sau đó định lượng vitexin bằng HPLC [5] tuy nhiên chưa có công bố về phương pháp định lượng vitexin trong dược liệu lạc tiên cũng như chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên bằng HPLC.. Vì
TỔNG QUAN
Tổng quan về lạc tiên Passiflora foetida L
1.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật và phân bố a Đặc điểm hình thái thực vật
Cây leo có thân mềm, tròn, rỗng và có lông thưa, với lá mọc so le, chia thành 3 thùy, thùy giữa lớn hơn hai thùy bên, mép lá uốn lượn và có lông mi nhỏ Gốc lá hình tim đầu nhọn, gân lá hình chân vịt, và cả hai mặt lá đều có lông mịn Tua cuốn mọc ở kẽ lá, cuộn lại như lò xo Hoa lớn, đều, lưỡng tính, mọc riêng ở kẽ lá với tổng bao có ba lá bắc rời nhau, bao hoa gồm năm lá đài màu xanh lục có viền trắng Mỗi lá đài có phần phụ hình nhọn, trong khi 5 cánh hoa màu trắng pha tím nhạt xen kẽ với các lá đài Giữa hoa có một vòng tua nhiều phần phụ hình sợi chỉ màu tím, cùng với cột nhỏ hình trụ mang 5 nhị màu vàng và bộ nhụy có 3 lá noãn, bầu thường một ô Quả mọng, hình trứng, dài khoảng.
3 cm, bao bọc bởi tổng bao lá bắc tồn tại, vỏ quả mỏng khi chín màu vàng, hạt nhiều, có áo hạt thơm, ăn được [3] b Phân bố
Cây Passiflora foetida mọc hoang khắp nơi ở nước ta, nhất là các tỉnh Hòa Bình, Thái Nguyên, Bắc Giang, Quảng Bình, Thừa Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng
Trên thế giới, cây lạc tiên có ở Nam Trung Quốc, Lào, Campuchia và một số nước Đông Nam Á khác [3]
Cây Lạc tiên (P.foetida L.) đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng về thành phần hóa học của nó Hai thành phần chính được xác định trong cây này, tương tự như các loài khác thuộc chi Passiflora L., là flavonoid và alcaloid.
Tác giả Nguyễn Thị Yến và cộng sự đã xác định các flavonoid trong lạc tiên
The article discusses various flavonoids, including apigenin, luteolin, chrysoeriol, tricin, quercetin-4'-methyl ether, vitexin, vitexin-2"-O-xyloside, orientin, apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside, and luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside Notably, certain C-glycosyl flavonoids, such as vitexin, isovitexin, 2’’-xylosylvitexin, and luteolin-7-D-glucoside, are commonly found in the Passiflora L genus.
Lạc tiên chứa nhiều hợp chất quý giá như cyanohydrin glycosid, bao gồm tetraphyllin A, tetraphyllin B, tetraphyllin B sulphate, deidaclin và volkenin Ngoài ra, lạc tiên còn cung cấp các acid béo thiết yếu như acid linoleic và acid linolenic, cùng với các polyketide α-pyrone, được gọi là passifloricin, được chiết xuất từ nhựa cây.
Phân tích hóa học phần thân mang lá của cây lạc tiên ở Việt Nam cho thấy sự hiện diện của các hợp chất như triterpene, flavonoid, alkaloid, acid hữu cơ và chất khử Các hợp chất phenol được phát hiện trong cả thân và lá, trong khi alkaloid chỉ có trong lá Nghiên cứu cũng xác định hai flavonoid chính trong lá cây lạc tiên là vitexin và xylosyl vitexin.
1.1.3 Tác dụng dược lý và công dụng a Tác dụng dược lý
Nghiên cứu về cây P foetida đã chỉ ra rằng chiết xuất của cây này sở hữu nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng, bao gồm tác dụng an thần, chống tiêu chảy, giảm đau, chống viêm, chống trầm cảm, hạ huyết áp, hỗ trợ điều trị tiểu đường, chống ung thư và kháng khuẩn.
Lạc tiên có khả năng tăng tổng thời gian ngủ đáng kể, chủ yếu nhờ vào việc gia tăng thời gian ngủ sóng chậm (SWS) Mặc dù thời gian ngủ REM (giấc ngủ có chuyển động mắt nhanh) có xu hướng giảm, nhưng sự suy giảm này không đáng kể Việc giảm thời gian và tần suất của giấc ngủ REM sau khi sử dụng chiết xuất lạc tiên cho thấy rằng cây lạc tiên sở hữu các đặc tính cần thiết để được công nhận là một chất gây ngủ hiệu quả.
Nghiên cứu của Asadujjaman Md và các đồng tác giả cho thấy cao chiết EtOH từ Passiflora foetida có khả năng giảm đau, chống tiêu chảy và gây độc tế bào, dựa trên các thí nghiệm thực hiện trên chuột.
