TỔNG QUAN
Tổng quan về tế bào da người
Hình 1.1 Cấu tạo da người
Da là cơ quan chiếm diện tích lớn nhất trên cơ thể người, có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ khỏi vi khuẩn và các yếu tố môi trường, đồng thời giúp điều chỉnh nhiệt độ cơ thể và cảm nhận nhiệt độ nóng, lạnh Da bao gồm ba lớp khác nhau (Chaurasia, 2004).
Lớp thượng bì (Epidemis): lớp ngoài cùng của da có chức năng cung cấp một hàng rào chống thấm nước và tạo ra màu da của chúng ta
Lớp nội biểu bì (Dermis): bên dưới lớp biểu bì, chứa mô liên kết cứng, nang lông và tuyến mồ hôi
Lớp hạ bì (Hypodemis): Các mô dưới da được cấu thành từ chất béo và mô liên kết
Thượng bì là lớp ngoài cùng của da, chủ yếu bao gồm các tế bào biểu mô sừng (Keratinocyte) chiếm 95%, cùng với tế bào hắc tố (Melanoma), tế bào thần kinh (Merkel) và tế bào Langerhans Lớp thượng bì không chỉ bảo vệ da mà còn giữ ẩm cho cơ thể, cấu trúc gồm bốn lớp tế bào chính từ ngoài vào trong: lớp tế bào sừng, lớp tế bào hạt, lớp tế bào gai và lớp tế bào đáy Đặc biệt, ở lòng bàn tay và bàn chân có thêm một lớp bóng nằm giữa lớp sừng và lớp hạt.
2 có 5 lớp) Thượng bì có độ dày 0,4 – 1,5 mm tùy theo từng vị trí trên cơ thể (Monteiro- Riviere, 2010)
Lớp tế bào đáy (Stratum basale)
Lớp tế bào cơ bản (Basal cells) là lớp sâu nhất của thượng bì, chứa các tế bào hình trụ với nhân thẳng đứng và nguyên sinh chất ưa kiềm có hạt sắc tố melanin Đây là nơi sản sinh tế bào keratinocyte, giúp chống lại tia UV, ngăn ngừa vi khuẩn, nấm và kí sinh trùng xâm nhập, đồng thời giữ nước cho cơ thể Các tế bào đáy có khả năng tái tạo mạnh mẽ, thay thế các tế bào cũ đã biệt hóa Thời gian để một tế bào đáy phân chia, biệt hóa và di chuyển tới lớp sừng là khoảng 14 ngày, và để hình thành vảy da và bong ra cần thêm 14 ngày nữa Như vậy, khả năng tái tạo của lớp thượng bì mất khoảng 4 tuần (Montagna, 2012).
Lớp tế bào gai (Stratum spinosum)
Các tế bào lớp gai bao gồm 5-10 hàng tế bào hình đa diện, kết nối với nhau qua các thể nối (desmosome) bằng phospholipid Khi tách rời, bề mặt của các tế bào gai xuất hiện những chỗ nhú lên như gai Tương tự như tế bào lớp đáy, tế bào gai có khả năng sản sinh rất nhanh và liên tục, dẫn đến việc biểu bì da người được đổi mới khoảng 20-27 ngày một lần.
Lớp tế bào hạt (Stratum granulosum)
Lớp tế bào này bao gồm 3-4 hàng tế bào dẹt nằm trên lớp tế bào gai, nơi các tế bào sản sinh ra hạt nhỏ và di chuyển lên lớp sừng để hình thành chất sừng và lipid biểu bì Bào tương của các tế bào hạt chứa nhiều hạt keratohyalin, chủ yếu là tiền chất Filaggrin và các lá keratin trung gian, cho thấy quá trình sừng hóa đang diễn ra (Walters, 2002).
Lớp tế bào sáng (Stratum lucidum)
Lớp tế bào này chỉ xuất hiện ở lòng bàn tay và bàn chân, nằm trên lớp hạt với các tế bào không có nhân, dẹt và được sắp xếp thành 2-3 hàng Những tế bào này thường phẳng và khó phân biệt.
Lớp tế bào sừng (Stratum corneum)
Lớp tế bào sừng là lớp ngoài cùng của da, bao gồm khoảng 20 lớp tế bào và chứa các tuyến mồ hôi cùng tuyến bã nhờn Đây là những tế bào lớn nhất trong lớp da.
Lớp thượng bì bao gồm chủ yếu là chất sừng (keratin), với các tế bào ở lớp này được kết nối với nhau nhờ chất gian bào Điều này tạo thành một khối vững chắc, giúp bảo vệ da khỏi các tác động từ môi trường bên ngoài.
Thượng bì không có mạch máu vì các sợi thần kinh chỉ phân nhánh đến lớp đáy của da, do đó, nó được nuôi dưỡng chủ yếu bởi dịch gian bào (Monteiro-Riviere, 2010).
1.1.2 Lớp nội bì (trung bì) (Dermis)
Lớp nội bì, hay trung bì, nằm dưới thượng bì và là vùng dày nhất của da, với độ dày thay đổi từ 0,1 mm đến vài mm tùy thuộc vào từng vùng cơ thể Lớp này chứa các biểu mô liên kết giúp giữ hạ thượng bì và lớp hạ bì, được ngăn cách bởi màng đáy dày khoảng 0,5 mm Dịch trong lớp nội bì cung cấp dinh dưỡng cho thượng bì thông qua quá trình vận chuyển qua màng đáy Ranh giới giữa thượng bì và trung bì không phải là đường thẳng mà có hình dạng lượn sóng, với phần sóng nhô lên gọi là gai bì và phần lượn xuống giữa các gai bì được gọi là mào liên gai.
