TỔNG QUAN
Đại cương về vi khuẩn Enterococcus faecium
Enterococcus faecium là một loại cầu khuẩn gram dương thuộc họ Enterococci, tồn tại dưới dạng đơn, đôi hoặc chuỗi Đây là một phần của vi hệ đường ruột ở người, có khả năng gây nhiễm khuẩn nội sinh và ngoại sinh, cả trong bệnh viện và ngoài cộng đồng Với khả năng kháng thuốc tự nhiên và tiếp nhận gen kháng thuốc nhanh chóng, E faecium đã trở thành một trong những loài Enterococci phổ biến nhất trong nhiễm khuẩn bệnh viện Loại vi khuẩn này thường gây ra các bệnh lý như viêm nội tâm mạc, viêm túi mật, nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng ổ bụng thứ phát và nhiễm khuẩn tiết niệu Đặc biệt, E faecium có thể dẫn đến nhiễm trùng huyết, nguyên nhân chính gây tử vong ở bệnh nhân Những đối tượng có nguy cơ cao bao gồm bệnh nhân suy giảm miễn dịch, bệnh nhân ghép tạng, người sử dụng dụng cụ xâm lấn, và bệnh nhân có thời gian nằm viện dài hoặc có tiền sử sử dụng kháng sinh như quinolon, vancomycin.
E faecium có khả năng kháng nội tại với kháng sinh nhóm beta-lactam và nhóm aminoglycosid, vì thế tỉ lệ kháng ở hai nhóm này ngày càng cao [16] Vancomycin trở thành một trong những phác đồ kháng sinh đầu tay điều trị nhiễm khuẩn do E faecium Tuy nhiên do lạm dụng vancomycin trong điều trị cũng như trong thức ăn chăn nuôi, tỉ lệ E faecium kháng vancomycin tăng lên một cách nhanh chóng [36] Theo báo cáo của tổ chức Kháng kháng sinh Australia, năm 2016 tỉ lệ kháng vancomycin trên các chủng
E faecium phân lập được từ bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết là 50%, tăng gấp 7 lần so với 10 năm trước [31] Còn tại Hoa Kỳ, một số thời điểm tỉ lệ này đã lên tới hơn 80% tại một số bệnh viện khi lấy mẫu phân lập vi khuẩn từ bệnh nhân và từ các dụng cụ y tế có xâm lấn [62] Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Santona và cộng sự (cs) (2018), trên 50% các chủng E faecium kháng ampicilin ở Bệnh viện Trung ương Huế đã kháng lại vancomycin [52]
Cơ chế kháng vancomycin của E faecium chủ yếu là do sự thay thế pentapeptid ái lực cao (D-Ala-D-Ala) bằng pentapeptid ái lực thấp (D-Ala-D-Lac), liên quan đến cụm gen vanA hoặc vanB Vi khuẩn E faecium có khả năng sử dụng các yếu tố di truyền di động như plasmid, trình tự chèn và gen nhảy để thu nhận và tích hợp các cụm gen vanA/vanB vào hệ gen của chúng Cơ chế này không chỉ giúp lan truyền yếu tố kháng thuốc một cách hiệu quả mà còn tạo điều kiện cho sự gia tăng tình trạng kháng vancomycin.
1.1.3 Đường lây truyền và khả năng tồn tại của E faecium
1.1.3.1 Đường lây truyền trong bệnh viện
Bệnh nhân nhiễm E faecium được xem là nguồn lây truyền trực tiếp trong môi trường bệnh viện Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ lưu hành VREfm trong bệnh viện có mối liên hệ chặt chẽ với tỷ lệ nhập viện của những bệnh nhân từng mắc VREfm.
Bệnh nhân có thể lây nhiễm vi khuẩn VREfm không chỉ qua tiếp xúc trực tiếp mà còn gián tiếp thông qua môi trường Việc điều trị trong phòng có bệnh nhân mang VREfm là yếu tố nguy cơ lây nhiễm, do vi khuẩn này có thể tồn tại lâu dài sau khi phơi nhiễm Cụ thể, E faecium có thể sống tới 7 ngày trên bề mặt bàn, 24 giờ trên tay nắm giường, 60 phút trên điện thoại và 30 phút trên ống nghe Ngoài ra, các vị trí thường xuyên tiếp xúc trong bệnh viện như dây quấn huyết áp, nút báo động, tay nắm cửa và bệ ngồi toilet cũng thường phát hiện vi khuẩn E faecium.
Sự lây truyền của E faecium, đặc biệt là VREfm, có thể xảy ra qua tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân nhiễm khuẩn hoặc gián tiếp qua các bề mặt môi trường bị ô nhiễm Những bề mặt này là nơi lý tưởng cho VREfm ẩn nấp và lây lan sang các bệnh nhân nhập viện tiếp theo.
Một nguồn lây truyền khác của vi khuẩn E faecium là thông qua tiếp xúc chéo với nhân viên y tế Khi các nhân viên y tế tiếp xúc với bệnh phẩm của bệnh nhân nhiễm E faecium, họ có thể vô tình mang theo vi khuẩn trên găng tay, khẩu trang hoặc áo choàng, từ đó lây nhiễm cho các bệnh nhân khác Việc di chuyển của nhân viên y tế rất rộng rãi, dẫn đến khả năng lây truyền giữa các khoa trong bệnh viện hoặc giữa các bệnh viện khác nhau.
5 bệnh viện, rất khó để có thể đánh giá và kiểm soát được lịch sử tiếp xúc cũng như khả năng lây truyền thông qua các nhân viên y tế [14]
1.1.3.2 Khả năng tồn tại của E faecium trong môi trường bệnh viện
Enterococci, đặc biệt là E faecium, là những vi sinh vật có khả năng sống sót mạnh mẽ So với tổ tiên, E faecium đã phát triển các đặc điểm cho phép chúng chống chọi với môi trường khô hạn, thiếu dinh dưỡng và những điều kiện khắc nghiệt như trong bệnh viện.