Các thử nghiệm vi sinh đã chứng minh hiệu quả dịch chiết MeOH và nước của P foetida có tác dụng chống nấm da, chống lại các loài Trichophyton và
Arthroderma, có liên quan đến chứng viêm da [18]
P foetida có khả năng chống đái tháo đường bằng cách ức chế các enzym liên quan đến tăng đường huyết sau ăn Hoạt tính ức chế α-amylase tối đa được ghi nhận trong 100 àg/ml dịch chiết nước và ethanol của rễ với mức ức chế tương ứng là 80,3% và 83,3% [42]
Nghiên cứu của Ranganatha N và cộng sự cho thấy cao chiết ethyl acetat từ P foetida có tác dụng hạ huyết áp đáng kể, với liều 300mg/ml cho hiệu quả tương đương với 5mg amlodipin.
Nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy luteolin trong P foetida có khả năng ngăn chặn sự hình thành ung thư ở động vật, giảm sự phát triển của khối u và tăng cường độ nhạy cảm của tế bào khối u với tác dụng gây độc tế bào của một số thuốc chống ung thư.
Ngọn và lá non của cây có thể sử dụng làm rau, trong khi quả chín có thể ăn được Toàn bộ cây mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như an thần, điều kinh, và chữa trị các triệu chứng như mất ngủ, ho, suy nhược thần kinh và phù thũng Lá cây khi giã đắp có tác dụng chữa mụn nhọt, lở loét ở chân và viêm mủ da Ngoài ra, toàn cây cũng có khả năng chữa bỏng do lửa và bỏng nước sôi.
Tổng quan về vitexin
1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất
Vitexin có danh pháp IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-8-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]chromen-4- one Công thức cấu tạo của vitexin được thể hiện ở hình 1.1
Hình 1 1 Công thức cấu tạo của vitexin
Vitexin có công thức hóa học: C21H20O10, khối lượng phân tử: 432,4 g/mol Điểm nóng chảy: 248 - 250 0 C, điểm sôi: 767,7 0 C ở 760 mmHg
Vitexin có tính acid yếu, pKa = 6,27
Vitexin ớt tan trong nước (6,72 àg/ml) [22]
1.2.2 Tác dụng dược lý a Tác dụng chống oxy hóa
Vitexin có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, đặc biệt trong việc loại bỏ các gốc tự do phát sinh từ tia UVB, như đã được chứng minh qua nghiên cứu trên nguyên bào sợi da người Điều này mở ra tiềm năng sử dụng vitexin để ngăn ngừa tổn thương da do ánh nắng mặt trời.
Vitexin có khả năng chống lại các phản ứng oxy hóa, quá trình peroxy hóa lipid và các tổn thương oxy hóa khác, góp phần vào việc điều trị nhiều bệnh lý liên quan đến oxy hóa như co giật, suy giảm trí nhớ, thiếu máu cục bộ não, nhiễm độc thần kinh, tổn thương cơ tim, hô hấp và rối loạn chức năng trao đổi chất Đồng thời, Vitexin cũng thể hiện tác dụng chống viêm hiệu quả.
Trong một thí nghiệm với chuột, vitexin đã được chứng minh là có tác dụng
Việc ức chế cơn đau do viêm không chỉ giúp ngăn chặn sự suy giảm khả năng của động vật trong việc loại bỏ các gốc tự do mà còn ức chế sản xuất các cytokine gây viêm Điều này có thể góp phần vào tác dụng chống ung thư, mang lại lợi ích cho sức khỏe tổng thể.
Nghiên cứu cho thấy vitexin có khả năng ức chế quá trình di cư và xâm lấn của các tế bào khối u chuột Đối với tế bào ung thư miệng ở người, vitexin không chỉ làm giảm khả năng sống sót mà còn hạn chế di căn Ngoài ra, vitexin còn thể hiện hiệu quả chống lại ung thư vú và tế bào ung thư bạch cầu ở người.
Nghiên cứu in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng vitexin có khả năng chống lại nhiều loại ung thư thông qua các cơ chế proapoptotic (chết tế bào theo chương trình) và autophagy (tự thực bào).
Nghiên cứu in vitro của Zhang W và các cộng sự đã chỉ ra rằng vitexin có tác dụng ức chế sự xâm lấn và di căn của tế bào u ác tính A375 và C8161 Sau khi điều trị với vitexin trong 24 hoặc 48 giờ, khả năng xâm lấn và di chuyển của các tế bào này giảm rõ rệt, tùy thuộc vào liều lượng và thời gian điều trị.
Vitexin được xem như một liệu pháp tiềm năng trong điều trị bệnh bạch cầu, nhờ khả năng kích thích sự biểu hiện của caspase-3 và caspase-9 trong các tế bào bạch cầu, đồng thời làm giảm mức độ Bcl-2, một protein ức chế quá trình chết tế bào Điều này dẫn đến việc thúc đẩy quá trình apoptosis, giúp tiêu diệt các tế bào bệnh lý.
Vitexin và các hợp chất tương tự đã được nghiên cứu với vai trò là chất chống tăng đường huyết Các nghiên cứu cho thấy việc cho chuột uống vitexin hoặc isovitexin giúp giảm đáng kể hàm lượng đường huyết sau khi ăn, và tác dụng hạ đường huyết này phụ thuộc vào liều lượng sử dụng.