Hạ bì, hay còn gọi là lớp mỡ dưới da, là nơi chứa mô liên kết, nhiều mạch máu và thần kinh, giúp duy trì sự sống cho da Lớp hạ bì cũng đóng vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu các tác động và tổn thương từ bên ngoài, đồng thời góp phần điều hòa nhiệt độ cơ thể (Walters, 2002).
Màu da được hình thành bởi các tế bào melanocyte trong lớp biểu bì, chịu trách nhiệm sản xuất sắc tố melanin thông qua enzyme tyrosinase Nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc ức chế enzyme tyrosinase nhằm ngăn chặn sự hình thành melanin, giúp điều trị tình trạng nám da hiệu quả.
Tổng quan về Tyrosinase
Hình 1.2 Các dạng oxy hóa của Tyrosinase
Tyrosinase, hay enzyme polyphenol oxidase (PPO), là một enzyme monooxygenase có vai trò quan trọng trong việc sản xuất melanin Enzyme này tham gia vào hai phản ứng chính trong quá trình tổng hợp melanin: hydroxyl hóa monophenol thành o-diphenol và oxi hóa o-diphenol thành o-quinone Sau đó, o-quinone trải qua nhiều phản ứng để hình thành melanin Tyrosinase là enzyme chứa đồng, có mặt trong mô thực vật và động vật, xúc tác cho quá trình sản xuất melanin và các sắc tố khác từ amino acid tyrosine PPO được tìm thấy trong melanosome, nơi được tổng hợp trong các tế bào melanocyte.
Enzyme tyrosinase, có mặt trong nấm, động vật và thực vật, đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành sắc tố Tyrosinase tồn tại ở ba dạng: oxy, deoxy và met-tyrosinase Cả met-tyrosinase và oxy-tyrosinase đều có khả năng oxy hóa o-diphenol thành o-quinone, trong khi chỉ oxy-tyrosinase mới có thể hydroxyl hóa monophenol thành o-diphenol Dạng deoxy-tyrosinase là dạng yếu, không ổn định và phản ứng với oxy để chuyển thành oxy-tyrosinase.
Hình 1.3 Trung tâm hoạt động của Tyrosinase
Tyrosinase có cấu trúc hoạt động chính bao gồm túi enzyme và hai nguyên tử đồng nằm ở đáy túi, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác Mỗi nguyên tử đồng liên kết phối trí với ba phân tử histamin Miệng túi enzyme được cấu thành từ các chuỗi acid amin như Val283, Phe264, His244, Val248, và Asn260.
Melanogenesis là quá trình sản xuất melanin, chủ yếu do các tế bào melanocyte thực hiện Melanin, một polymer tự nhiên, hiện diện ở nhiều vị trí trong cơ thể như mắt, tai, não, tóc và da Có ba dạng melanin chính ở người: eumelanin, pheomelanin và neuromelanin Neuromelanin tồn tại trong não, trong khi eumelanin và pheomelanin chủ yếu nằm trong da, với eumelanin là sắc tố màu nâu đen và pheomelanin là sắc tố màu vàng đỏ Màu da phụ thuộc vào di truyền và các yếu tố môi trường như tia cực tím và ánh sáng, thay đổi theo tỷ lệ giữa eumelanin và pheomelanin Lượng eumelanin cao tạo ra tông màu da tối hơn, trong khi lượng pheomelanin cao giúp màu da sáng và đều màu hơn.
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của eumelanin (A) và pheomelanin (B)
1.2.2.1 Quá trình sản xuất melanin (melanogenesis)
Quá trình sản xuất melanin diễn ra trong melanosome của tế bào melanocyte, nơi eumelanin và pheomelanin được tổng hợp thông qua các phản ứng do các enzyme melanogenic như PAH, TRYP1 và TPYP2 xúc tác Sự sản xuất các enzyme này được thúc đẩy bởi yếu tố phiên mã microphthalmia (MITF), đóng vai trò điều chỉnh tổng hợp melanin MITF cũng chịu sự điều chỉnh từ nhiều con đường truyền tín hiệu như Protein kinase C (PKC), Cyclic adenosine monophosphate (cAMP), MAP Kinase (MEK) và Wingless – related integration site (WNT), được kích hoạt bởi các thụ thể như KIT và melanocortin – 1 receptor (MC1R) Ngoài ra, MITF còn thúc đẩy sự biểu hiện của các gen như SOX10 và PAX3.
Quá trình hình thành melanin bắt đầu với enzyme tyrosinase (TYR), enzyme này hydroxyl hóa amino acid tyrosine thành L-3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA), sau đó DOPA nhanh chóng bị oxy hóa thành DOPA quinone Sự hiện diện của cysteine và glutathione dẫn đến việc hình thành cysteinyl-DOPA, sau đó sẽ bị oxy hóa và trùng hợp thành pheomelanin, loại melanin hòa tan có màu vàng đỏ Ngược lại, khi không có cysteine và glutathione, DOPA quinone sẽ đóng vòng.
DOPA chrome có thể tham gia vào hai con đường hình thành melanin: một là chuyển hóa thành 5,6-dihydroxyindole (DHI) và sau đó oxy hóa thành DHI-melanin màu nâu đen; hai là biến đổi thành axit DHI-2-carboxylic (DHICA) dưới tác dụng của DOPAchrome tautomerase (TYRP2), sau đó được TYRP1 xúc tác để tạo thành DHICA-melanin màu nâu nhạt Cả hai loại melanin này đều thuộc eumelanin, loại melanin này có vai trò quan trọng trong màu da và tạo sự đa dạng về màu sắc giữa các nhóm dân tộc.
1.2.2.2 Các phương pháp ức chế sự hình thành melanin
Kiểm soát nám da là thách thức lớn cho bác sĩ da liễu do nhiều phương pháp điều trị không hiệu quả Hiện nay, nghiên cứu tập trung vào việc ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase và các enzyme melanogic để giảm sản xuất melanin.