E faecium có khả năng kháng nội tại với các kháng sinh nhóm beta-lactam và một số kháng sinh nhóm aminoglycosid Bên cạnh đó, trong quá trình phơi nhiễm với kháng sinh được sử dụng trong bệnh viện, nhờ hệ gen linh hoạt E faecium còn có thể thu nhận gen kháng các kháng sinh như tetracyclin, nhóm glycopeptid hoặc nhóm aminoglycosid từ các loài vi khuẩn khác thông qua các yếu tố di truyền di động, và dần trở thành chủng đa kháng tồn tại dai dẳng trong môi trường bệnh viện [16]
E faecium nổi bật với khả năng chịu nhiệt và kháng lại các chất sát khuẩn, cho phép chúng tồn tại lâu dài Enterococci đã được công nhận từ lâu về khả năng chịu nhiệt cao, và E faecium thể hiện khả năng này vượt trội hơn so với các loài khác trong cùng họ Đặc biệt, một số chủng VRE có thể sống sót ở nhiệt độ lên đến 80℃.
Theo khuyến cáo của Bộ Y tế Anh, việc xử lý quần áo và chăn màn trong bệnh viện cần đạt nhiệt độ 80℃ trong 3 phút Tuy nhiên, E faecium đã phát triển khả năng kháng cồn đáng kể do việc sử dụng dung dịch sát khuẩn có chứa cồn trong vệ sinh tay ngày càng phổ biến Hơn nữa, vi khuẩn này cũng tăng cường khả năng chống chịu với chlohexidine, một chất khử trùng thường dùng trước phẫu thuật Điều này cho thấy E faecium có khả năng thích ứng tốt với các thay đổi trong môi trường, như việc gia tăng sử dụng cồn sát khuẩn Thêm vào đó, sự không đồng nhất trong quy trình sát khuẩn giữa các nhân viên y tế và các bệnh viện là một yếu tố quan trọng khiến việc loại bỏ hoàn toàn E faecium trở nên khó khăn, dẫn đến nguy cơ lây lan không lường trước.
1.1.4 Biện pháp kiểm soát lây truyền VRE trong bệnh viện
Theo khuyến cáo của CDC, việc loại bỏ vi khuẩn kháng vancomycin (VRE) sẽ trở nên dễ dàng hơn khi các chủng VRE chỉ xuất hiện trong một số ít bệnh nhân hoặc trong một khoa phòng cụ thể.
6 sẽ rất khó khăn và tốn kém nếu các chủng này đã lan rộng ra nhiều vị trí trong bệnh viện
Nhân viên y tế cần tích cực áp dụng các biện pháp kiểm soát nhiễm trùng và tuân thủ nghiêm ngặt quy định để hạn chế sự lây lan của VRE trong bệnh viện.
+ Thực hiện cách ly để ngăn ngừa lây truyền VRE từ bệnh nhân sang bệnh nhân
Để đảm bảo an toàn cho nhóm bệnh nhân nhiễm VRE, cần sử dụng riêng các thiết bị y tế như ống nghe, máy đo huyết áp và nhiệt kế Ngoài ra, trong quá trình chăm sóc, nhân viên y tế nên mặc áo bảo hộ và găng tay riêng để giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm.
Giải trình tự toàn bộ hệ gen và ứng dụng trong nghiên cứu đường lây truyền của
1.2.1 Vai trò của nghiên cứu đường lây truyền
Kháng kháng sinh hiện đang là một thách thức lớn đối với sức khỏe cộng đồng Việc hiểu rõ cơ chế và con đường lây truyền của các tác nhân gây bệnh, đặc biệt là vi khuẩn đa kháng, sẽ giúp kiểm soát hiệu quả các đợt dịch Một nghiên cứu tại Bệnh viện Đại học Cambridge trên 12 trẻ em mang MRSA đã phát hiện thêm 26 trường hợp liên quan và chỉ ra sự lây truyền giữa các khoa, giữa các bà mẹ tại phòng sau sinh, cũng như trong cộng đồng Để ngăn chặn lây truyền, các biện pháp phòng chống nhiễm khuẩn đã được áp dụng ngay lập tức Nghiên cứu cũng cho thấy nhân viên y tế mang MRSA có thể là nguồn lây nhiễm tiềm ẩn cho các đợt dịch trong bệnh viện.
Nghiên cứu đường lây truyền đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh, như đã chứng minh qua các đợt dịch do E coli và Klebsiella pneumoniae đa kháng Trong đại dịch Covid-19, các nghiên cứu về lây truyền của virus SARS-CoV-2 qua không khí, tiếp xúc trực tiếp và bề mặt nhiễm bẩn đã cung cấp cơ sở cho các biện pháp phòng ngừa hiệu quả Đối với virus lây lan nhanh như SARS-CoV-2, điều tra dịch tễ và lịch sử tiếp xúc là cần thiết để xác định nguồn lây và áp dụng biện pháp kiểm soát Tuy nhiên, với vi khuẩn đa kháng, việc phát hiện các trường hợp không triệu chứng trở nên khó khăn, dẫn đến việc chúng trở thành nguồn lây thầm lặng, phát tán vi khuẩn và gen kháng kháng sinh trong bệnh viện và cộng đồng.
Trong thực hành kiểm soát nhiễm khuẩn, việc xây dựng đường lây truyền là rất quan trọng để xác định chính xác các cụm chủng liên quan đến đợt dịch Để làm được điều này, ngoài thông tin dịch tễ học, cần xem xét cả trình tự hệ gen của tác nhân gây bệnh.
1.2.2 Giải trình tự toàn bộ hệ gen
1.2.2.1 Vai trò của WGS trong nghiên cứu đường lây truyền
Dữ liệu giải trình tự toàn bộ genome (WGS) cung cấp thông tin chi tiết về trình tự nhiễm sắc thể và các yếu tố di động, thu thập từ các phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới Đối với vi khuẩn đa kháng, WGS cho phép phân tích toàn diện các đặc điểm gen của vi sinh vật, bao gồm định loài, phân loại MLST, và xác định sự hiện diện của gen kháng và gen độc lực Một ứng dụng lâm sàng quan trọng của WGS là khả năng dự đoán nhanh kiểu hình kháng kháng sinh, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị chính xác Ngoài ra, trong nghiên cứu đường lây truyền, WGS hỗ trợ phân biệt rõ ràng các cụm chủng có liên quan và không liên quan đến đợt dịch thông qua việc xây dựng cây phân loài và xác định mối quan hệ gen giữa các chủng phân lập.