Vitexin ức chế α-glucosidase (một loại enzym phân hủy carbohydrat) có tác dụng làm giảm nguy cơ đái tháo đường type 2 [24], [54], [39]
Một nghiên cứu của Choi J S và cộng sự vào năm 2013 đã chứng minh rằng
Vitexin và isovitexin có khả năng chống đái tháo đường thông qua việc ức chế enzym PTP-1B, một enzym điều hòa âm tính ảnh hưởng đến hoạt động của insulin trong mô đích Ngoài ra, chúng cũng có tác dụng tích cực đối với sức khỏe tim mạch.
Nghiên cứu trên thỏ và tình nguyện viên khỏe mạnh cho thấy vitexin có tác dụng co bóp tích cực trên tâm nhĩ mà không kích hoạt thụ thể β1-adrenergic Nó không có hoạt tính giãn mạch và không thể đảo ngược phản ứng co mạch ở động mạch phổi Vitexin làm tăng lưu lượng nước tiểu và bài tiết natri, kali, đồng thời gây tăng huyết áp nhẹ ở thỏ Đặc biệt, nó giảm huyết áp động mạch trung bình ở cả tình nguyện viên và thỏ cao huyết áp nhẹ mà không liên quan đến giãn mạch trực tiếp hay chẹn thụ thể α, β-adrenergic Cơ chế hạ huyết áp của vitexin có thể là do tác dụng lợi tiểu của nó.
Uống trà từ hoa lạc tiên, đặc biệt là Passiflora incarnata, đã được biết đến với tác dụng an thần và gây ngủ Đây là một loại thảo mộc an toàn, được Bộ An toàn Thực phẩm và Dược phẩm Hàn Quốc (KFDA) công nhận Nghiên cứu của Kim G và cộng sự đã tiêu chuẩn hóa quy trình chiết xuất Passiflora incarnata bằng rượu etylic, tạo ra sản phẩm gây ngủ an toàn với vitexin là thành phần chính Kết quả cho thấy chiết xuất này chỉ có tác dụng gây ngủ trên mô hình động vật mà không gây ra rối loạn hành vi hay chuyển hóa bất lợi như tăng cảm giác thèm ăn hay tăng trọng lượng cơ thể.
1.2.3 Các phương pháp xác định
Lữ Thị Kim Chi cùng các cộng sự đã thực hiện việc chiết xuất và phân lập vitexin từ cây lạc tiên Họ cũng đã định lượng dung dịch vitexin tinh chế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Bài viết đề cập đến việc sử dụng detector PDA trong phân tích sắc ký với cột Phenomenex Gemini C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm) và pha động là acetonitril kết hợp với 0,1% acid acetic theo tỷ lệ 20:80, cùng với bước sóng phát hiện 340 nm Quy trình chiết xuất vitexin được mô tả là phức tạp, bao gồm 4 giai đoạn chiết, phân lập và tinh chế bằng các dung môi khác nhau như cồn 96%, cloroform, n-butanol và cao n-butanol thông qua cột diaion HP 20.
Pongpan N và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector DAD để xác định hàm lượng vitexin trong lạc tiên Họ sử dụng cột C18 với kích thước 250 x 4,6 mm và pha động gồm isopropanol, THF và H2O cùng 0.3% acid formic, với bước sóng phát hiện 340 nm Nghiên cứu cho thấy vitexin có thể được tách và định lượng từ dịch chiết lá lạc tiên với độ lệch chuẩn thấp, cho thấy vitexin là một marker phù hợp cho dược liệu lạc tiên Phương pháp HPLC này có thể được áp dụng để đánh giá chất lượng các dược phẩm chứa lạc tiên.
Một số phương pháp phân tích vitexin bằng HPLC được liệt kê trong bảng 1.1
Bảng 1 1 Một số phương pháp phân tích vitexin bằng HPLC
Mẫu Chuẩn bị mẫu Pha tĩnh Pha động Detector
Chiết xuất, phân lập, tinh chế vitexin qua 4 giai đoạn
Isopropanol - THF - H2O (5:15:80) và 0,3% formic acid
Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao, là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự phân tách các chất qua một pha tĩnh trong cột, với dòng pha động lỏng được điều khiển dưới áp suất cao Phương pháp này hoạt động dựa trên các cơ chế như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc loại cỡ, tùy thuộc vào pha tĩnh được sử dụng Hiện nay, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong phân tích hóa học, đặc biệt trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích dịch sinh học.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có thể áp dụng nhiều kỹ thuật khác nhau dựa trên đặc điểm của chất phân tích và yêu cầu công việc Các kỹ thuật sắc ký lỏng phổ biến bao gồm sắc ký phân bố (bao gồm sắc ký cặp ion), sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, và sắc ký các đồng phân quang học.
