Nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính trên cơ sở graphen ứng dụng trong phân tích ure và axít uric

TỔNG QUAN

Axit uric và ure

UA là một hợp chất hữu cơ dị vòng ngưng tụ chứa các dị tố nitơ, ôxi với công thức C5H4N4O3

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của UA Tên gọi hóa học: 7,9-dihydro-1H-purin-2,6,8(3H)-trion

UA là một axit yếu với hệ số phân li (pKa) =5,75-10,3 Trong huyết tương với pH= 7,4 thì 98% lượng UA tồn tại dưới dạng muối kiềm : monosodium Urat

UA được hình thành trong cơ thể thông qua quá trình dị hóa các base purin như adenin và guanidin Sau khi được sản xuất, UA sẽ hòa tan vào máu, được vận chuyển đến thận và cuối cùng được thải ra ngoài qua nước tiểu Trong cơ thể, UA có hai nguồn chính để tạo ra.

Ngoại sinh: từ thức ăn đưa vào cơ thể có chứa chất purin với hàm lượng từ

Nội sinh uric acid (UA) được sản xuất từ các tế bào chết trong cơ thể, với lượng khoảng 600 mg mỗi ngày pH của nước tiểu có ảnh hưởng lớn đến sự hòa tan của UA; thông thường, lượng UA thải qua nước tiểu là trên 800 mg mỗi ngày Khi pH nước tiểu cao, quá trình thải UA diễn ra thuận lợi hơn, trong khi pH thấp sẽ gây khó khăn cho việc đào thải UA.

- pH 5,0: UA bão hòa với nồng độ từ 390-900 μmol/L

- pH 7,0: UA bão hòa với nồng độ từ 9480-12000 μmol/L

1.1.1.2 Vai trò của UA trong cơ thể

UA được hấp thụ từ chế độ ăn uống qua ruột và phần lớn sẽ được thải ra qua thận, mặc dù một lượng đáng kể cũng được tái hấp thu tại cơ quan này UA xuất hiện trong các tế bào, mô và cơ quan với hàm lượng khác nhau.

Hình 1.2: Sơ đồ chuyển hóa UA trong cơ thể người [28]

Khi nồng độ axit uric (UA) trong huyết tương tăng cao, sẽ xảy ra lắng đọng natri urat tại các khớp, dẫn đến tổn thương nhiều cơ quan như mạch máu, tim, mắt và não Sự lắng đọng này gây ra các cơn gút cấp do viêm khớp tái phát và có thể là nguyên nhân của nhiều bệnh lý khác Các nghiên cứu của Frederick Mahomed, Alexandre Haig và Nathan Smith Davis đã chỉ ra rằng tăng UA có liên quan đến tăng huyết áp và bệnh thận Nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận mối tương quan giữa hàm lượng UA và các bệnh tim mạch như tăng huyết áp, hội chứng chuyển hóa, bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não và tiền sản giật Nếu UA lắng đọng ở tim, có thể gây viêm mạch máu và viêm màng ngoài tim; lắng đọng ở vùng đầu có thể dẫn đến viêm kết mạc và viêm màng não Ngược lại, nồng độ UA quá thấp có thể gây ra các bệnh như đa xơ cứng, Parkinson, Alzheimer và viêm thần kinh thị giác.

Nồng độ urat huyết thanh cao có thể do nhiều yếu tố, bao gồm nguyên nhân cấp tính như uống rượu, hội chứng ly giải khối u do hóa trị, và chế độ ăn giàu purin hoặc protein Bên cạnh đó, tăng urat máu mạn tính thường liên quan đến các tình trạng làm giảm mức lọc cầu thận và giảm bài tiết.

1.1.1.3 Các phương pháp phân tích UA

Các phương pháp phổ biến để xác định nồng độ axit uric (UA) bao gồm quá trình oxy hóa enzym để tạo ra hydro peroxit, allantoin và carbon dioxide, cũng như các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phát hiện bằng UV kết hợp khối phổ Những phương pháp này yêu cầu nhiều bước như chuẩn bị huyết thanh và tuân thủ các yêu cầu quang phổ để xác định sản phẩm, hoặc sử dụng kỹ thuật ghép enzym để đo gián tiếp nồng độ H2O2 Tuy nhiên, các phương pháp này thường phức tạp, cần thiết bị đắt tiền và yêu cầu kỹ năng chuyên môn cao từ người thực hiện Dưới đây là tổng quan về ưu điểm và hạn chế của từng phương pháp.

* Phương pháp xác định UA sử dụng enzym Uox

Tác giả San V [38] đã nghiên cứu phản ứng ghép oxy hóa giữa thuốc thử NCP và thuốc thử TOOS, trong một hệ thống bao gồm ba enzym: Uox, peroxidaza và ascorbat oxyaza.

Nồng độ của phức được hình thành bởi sự liên kết oxy hóa của thuốc thử NCP và TOOS tỷ lệ thuận với nồng độ UA

Phương pháp này cho phép xác định nồng độ axit uric (UA) tối đa lên đến 1,428 mmol/L Nghiên cứu chỉ ra rằng thuốc thử NCP có độ nhạy cao hơn khi xác định UA so với 4-AA Độ nhạy của phương pháp này đạt 0,71 đơn vị độ hấp thụ trên mỗi mmol/L UA, với giới hạn phát hiện (LOD) là 0,0035 mmol/L và giới hạn định lượng (LOQ) là 0,015 mmol/L UA.