Các phương pháp truyền thống như định danh, định typ huyết thanh và xác định khả năng nhạy/kháng với kháng sinh thường không đủ hiệu quả trong việc phân biệt các chủng vi khuẩn Hơn nữa, chúng cũng không thể phát hiện được sự nhiễm thêm các chủng khác trong quá trình điều trị cho bệnh nhân.
Từ đó không đánh giá được chính xác tỷ lệ gây nhiễm khuẩn bệnh viện của vi khuẩn so
Các phương pháp phân biệt gen như RFLP, PFGE và MLST đều có nhược điểm chung là chỉ phân tích một phần nhỏ của hệ gen vi khuẩn, gây khó khăn trong việc phân biệt các chủng vi khuẩn có mối quan hệ gần gũi Một nghiên cứu đã so sánh khả năng phân biệt các cụm chủng giữa PFGE, MLST và WGS trên vi khuẩn, cho thấy sự cần thiết phải cải thiện các phương pháp này để nâng cao độ chính xác trong việc xác định nguồn lây truyền.
Acinetobacter baumannii kháng carbapenem có hai chủng thuộc cùng một cụm khi phân biệt bằng phương pháp PFGE và MLST, với tỷ lệ tương ứng chỉ 13,6% và 4,1% Khi sử dụng dữ liệu WGS để phân tích, khả năng thuộc cùng một cụm giảm xuống chỉ còn 13,6% và 4,1%.
Chi phí giảm và thời gian trả kết quả nhanh là những yếu tố chính khiến WGS ngày càng phổ biến Sự phát triển của WGS đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu vi khuẩn, đặc biệt trong việc kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện đối với các vi khuẩn đa kháng.
1.2.2.2 Phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gen
Phương pháp Sanger, được giới thiệu bởi nhà khoa học Sanger và cộng sự vào năm 1977, là phương pháp giải trình tự gen đầu tiên, dựa trên nguyên lý kết thúc ngẫu nhiên chuỗi DNA bằng dideoxynucleotid (ddNTP) Mặc dù Sanger đã đặt nền móng cho các phương pháp giải trình tự gen sau này, nhưng giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) đã vượt trội hơn nhờ những ưu điểm như không cần nhân bản vi khuẩn, khả năng mã hóa và tách riêng thư viện DNA trong phân tích, cùng khả năng xử lý hàng triệu trình tự song song Công nghệ NGS phổ biến nhất hiện nay là công nghệ giải trình tự dựa trên nguyên lý tổng hợp của Illumina, với quy trình bốn bước cơ bản.
Bước 1: Chuẩn bị thư viện: Cắt và chọn các mảnh DNA có kích thước 200-300 cặp base (bp) để gắn adapter
Bước 2: Tạo Cluster: Biến tính DNA thành mạch đơn và khuếch đại bằng PCR theo nguyên tắc bắc cầu
Bước 3: Giải trình tự trong từng cluster theo nguyên lý tổng hợp
Bước 4: Xử lý kết quả phân tích
1.2.2.3 Xử lý dữ liệu giải trình tự
Sau khi hoàn tất quá trình giải trình tự trên hệ thống máy Illumina, các đoạn đọc ngắn được xuất ra dưới định dạng file Fastq Để khai thác dữ liệu giải trình tự cho các nghiên cứu như sự xuất hiện của gen kháng, gen độc lực hay xây dựng cây phân loài, cần thực hiện một số bước xử lý dữ liệu thô trước.
- Đánh giá chất lượng giải trình tự
Chất lượng giải trình tự được đánh giá thông qua điểm chất lượng Q, hay còn gọi là điểm Phred, phản ánh độ chính xác của từng nucleotid được giải mã Điểm này được tính bằng một công thức cụ thể.
Công thức Q = -10 log10P được sử dụng để tính toán điểm chất lượng, trong đó P đại diện cho xác suất xảy ra lỗi khi đọc trình tự Trong các nghiên cứu thực nghiệm, ngưỡng chất lượng Q30 thường được chọn làm tiêu chuẩn để sàng lọc dữ liệu cho các phân tích tiếp theo.
Dữ liệu giải trình tự gen từ hệ thống Illumina thường bao gồm các đoạn đọc ngắn khoảng vài trăm bp, không đủ để bao phủ toàn bộ gen vi khuẩn có kích thước hàng triệu bp Do đó, trước khi tiến hành phân tích đặc điểm bộ gen, cần thực hiện việc ghép nối các đoạn đọc thành các đoạn trình tự lớn hơn Việc lắp ráp không chỉ giúp tiết kiệm bộ nhớ lưu trữ mà còn tạo ra các file có định dạng quen thuộc, tốn ít dung lượng hơn, từ đó thuận tiện hơn cho việc phân tích bằng phần mềm tin sinh học và chia sẻ dữ liệu cho các nghiên cứu khác.
Khi lắp ráp các đoạn đọc trùng lặp theo hướng đúng, ta tạo ra các contig có kích thước lớn hơn Scaffold được hình thành từ việc lắp ráp các contig này, mặc dù có thể tồn tại khoảng trống do thiếu thông tin giữa các contig Việc loại bỏ những khoảng trống này cho phép ghép các scaffold thành nhiễm sắc thể hoàn chỉnh Tuy nhiên, khi chỉ sử dụng dữ liệu từ các đoạn đọc ngắn, quá trình lắp ráp thường chỉ dừng lại ở mức scaffold do sự xuất hiện của các đoạn lặp lại.
- Đánh giá chất lượng lắp ráp
Quá trình lắp ráp gen có thể gặp khó khăn do chất lượng đoạn đọc kém, độ bao phủ không đồng đều và sự phức tạp của bộ gen, như kích thước lớn hoặc các trình tự lặp lại Để đảm bảo chất lượng lắp ráp, cần thỏa mãn ba tiêu chí quan trọng: mức độ bao phủ của các contig phải lớn nhất, số lượng lỗi lắp ráp phải nhỏ nhất và số lượng contig phải ít nhất Chất lượng lắp ráp được đánh giá thông qua một số thông số cụ thể.