Giảm nồng độ enzyme tyrosinase và các melanogenic enzyme khác
Nghiên cứu cho thấy TGF-𝛽1 có khả năng ức chế tổng hợp melanin bằng cách ức chế hoạt động của các protein như MITF, tyrosinase, TRP-1 và TRP-2 Lysophosphatidic acid và C2 ceramide cũng có tác dụng tương tự khi ức chế MITF, làm giảm tổng hợp melanin Ngoài ra, 𝛼-Tocopherols được thử nghiệm và cho thấy khả năng giảm hắc tố, nhưng không ức chế trực tiếp tyrosinase mà ngăn chặn DOPA quinone cùng các quá trình oxy hóa liên quan đến hình thành hắc tố.
Ngăn chặn sự hình thành và vận chuyển melanosome
Sự vận chuyển melanosome sang keratinocyte là một trong những nguyên nhân chính gây tăng sắc tố da Niacinamide (Vitamin B3) đã được chứng minh có khả năng làm sáng da bằng cách ngăn chặn quá trình này, với các nghiên cứu được thực hiện cả in vitro và in vivo Tuy nhiên, cơ chế hoạt động cụ thể của nó vẫn cần được làm rõ (Hakozaki, 2002) Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng các chất thảo dược và neoglycoprotein có khả năng ức chế sự hình thành các thụ thể trung gian, từ đó ngăn chặn sự vận chuyển melanosome.
Các hợp chất phenol đơn giản
Hydroquinone và các dẫn xuất của nó là những chất ức chế tyrosinase hiệu quả, không chỉ thông qua việc tương tác với đồng tại vị trí hoạt động mà còn thay đổi chức năng của melanosome Chúng làm cạn kiệt glutathione và phá hủy sự oxy hóa của lipid màng và protein nhờ vào khả năng khử của hydroquinone.
Hydroquinone đã trở thành một hợp chất phổ biến trong việc điều trị tàn nhang và nám da từ năm 2003 Khi kết hợp với các hợp chất khác, hydroquinone có thể tăng cường hiệu quả của nhiều phương pháp trị nám (Pandya, 2001) Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng hydroquinone gặp nhiều hạn chế về mặt pháp lý, đặc biệt là ở châu Âu, nơi hợp chất này đã bị cấm từ tháng 12 năm 2000.
Nghiên cứu cho thấy 4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone và 4-n-butylresorcinol có khả năng ức chế tyrosinase gấp đôi và cải thiện nám, giảm sắc tố đáng kể ở nồng độ 0,3% Tuy nhiên, hai hợp chất này có thể gây độc tế bào do bị oxy hóa thành dạng quinonic.
Kojic acid là một chất ức chế tyrosinase hiệu quả, thường được sử dụng trong các sản phẩm làm sáng da, mặc dù có thể gây dị ứng (Kawai, 1995) Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy khi kết hợp kojic acid với các thành phần khác, khả năng ức chế melanin được cải thiện đáng kể (Lim.J.T., 1999).
Ascorbic acid được biết đến như một chất chống oxy hóa nhờ khả năng chuyển đổi o-DOPA quinone trở lại DOPA, giúp ngăn ngừa sự hình thành melanin Tuy nhiên, nó cũng có thể gây ra sự gia tăng các gốc tự do khi có mặt ion kim loại thông qua phản ứng Fenton Để nâng cao tính ổn định của ascorbic acid, các este ascorbate như magie ascorbyl-2-phosphate đã được phát triển Việc sử dụng kem chứa 10% dẫn xuất ascorbic acid hàng ngày đã cho thấy hiệu quả làm sáng da rõ rệt ở những bệnh nhân bị nám.
Nấm linh chi
Theo khoa học, nấm linh chi được phân loại như sau (Lê Xuân Thám, 1996):
Bảng 1.1 Phân loại khoa học nấm linh chi
Nấm linh chi (quả thể) bao gồm hai phần chính: cuống và mũ nấm Cuống nấm có thể dài hoặc ngắn tùy thuộc vào chủng loại, thường có hình trụ và đường kính từ 0,5-3cm Lớp vỏ của cuống nấm có màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen, bề mặt nhẵn bóng, không có lông Cuống nấm ít khi phân nhánh và đôi khi có thể uốn khúc.
Mũ nấm non có hình trứng, sau đó phát triển thành hình rẻ quạt hoặc bán nguyệt với kích thước từ 2-25cm rộng, 3-30cm dài và dày từ 0,5-2cm Bề mặt trên bóng như vecni, có màu sắc đa dạng từ vàng chanh, vàng nghệ đến vàng nâu, vàng cam, đỏ nâu và nâu tím, với các đường vân đồng tâm và lượn sóng Phần cuống nấm thường có hình dạng hơi gồ lên hoặc lõm xuống Mặt dưới của nấm có màu nâu nhạt, chứa các ống rất nhỏ để sản xuất bào tử, và khi bào tử chín sẽ có màu nâu Khi nấm trưởng thành, nó sẽ phát tán bào tử ra môi trường.
1.3.2.2 Điều kiện sống của linh chi
Linh chi phát triển qua hai giai đoạn chính: nuôi sợi và tạo quả thể Để canh tác quả thể, có thể sử dụng các phương pháp như trồng trên mùn cưa trong túi hoặc chai, hoặc trên các khúc gỗ tự nhiên Quá trình sinh sản của nấm chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ ẩm và oxy.