Một số phương pháp cố định enzym UOx đã được phát triển dựa trên cảm biến sinh học và quang phổ để xác định axit uric (UA) Nghiên cứu cho thấy phương pháp quang phổ đơn giản có thể phát hiện UA trong nước tiểu bình thường và mẫu nước tiểu của bệnh nhân gút, thông qua phản ứng của hydro peroxide với muối 4-Aminodiphenylamin Diazonium Sulfat (variamin blue) tạo ra dung dịch màu vàng lục nhạt Độ hấp thụ của sản phẩm phản ứng được đo bằng máy quang phổ UV với bước sóng tối đa 269 nm, thời gian đáp ứng là 20 phút Hoạt tính pH tối ưu cho phản ứng là pH 9, với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) chỉ 0,7% Biểu đồ hiệu chuẩn cho thấy nồng độ UA trong khoảng 0,5-13 mM, với giới hạn phát hiện là 0,58 mM.

Galban và cộng sự đã phát triển một phương pháp xác định axit uric (UA) trong huyết thanh thông qua phản ứng với enzyme UOx Quy trình này dựa trên sự thay đổi huỳnh quang trong phản ứng enzym của UOx với UA, khi dung dịch được kích thích ở bước sóng 287 nm và phát xạ được đo ở bước sóng 330 nm Kết quả cho thấy dải nồng độ làm việc từ 3.10 −5 đến 6.10 −4 M, với độ tái lập đạt 4% khi n = 7.

* Xác định axit uric bằng phương pháp HPLC

Kovarik và các đồng nghiệp đã thực hiện các phép đo HPLC trên 300 mẫu huyết thanh, so sánh với phương pháp enzym Các mẫu huyết thanh được khử protein bằng axit perchloric và phân tích bằng HPLC sử dụng cột pha đảo MAG 1; 4.6 x 150 mm, Biospher PSI 200 C18, 5µm, với pha động gồm 5% metanol.

Nghiên cứu cho thấy 25 mmol/L natri dihydrogenphosphat pH 4,75 mang lại kết quả xét nghiệm với độ sai khác dưới 5% Độ thu hồi đạt từ 90,0-103,4%, với giới hạn định lượng là 10,0 μmol/L (3,3 pmol/lần tiêm) Phương pháp sắc ký cho kết quả tương đối tốt so với phương pháp enzym, tuy nhiên giá trị trung bình thu được cao hơn.

Hai Fang Li và các đồng nghiệp đã áp dụng phương pháp HPLC pha đảo (RP-HPLC) với detector cực tím (UV) để xác định đồng thời Creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin trong nước tiểu Các mẫu nước tiểu được xử lý qua các bước pha loãng, ly tâm và lọc, sau đó được phân tách bằng cột ODS-BP và rửa giải bằng dung dịch đệm metanol/50 mM NaH2PO4 ở pH 5,26 (5:95) Độ tuyến tính của các diện tích peak cực đại và nồng độ dung dịch tiêu chuẩn cho Creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin đạt hệ số tương quan từ 0,9957 đến 0,9993 Phương pháp phân tích cho kết quả lặp lại tốt với các giá trị cho UA, hypoxanthin và xanthin lần lượt là 93,49%; 97,90% và 95,38% Giới hạn phát hiện (LOD, S/N≥3) đối với các hợp chất này lần lượt là 0,010; 0,025; 0,050 và 0,025 mg.

* Xác định axit uric bằng phương pháp điện hóa

Các kỹ thuật điện hóa, đặc biệt là máy đo đường huyết, đã trở thành công cụ phổ biến trong việc xác định nhiều chất, đặc biệt ở bệnh nhân tiểu đường Phương pháp phân tích điện hóa nổi bật với thời gian phân tích nhanh hơn so với các phương pháp quang phổ Cảm biến điện hóa thu hút sự quan tâm lớn từ các nhà nghiên cứu nhờ vào quy trình thí nghiệm đơn giản, khả năng áp dụng cho nhiều mẫu sinh học, chi phí thiết bị thấp, cùng với độ chọn lọc và độ nhạy cao Đặc biệt, do UA dễ bị oxy hóa tại các điện cực thông thường trong dung dịch nước, dẫn đến sản phẩm allantoin, nên phương pháp điện hóa trở thành lựa chọn ưu tiên.

UA và AA thường xuất hiện đồng thời trong các chất lỏng sinh học như máu và nước tiểu, gây khó khăn trong việc tách biệt chúng do pic oxy hóa gần nhau, dẫn đến độ chọn lọc kém Để xác định chính xác UA khi có mặt AA, cần phát triển phương pháp chọn lọc nhằm hạn chế ảnh hưởng sai sót từ AA Việc xác định chọn lọc UA và AA đã thu hút sự quan tâm lớn từ các nhà nghiên cứu điện hóa Nồng độ UA và AA trong mẫu sinh học thay đổi tùy theo tình trạng sức khỏe, dao động từ 10^-7 đến 10^-3 mol/L Để giảm thiểu ảnh hưởng của AA, xu hướng hiện nay là sử dụng các điện cực biến đổi polyme (PMEs) và các điện cực biến đổi hóa học (CME) để phát hiện chọn lọc.