Tình hình nghiên cứu đường lây truyền của VREfm trong bệnh viện
1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới
Hệ thống dữ liệu WGS phong phú, kết hợp với sự phát triển của các công cụ tin sinh học, đã làm sáng tỏ nhiều vấn đề quan trọng trong nghiên cứu nhiễm khuẩn bệnh viện.
E faecium, tiêu biểu như xây dựng mạng lưới lây truyền của các chủng kháng thuốc trong bệnh viện, phát hiện nguồn bệnh F0, từ đó nâng cao hiệu quả của các biện pháp kiểm soát và cách ly [5], [45], [66]
Khi nghiên cứu đợt dịch VREfm xảy ra tại một bệnh viện ở Đức trong giai đoạn
Từ năm 2015 đến 2016, Liese và cộng sự đã ghi nhận sự gia tăng đột biến nhiễm khuẩn do VREfm tại bệnh viện, với tỷ lệ nhiễm mới trung bình là 5,2 bệnh nhân/tháng, so với 0,94 bệnh nhân/tháng ở các giai đoạn trước Các chủng VREfm phân lập cho thấy 80% chứa gen vanB và 20% chứa gen vanA, chủ yếu thuộc các kiểu di truyền ST17, ST80, ST117, và ST192, đều thuộc dòng A1, dòng E faecium chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện Nghiên cứu đã xây dựng cây phân loài dựa trên SNP của hệ gen cốt lõi và đánh giá mức độ di chuyển cũng như tiếp xúc của bệnh nhân, từ đó phát hiện nguồn bệnh và hình thành đường lây truyền VREfm giữa các nhóm bệnh nhân.
Trong nghiên cứu giám sát nhiễm khuẩn tại một bệnh viện ở Thụy Sĩ trong vòng 3 năm, Mohamed và cộng sự (2019) đã phát hiện 10 đợt dịch do 13 kiểu gen khác nhau của VREfm gây ra, với dữ liệu giải trình tự cho thấy các chủng chủ yếu thuộc ST17, ST80 và ST117 Các chủng này thường chỉ khác nhau 0 – 3 SNP, cho thấy sự lây lan của vi khuẩn VREfm giữa các bệnh nhân trong bệnh viện Tương tự, Bernd N và cộng sự cũng báo cáo kết quả tương tự khi nghiên cứu đường lây truyền của VRE, đồng thời phát triển các công cụ hỗ trợ tích hợp và hình ảnh hóa thông tin dịch tễ của bệnh nhân vào cây phân loài.
Bằng cách giải trình tự các chủng Enterococci nhạy với vancomycin (VSE) từ người mang VRE tại một trung tâm chăm sóc sức khỏe ở Anh, Brodrick và cộng sự (2016) phát hiện rằng các chủng VSE không có sự khác biệt về hệ gen so với VRE Nghiên cứu cho thấy các chủng VSE có thể đã tiếp nhận gen kháng vancomycin từ VRE qua quá trình chuyển gen ngang, đồng thời phát hiện transposon vanA trên plasmid.
Nghiên cứu cho thấy rằng các chủng Enterococci kháng vancomycin ở người tham gia đều có nguồn gốc từ một nhân tố chuyển vị chung, cụ thể là cụm gen vanA, với trình tự transposon vanA chỉ khác nhau tối đa 1 SNP Ngoài ra, Brodrick phát hiện hệ gen của VRE tại trung tâm chăm sóc sức khỏe này tương đồng với hệ gen của VRE từ các trường hợp nhiễm khuẩn huyết tại một bệnh viện đại học gần đó, cho thấy có khả năng lây truyền giữa hai cơ sở y tế.
1.3.2 Nghiên cứu tại Việt Nam
Tại Việt Nam, nghiên cứu về con đường lây truyền của các tác nhân gây bệnh trong bệnh viện còn hạn chế, đặc biệt là đối với vi khuẩn E faecium Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào phân tích tần suất nhiễm khuẩn bệnh viện và tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn này.
Nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về dữ liệu WGS cho E faecium được thực hiện tại Bệnh viện Trung ương Huế vào năm 2018, nhằm phân tích đặc điểm gen của VRE và gen kháng vancomycin Kết quả cho thấy các chủng phân lập thuộc 5 ST: ST17, ST18, ST78, ST262 và ST1086, trong đó ST17 là phổ biến nhất Hệ gen của VREfm có nhân tố chuyển vị tương tự Tn1549 tích hợp trong nhiễm sắc thể, với tỉ lệ đột biến cao tại operon vanB2, làm tăng khả năng kháng vancomycin và teicoplanin Nghiên cứu khuyến cáo không nên sử dụng teicoplanin do lo ngại sự lan truyền của Tn1549-vanB2 Việc sử dụng hợp lý kháng sinh glycopeptid và áp dụng biện pháp giám sát hiệu quả sẽ giúp giảm thiểu sự lây truyền của VSE/VREfm trong bệnh viện.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên tất cả bệnh nhân điều trị nội trú tại Khoa ICU của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ ngày 27/06/2017 đến 09/01/2018, đáp ứng các tiêu chuẩn đã đề ra.
- Bệnh nhân từ 18 tuổi trở lên
Vi khuẩn E faecium được phân lập từ 04 loại mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu môi trường bằng cách nuôi cấy trên môi trường chọn lọc CHROMagar™ VRE (CHROMagar, Paris, Pháp) Mẫu bệnh phẩm bao gồm ngoáy trực tràng, nước tiểu, đờm/dịch hút phế quản hoặc vết thương (nếu có) được thu thập tại các thời điểm khác nhau như lúc vào nghiên cứu, hàng tuần trong quá trình điều trị và khi ra viện Mẫu môi trường được lấy từ các vị trí như giường bệnh nhân, thiết bị y tế như máy thở, máy theo dõi, máy lọc máu, hoặc tủ đầu giường bệnh với tần suất 1 lần mỗi tháng.
- Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn E faecium này cho thấy chủng này đã kháng với kháng sinh vancomycin
- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu
- Bệnh nhân rút khỏi nghiên cứu tại bất kỳ giai đoạn nào
Nghiên cứu tuyển chọn được 48 bệnh nhân, tương ứng phân lập được 100 mẫu bệnh phẩm và 4 mẫu môi trường.