1.3.2 Các thông số đặc trưng trong quá trình sắc ký a Hệ số dung lượng k’ k’ = K 𝑉 𝑠
Vs: thể tích pha tĩnh
Vm: thể tích pha động
Qs: lượng chất trong pha tĩnh
Qm: lượng chất trong pha động tR: thời gian lưu t’R: thời gian lưu hiệu chỉnh
Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 8 b Hệ số chọn lọc α
𝑡 𝑅𝐴 Quy ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên α > 1 Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 c Hệ số đối xứng của pic F
W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic d Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột
W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic e Độ phân giải R s
Trong đó: tRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)
WB, WA: độ rộng pic đo ở các đáy pic
W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic k’ là thừa số dung lượng trung bình của 2 cấu tử A và B cạnh nhau cần phân tích
Nếu các pic đối xứng, độ phân giải tối thiểu để định tính là Rs = 1,0, trong khi đó, để định lượng, Rs = 1,5 là phù hợp.
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính như bình chứa pha động, bơm để đẩy pha động qua hệ thống sắc ký với áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector và máy tính hoặc máy phân tích để ghi nhận kết quả.
Hình 1 2 Cấu tạo máy HPLC
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1 Đối tượng Đối tượng nghiên cứu: vitexin Đối tượng phân tích: chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên
Chất chuẩn: Vitexin (ChemFaces, số lô CFN98601, hàm lượng 98,64%) Chế phẩm nghiên cứu:
- Viên mất ngủ Nightcare (Công ty TNHH Dược Nanocare Việt Nam, số lô
011119, hạn dùng 17/11/2022) chứa 500 mg lạc tiên
- Viên an thần Mimosa (Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC, số lô 20033, hạn dùng 051023) chứa 600 mg lạc tiên
- Acetonitril, ethanol, methanol loại dùng cho HPLC (Merck, Đức); acid phosphoric và kali dihydro phosphat tinh khiết phân tích (Merck, Đức)
- Nước cất 2 lần (dùng ngay sau khi cất)
2.1.3 Thiết bị - dụng cụ a Thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent Technologies Series 1200 với detector DAD và phần mềm Chemstation (Agilent, Mỹ), cột sắc ký Sunfire TM C18
The laboratory is equipped with essential instruments including the Ultrasonic LC60H (Elma, Germany) with specifications of 250 mm x 4.6 mm and a power of 5 W, a Labinco L46 vortex mixer from Taiwan, an A&D GR200 analytical balance from Japan, and a pH meter from Eutech Instruments, Singapore.
Micropipet 10 – 100 àl Nichipipet ABMATE pro, 100 – 1000 àl Nichipet
Để thực hiện thí nghiệm, cần chuẩn bị màng lọc cellulose 0,45 µm cùng với các dụng cụ như pipet chính xác 10 ml, bình định mức 50 ml, bình nón, cốc đong, pipet Pasteur, cốc có mỏ, vial, chày, cối sứ và phễu.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích vitexin trong chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thẩm định phương pháp được thực hiện dựa trên các tiêu chí quan trọng như độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính Ngoài ra, các chỉ số giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) cũng được xác định Độ đúng và độ lặp của phương pháp sẽ được kiểm tra theo hướng dẫn của AOAC để đảm bảo tính chính xác và tin cậy trong kết quả.
- Ứng dụng phương pháp trên định lượng vitexin trong một số chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên trên thị trường.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Chuẩn bị các mẫu chạy sắc ký a Dung dịch chuẩn vitexin gốc
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc vitexin 108 ppm, cần cân chính xác 5,4 mg vitexin vào bình định mức 50 ml, sau đó thêm ethanol 50% đến vạch định mức Sau khi hoàn tất, bọc kín bình và bảo quản trong tủ lạnh.
Cân 20 viên nang chế phẩm, tính khối lượng trung bình của hỗn hợp cao dược liệu trong nang và nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng chế phẩm tương ứng với khoảng 500 mg lạc tiên cho vào bình nón Thêm 10 ml hỗn hợp dung môi nước và ethanol (4:6), chiết siêu âm trong 10 phút Dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi chuyển vào vial qua màng lọc cellulose 0,45 àm
2.3.2 Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký a Khảo sát quy trình chiết mẫu
Khảo sát dung môi chiết
15 b Khảo sát các điều kiện sắc ký để xác định vitexin
- Khảo sát bước sóng phát hiện
- Khảo sát tốc độ dòng
- Khảo sát thể tích tiêm mẫu
2.3.3 Thẩm định phương pháp định lượng
Thẩm định phương pháp dựa trên các tiêu chí như độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ theo AOAC (2016) Độ đặc hiệu là khả năng xác định chính xác một chất phân tích trong sự hiện diện của các thành phần khác có trong mẫu thử, đảm bảo khả năng định tính và định lượng chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố ngoại lai.
Cách xác định: Phân tích mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, mẫu trắng trong cùng điều kiện sắc ký
Trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng, không được xuất hiện pic tại khoảng thời gian lưu tương ứng với vitexin trong mẫu chuẩn Nếu có pic tạp, đáp ứng của nó phải nhỏ hơn hoặc bằng 1,0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn.
