vi khuẩn không thể phát triển dù có đủ dinh dưỡng và được ủ ở nhiệt độ thích hợp Sau 10 giờ, quần thể vi khuẩn trong tất cả các mẫu này đã đạt giai đoạn tử vong, trong khi mẫu đối chứng chưa đạt pha cân bằng, điều này khẳng định hiệu quả kháng khuẩn của nano bạc.

Các hạt nano bạc liên kết với peptidoglican ở thành tế bào vi khuẩn, ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào, dẫn đến việc làm tê liệt vi khuẩn Sau khi tác động lên màng tế bào, các hạt nano bạc thâm nhập vào bên trong và tương tác với các enzym trong quá trình hô hấp, gây ức chế quá trình này Đáng chú ý, nồng độ tế bào trong tất cả các mẫu chứa hạt nano bạc đều tương đương nhau ở mọi thời điểm, mặc dù mẫu có nồng độ nano bạc cao hơn lại có nồng độ vi khuẩn thấp hơn Sau 11 giờ, nồng độ vi khuẩn trong tất cả các mẫu chứa hạt nano bạc đều xấp xỉ giống nhau.

Chứng tỏ nồng độ tế bào trong các mẫu có nano bạc nhỏ hơn 17 lần nồng độ tế bào trong mẫu không có nano bạc

Từ kết quả trên ta thấy rằng với mọi nồng độ nano bạc từ 5 μg/ml đến 25 μg/ml đều thể hiện tính kháng khuẩn mạnh với E coli.

Sau 8 giờ, các bình nuôi cho thấy bình không chứa hạt nano (bên phải) bị vẩn đục, chứng tỏ sự phát triển mạnh mẽ của vi khuẩn Ngược lại, các bình có chứa hạt nano bạc gần như không thay đổi màu sắc.

Trong 10 giờ đầu, mật độ vi khuẩn hầu như không đổi Trong giai đoạn này vi khuẩn bị ức chế do tác dụng của các ion bạc được giải phóng từ hạt nano bạc Tuy nhiên cấu trúc tế bào của vi khuẩn vẫn chưa bị phá hủy.

Sau 10 giờ, nồng độ vi khuẩn giảm mạnh cho thấy các tế bào đã bắt đầu bị phá hủy Tuy nhiên trong bình nuôi cấy cũng có thể có các cá thể có khả năng kháng lại nano bạc tồn tại.

So sánh với phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn

Phương pháp đo bán kính vòng vô khuẩn sử dụng dung dịch nano bạc tẩm vào đĩa giấy và đặt lên môi trường thạch đã cấy vi khuẩn thử nghiệm Dung dịch này nhanh chóng khuếch tán, ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và tạo ra vòng vô khuẩn Đường kính của vòng này phản ánh mức độ kháng khuẩn của dung dịch nano bạc, với vòng lớn cho thấy tính kháng khuẩn mạnh hơn Phương pháp này đơn giản và dễ thực hiện, nhưng chỉ cho biết mức độ kháng khuẩn cuối cùng qua bán kính vòng vô khuẩn.

Phương pháp đo OD, mặc dù phức tạp, cung cấp thông tin quan trọng về sự phát triển của quần thể vi khuẩn khi tiếp xúc với dung dịch nano bạc Phương pháp này cho phép xác định ảnh hưởng của hạt nano bạc lên từng giai đoạn sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó giúp xác định giai đoạn mà quần thể vi khuẩn dễ bị tác động nhất bởi hạt nano bạc.