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại 04 phòng ICU gồm HS1 (giường 1-5), HS2 (giường 6-8), HS3 (giường 9-11) và HS4 (giường 12-16) thuộc Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Sơ đồ bố trí giường bệnh và phòng bệnh tại Khoa ICU được trình bày trong Phụ lục 1.
Quy trình nghiên cứu được thể hiện trong Hình 2.1
2.2.2 Các nội dung nghiên cứu
Mục tiêu 1: Xây dựng cây phân loài từ các chủng VREfm phân lập được, gồm 3 nội dung nghiên cứu:
- Phân tích dữ liệu WGS
- Xác định mức độ sai khác SNP hệ gen cốt lõi giữa các cặp chủng
- Xây dựng cây phân loài
Mục tiêu 2: Xây dựng đường lây truyền của VREfm tại Khoa ICU, gồm 4 nội dung nghiên cứu:
- Xác định các nhánh của cây phân loài
- Xác định ngưỡng SNP và cụm lây truyền
- Xây dựng mô hình dịch tễ
- Xây dựng đường lây truyền
Tuyển chọn BN → Theo dõi BN, thu mẫu bệnh phẩm → Nuôi cấy, phân lập trên môi trường chọn lọc → Định danh → Làm KSĐ
Phân tích thông tin dịch tễ học của BN
Phân tích dữ liệu WGS của VREfm
Xây dựng cây phân loài
Xác định ngưỡng SNP và cụm lây truyền Đường lây truyền Phân loại theo MLST
Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu thập thông tin bệnh nhân
Thông tin dịch tễ của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu được trích xuất từ dữ liệu bệnh án điện tử, bao gồm:
- Thời điểm nhập viện/xuất viện
- Thời điểm tham gia vào nghiên cứu
- Các thời điểm lấy mẫu bệnh phẩm
Các bệnh nhân tham gia nghiên cứu được đánh dấu bằng ký hiệu ND kèm theo số thứ tự theo thời gian Mẫu môi trường cũng được ghi nhận bằng ký hiệu NHE cùng với số thứ tự tương ứng theo thời gian.
2.3.2 Phương pháp thu thập thông tin liên quan đến các chủng VREfm
- Mỗi bệnh nhân tham gia nghiên cứu được thu thập 4 loại mẫu bệnh phẩm: ngoáy trực tràng; nước tiểu; đờm/dịch hút phế quản; vết thương (nếu có)
- Thời điểm lấy mẫu: Tại thời điểm vào nghiên cứu; lấy mẫu 1 lần mỗi tuần trong thời gian nằm viện và tại thời điểm xuất viện
Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn, cũng như xác định độ nhạy kháng với kháng sinh, được mô tả chi tiết trong Phụ lục 2 Thực nghiệm được thực hiện tại phòng Vi khuẩn, Khoa Xét nghiệm của Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương.
Quy trình giải trình tự gen thế hệ mới sử dụng hệ thống Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) được mô tả chi tiết trong Phụ lục 3, với các thí nghiệm được thực hiện tại viện Sanger, Vương quốc Anh.
2.3.3 Phương pháp xử lý dữ liệu
2.3.3.1 Đánh giá chất lượng giải trình tự gen
Dữ liệu giải trình tự từ hệ thống Illumina Hiseq được kiểm soát chất lượng bằng phần mềm FastQC (v.0.11.8) và loại bỏ các vị trí kém chất lượng với ngưỡng Q30 bằng phần mềm Trimmomatic (v.0.39).
Lắp ráp de novo bộ gen vi khuẩn VREfm từ các đoạn đọc (reads) thành các contig bằng phần mềm SPAdes (v3.12.0) [cab.spbu.ru/software/spades/]
2.3.3.3 Xác định kiểu trình tự
Kiểu trình tự (ST) của các chủng Enterococcus faecium được xác định từ contig sau khi lắp ráp, sử dụng phần mềm MLST phiên bản 2.18.0 Dữ liệu này dựa trên cơ sở dữ liệu ST có sẵn tại https://pubmlst.org/efaecium/ Cơ sở dữ liệu này bao gồm các sơ đồ MLST gốc và các thông tin liên quan đến các allele và kiểu gen, cung cấp thông tin quan trọng cho việc phân loại và nghiên cứu các chủng vi khuẩn.
2.3.3.4 Xây dựng cây phân loài và xác định các SNP của hệ gen cốt lõi
Trình tự hệ gen cốt lõi được gióng hàng bằng phần mềm PARsnp (v1.2) [github.com/marbl/parsnp], với thuật toán xác định rằng các đoạn trình tự xuất hiện ở hơn 90% số chủng tham gia nghiên cứu tạo thành hệ gen cốt lõi Chủng NHE112, được phân lập tại giường số 8 vào ngày 09/07/2017, được chọn làm chủng tham chiếu để gióng hàng trình tự, đảm bảo kích thước của nó nằm trong khoảng trung bình của các chủng nghiên cứu và phản ánh gần nhất bộ gen của các chủng VRE trong môi trường bệnh viện.
Các đoạn tái tổ hợp đã được loại bỏ khỏi hệ gen cốt lõi bằng phần mềm Gubbin (v.2.3.5) [github.com/sanger-pathogens/Gubbins] Số lượng SNP khác biệt trong hệ gen cốt lõi giữa các cặp chủng được tính toán thông qua phần mềm snp-dists (v0.7.0) [github.com/tseemann/snp-dists].
Phần mềm IQ-Tree 2 là công cụ hiệu quả để xây dựng cây phân loài, sử dụng mô hình K2P+ASC và được đánh giá bằng ModelFinder Plus, với giá trị bootstrap đạt 1000 [iqtree.org].
Số liệu thống kê được xử lý bằng phần mềm SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago)
2.3.3.6 Quản lý và lưu trữ dữ liệu
Toàn bộ dữ liệu WGS của các chủng VREfm phân lập được quản lý và lưu trữ trên Onedrive với định dạng FASTQ
2.3.4 Phương pháp xây dựng đường lây truyền
Khả năng lây truyền vi khuẩn VREfm từ bệnh nhân A sang bệnh nhân B được xác định dựa trên mô hình ba yếu tố Thời gian – Không gian – Trình tự (TPS) Yếu tố thời gian yêu cầu rằng thời điểm phân lập chủng VREfm ở bệnh nhân A phải xảy ra trước khi phân lập chủng VREfm ở bệnh nhân B Yếu tố trình tự gen được thỏa mãn khi hai chủng vi khuẩn thuộc cùng một cụm lây truyền trên cây phân loại Cuối cùng, yếu tố không gian được xác định khi xảy ra một trong các trường hợp liên quan đến vị trí lây nhiễm.