Thời gian lưu pic vitexin của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và dung dịch thử thêm chuẩn cần phải tương đương nhau Để đảm bảo độ chính xác, pic của mẫu thử phải tách biệt hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu, điều này phản ánh độ thích hợp của hệ thống phân tích.
Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ
16 thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị
Để xác định tính thích hợp của hệ thống, tiến hành tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn vitexin Ghi lại các giá trị thời gian lưu và diện tích pic Tính tương thích của hệ thống được thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích.
Yêu cầu: RSD của thời gian lưu ≤ 1,0%
RSD của diện tích pic không vượt quá 2,0% Độ tuyến tính của phương pháp phân tích thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong một khoảng xác định.
Nó được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với hệ số tương quan r
Để xác định nồng độ vitexin, chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn với nồng độ từ 2 ppm đến 25 ppm Tiến hành đo diện tích pic của từng dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch đo một lần) và xây dựng đường hồi quy theo công thức y = ax + b.
Yêu cầu: Hệ số tương quan 0,995 ≤ r ≤ 1 d Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà hệ thống phân tích có thể nhận diện tín hiệu có ý nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hoặc tín hiệu nền, mặc dù chưa thể định lượng chính xác.
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử mà có thể được xác định bằng phương pháp khảo sát với độ chính xác và độ tin cậy thích hợp.
Để xác định giới hạn phát hiện (LOD), cần pha loãng mẫu chuẩn đến nồng độ tối thiểu mà vẫn có thể nhận diện tín hiệu của chất phân tích Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) được tính toán, và LOD được chấp nhận khi tín hiệu đạt từ 2 đến 3 lần so với mức nhiễu.
17 đường nền, thông thường lấy S/N = 3
LOQ được xác định tại nồng độ mà tín hiệu vượt trội gấp 10-20 lần so với nhiễu nền, thường lấy S/N = 10 Độ lặp lại phản ánh mức độ tương đồng giữa các kết quả đo lường theo quy trình thử nghiệm lặp lại, được thể hiện qua độ lệch chuẩn S hoặc độ lệch chuẩn tương đối RSD (%).
Để xác định độ chính xác của phương pháp, cần chuẩn bị 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn và tiêm vào hệ thống sắc ký, sau đó tính toán độ lệch chuẩn tương đối (RSD) theo các mức nồng độ quy định tại AOAC 2016 Độ đúng của phương pháp được đánh giá dựa trên mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực tế hoặc giá trị được chấp nhận Độ thu hồi, hay còn gọi là độ đúng, được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa các giá trị thu được và giá trị lý thuyết.
Để xác định hàm lượng vitexin, cần thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào mẫu thử, với ba mức khác nhau, đảm bảo tổng nồng độ vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Độ thu hồi được tính toán theo công thức cụ thể.
Yêu cầu: Tỉ lệ thu hồi và RSD (%) cho mỗi mức nồng độ được quy định tại AOAC 2016
2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Excel 2016
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Chuẩn bị các dung dịch
Dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn vitexin gốc 100 ppm pha các dung dịch vitexin có nồng độ từ 2 đến 25 ppm, dung môi pha mẫu là ethanol 50%
Để tiến hành thử nghiệm, cân chính xác khoảng 0,5 g chế phẩm đã được đồng nhất vào bình nón Sau đó, thêm 10 ml hỗn hợp dung môi nước và ethanol theo tỉ lệ 4:6 hoặc hỗn hợp nước và methanol theo tỉ lệ 6:4 Tiến hành siêu âm trong 10 phút và lọc để thu được dịch.
Dung dịch đệm KH2PO4 pH 4,5 được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 6,8 g KH2PO4 vào cốc đong, sau đó định mức đủ 1 lít bằng nước cất 2 lần Tiếp theo, thêm 2 ml triethylamin và điều chỉnh pH về 4,5 bằng acid phosphoric.
Dung dịch H3PO4 0,1% được pha chế bằng cách cho 600 ml dung dịch H3PO4 85% vào cốc đong, sau đó thêm nước cất hai lần cho đủ 1 lít Cuối cùng, điều chỉnh pH của dung dịch bằng dung dịch NaOH 0,1M đến đạt pH = 2,5.
Khảo sát
Chuẩn bị mẫu chế phẩm chiết bằng ethanol 60 %, methanol 40 % và khảo sát các điều kiện sắc ký để tách vitexin
3.2.1 Khảo sát bước sóng phát hiện
Trong quá trình quét phổ UV từ 210 nm đến 400 nm của pic sắc ký mẫu chuẩn vitexin 10 ppm, chúng tôi ghi nhận sự xuất hiện của hai đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng 269 nm và 342 nm với cường độ tương đương Dựa trên kết quả này, nhóm nghiên cứu đã quyết định chọn bước sóng 342 nm để tiến hành định lượng vitexin trong mẫu chế phẩm.