Nghiên cứu cho thấy sợi nấm linh chi phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 25-32°C, trong khi nhiệt độ tối ưu cho sự ra quả là 27-32°C Độ ẩm của chất nền mùn cưa cần duy trì ở mức 65-70%, với pH tối ưu từ 4.2 đến 5.3 Ánh sáng tán xạ là cần thiết trong quá trình hình thành quả thể, cùng với mức cường độ ánh sáng từ 50-450 lux Oxy đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của sợi nấm, và độ ẩm không khí cần duy trì ở khoảng 90% trong giai đoạn đầu, giảm xuống 70-80% khi hình thành tai nấm, và cuối cùng là 30-40% trong giai đoạn phát triển quả thể Đảm bảo độ thoáng tốt trong suốt quá trình nuôi sợi và tạo quả thể là điều kiện thiết yếu cho sự phát triển của nấm linh chi.
Khi bào tử chín trong tự nhiên, chúng phát tán và bám vào giá thể như cây rừng để phát triển Nếu gặp điều kiện khắc nghiệt, bào tử sẽ hình thành lớp vỏ dày bao bọc Tuy nhiên, trong nuôi trồng, cần chọn điều kiện thích hợp để bào tử phát triển tốt nhất.
Nấm linh chi là một loại nấm gỗ cứng và đắng, có hình dáng giống như cái quạt hoặc móng guốc, thường mọc trên thân cây sống hoặc cây chết, đặc biệt là các loại cây lá rụng như sồi, phong, du, liễu, bạch đàn và mộc lan Loại nấm này cũng được tìm thấy trên cây lá kim ở châu Âu, châu Á, Bắc và Nam Mỹ Tại phương Đông, nấm linh chi chủ yếu phát triển trên cây mận, thường ở rễ và gốc cây trên mặt đất (Wasser S P., 2005).
Một số loài nấm linh chi được sử dụng rộng rãi cho mục đích y học như: G lucidum,
G.luteum Steyaert, G.atrum, G.tsugae, G.applanatum, G.australe, G.capense, G.tropicum, G.tenue, G.sinense Theo hai cuốn sách y học thực vật nổi tiếng của Trung Quốc là Shen
Nong Ben Cao Jing (25 - 220 sau Công Nguyên) và Ben Cao Gang Mil của Li Shi-Zhen (1590 sau Công Nguyên) đã ghi nhận sáu loài nấm linh chi tại Trung Quốc Trên toàn cầu, có hơn 250 loài nấm linh chi được xác định (Moncalvo, 1997; Wasser & Weis, 1997) Tại Việt Nam, khoảng 37 loài linh chi phân bố chủ yếu ở các rừng gỗ lá rộng, đặc biệt là rừng gỗ lim, do đó còn được gọi là nấm lim (Đinh Xuân Linh, 2010) Tỉnh Thừa Thiên Huế có 39 loài thuộc ba chi: Amauroderma, Ganoderma và Haddowia (họ Ganodermataceae) (Ngô Anh, 1999).
Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh, nằm ở khu vực Tây Nguyên, là nơi sinh sống của ít nhất 25 loài nấm thuộc chi Ganoderma Các loài nấm này chủ yếu phát triển dưới tán rừng lá rộng thường xanh, bên cạnh đó cũng xuất hiện ở các sinh cảnh khác như rừng lá rộng bán thường xanh, rừng hỗn giao lá rộng và lá kim, cũng như rừng hỗn giao tre nứa (Nguyễn Phương Đại Nguyên, 2015).
Dựa vào màu sắc nấm linh chi được phân thành 6 loại và công dụng khác nhau trong y học (Hsu H C., 1985):
Bảng 1.2 Phân loại nấm linh chi theo màu sắc
STT Màu sắc Vị Tên tiếng
Nhật Tên tiếng Việt Công dụng
1 Xanh Chua Aoshiba Nấm linh chi xanh
Cải thiện thị lực và chức năng gan, an thần
2 Đỏ a Đắng Akashiba Nấm linh chi đỏ
Ngăn ngừa bệnh AIDS; cải thiện trí nhớ
3 Vàng Ngọt Kishiba Nấm linh chi vàng Tăng cường chức năng lá lách, an thần
4 Trắng Cay hăng Shiroshiba Nấm linh chi trắng Cải thiện chức năng phổi
5 Đen Mặn Kuroshiba Nấm linh chi đen Bảo vệ thận
6 Tím Ngọt Murasakishiba Nấm linh chi tía
Tăng cường chức năng của tai, khớp, cơ bắp; cải thiện làn da a Nấm linh chi đỏ có dược tính mạnh nhất (Hsu, 1985)
1.3.3 Một số loại nấm linh chi Việt Nam
Nhu cầu sử dụng nấm linh chi chữa bệnh tại Việt Nam và xuất khẩu đang gia tăng, nhưng nguồn nấm linh chi tự nhiên ngày càng khan hiếm Theo Quyết định số 439 ngày 16/4/2012 của Thủ tướng Chính phủ, nấm ăn và nấm dược liệu được ưu tiên phát triển đến năm 2020 Nấm linh chi hiện được trồng nhân tạo ở nhiều khu vực trên cả nước, đặc biệt là phía Nam, nơi Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường của Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh cung cấp giống nấm linh chi Các loại nấm linh chi phổ biến bao gồm linh chi đỏ, linh chi Hàn Quốc, linh chi Nhật Bản, hồng chi Đà Lạt, linh chi Việt Nam và linh chi sừng hươu.
Nấm linh chi sừng hươu là một biến thể quý hiếm của nấm linh chi đỏ, chỉ có 1 trong 10.000 cây mới có dạng này Đặc điểm nổi bật của loại nấm này là phần đầu không có tán dù mà co lại và phân nhánh giống như sừng hươu Nghiên cứu cho thấy, khi nấm linh chi đỏ được nuôi trồng trong điều kiện ánh sáng và nồng độ khí CO2, CO, O2 thích hợp, sẽ sản sinh ra nấm có hình dạng đặc biệt này Nấm linh chi sừng hươu được kỳ vọng có hàm lượng flavonoid và phenol cao nhờ vào điều kiện chăm sóc đặc biệt (Sudheer, 2018).