Cảm biến sinh học

1.2.1 Cấu tạo cảm biến sinh học

Cảm biến sinh học là thiết bị kết hợp các thành phần sinh học với bộ chuyển đổi tín hiệu để phát hiện và phân tích các yếu tố hóa sinh Thiết bị này bao gồm bốn bộ phận chính: đầu thu sinh học để phát hiện tác nhân sinh học, tác nhân cố định gắn kết đầu thu lên điện cực, bộ phận chuyển đổi tín hiệu biến đổi sinh học thành tín hiệu đo được, và bộ phận xử lý hiển thị tín hiệu cho máy tính Cảm biến sinh học có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như sinh học, dược phẩm, nông nghiệp, vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo vệ môi trường và an toàn trong công nghiệp.

Hình 1.5: Cấu tạo và các thành phần của cảm biến sinh học [105]

- Tác nhân cần phát hiện [106]

Các tác nhân cần phát hiện được phân loại theo cấu tạo gồm: a) Các vi khuẩn như E coli, Candida và vi khuẩn bệnh than, thường được phát hiện bởi các cảm biến sinh học; b) Các phân tử nhỏ như CO, CO2, gluco, rượu, ure, thuốc trừ sâu, amino axit, paracetamol, aspirin, penicilin, TNT và các tác nhân thần kinh khác; c) Các phân tử sinh học có kích thước lớn như ADN, RNA, protein, enzym và hormone.

Nhiều cảm biến sinh học được phát triển với các kết hợp cụ thể cho từng ứng dụng Đầu thu sinh học (Biological Receptor) phản ứng trực tiếp với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học Các loại đầu thu được phân loại dựa trên các tác nhân sinh học sử dụng.

Đầu thu sinh học được sản xuất từ enzym, như ureaza và glucô, là loại đầu thu phổ biến nhất hiện nay.

Đầu thu được chế tạo từ các kháng thể hoặc kháng nguyên có đặc điểm nổi bật là tính chọn lọc cao và khả năng tạo liên kết mạnh mẽ.

Các đầu thu sinh học làm từ protein, như cảm biến phát hiện hormone và xác định các chất kích thích thần kinh, nổi bật với tính chọn lọc cao Tuy nhiên, nhược điểm lớn của chúng là khó khăn trong việc cách ly.

Đầu thu sinh học được làm từ các axit nucleic như ADN và ARN, thường được sử dụng để phát hiện đột biến và sai lệch trong cấu trúc di truyền Các cảm biến này đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích và nghiên cứu gen.

Hình 1.6: Một số phần tử sinh học được sử dụng làm đầu thu sinh học

Đầu thu kết hợp là công nghệ sử dụng đồng thời nhiều phân tử như enzym, kháng thể, và protein trên một đế, giúp mở rộng khả năng hoạt động của các cảm biến sinh học Một số ứng dụng nổi bật của loại cảm biến này bao gồm cảm biến xác định thuốc nổ TNT, cảm biến phát hiện vi khuẩn bệnh than và cảm biến thử thai.

Đầu thu sinh học có thể được chế tạo từ tế bào, không chỉ từ các phân tử hay nguyên tử Một số tế bào vi khuẩn biến đổi gen đã được ứng dụng để tạo ra đầu thu sinh học Khi tiếp xúc với các phân tử chất độc, những tế bào này sẽ phát sáng, giúp chúng ta phát hiện sự hiện diện của các chất độc hại.

Tác nhân cố định đóng vai trò quan trọng trong cảm biến sinh học, chịu trách nhiệm gắn kết các đầu thu sinh học lên đế Chúng hoạt động như một bộ phận trung gian liên kết các thành phần sinh học từ cơ thể sống với các thành phần vô cơ Việc lựa chọn tác nhân cố định phù hợp là rất quan trọng, vì chúng cần đảm bảo gắn kết và cố định về mặt cơ học, đồng thời duy trì liên kết tín hiệu giữa phần sinh học và phần chuyển đổi Phương pháp vật lý và gắn kết hóa học để bắt giữ thành phần sinh học được minh họa trong hình 1.7.

Hình 1.7: Các dạng bắt giữ đầu thu sinh học bằng phương pháp vật lý và gắn kết hoá học

Bộ phận chuyển đổi là thành phần thiết yếu trong cảm biến sinh học, với nhiều phương pháp chuyển đổi khác nhau như chuyển đổi điện hoá, quang học, nhiệt, tinh thể áp điện và vi cơ.

- Chuyển đổi điện hoá bao gồm chuyển đổi dựa trên điện thế (potentiometric), dòng điện (amperometric) và độ dẫn (conductometric)

Chuyển đổi quang là quá trình hoạt động dựa trên các hiệu ứng như hấp thụ ánh sáng nhìn thấy và tia UV, phát xạ huỳnh quang và lân quang, cũng như các hiện tượng luminisxen sinh học và hóa học.

Hình 1.8: Cảm biến sinh học trên cơ sở bộ chuyển đổi quang

(http://www/bsse.ethz.ch)

Chuyển đổi nhiệt hoạt động dựa trên sự thay đổi entanpi khi hình thành hoặc phá vỡ các liên kết hóa học trong phản ứng enzym Bộ chuyển đổi này có khả năng hoạt động hiệu quả với tất cả các loại phản ứng, nhưng lại có tính chọn lọc thấp.

Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoạt động dựa trên nguyên lý rằng tần số dao động của tinh thể sẽ thay đổi khi lực tác động lên nó thay đổi Sự thay đổi này tuân theo phương trình Sauerbrey.

Tần số dao động của tinh thể áp điện (f) phụ thuộc vào sự thay đổi khối lượng (Δm) đặt lên nó, trong khi A là hằng số đặc trưng cho tinh thể áp điện.

Nghiên cứu trong nước về cảm biến điện hóa và sinh học

Phát triển nghiên cứu công nghệ nano là một hướng đi đúng đắn, kết hợp giữa xu hướng nghiên cứu công nghệ nano toàn cầu và nhu cầu giải quyết các vấn đề của Việt Nam Công nghệ nano có nhiều ứng dụng đa dạng trong các lĩnh vực như điện tử, bán dẫn, năng lượng mới, y dược, y sinh, môi trường, cơ khí và tự động hóa Trước đây, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào lý thuyết cơ bản, dẫn đến các phương pháp chế tạo phức tạp, yêu cầu thiết bị đắt tiền và quá trình xử lý nhiệt độ cao để đạt được cấu trúc vật liệu mong muốn, như phún xạ, nguội nhanh và gốm.

Hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu mới và đạt được những thành tựu đáng kể

Sử dụng hạt nano không qua xử lý trung gian là ứng dụng đơn giản nhất của vật liệu nano, đặc biệt là hạt nano từ tính ô xít sắt có khả năng hấp phụ ion kim loại nặng như As Kết hợp hạt nano với phèn chua mang lại giải pháp làm sạch nước hiệu quả và dễ triển khai Hạt nano bạc có khả năng diệt khuẩn cao, có thể được sử dụng để tẩm lên than hoạt tính, tạo ra khẩu trang phòng chống bệnh hô hấp Hạt nano vàng cũng có tính diệt khuẩn, khi pha chế với rượu tạo ra sản phẩm nano vàng có chức năng phòng độc tốt Trong ứng dụng sinh học, hạt nano cần được chức năng hóa bề mặt để liên kết với các đối tượng sinh học như DNA, kháng thể, enzyme, thường sử dụng các nhóm chức như amino, biotin, steptavidin, carbonxyl, thiol, silica hoặc các bề mặt có điện tích âm hoặc dương Nhóm nghiên cứu của Trung tâm Khoa học Vật liệu trường Đại học Khoa học đang hợp tác với đại học Kent (Anh) để phát triển các ứng dụng này.

Đại học Quốc gia Hà Nội đã thành công trong việc chức năng hóa nhóm amino của các hạt nano từ tính, nhằm đánh dấu và phân tách tế bào bạch cầu CD4 + T, từ đó hỗ trợ hiệu quả trong việc điều trị bệnh nhân nhiễm HIV.

Nghiên cứu xác định ure trong mẫu sinh học thông qua cảm biến sinh học đang mở ra một hướng đi mới trong lĩnh vực y sinh tại Việt Nam Đây là một nghiên cứu quan trọng, phản ánh sự phát triển của y sinh học trong nước Tuy nhiên, hiện nay vẫn còn rất ít thông tin về việc xác định ure trong mẫu huyết thanh.

Các phương pháp biến tính điện cực để xác định axit uric, ure

UA có tính chất điện hoạt cao, nhưng việc phân tích UA bằng phương pháp điện hóa gặp khó khăn do sự tồn tại của nhiều chất trong mẫu sinh học, đặc biệt là axit ascorbic và DA, vì chúng có điện thế oxi hóa gần giống với UA Các điện cực thông thường như GCE, Pt và Au không thể cung cấp tín hiệu chọn lọc và dễ mất hoạt tính điện hóa do các sản phẩm phản ứng oxi hóa – khử Để khắc phục những hạn chế này, nghiên cứu về biến tính bề mặt điện cực bằng vật liệu tiên tiến đang được kỳ vọng cao.

Biến tính bề mặt điện cực là quá trình áp dụng các giải pháp khác nhau để cải thiện các tính chất lý hóa của bề mặt điện cực Mục tiêu bao gồm tăng cường hoạt tính xúc tác điện hóa thông qua việc sử dụng vật liệu có diện tích bề mặt lớn, từ đó nâng cao độ nhạy Ngoài ra, việc tăng cường khả năng chọn lọc thông qua các nhóm chức và cải thiện tính chất động học khuếch tán của chất điện hoạt cũng rất quan trọng Cuối cùng, việc tập trung nồng độ chất điện hoạt tại lớp tiếp xúc giữa môi trường dung dịch và bề mặt điện cực cũng góp phần nâng cao hiệu suất hoạt động của điện cực.

Gr là vật liệu có cấu trúc mạng lưới lục giác, được hình thành từ các nguyên tố carbon sắp xếp theo kiểu tổ ong Độ dày của mạng lưới này chỉ bằng một nguyên tử carbon, với chiều dài liên kết C-C khoảng 0,142 nm.

Hình 1.11: Cấu trúc của Gr

Nguyên tử carbon có tổng cộng 6 điện tử, nhưng chỉ có 4 điện tử ở các trạng thái 2s và 2p là quan trọng trong việc hình thành liên kết hóa học Các trạng thái 2s và 2p này sẽ lai hóa với nhau, tạo thành 3 trạng thái sp² định hướng trong một mặt phẳng, với các liên kết tạo thành góc 120 độ giữa chúng.