Hình 3 1 Phổ hấp thụ UV của vitexin
3.2.2 Khảo sát dung môi chiết
Dung môi và pH chiết là 2 yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hòa tan và độ bền của các flavonoid [11]
Nghiên cứu của Fu Y và cộng sự [26] đã chỉ ra rằng việc chiết xuất vitexin từ lá cây Cajanus cajan bằng nước và hỗn hợp ethanol: nước cho hiệu suất khác nhau Cụ thể, khi tỷ lệ ethanol trong dung môi chiết tăng lên, hiệu suất chiết vitexin ban đầu tăng nhưng sau đó lại giảm Hàm lượng vitexin cao nhất được thu được khi sử dụng dung môi ethanol 60%.
Pongpan N và cộng sự [43] dùng methanol 40% để chiết vitexin từ lá cây lạc tiên Passiflora foetida và định lượng vitexin bằng HPLC
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát chiết vitexin từ mẫu chế phẩm bằng hỗn hợp dung môi ethanol và nước với tỉ lệ 6:4, cùng với hỗn hợp dung môi methanol và nước tỉ lệ 4:6 (v/v) Kết quả của quá trình chiết xuất được thể hiện qua các sắc ký đồ sau đây.
Hình 3 2 Chế phẩm chiết bằng MeOH 40%
Hình 3 3 Chế phẩm chiết bằng EtOH 60%
Trong nghiên cứu, mẫu thử chiết bằng ethanol 60% cho thấy thời gian lưu của vitexin là 17,121 phút với chỉ số purity factor đạt 0,997 Ngược lại, mẫu chiết bằng methanol 40% có thời gian lưu ngắn hơn, chỉ 15,443 phút, nhưng chỉ số purity factor chỉ đạt 0,594 Điều này chỉ ra rằng sự hiện diện của các hợp chất khác có cấu trúc tương tự vitexin tại thời điểm pic tR = 15,443 phút đã làm giảm độ tinh khiết của mẫu Do đó, phương pháp chiết bằng methanol 40% không hiệu quả trong việc tách vitexin khỏi hỗn hợp dược liệu.
Thử nghiệm chiết xuất bằng ethanol 60% cho kết quả với chỉ số purity factor cao đạt 0,997 Điều này được giải thích bởi vitexin có nhiều nhóm hydroxyl linh động và cấu trúc phân tử lớn, giúp tăng cường độ phân cực gần gũi với ethanol 60%, từ đó cải thiện khả năng hòa tan.
Kết luận: Lựa chọn ethanol 60% làm dung môi chiết
3.2.3 Khảo sát thành phần pha động
Thành phần pha động ảnh hưởng đến lực tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh, dẫn đến việc thay đổi thứ tự rửa giải và thời gian lưu của chất phân tích Trong quá trình nghiên cứu, các điều kiện cụ thể được giữ cố định để đảm bảo tính chính xác của khảo sát.
- Cột phõn tớch Sunfire TM C18 (250mm*4,6mm; 5àm);
- Thể tớch tiờm: 20 àl; tốc độ dũng: 1,2 ml/phỳt
- Detector DAD; bước sóng làm việc: 342 nm a Hệ pha động thứ nhất
Theo tài liệu [36], khảo sát hệ pha động gồm đệm phosphat KH2PO4 pH 4,5 và ACN với các chương trình gradient khác nhau
Bảng 3 1 Kết quả khảo sát chương trình gradient điều kiện thứ nhất
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử (phút)
Hình 3 4 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 1
Hình 3 5 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 2
Hình 3 6 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy chương trình gradient 3
Nhận xét: Chương trình gradient 1, trong sắc ký đồ của mẫu chế phẩm có
Trong nghiên cứu, pic trùng với thời gian lưu của pic trong mẫu chuẩn là 43 phút và có phổ tương tự, cho thấy mẫu chế phẩm chứa vitexin Tuy nhiên, thời gian lưu giữ của vitexin trong cột quá dài, do đó cần điều chỉnh chương trình gradient pha động để tối ưu hóa thời gian rửa giải và giảm lượng dung môi sử dụng.
Chương trình gradient 2 và 3 đã rút ngắn đáng kể thời gian lưu của vitexin, tuy nhiên độ phân giải giữa pic vitexin và pic liền kề vẫn thấp, không tách biệt được vitexin Trong khi đó, chương trình gradient 4 cho thấy hệ số phân giải của pic vitexin với pic liền kề tương đối tốt, nhưng chỉ số purity factor lại thấp (0,659), cho thấy có thể tồn tại nhiều chất khác có cấu trúc hóa học tương tự vitexin tại vị trí pic tR = 12,168 phút, dẫn đến pic này không đạt độ tinh khiết.
Kết luận cho thấy rằng hệ pha động sử dụng đệm phosphat KH2PO4 pH 4,5 kết hợp với ACN trong các chương trình gradient không đạt hiệu quả trong việc tách vitexin ra khỏi nền mẫu Hệ pha động thứ hai cũng cần được khảo sát thêm để cải thiện khả năng tách.
Theo tài liệu [30], một khảo sát đã được thực hiện để tối ưu hóa điều kiện tách vitexin khỏi mẫu nền, sử dụng hệ pha động gồm H3PO4 0,1% với pH 2,5 và ACN ở các tỉ lệ khác nhau Kết quả của các chương trình đẳng dòng được trình bày chi tiết trong bảng 3.2.