Hình 1.6 Nấm linh chi sừng hươu 1.3.3.2 Linh chi Hàn Quốc
Linh chi Hàn Quốc là loại nấm hóa gỗ có hình dạng quả thể như mũ thận, tròn hoặc dạng quạt, dày và có đường kính từ 3 đến 10 cm Cuống nấm dài, đính lệch, có hình trụ tròn hoặc dẹt, đôi khi phân nhánh Mặt trên của mũ nấm có các vòng đồng tâm và mép lượn sóng, với màu sắc toàn cây nấm thường là nâu đỏ, đỏ vàng hoặc nâu đen.
Hình 1.7 Nấm linh chi đỏ Hàn Quốc 1.3.3.3 Linh chi Nhật Bản
Hình 1.8 Nấm linh chi Nhật Bản
Linh chi Nhật Bản có đường kính từ 7 – 9cm, nặng khoảng 30g, gấp đôi linh chi Việt Nam Bề mặt nấm tương tự như hồng chi Đà Lạt nhưng tròn hơn, với lớp phấn mỏng trên mặt và vỏ màu đỏ sậm Mặt dưới của nấm có màu vàng chanh nhạt, và cuống nấm rất ngắn, gần như không có.
Hình 1.9 Linh chi Việt Nam
Linh chi Việt Nam có đường kính từ 8 đến 11cm và chiều cao khoảng 6cm tính từ cuống đến chóp Nấm nhẹ, chỉ nặng khoảng 15g, với tai nấm hình quạt màu nâu, bề mặt đỏ sậm và phía dưới màu trắng đục.
Nấm linh chi Nhật Bản và Hàn Quốc nặng hơn so với linh chi Việt Nam dù kích thước nhỏ và cứng hơn
Hình 1.10 Hồng chi Đà lạt
Nấm linh chi đỏ Đà Lạt, hay còn gọi là hồng chi, có đường kính tai nấm từ 7 đến 11cm và trọng lượng khoảng 10g mỗi quả thể Chân nấm dài từ 5 đến 9cm, với bề mặt trên tai nấm mang màu nâu đỏ đặc trưng và phủ lớp phấn bào tử Đặc điểm nhận dạng của nấm là quả thể tròn, hơi dẹp, màu nâu trên bề mặt, chân nấm màu đỏ sậm bóng, và mặt dưới có màu vàng chanh.
Về thành phần hóa học, cơ thể đậu quả, sợi nấm và bào tử của G.lucidum chứa khoảng
The article discusses 400 different bioactive compounds, primarily including triterpenoids, polysaccharides, nucleotides, phenols, terpenoids, tannins, saponins, sterols, steroids, fatty acids, proteins/peptides, and trace elements, as referenced in various studies (McKenna, 2002; Gao Y Z., 2002; Kim H W., 1999; Smith, Rowan).
Định hướng nghiên cứu
Melanin hình thành trên da là nguyên nhân chính gây ra tàn nhang, nám da và sạm da, tuy không gây hại nhưng lại ảnh hưởng đến thẩm mỹ và tạo cảm giác tự ti cho phụ nữ Hiện nay, việc sử dụng các chất chống oxy hóa tự nhiên từ rau gia vị và thảo mộc để ngăn chặn quá trình hình thành melanin đang được chú trọng, nhờ vào tính an toàn và lành tính của chúng.
Nghiên cứu chỉ ra rằng nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) chứa các hợp chất có khả năng ức chế sự hình thành melanin trên da (Kim J., 2016) Bên cạnh đó, khả năng kháng oxy hóa và ức chế melanin của nấm dược liệu, đặc biệt là nấm linh chi, đang được khám phá rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.
Nấm Linh chi được đánh giá có hàm lượng chống oxy hóa cao hơn cả nhân sâm từ
Nhân sâm có khả năng ức chế enzyme tyrosinase, giúp ngăn chặn sự hình thành sắc tố melanin trên da với IC50 = 150 àg/mL (Nguyễn Hữu Đống Đ X., 2003; Shimofuruya H, 2003) Nấm linh chi, một sản phẩm cao cấp và dược liệu quý, đã được trồng phổ biến ở Việt Nam, sở hữu hàm lượng phenolic và hoạt tính sinh học cao, cho thấy tiềm năng ứng dụng lớn trong ngành mỹ phẩm.
Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các loại cao trích từ nấm linh chi, đồng thời kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng ngăn chặn sự hình thành melanin trên da.
- Tổng quan về tế bào da, nguyên liệu nghiên cứu, enzyme tyrosinase
- Điều chế cao trích nấm linh chi bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi EtOH
- Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa, khả năng ức chế enzyme tyrosinase
- Lựa chọn mẫu cao có tiềm năng ức chế enzyme tyrosinase để thử nghiệm trên tế bào
- Xử lý số liệu, đánh giá kết quả đạt được từ đó đưa ra đề xuất áp dụng mẫu cao trong lĩnh vực mỹ phẩm
NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
Nấm linh chi khô được cung cấp bởi Phòng Nấm ăn và Dược liệu, thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông lâm Tp Hồ Chí Minh (Quận Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh) Sản phẩm được bảo quản trong túi zip có gói hút ẩm, đảm bảo chất lượng và độ tươi ngon.