- Bệnh nhân A và B có ≥ 1 ngày nằm cùng phòng
- Bệnh nhân A đã nằm tại giường ≥ 14 ngày, trong vòng không quá 7 ngày, bệnh nhân
B cũng chuyển vào đúng giường đó [10], [19]
Khả năng lây truyền giữa các bệnh nhân mang VREfm trong bệnh viện được đánh giá dựa trên các mức độ chắc chắn khác nhau Mức độ chắc chắn cao hơn khi thỏa mãn nhiều yếu tố trong mô hình TPS Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân chia đường lây truyền thành hai mức độ, với mức độ chắc chắn 1 được xác định khi thỏa mãn cả yếu tố thời gian và yếu tố trình tự hệ gen.
2 (cao hơn mức độ 1) xảy ra khi thỏa mãn cả 3 yếu tố [65], [10].
Vấn đề đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu thuộc dự án: “Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới để xác định vi khuẩn đa kháng thuốc gây nhiễm khuẩn bệnh viện”
Nghiên cứu được sự phê duyệt của Hội đồng đạo đức - Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Số quyết định: 241/NĐTW-TCCB ngày 2 tháng 6 năm 2016
Mọi dữ liệu thu thập được đảm bảo tính bảo mật, chỉ phục vụ mục đích nghiên cứu
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng cây phân loài của các chủng VREfm phân lập được
3.1.1 Thông tin chung về đối tượng nghiên cứu
Từ ngày 27/06/2017 đến 09/01/2018, Khoa ICU Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn 48 bệnh nhân nhiễm VREfm Tất cả bệnh nhân đều được ghi nhận đầy đủ thông tin về dịch tễ, kháng sinh đồ và dữ liệu giải trình tự toàn bộ gen của các chủng VREfm được phân lập.
Trong quá trình nghiên cứu, đã phân lập thành công 104 chủng VREfm từ các mẫu bệnh phẩm và môi trường Đặc biệt, 24 trong số 48 bệnh nhân (chiếm 50,0%) có ít nhất hai mẫu bệnh phẩm dương tính với VREfm Tỉ lệ các chủng VREfm theo từng loại mẫu bệnh phẩm được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Tỉ lệ các chủng VREfm theo loại mẫu bệnh phẩm
Ngoáy trực tràng Đờm/dịch hút phế quản
Trong nghiên cứu, tổng cộng có 100 chủng VREfm được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân trong thời gian nằm viện, cùng với 4 chủng VREfm được lấy từ môi trường Các chủng VREfm chủ yếu được phát hiện ở trực tràng, chiếm tới 89,52%, bên cạnh đó có 2 trường hợp phát hiện VREfm trong bệnh phẩm đờm/dịch hút phế quản và 4 trường hợp trong bệnh phẩm nước tiểu Đặc biệt, cả 4 mẫu môi trường mang VREfm đều được phân lập vào ngày 09/07/2017 tại các vị trí giường số 4, 5, 8 và 12B.
Các chủng VREfm chủ yếu được phân lập từ mẫu bệnh phẩm ngoáy trực tràng, vì E faecium là một trong những vi khuẩn thuộc vi hệ đường ruột của người bình thường Nghiên cứu của Been và cộng sự (2013) đã chứng minh sự hiện diện của các vi khuẩn này trong các mẫu bệnh phẩm.
Khuẩn E faecium nhạy với vancomycin trong đường ruột có thể đã tích hợp nhân tố chuyển vị vanA hoặc vanB thông qua plasmid từ một chủng VRE trong bệnh viện, dẫn đến tình trạng kháng vancomycin ngày càng phổ biến, gây đe dọa cho sức khỏe bệnh nhân Khoa ICU Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương tiếp nhận và điều trị các bệnh nhân nhiễm trùng nặng, như sốc nhiễm khuẩn và viêm não màng não, những người thường có hệ miễn dịch suy giảm và tiền sử sử dụng kháng sinh, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nhiễm khuẩn do VREfm.
3.1.2 Kết quả mức độ sai khác SNP hệ gen cốt lõi
Chúng tôi sử dụng chủng môi trường NHE112 làm tham chiếu để xác định và so sánh hệ gen cốt lõi của 104 chủng VREfm bằng phần mềm Parsnp (v.1.2) Qua đó, 104 chủng VREfm tạo thành 5356 cặp và số lượng SNP của hệ gen cốt lõi được thống kê bằng phần mềm Snp-dist (v.0.7.0) Kết quả thống kê được trình bày trong Hình 3.1.
Hình 3.1 Biểu đồ thống kê số lượng SNP sai khác tại hệ gen cốt lõi
Nghiên cứu cho thấy sự đa dạng về đặc điểm hệ gen của các chủng phân lập Sau khi loại bỏ các đoạn tái tổ hợp, số lượng SNP khác nhau trong hệ gen cốt lõi của từng cặp 2 chủng VRE dao động từ 0 đến 180, với phần lớn tập trung trong khoảng 0-5 SNP Đặc biệt, có 355 cặp (chiếm 6,63%) có sự khác biệt 0 SNP, tức là hệ gen cốt lõi hoàn toàn giống nhau.
Số lượng SNP trong hệ gen cốt lõi giữa các cặp sẽ được sử dụng để xây dựng cây phân loài và xác định các cụm lây truyền.
3.1.3 Cây phân loài dựa trên SNP hệ gen cốt lõi
Phân tích phân loài dựa trên dữ liệu WGS và SNP của hệ gen cốt lõi là phương pháp phổ biến để nghiên cứu sự phong phú và đặc điểm tiến hóa của các chủng vi khuẩn trong môi trường bệnh viện Chúng tôi đã xây dựng cây phân loài cho 104 chủng VREfm bằng phương pháp Maximum Likelihood sử dụng phần mềm IQ-Tree 2, dựa trên mức độ sai khác SNP của hệ gen cốt lõi Kết quả phân tích được thể hiện trong Hình 3.2.