Bảng 3 2 Kết quả khảo sát các chương trình đẳng dòng
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau nhưng phổ không giống nhau
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau nhưng phổ không giống nhau
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau, phổ giống nhau
Hệ số match: 88,7% Purity factor: 0,998
Thời gian lưu của vitexin trong mẫu thử và chuẩn trùng nhau, phổ giống nhau
Hệ số match: 96,4% Purity factor: 0,994
Dựa trên kết quả thực nghiệm, vitexin cho thấy sự nhạy cảm đặc biệt với độ phân cực của pha động Chỉ cần thay đổi một tỷ lệ nhỏ của ACN cũng có thể tác động lớn đến thời gian lưu của vitexin Cụ thể, tại tỷ lệ 19% ACN, thời gian lưu của vitexin bị ảnh hưởng đáng kể.
Vitexin có thời gian lưu ngắn, dẫn đến việc chưa hoàn toàn tách biệt khỏi các chất khác trong hỗn hợp dược liệu Kết quả khảo sát cho thấy chương trình đẳng dòng với 17,5% ACN là phương pháp tách hiệu quả nhất, mang lại hệ số chồng phổ và độ tinh khiết pic cao.
Kết luận: Lựa chọn dung môi pha động là đệm H3PO4 0,1% pH 2,5 và ACN theo chương trình đẳng dòng 17,5% ACN
Hình 3 7 Sắc ký đồ mẫu chế phẩm chạy đẳng dòng 17,5% ACN
3.2.4 Khảo sát tốc độ dòng và thể tích tiêm mẫu
Bảng 3 3 Kết quả khảo sát tốc độ dòng và thể tích tiêm
Tốc độ dũng (ml/phỳt) Thể tớch tiờm (àl) Rs
Ở tốc độ 1,3 ml/phút, thể tích tiêm 15 µl giúp các pic tách ra hiệu quả mà không kéo dài thời gian lưu, đồng thời áp suất bơm thích hợp cho quá trình chạy sắc ký, đảm bảo bơm hoạt động ổn định Do đó, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn phương pháp này.
26 chọn tốc độ dũng 1,3 ml/phỳt với thể tớch tiờm 15 àl cho quỏ trỡnh phõn tớch
Kết luận điều kiện sắc ký sử dụng cột Sunfire TM C18 với kích thước 250 mm x 4,6 mm và kích thước hạt 0,5 µm Bước sóng phát hiện được thiết lập ở 342 nm, trong khi nhiệt độ cột duy trì ở 25°C Thể tích tiêm mẫu là 15 µl và tốc độ dòng là 1,3 ml/phút Pha động bao gồm H3PO4 0,1% với pH 2,5 và acetonitril (ACN) theo tỷ lệ 82,5:17,5.
Thẩm định phương pháp định lượng
Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện đã khảo sát với:
- Mẫu trắng: dung dịch ethanol 60%
- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn vitexin 10 ppm
- Mẫu chế phẩm: chuẩn bị như mục 3.1
- Mẫu chế phẩm thờm chuẩn: hỳt chớnh xỏc 500àl dung dịch chế phẩm và
500 àl dung dịch chuẩn 10 ppm, lọc cho vào vial
Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 3.4
Bảng 3 4 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu
Mẫu Thời gian lưu (phút)
Hình 3 8 Sắc ký đồ kết quả độ đặc hiệu a) mẫu trắng b) mẫu chuẩn c) mẫu chế phẩm d) mẫu chế phẩm thêm chuẩn
- Trên sắc ký đồ chuẩn vitexin ở bước sóng 342 nm xuất hiện pic ở vị trí 14,456 phút
- Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không có pic tại thời gian tương ứng với thời gian lưu của vitexin trong mẫu chuẩn
Trên sắc ký đồ, pic của vitexin trong mẫu chế phẩm và mẫu chế phẩm thêm chuẩn xuất hiện tại thời gian lưu tương ứng với mẫu chuẩn Hệ số match của vitexin trong mẫu chế phẩm đạt 97,3%, trong khi đó, mẫu chế phẩm thêm chuẩn là 95,7% Purity factor của vitexin trong mẫu chế phẩm được xác định là 0,995 Đặc biệt, pic của vitexin trong mẫu thử tách hoàn toàn khỏi các pic khác trong nền mẫu với Rs = 1,53.
Kết luận: Phương pháp đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ đặc hiệu
3.3.2 Độ ổn định hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn vitexin 10 ppm để ghi lại giá trị thời gian lưu và diện tích pic Độ ổn định của hệ thống được đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD), với kết quả được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3 5 Kết quả độ ổn định hệ thống
Lần tiêm Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s)
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu nhỏ hơn 1,0 % và độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic nhỏ hơn 2,0 %
Kết luận: Hệ thống sắc ký ổn định đối với mẫu phân tích
3.3.3 Đường chuẩn Đường chuẩn được xây dựng trên một dãy dung dịch chuẩn gồm 8 dung dịch có nồng độ vitexin chuẩn biến thiên trong một khoảng 2 đến 25 ppm
Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 108 ppm pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 2,16 ppm; 5,4 ppm; 8,65 ppm; 10,8 ppm; 12,96 ppm; 16,2 ppm; 21,6 ppm; 27 ppm
Tiến hành chạy sắc ký Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic
Nồng độ vitexin tương ứng với giá trị 29, với kết quả diện tích pic được ghi lại trong bảng 3.6 Hình 3.9 minh họa đồ thị hồi quy tuyến tính của dữ liệu này.