- Ethanol (EtOH) 99.5 0 (Chemsol, Việt Nam)
- Ethanol (EtOH) 96 0 (Chemsol, Việt Nam)
- 1,1 – diphenyl – 2 – picryhydraxyl (DPPH) (Merk, Germany)
- Potassium ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) (Merk, Germany)
- Đệm phosphate (KH2SO4 – K2HSO4) (Xilong, China)
- Tricholoroacetic acid (TCA) (Xilong, China)
- Ferric chloride (FeCl3) (Merk, Germany)
- Thuốc thử Folin – Ciocalteu (Merk, Germany)
- Sodium carbonate (Na2CO3) (Xilong,China)
- Gallic acid (GA) (Merk, Germany)
- Hệ thống cô quay chân không (Yamamoto, Nhật Bản)
- Máy đo độ hấp thụ quang UV – Vis (Dynamica, Thụy sĩ)
- Máy đo pH (Metteler Toledo, Hoa Kỳ)
- Máy ly tâm (Hermle, Đức)
- Máy đồng hóa (Ika, Đức)
- Các dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm
Nội dung nghiên cứu
Nấm linh chi khô bao gồm năm loại chính: linh chi Việt Nam, linh chi Hàn Quốc, linh chi Nhật Bản, hồng chi Đà Lạt và sừng hươu Sau khi thu mua, các loại nấm này được xay thành bột và bảo quản trong các điều kiện thích hợp để giữ nguyên giá trị dinh dưỡng và hiệu quả sử dụng.
Hình 1.13 Sơ đồ nghiên cứu
Nấm linh chi khô Điều chế cao trích
Khảo sát khả năng chống oxi hóa
Lựa chọn mẫu có hoạt tính cao nhất
- Khả năng ức chế Tyrosinase nội bào
- Thử độc tính đối với tế bào
- Khả năng ức chế melanin trên tế bào
Thử nghiệm trên tế bào
Khảo sát khả năng ức chế tyrosinase
Phân tích thành phần hóa học
Bột nấm linh chi được chiết xuất bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi EtOH 96% trong các bình thủy tinh tối màu, và dịch ngâm được thu thập sau ba lần lọc Sau khi cô quay, sản phẩm được sấy khô ở nhiệt độ 45 - 50℃ đến khi đạt khối lượng không đổi Cuối cùng, cao trích được bảo quản trong các lọ thủy tinh tối màu, tránh ánh sáng và được lưu trữ ở nhiệt độ lạnh để đảm bảo chất lượng.
Nghiên cứu sẽ thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của 5 mẫu cao được chiết xuất từ 5 loại nấm linh chi khác nhau Các phương pháp được áp dụng bao gồm xác định tổng hàm lượng polyphenol, kiểm tra khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH và đánh giá năng lực khử.
Fe 3+ được sử dụng để thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase Mục tiêu là lựa chọn một mẫu cao có khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase tốt nhất để tiến hành thử nghiệm trên tế bào.
Mẫu cao đã được chọn lọc sẽ được phân tích bằng phương pháp HPLC và tiến hành thử nghiệm trên tế bào Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm khả năng ức chế enzyme tyrosinase nội bào, khả năng ức chế melanin, và độc tính của mẫu cao đối với tế bào.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1 Sơ đồ điều chế cao trích
Hình 2.1 Sơ đồ điều chế cao trích
Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường thuộc trường Đại học Nông Lâm đã thu hoạch nấm linh chi tươi từ ngày 13 đến 16 tháng 1 năm 2020 Sau khi cắt rễ, nấm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 58℃ Sau quá trình sấy, nấm được đóng gói trong túi zip với độ ẩm dưới 13% để bảo quản Cuối cùng, nấm thành phẩm được xay thành bột và chế biến thành cao trích bằng phương pháp ngâm dầm.
Cao trích từ 6 loại nấm linh chi được thực hiện bằng cách sử dụng 100g bột nấm linh chi, kết hợp với dung môi EtOH 96% theo tỷ lệ 1/5 Quá trình chiết xuất bao gồm việc thay dung môi sau mỗi 24 giờ và lọc dịch bằng giấy lọc cho đến khi thu được dịch lọc trong suốt, thường mất khoảng 3 ngày.
Trích ly ngâm dầm với EtOH
Sau khi thực hiện quá trình lọc dịch lần thứ tư, cô tiến hành quay ở nhiệt độ 50℃ với tốc độ 110 vòng/phút trong khoảng 20 – 30 phút Cao trích thu được sẽ được cho vào hũ thủy tinh nhỏ 10ml tối màu và sấy khô ở nhiệt độ 45 - 50℃ Sau đó, mẫu cao trích sẽ được cân lại bằng cân phân tích để tính toán hiệu suất thu hồi và được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4℃.
Công thức tính hiệu suất thu hồi của cao trích trên g mẫu như sau:
Bảng 2.1 Phân loại các mẫu cao trích
STT Ký hiệu Tên mẫu
1 E-VN Linh chi Việt Nam
2 E-HQ Linh chi Hàn Quốc
3 E-NB Linh chi Nhật Bản
4 E-HC Linh chi hồng chi
Nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp Hồ Chí Minh đã tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của 5 mẫu E-SH Linh chi sừng hươu.
2.3.2.1 Định lượng hàm lượng tổng polyphenol
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp so màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu (Tiêu chuẩn quốc gia, TCVN 9745:2013, ISO 14502:2005) để định lượng hàm lượng tổng polyphenol
Polyphenol được chiết xuất từ cao trích đã được nghiền mịn hoặc ở dạng cao với một lượng nhỏ dung môi, sử dụng methanol 70% ở nhiệt độ 70℃ Để xác định các polyphenol trong dịch chiết, phương pháp đo màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu trong môi trường kiềm được áp dụng Thuốc thử này chứa axit phospho – vonframic, trong quá trình khử nhóm hydroxyl phenol, phản ứng sinh ra màu xanh với độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 760 nm Sự hình thành màu xanh này là do sự tương tác của vonfram và molypden.