Hình 1.12: Các liên kết của mỗi nguyên tử các bon trong mạng Gr

Graphene (Gr) là một vật liệu cực kỳ cứng, vượt trội hơn cả kim cương, với độ bền cao gấp hơn 200 lần thép Dù ở dạng đơn lớp, graphene lại dẻo như nhựa, có thể dễ dàng bẻ cong, gấp hoặc cuộn lại Nó trong suốt, cho phép ít nhất 90% ánh sáng đi qua và có điện trở thấp hơn so với các chất dẫn điện trong suốt tiêu chuẩn như indi-thiếc oxit Những đặc tính này mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong sản xuất màn hình cảm ứng chất lượng cao, pin mặt trời, thiết bị lưu trữ năng lượng và điện thoại di động, đồng thời có khả năng thay thế silicon trong sản xuất chip máy tính tốc độ cao.

Hình 1.13: Những tính năng kỳ diệu đã tạo cho graphen khả năng ứng dụng đặc biệt

Trong lĩnh vực vi điện tử, transistor Gr với tính chất độc đáo đã phát triển nhiều linh kiện đa dạng và ưu việt, phục vụ cho nhu cầu của nhiều thiết bị khác nhau Những mạch tích hợp này thường khó hình dung đối với những người không phải chuyên môn.

(IC) dùng Gr đã thu nhỏ được kích thước đến tối đa mà vẫn bảo đảm (và nâng cao) tính năng các thiết bị vi điện tử

Các nhà nghiên cứu đang phát triển thiết bị điện tử sử dụng linh kiện từ graphene (Gr) để phân tích ADN và bộ gen của con người cũng như động thực vật, với mục tiêu nâng cao hiệu suất tính toán và độ chính xác Bên cạnh đó, các tấm ôxit graphene cũng được phát hiện có tính sát khuẩn cao, hứa hẹn ứng dụng trong việc chế tạo dụng cụ đựng thực phẩm nhằm bảo quản lâu dài.

Trong lĩnh vực điện hóa, graphene (Gr) được ứng dụng chủ yếu trong chế tạo cảm biến Gr có thể được tổng hợp bằng nhiều phương pháp, trong đó nổi bật là phương pháp sử dụng băng dính của nhóm nghiên cứu Geim vào năm 2004 để tách lớp Gr từ graphit Phương pháp đầu tiên để tổng hợp Gr là CVD lên bề mặt Niken khi phân hủy etyle Gần đây, Gr còn được tổng hợp qua một số phương pháp khác như tổng hợp hóa học từ graphit và CVD lên tấm đồng từ hơi hydro và metan Compozit của Gr với polyme đã được ứng dụng trong việc chế tạo cảm biến để xác định nhiều loại chất sinh học khác nhau.

Polyme dẫn điện (CP) đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực điện và cảm biến Những màng polyme mỏng, đồng nhất và kết dính có thể được tạo ra thông qua quá trình bố trí điện, cho phép lắng đọng trên các bề mặt nhỏ với độ chọn lọc cao.

Một số chất dẫn điện phổ biến như PANI, PPy và poly-3,4-ethylene dioxythiophene (PEDOT) thường được sử dụng trong chế tạo cảm biến urê (UA) Các thí nghiệm ban đầu đã phát triển các cảm biến UA dựa trên polymer, sử dụng poly pha tạp dodecyl sulfat (N-methylpyrrole) Màng polymer có khả năng kết hợp enzym trong quá trình điện hóa nhờ vào tương tác tĩnh điện giữa lớp chất dẫn điện bị oxy hóa và enzym anion Cảm biến được thiết kế cho các phép đo lưỡng cực, với điện cực làm việc được phủ bằng hỗn hợp polymer và enzym, trong khi điện cực còn lại chỉ sử dụng polymer Sự phân cực giữa hai điện cực được sử dụng để đo nồng độ UA và ure.

Một nghiên cứu của Zheng đã chỉ ra rằng việc sử dụng lớp β-cyclodextrin (CD) kết hợp với poly (N-acetylanilin) trên điện cực carbon kính (GCE) cho phép xác định UA một cách chọn lọc và nhạy cảm Độ nhạy và độ chọn lọc của cảm biến này phụ thuộc vào sự hình thành phức hợp siêu phân tử giữa β-CD và điện cực biến tính polyme.

Các phép đo SWV được thực hiện ở pH 5 cho thấy AA tồn tại dưới dạng anion và không tạo phức với β-CD, cho phép chọn lọc UA ở nồng độ từ 1.10^-5 đến 2.10^-4 mol/L Phương pháp tương tự sử dụng GCE biến tính poly (3-acetylthiophene) đã chứng minh tính chọn lọc cao cho UA trong sự hiện diện của AA Mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ UA và dòng điện cực đại nằm trong khoảng 1,25.10^-5 - 1,75.10^-4 mol/L, với giới hạn phát hiện là 5,27.10.

Sử dụng điện cực polyme biến tính cho quá trình điện hóa axit uric (UA) đã cho thấy hiệu quả đáng kể, với cường độ oxy hóa giảm 160 mV so với điện cực carbon glass (GCE) trần Hệ thống này có khả năng tách biệt hoàn toàn các đỉnh oxy hóa của UA, axit ascorbic (AA) và dopamine (DA) UA có thể được phát hiện trong khoảng từ 5.10^-9 đến 8.10^-.