Bảng 3 6 Kết quả khảo sát đường chuẩn
Mẫu Nồng độ (ppm) Diện tích pic
Phương trình hồi quy tuyến tính y = 24,953 x – 3,0846 r = 0,997
Hình 3 9 Tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ vitexin
Nhận xét: Từ đồ thị ta thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát, tương quan
30 tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic khảo sát như sau: vitexin tuyến tính trong khoảng nồng độ 2,16 – 27 àg/ml, hệ số tương quan r = 0,997
Kết luận: Phương pháp đã khảo sát có khoảng tuyến tính đạt yêu cầu
3.3.4 Độ lặp lại của phương pháp
Trong nghiên cứu, mẫu chế phẩm được cân 6 lần, mỗi lần khoảng 0,5 g Sau đó, quy trình chuẩn bị mẫu thử được thực hiện và tiêm vào hệ thống sắc ký để lấy giá trị trung bình Độ lặp lại được xác định qua RSD của hàm lượng vitexin trong mẫu chế phẩm, với kết quả được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3 7 Kết quả độ lặp lại
Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng trung bình vitexin trong mẫu chế phẩm đạt 103,98 àg/g với độ lệch chuẩn tương đối là 4,61% Theo quy định của AOAC (2016), phương pháp đạt tiêu chuẩn lặp lại khi độ lệch chuẩn tương đối của hàm lượng nhỏ hơn 5,3% ở ngưỡng nồng độ 100 àg/g Do đó, phương pháp này có độ lặp lại đạt yêu cầu.
3.3.5 Độ đúng của phương pháp
Cân mẫu chế phẩm 9 lần khác nhau, mỗi lần khoảng 0,25 g cho vào bình
31 nón Thêm dung dịch vitexin chuẩn, chiết siêu âm bằng ethanol 60 % trong vòng
Trong quá trình nghiên cứu, sau 10 phút, dịch chiết được lọc và tiêm vào hệ thống sắc ký theo thứ tự Nồng độ vitexin trong mẫu được xác định dựa trên đường chuẩn, và kết quả được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3 8 Kết quả độ đúng
Lượng chuẩn Vitexin thêm vào (àg/ml)
Lượng Vitexin trong mẫu (àg/ml)
Lượng chuẩn tìm lại (àg/ml) Độ thu hồi (%)
Tiêu chuẩn AOAC (2016) xác định nồng độ từ 1 – 10 àg/ml với độ thu hồi từ 80 – 110 % và RSD từ 7,3 – 11 % Đối với vitexin, độ thu hồi đạt từ 80 – 89 % và RSD ở cả ba mức nồng độ đều nhỏ hơn 7,3 %.
Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng trong khoảng nồng độ khảo sát
3.3.6 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Xác định LOD và LOQ dựa vào tỉ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N)
Tỉ lệ S/N bằng 3/1 thường được chấp nhận để thiết lập LOD Tỉ lệ S/N bằng 10/1 thường được chấp nhận để thiết lập LOQ
So sỏnh đỏp ứng của mẫu chuẩn ở nồng độ 0,5 àg/ml với mẫu trắng được kết quả S/N = 15,3/1 Như vậy nồng độ 0,5 àg/ml được chấp nhận là LOQ
So sỏnh đỏp ứng của mẫu chuẩn ở nồng độ 0,2 àg/ml với mẫu trắng được kết quả S/N = 4/1 Như vậy nồng độ 0,2 àg/ml được chấp nhận là LOD
Phương pháp đã được thẩm định dựa trên các tiêu chí như độ đặc hiệu, độ ổn định hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng, tất cả đều đạt yêu cầu theo hướng dẫn của AOAC (2016).
Xác định hàm lượng vitexin trong mẫu chế phẩm
Nghiên cứu áp dụng phương pháp định lượng vitexin trong hai chế phẩm từ dược liệu chứa lạc tiên trên thị trường, bao gồm Viên mất ngủ Nightcare (500 mg lạc tiên, Công ty TNHH Dược Nanocare Việt Nam, số lô 011119, hạn dùng 17/11/2022) và Viên an thần Mimosa (600 mg lạc tiên, Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC, số lô 20033, hạn dùng 051023) Kết quả của nghiên cứu được trình bày chi tiết trong bảng 3.9.
Bảng 3 9 Kết quả xác định hàm lượng vitexin trong một số chế phẩm
Mẫu Khối lượng cân (g) Diện tích pic
Như vậy, khi phân tích một lượng chế phẩm Nightcare và Mimosa tương ứng với 500 mg lạc tiên thì lượng vitexin thu được là tương đương nhau.