- Mẫu Blank thiết bị: Lấy 10ml nước cất chuyển vào ống nghiệm
- Mẫu Blank quy trình: Lấy 10ml MeOH:H2O (7:3) vào ống nghiệm Sau đó tiến hành pha loãng theo hệ số F
Quy trình dựng đường chuẩn Acid galic
Lấy 1,3ml axit gallic với các nồng độ 1, 2,5, 10 và 20, cùng với mẫu blank, cho vào các ống hach Tiếp theo, thêm 1ml Folin 20% vào các ống hach chứa axit gallic ở các nồng độ tương ứng.
29 độ khác nhau Lắc đều và để yên 3 – 8 phút ở nhiệt độ phòng Tiếp theo thêm 700μl Na2CO3
Để thực hiện thí nghiệm, hãy cho 10% mẫu vào các ống hạch và giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó, đo mật độ quang trong cuvet thủy tinh có chiều dài đường quang 10mm bằng máy đo quang phổ UH5300 UV/Vis tại bước sóng 760nm.
Quy trình định lượng tổng hàm lượng polyphenol
Hình 2.2 Sơ đồ định lượng tổng hàm lượng polyphenol
Pha loãng theo hệ số F Nước cất
Lấy 1,3ml mẫu Lắc đều Để yên 3 – 8 phút Để yên nhiệt độ phồng 30 phút Đo mật độ quang 760nm
Đầu tiên, cân chính xác 0,200g mẫu cao trích cho vào ống thủy tinh và pha với 10ml hỗn hợp dịch chiết MeOH:H2O (7:3) ở 70℃ Sau đó, đậy nắp và trộn trên máy vortex Tiếp theo, đun nóng ống hach trong bể điều nhiệt ở 70℃ trong 10 phút, đồng thời vortex các ống chiết sau mỗi 5 phút (2 lần) Cuối cùng, tiến hành ly tâm với vận tốc 3500r/min trong 10 phút và gạn dịch trong Nếu dịch không trong, lọc qua nylon 2μm.
Cho 0,5ml dung dịch đã chiết vào bình định mức 10ml và pha loãng bằng nước cất đến vạch, sau đó lắc đều Tiến hành kiểm tra mật độ quang để so sánh với đường chuẩn gallic acid; nếu không nằm trong khoảng chuẩn, cần pha loãng với hệ số F thích hợp Tiếp theo, lấy 1,3ml mẫu dịch chiết đã pha loãng theo hệ số F, mẫu blank thiết bị và mẫu blank quy trình vào các ống hach Thêm 1ml Folin 20% vào các ống hach chứa mẫu, lắc đều và để yên 3 – 8 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm 700μl.
Cho Na2CO3 10% vào các ống hach và để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó, đo mật độ quang trong cuvet thủy tinh có chiều dài đường quang 10mm bằng máy đo quang phổ UH5300 UV/Vis ở bước sóng 760nm Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp Hồ Chí Minh.
2.3.2.2 Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Phương pháp ức chế gốc tự do bằng DPPH (1,1 – diphenyl – 2 – picryhydraxyl) dựa vào phản ứng khử giữa DPPH và polyphenol, trong đó electron trên nguyên tử N của DPPH được khử khi nhận một nguyên tử hydro từ chất chống oxy hóa, tạo thành hydrazine Sau phản ứng, màu dung dịch chuyển từ tím sang vàng nhạt, đồng thời độ hấp thu ở bước sóng xác định giảm Giá trị mật độ quang OD thấp cho thấy khả năng bắt gốc tự do DPPH cao hơn.
Quy trình xác định chất đối chứng dương với gallic acid
Sử dụng axit gallic với nồng độ 100 mg/L, pha loãng với các nồng độ 1; 2,5; 5; 10 trong EtOH và DPPH Để hỗn hợp này nghỉ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và trong bóng tối Cuối cùng, tiến hành đo độ hấp thụ tại bước sóng 519 nm.
Quy trình đo các mẫu cao trích
Hình 2.3 Sơ đồ đo các mẫu cao trích Thuyết minh quy trình
Cân chính xác 0,003g mẫu cao trích vào ống chiết thủy tinh và thêm 6ml dịch chiết ethanol, sau đó lắc đều để tạo dung dịch mẫu có nồng độ 500μg/ml Tiến hành pha loãng với các nồng độ 10, 25, 50, 100μg/ml bằng EtOH và DPPH, mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần Nếu hoạt tính của mẫu thử mạnh, thử nghiệm sẽ tiếp tục với các nồng độ thấp hơn như 10, 5, 2, 1μg/ml, với nồng độ cuối cùng là 50μg/ml Sau khi để yên trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phòng, đo mật độ quang tại bước sóng 519nm.
0,003g cao trích Đậy nắp, lắc đều
Pha loãng theo các nồng độ
EtOH 95% DPPH Để yên trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 519nm
AC - Gía trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control)
AS - Gía trị mật độ quang của dung dịch có mẫu cao (sample)
Mẫu control: Ta thay V1 (àl) bằng V2 (àl) EtOH
Mẫu blank: Được chuẩn bị tương tự mẫu sample nhưng ta thay VDPPH bằng VEtOH
IC50 là chỉ số quan trọng để đánh giá mức độ ức chế của các mẫu cao đối với gốc tự do hoặc enzyme, được định nghĩa là nồng độ cần thiết để ức chế 50% hoạt động của chúng Giá trị IC50 càng thấp cho thấy mẫu có hoạt tính ức chế càng cao.
Tiến hành khảo sỏt hoạt tớnh của mẫu ở 4 nồng độ 100; 50; 25; 10àg/mL
Đối với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính theo nồng độ, chúng ta có thể vẽ một đường thẳng biểu diễn mối quan hệ giữa % ức chế (y) và nồng độ (x) dưới dạng 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏.