Cảm biến điện hóa chọn lọc dựa trên ống nano cacbon biến tính β-cyclodextrin đã được Wang và cộng sự báo cáo, cho thấy khả năng phát hiện với giới hạn thấp nhất là 1.10 -9 molL -1 Phản ứng tuyến tính của cảm biến này được ghi nhận trong khoảng từ 5.10 -7 đến 5.10 -5 molL -1.

UA giới hạn phát hiện là 2.10 - 6 molL -1 - 0,2 molL -1 trong dung dịch đệm acetat (pH 4,5)

Ortega và cộng sự đã phát triển cảm biến sinh học ure (UA) dẫn điện từ polyanilin-poly (n-butylmethacrylat), sử dụng kỹ thuật đúc với dung dịch tetrahydrofuran và chất phân tán PVME, PVEE Các vật liệu này được thử nghiệm với enzym Uox để phát hiện UA Roy đã phát hiện ra rằng điện hóa đồng thời UA và AA có thể thực hiện tại điện cực GCE phủ PDMA, cho thấy tính ổn định và khả năng tái tạo cao trong phản ứng điện hóa mà không bị ảnh hưởng Việc sử dụng điện cực GCE với lớp PDMA giúp tách biệt điện thế cực đại của AA và UA trong cùng một dung dịch, với mức độ phân tách phụ thuộc vào động học tương tác tĩnh điện giữa các ion Ngoài ra, một số cảm biến polymer dẫn khác cũng được phát triển dựa trên PPy.

[129] cũng được nêu để phát hiện UA Điện cực có chứa các polyme như polypyrrole-dodecyl sulfat [130], poly (4-vinylpyridin) [131] và ultrathin polypyrrole-tetradecyl sulfat vàng [132]

1.4.3 Ứng dụng hạt Nano kim loại

Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của nghiên cứu

Nghiên cứu của luận án tập trung vào việc chế tạo điện cực biến tính để đo chọn lọc UA và ure, dựa trên việc biến tính điện cực GCE, nhằm đáp ứng các yêu cầu cụ thể đã được nêu trong các phần trước.

- Đạt giới hạn định lượng thấp, khoảng tuyến tính dài đối với UA và ure

Độ chọn lọc cao trong việc xác định acid uric (UA) và ure là rất quan trọng, đặc biệt khi có sự hiện diện của các chất khác Một trong những yếu tố ảnh hưởng đáng chú ý đến việc xác định UA là sự can thiệp của các chất khác trong mẫu thử.

- Độ ổn định và độ lặp lại tốt của tín hiệu giữa các lần đo với độ lệch chuẩn của tín hiệu nhỏ

- Cảm biến phù hợp ứng dụng phân tích mẫu sinh học là mẫu nước tiểu, mẫu huyết thanh hoặc dịch sinh học

Phát triển công cụ phân tích nhanh và nhạy cho hàm lượng UA và ure trong mẫu huyết thanh là nhu cầu thiết yếu trong phân tích lâm sàng, mang lại ý nghĩa thực tiễn cao Nghiên cứu vật liệu biến tính nhằm xác định UA và ure với độ nhạy và chọn lọc cao sẽ góp phần thúc đẩy sự phát triển của lĩnh vực phân tích điện hóa hiện đại tại Việt Nam.

Kết luận

Chỉ số UA và ure trong máu là những yếu tố quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh gút và các bệnh thận Để xác định chính xác các căn bệnh này, y học cần sử dụng các công cụ và thiết bị hiện đại nhằm phân tích UA và ure trong mẫu sinh học cũng như thực hiện các xét nghiệm trực tiếp trên cơ thể.

Ure và axit uric (UA) có thể được phân tích bằng nhiều phương pháp như đo quang, enzym, HPLC và phương pháp điện hóa, trong đó phương pháp điện hóa tỏ ra ưu việt nhờ tính chất điện hoạt cao của UA Nghiên cứu chế tạo và thu nhỏ cảm biến điện hóa với các điện cực biến tính đang mở ra nhiều triển vọng, tuy nhiên, để đạt được thành công cần vượt qua các thách thức như ảnh hưởng của các chất đồng thời có mặt trong mẫu sinh học như axit ascorbic (AA) và dopamine (DA) Sự tương đồng trong khả năng oxi hóa giữa UA và các chất này gây khó khăn cho việc phân tích điện hóa, dẫn đến thiếu tính chọn lọc Hơn nữa, các sản phẩm oxi hóa từ các chất này có thể hấp thụ hoặc polyme hóa trên bề mặt điện cực, làm giảm hiệu năng của nó.

Các cảm biến xác định UA và ure yêu cầu độ nhạy cao, khả năng đo nhanh và tính chọn lọc Nhờ vào sự phát triển của khoa học vật liệu, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều loại vật liệu khác nhau để chế tạo các điện cực biến tính, cho phép xác định đồng thời hoặc chọn lọc UA và ure trong môi trường có các yếu tố ảnh hưởng Những vật liệu được chú trọng gần đây bao gồm cacbon dạng ống nano, graphene, hạt nano kim loại hoặc oxit kim loại, vật liệu polyme dẫn, compozit và các ion lỏng.

Nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính để xác định UA và ure một cách nhanh chóng, nhạy bén, chọn lọc và tương thích sinh học đang thu hút sự quan tâm lớn Mặc dù các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã đạt được nhiều thành tựu quan trọng, vẫn còn nhiều mục tiêu cần đầu tư để phát triển sản phẩm phục vụ y học Do đó, nhiều nhà khoa học tiếp tục tìm kiếm các giải pháp tối ưu Tổng quan cho thấy sự quan tâm và triển vọng của hướng nghiên cứu này ngày càng tăng.

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu

Luận án nghiên cứu về việc chế tạo cảm biến điện hóa bằng cách tối ưu hóa các vật liệu nhạy và chọn lọc với ure và axit uric (UA) Để đạt được sự chọn lọc trong việc xác định ure, UA và các thành phần phổ biến trong mẫu huyết thanh, cần có cơ sở khoa học để biến tính điện cực GCE thông thường Qua việc tổng quan tài liệu, luận án đã trình bày các kết quả thực tế đạt được, với từng bước phát triển thống nhất nhằm giải quyết triệt để vấn đề nghiên cứu.

1 Nghiên cứu chế tạo điện cực đo UA

- Chế tạo điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs và điện cực GCE/rGO/PDA- Cu/CuNPs

- Nghiên cứu ảnh hưởng của Gr, rGO trên điện cực GCE

- Nghiên cứu các điều kiện tổng hợp tối ưu PDA-Cu(II)

- Nghiên cứu tổng hợp CuNPs lên điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)

- Đánh giá đặc trưng của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs, GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điện cực

2 Nghiên cứu chế tạo điện cực đo ure

* Nghiên cứu chế tạo điện cực Pt/Gr/PANi/Ureaza

- Nghiên cứu đặc tính của graphen tổng hợp

- Nghiên cứu chế tạo và khảo sát các đặc trưng của điện cực Pt/Gr/PANi/Ureaza

3 Các điện cực đã biến tính thành công được ứng dụng phân tích mẫu thực tế Kết quả phân tích mẫu được so sánh với kết quả của đơn vị thử nghiệm chuyên nghiệp Kết quả phân tích mẫu nước tiểu được thêm bổ sung chất chuẩn UA, ure được đánh giá độ thu hồi và so sánh với kết quả của bệnh viện…

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ

- Thiết bị nghiên cứu điện hóa đa năng Autolab (AUT30.v AUTOLAB, Eco Chemie B.V., Hà Lan)

- Điện cực so sánh Ag/AgCE1(KCl 3M), điện cực đối Pt và điện cực làm việc GCE có đường kính 2mm (6.1204.110GCE, Metrohm- Thụy Sỹ)

- Thiết bị quang phổ Raman Jasco NRS- 3000 Series, bước sóng kích thích laze 532nm và mật độ cong suất 2.9 mW/cm 2

- Thiết bị hiển vi điện tử quét phát xạ trường (field-emission scanning electron microscope – FE - SEM, JSM – 6700, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)

- Vi điện cực tích hợp Dropsens (Hà Lan): đường kính điện cực làm việc là 1,6 mm

- Các hóa chất gồm Gr, graphit, UA, ure, DA, AA, hãng sản xuất Sigma (Đức)

Di-Natri hydro photphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O) được sản xuất bởi Prolabo (Pháp) và Natri dihydrogen phosphat monohydrat (NaH2PO4.H2O) do Merck (Đức) cung cấp Dung dịch đệm 0,1 M (PBS) với pH 7,0 được điều chế từ hai hợp chất này.

Na2HPO4.2H2O và NaH2PO4.2H2O

- CuCl2, axid sulfuric (H2SO4), axid clohydric (HCl), amoniac (NH4OH), etanol, hydro peoxit (H2O2), natrinitorit (NaNO2), hãng sản xuất Merck, Đức

- Enzym ureaza (E.C.3.5.1.5, 42 đơn vị/mg, Sigma - Aldrich)

- Dung dịch Pyrol của hãng Fluka (Thụy Sĩ) đã được cất trước khi sử dụng và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 o C

- Tất cả các hóa chất được chuẩn bị bằng nước deion

2.1.3.1 Các phương pháp nghiên cứu phản ứng và bề mặt điện cực Để nghiên cứu phản ứng và bề mặt điện cực, các kỹ thuật đã được sử dụng trong luận án này gồm: Von-ampe vòng (CV), hiển vi điện tử quét (SEM), phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX), Von - Ampe xung vi phân (DPV)

* Phương pháp von-ampe vòng (CV)

Phương pháp CV (Chu kỳ điện hóa) được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu điện hóa, cung cấp thông tin quan trọng về các phản ứng và quá trình điện hóa Ưu điểm nổi bật của CV là khả năng đánh giá nhanh chóng nhiệt động học của quá trình oxi hóa khử và động học của phản ứng trao đổi điện tử giữa chất oxi hóa và chất khử, cũng như quá trình hấp phụ Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng vị trí điện thế mà tại đó chất điện hoạt bị oxi hóa hoặc khử, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của môi trường đến quá trình oxi hóa khử.

Trong luận án này, phương pháp CV được thực hiện trên hệ thiết bị nghiên cứu điện hóa đa năng Autolab (AUT30.v AUTOLAB, Eco Chemie B.V., Hà Lan)

Hệ đo bao gồm ba điện cực: điện cực so sánh Ag/AgCl (KCl 3M), điện cực đối Pt và điện cực làm việc Điện cực làm việc sử dụng glasy cacbon (GCE) với đường kính 2mm từ Metrohm-Thụy Sỹ, có thể là không biến tính hoặc đã được biến tính.