Hình 3.2 Cây phân loài của 104 chủng VREfm dựa trên SNP hệ gen cốt lõi
Chủng VREfm được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân mã ND003 trong lần xét nghiệm thứ nhất, ký hiệu là ND003_L1 Ngoài ra, NHE là chủng VREfm phân lập từ mẫu môi trường Chỉ số bootstrap, thể hiện bằng phần trăm tại các nhánh của cây phân loài, cho biết độ tin cậy của nhánh đó; ví dụ, chỉ số 99 cho thấy nhánh có độ tin cậy lên đến 99%.
Cây phân loài được xây dựng từ 104 chủng VREfm cho thấy mức độ tương đồng cao trong hệ gen, với không có chủng nào khác biệt đủ để tạo thành nhóm ngoài Các chủng có hệ gen cốt lõi giống hệt nhau được xếp vào cùng một nhánh, cho thấy xu hướng phân chia thành một số nhóm lớn Trong đó, các chủng trong cùng một nhóm có mối quan hệ gần gũi hơn so với các chủng thuộc hai nhóm khác nhau.
Kể từ khi kỹ thuật giải trình tự gen trở nên phổ biến, việc sử dụng dữ liệu WGS để xây dựng cây phân loài đã trở thành phương pháp ưu việt trong việc phát hiện các cụm chủng có mối quan hệ gen gần gũi, vượt trội hơn so với các phương pháp truyền thống như MLST, cgMLST hay PFGE, vốn chỉ tập trung vào một phần nhỏ của hệ gen Trong nghiên cứu kiểm soát nhiễm khuẩn, cây phân loài cung cấp cái nhìn tổng quát về mô hình tiến hóa của các chủng theo thời gian và có khả năng phân biệt chính xác các cụm chủng trong cùng một đợt dịch hoặc đường lây truyền SNP hệ gen cốt lõi hiện là dữ liệu đầu vào đáng tin cậy cho việc xây dựng cây phân loài, tuy nhiên, trong nghiên cứu này, các SNP đã được loại bỏ các đoạn tái tổ hợp, vì chúng có thể làm biến đổi hình dạng và độ dài các nhánh của cây Nếu ước tính cả các đoạn tái tổ hợp, khối lượng kịch bản tiến hóa cần thiết sẽ vượt quá khả năng của các công cụ hiện tại.
Nghiên cứu của Santona và cộng sự (2018) tại Bệnh viện Trung ương Huế có đối tượng nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu của chúng tôi, trong đó các tác giả đã xây dựng hai cây phân loài dựa trên dữ liệu SNP của hệ gen cốt lõi và toàn bộ hệ gen, phát hiện sự khác biệt trong cấu trúc của hai cây này Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen hiện tại sử dụng hệ thống Illumina cho phép giải trình tự các đoạn ngắn, dẫn đến khó khăn trong việc lắp ráp hệ gen hoàn chỉnh do sự tồn tại của các đoạn lặp lại trong gen vi khuẩn Dữ liệu SNP từ toàn bộ hệ gen thường thiếu độ tin cậy hơn so với dữ liệu từ hệ gen lõi, do đó, cây phân loài dựa trên SNP của hệ gen cốt lõi sẽ chính xác hơn Mục đích nghiên cứu của Santona và cộng sự là xác định sự gần gũi di truyền của các chủng VREfm với các chủng tham chiếu toàn cầu, trong khi nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào việc xây dựng đường lây truyền Điều này cho thấy ứng dụng của cây phân loài trong việc xác định vị trí và nguồn gốc các chủng vi khuẩn tại Việt Nam so với các chủng khác trên thế giới.
Xây dựng đường lây truyền của VREfm tại Khoa ICU
3.2.1 Kết quả phân chia nhánh trên cây phân loài
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân chia 104 chủng trên cây phân loài thành các nhánh bằng cách chọn nhánh lớn nhất từ gốc cây, đảm bảo rằng các chủng trong nhánh đều thuộc một loại ST Mỗi nhánh bao gồm một tổ tiên chung và tất cả các thế hệ sau của nó, theo quy ước quốc tế Kết quả phân chia nhánh được trình bày rõ ràng trong Hình 3.3.
Kí hiệu ND003_L1 chỉ ra rằng chủng VREfm được phân lập từ mẫu bệnh phẩm xét nghiệm đầu tiên của bệnh nhân ND003, trong khi NHE là chủng VREfm phân lập từ mẫu môi trường ST (Sequence Type) là kiểu chuỗi, và chỉ số bootstrap thể hiện độ tin cậy của các nhánh trong cây phân loại; ví dụ, chỉ số 99 cho thấy nhánh đó có độ tin cậy 99% Các chủng thuộc cùng một nhóm sẽ có các đặc điểm di truyền tương đồng.
Hình 3.3 Kết quả phân chia nhánh trên cây phân loài
27 một ST, tên chủng được kí hiệu cùng màu Các chủng thuộc cùng một nhánh, nhánh được kí hiệu cùng màu
Tại Khoa ICU, đã phân lập được 104 chủng VREfm từ 7 kiểu di truyền (ST) khác nhau Trong đó, 48,08% các chủng thuộc ST552, 24,04% thuộc ST17, và khoảng 28% còn lại thuộc các ST11, ST78, ST80, ST612, và ST759 Theo định nghĩa nhánh, có 11 nhánh được xác định, với ST17 chia thành 5 nhánh A, B, C, D và E, trong khi ST552 chia thành 3 nhánh A, B và C Các nhánh còn lại thuộc về ST80, ST612 và ST759 Đáng chú ý, 1 chủng thuộc ST11 (ND195_L2) và 2 chủng thuộc ST78 (ND121_L1 và ND61_L4) không tạo thành nhánh nào.