Nghiên cứu khả năng ức chế melannin và tyrosinase nội bào
2.4.1 Thử độc tính tế bào
Thử nghiệm MTT là một phương pháp hiệu quả để kiểm tra khả năng sống sót của tế bào, dựa trên sự chuyển đổi MTT (3-(4,5 dimethyl thiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) thành tinh thể formazan nhờ vào hoạt động của enzyme dehydrogenase trong ty thể (Riss, 2016).
Hình 2.7 Sự chuyển đổi MTT thành tinh thể formazan
Hình 2.8 Quy trình thử độc tính tế bào
Hòa tan formazan DMSO Đo mật độ quang ở 550nm Ủ lần 1 Ủ lần 2
Chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau
Tế bào hắc sắc tố ung thư B16 được cung cấp từ phòng thí nghiệm sinh học phân tử và môi trường, Đại học Khoa học tự nhiên Tp.Hồ Chí Minh, được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) với 10% huyết thanh thai bò và 1% kháng sinh Streptomycin/Penicilin, ở điều kiện 37ºC và 5% CO2 Cấy truyền tế bào được thực hiện khi độ che phủ bề mặt flask đạt trên 80%, và mật độ tế bào được xác định bằng buồng đếm hồng cầu để tính toán số lượng tế bào cần thiết cho thí nghiệm.
Sau khi tế bào được nuôi cấy, tế bào B16 được nuôi trong đĩa 96 giếng với mật độ
Mỗi giếng được chuẩn bị với 10^4 tế bào ở điều kiện 37ºC và 5% CO2 Cao trích được pha loãng với Dimethyl sulfoxide (DMSO) và sau đó được đưa vào môi trường DMEM mới để đạt nồng độ từ 10 àg/ml đến 120 àg/ml, trong đó môi trường không có tế bào được sử dụng làm blank và môi trường chứa 1 àl/ml DMSO làm đối chứng Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Sau khi hút bỏ môi trường cũ, các mẫu thử sẽ được bổ sung vào mỗi giếng và ủ ở điều kiện 37ºC, 5% CO2.
48 giờ Sau 48 giờ, bổ sung 10àl thuốc thử MTT vào mỗi giếng và tiếp tục ủ ở 37ºC, 5%
Sau 3 giờ loại bỏ môi trường, rửa lại bằng PBS và thêm 100µl DMSO vào mỗi giếng, lắc đều trong 10 phút Cuối cùng, tiến hành đo quang tại bước sóng 550nm để đánh giá kết quả.
Phần trăm tế bào sống sót được tính theo công thức sau:
As: Giá trị đo quang của mẫu thử
Giá trị đo quang của mẫu control (mẫu không có mẫu thử) được thực hiện tại Phòng thí nghiệm sinh học phân tử và môi trường, trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp Hồ Chí Minh.
2.4.2 Đánh giá tyrosinase nội bào và melanin nội bào
Sử dụng IBMX có thể kích thích quá trình sinh tổng hợp melanin thông qua con đường tín hiệu phụ thuộc cAMP, con đường chủ yếu điều hòa hình thành sắc tố ở tế bào melanocyte Hàm lượng melanin nội bào được xác định tại bước sóng 450nm, trong khi hoạt tính enzyme tyrosinase nội bào được đánh giá qua phản ứng với cơ chất L-DOPA (Lin, 2011).
Chuẩn bị ở các nồng độ khác nhau
DMSO Đo mật độ quang ở 450nm Ủ lần 1 Ủ lần 2 Đệm Na- phosphate
L-DOPA Đo mật độ quang ở 492nm
Hình 2.9 Sơ đồ đánh giá tyrosinase nội bào và melanin nội bào
Tế bào B16 được nuôi trong đĩa 6 giếng với mật độ 2x10^5 tế bào/giếng trong 2ml môi trường DMEM ở điều kiện 37ºC, 5% CO2 trong 24 giờ Cao trích được pha với DMSO và hòa với môi trường DMEM để đạt các nồng độ 10µg/ml, 20µg/ml, 40µg/ml, với đối chứng âm là môi trường chứa 2µl/ml DMSO và đối chứng dương là Arbutin 2mM IBMX được thêm vào mỗi giếng (trừ đối chứng) với nồng độ 100µM, và mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Sau khi hút bỏ môi trường cũ, các mẫu thử được bổ sung vào mỗi giếng và ủ ở 37ºC trong 48 giờ Sau 48 giờ, tiến hành ly tâm ở 13000rpm trong 20 phút ở 4ºC để thu tủa, từ đó đo hàm lượng melanin nội bào và phần dịch nổi để đánh giá tyrosinase nội bào.
Sau khi thu tủa vào các ống nghiệm, bổ sung 10% DMSO và NaOH 1N, mẫu được gia nhiệt ở 80°C cho đến khi melanin hòa tan hoàn toàn, sau đó đo mật độ quang ở 450nm Để đánh giá tyrosinase nội bào, lấy 70µl tyrosinase vào ống nghiệm, ủ 5 phút ở 37ºC, rồi thêm 150µl đệm Na-phosphate 20mM và 150µl L-DOPA 10mM, ủ trong 10 phút và đo mật độ quang tại 492nm Đồng thời, thực hiện mẫu blank không có L-DOPA bằng cách thay 150µl L-DOPA bằng 150µl đệm Na-phosphate 20mM Địa điểm thực hiện thí nghiệm là Phòng thí nghiệm sinh học và môi trường, trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp Hồ Chí Minh.
2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu
Data analysis, including the calculation of mean, standard deviation, and error, can be efficiently performed using Excel 2016 (Microsoft Inc, Redmond, California, USA) Additionally, statistical processing through ANOVA is conducted using SPSS software (SPSS 20 for Windows, SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