Các khoảng quét thế được lựa chọn để nghiên cứu phản ứng điện hóa dựa trên đặc trưng bề mặt của điện cực làm việc và tính chất điện hóa của chất điện hoạt Ngoài ra, số vòng quét và tốc độ quét cũng được khảo sát và điều chỉnh phù hợp với mục đích nghiên cứu.

*Phương pháp von-ampe xung vi phân

Kỹ thuật DPV được sử dụng để giảm giới hạn phát hiện bằng cách tăng tỷ lệ dòng Faraday so với dòng phi Faraday Các thiết bị hiện đại áp dụng kỹ thuật áp thế dạng xung có khả năng hạ thấp giới hạn phát hiện của phương pháp von-ampe xuống đến 10^-8 M DPV là một kỹ thuật tiên tiến thuộc nhóm các phương pháp kiểm soát điện thế và đo dòng Faraday, cho phép đo chính xác dòng Faraday sinh ra từ quá trình oxi hóa khử các chất điện hoạt, đồng thời tách biệt với dòng phi Faraday do lớp điện kép giữa bề mặt điện cực và dung dịch Trong phương pháp von-ampe xung vi phân, điện cực làm việc được áp thế một chiều biến thiên chậm (1-2 mV/s) với các xung 10-.

Trong quá trình áp thế với 100 mV, dòng điện được đo tại hai thời điểm: ngay trước khi áp xung và ngay trước khi kết thúc xung Hiệu cường độ dòng điện tại hai thời điểm này, được ký hiệu là   i i t 2  i t 1, thể hiện qua biến thiên điện thế và tạo ra đồ thị DPV dạng pic tín hiệu Chiều cao của pic tín hiệu trên đồ thị DPV tỷ lệ thuận với nồng độ chất điện hoạt trong dung dịch đo.

Khi thực hiện phép đo DPV, cần xác định các thông số quan trọng bao gồm khoảng quét thế, bước thế, cường độ xung, thời gian áp xung và chu kỳ áp xung.

* Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM)

Kính hiển vi điện tử quét (SEM) là thiết bị nghiên cứu hình thái bề mặt của mẫu với độ phóng đại lên tới 1 triệu lần, vượt trội so với kính hiển vi quang học chỉ có độ phóng đại tối đa 10.000 lần SEM cung cấp độ phân giải vài nanomet, trong khi kính hiển vi quang học chỉ đạt vài micromet Một trong những ưu điểm nổi bật của SEM là khả năng tạo ra hình ảnh 3 chiều sắc nét và độ sâu trường ảnh lớn hơn Tuy nhiên, mẫu cần quan sát phải được xử lý bề mặt và quá trình hoạt động của SEM diễn ra trong môi trường chân không, đòi hỏi sự chuẩn bị phức tạp.

Trong thiết bị kính hiển vi điện tử quét (SEM), điện tử thay thế ánh sáng trong kính hiển vi quang học Điện tử được phát ra từ súng phóng điện tử và tăng tốc với điện áp từ 10kV đến 50kV Chùm điện tử sơ cấp được điều khiển để quét trên bề mặt mẫu, tạo ra các tín hiệu thứ cấp từ sự tương tác với mẫu Các tín hiệu này bao gồm điện tử thứ cấp, chùm điện tử tán xạ ngược, điện tử tán xạ không đàn hồi, điện tử tán xạ đàn hồi, điện tử hấp thụ, điện tử Auger và tia X Những tín hiệu này được sử dụng để tái tạo hình thái bề mặt mẫu một cách chính xác thông qua việc phân tích dữ liệu từ ống đếm.

Trong luận án này, các lớp vật liệu biến tính bề mặt điện cực đã được chụp ảnh SEM để so sánh sự khác biệt trong quá trình hình thành và biến đổi của vật liệu.

* Phương pháp Phổ tán sắc năng lượng

Phổ tán sắc năng lượng là một kỹ thuật quan trọng trong phân tích thành phần hóa học của vật rắn Kỹ thuật này dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn khi nó tương tác với các bức xạ, chủ yếu là chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử.

Kỹ thuật EDX được thực hiện chủ yếu trong kính hiển vi điện tử, nơi ảnh vi cấu trúc vật rắn được ghi lại thông qua chùm điện tử năng lượng cao Khi chùm điện tử này chiếu vào vật rắn, nó xuyên sâu vào nguyên tử và tương tác với các lớp điện tử bên trong, tạo ra các tia đặc trưng.

X có bước sóng đặc trưng tỉ lệ với nguyên tử số (Z) của nguyên tử theo định luật Mosley

Thực nghiệm

2.2.1.1 Chế tạo và khảo sát điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs Điện cực GCE được làm sạch bằng bột nhụm oxit cỡ hạt 0,3àm, sau đú rửa sạch và rung siờu õm 20s trong nước khử ion Nhỏ 5àl Gr (Gr một lớp, từ vật liệu ACS (ACS Material) cú đường kớnh vảy 0,4 - 5àm, độ dày 0,6 - 1,2nm và điện trở

Điện cực GCE được phủ một lớp graphene (G) có độ dẫn điện thấp (