Ngoại trừ hai chủng ND161_L4 và ND121_L1 không xác định được kiểu ST, các chủng còn lại trong nghiên cứu thuộc 7 ST khác nhau, tất cả đều nằm trong phức hợp CC17, liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện và bùng phát dịch toàn cầu Nhóm này mang cụm gen vanA hoặc vanB, dễ biểu hiện kháng vancomycin và thu nhận gen kháng ngoại sinh khác ST17 là ST phổ biến trong các đợt dịch VREfm toàn cầu, nhưng tại Việt Nam, chỉ có gần 25% số chủng thuộc ST17 trong nghiên cứu của chúng tôi, so với hơn 50% trong nghiên cứu từ Bệnh viện Trung ương Huế Đặc biệt, ST552 chiếm gần 50% số chủng VRE trong nghiên cứu của chúng tôi, cho thấy sự phổ biến hơn Cả ST17 và ST552 đều là các chủng đa kháng kháng sinh và có thể phân thành nhiều nhánh dựa trên cấu trúc cây phân loài, do chứa các gen kháng kháng sinh khác nhau.
Phân loại các chủng E faecium dựa trên 7 gen chức năng thiết yếu như gdh, purK, pstS, atpA, ddl, gyd, và adk được coi là tiêu chuẩn vàng trong phân loại vi khuẩn Tuy nhiên, việc chỉ dựa vào trình tự của 7 gen này để xác định chủng VREfm gây ra đường lây truyền là không đủ chặt chẽ Do đó, cần áp dụng các tiêu chí phân loại nghiêm ngặt hơn như phân loại theo MLST Kết quả phân loại theo MLST cho thấy 7 ST được chia thành 11 nhánh, trong đó không có nhánh nào chỉ gồm các chủng phân lập từ một bệnh nhân, và một số nhánh có sự xuất hiện của các chủng khác nhau.
VREfm được phân lập từ môi trường, cho thấy khả năng lây truyền giữa các bệnh nhân và sự ảnh hưởng của yếu tố môi trường như giường bệnh và thiết bị y tế đã qua sử dụng trong quá trình lây nhiễm.
3.2.2 Kết quả ngưỡng SNP và cụm lây truyền Để xác định chính xác hơn các cụm lây truyền, từ nhánh chúng tôi phân chia thành các cụm lây truyền bằng cách đưa ra một ngưỡng sai khác SNP hệ gen cốt lõi Hai chủng bất kì thuộc cùng một cụm phải có mức độ sai khác SNP không vượt quá ngưỡng Chúng tôi thống kê mức độ sai khác SNP hệ gen cốt lõi giữa các chủng trong cùng nhánh mà thuộc cùng một bệnh nhân và nhận thấy có sự khác nhau không quá 2 SNP Hay nói cách khác, chủng VREfm mà một bệnh nhân mang được chấp nhận là có sự biến đổi ≤
Trong nghiên cứu này, các chủng VREfm được phân loại thành một chủng duy nhất nếu chúng có sự khác biệt ≤ 2 SNP trong hệ gen cốt lõi Điều này cho thấy rằng nếu hai bệnh nhân mang các chủng VREfm khác nhau với sự khác biệt ≤ 2 SNP, có khả năng xảy ra lây truyền giữa họ.
Ngưỡng sai khác SNP trong hệ gen cốt lõi để xác định một cụm lây truyền là 2SNP Dựa trên ngưỡng này, các cụm lây truyền được xây dựng với điều kiện rằng tất cả các chủng trong một cụm phải thuộc cùng một nhánh.
2) Các chủng trong cùng một cụm khác nhau không quá 2SNP hệ gen cốt lõi 3) Trong cụm phải có sự xuất hiện của các chủng thuộc ≥ 2 bệnh nhân hoặc ≥1 bệnh nhân và 1 chủng từ môi trường Dựa vào tiêu chuẩn lựa chọn, các cụm lây truyền xác định được được trình bày trong Bảng 3.2
Bảng 3.2 Các cụm lây truyền trong 104 chủng VREfm
Tên cụm Số lượng chủng Các chủng thành phần
ND047_L6, ND047_L7, ND047_L8 ND062_L3; ND079_L3; ND127_L2 NHE126
ND171_L2, ND171_L4, ND171_L5, ND171_L6, ND171_L7
ND172_L2, ND172_L3, ND172_L3D, ND172_L4, ND172_L5, ND172_L6
ND182_L2; ND189_L3; ND198_L4 ND199_L3, ND199_L4
ND081_L1 ND087_L1, ND087_L3, ND087_L4 ND108_L1
ND075_L5, ND075_l6, ND075_L8, ND075_L9 ND089_L6, ND089_L6T, ND089_L7, ND089_L7T ND117_L2, ND117_L6, ND117_L7
ND132_L1 ND158_L2, ND158_L3 ND161_L2, ND161_L3 ND162_L1, ND162_L2, ND162_L3, ND162_L5 ND168_L2; ND176_L3
ND050_L8; ND061_L6; ND063_L3; ND080_L2; ND111_L4
ND021_L2, ND021_L3 ND024_L4; ND057_L4; ND074_L5; ND109_L1 NHE112
Kí hiệu bệnh phẩm bao gồm T cho mẫu nước tiểu, D cho mẫu đờm hoặc dịch hút phế quản, trong khi các chủng VRE không có kí hiệu được coi như lấy từ bệnh phẩm ngoáy trực tràng.
Trong số 104 chủng VREfm được phân lập, đã xác định được 12 cụm lây truyền liên quan đến 87 chủng, chiếm 83,65% Cụm lây truyền lớn nhất bao gồm 24 chủng và liên quan đến 10 bệnh nhân, trong khi cụm nhỏ nhất chỉ có 2 chủng, liên quan đến 1 bệnh nhân và 1 mẫu môi trường.
Việc áp dụng các tiêu chuẩn phân cụm chặt chẽ hơn là cần thiết nhằm loại bỏ các chủng không tham gia lây truyền, từ đó giảm thiểu nhu cầu đánh giá các đường lây truyền.
Trong nghiên cứu về đường lây truyền VREfm, việc xác định ngưỡng SNP là rất quan trọng Liese và cộng sự (2018) xác định ngưỡng phân cụm là 13 SNP dựa trên biểu đồ thống kê, trong khi Adelbary và cộng sự (2019) lại sử dụng cây phân loài từ dữ liệu WGS với sự khác nhau 0-2 SNP trong cùng một cụm Nghiên cứu của chúng tôi kết hợp cả hai phương pháp để tìm ra ngưỡng SNP phù hợp nhất Theodore và cộng sự (2021) cũng áp dụng cách tiếp cận này, nhưng phải chọn ngưỡng SNP sơ bộ dựa trên kinh nghiệm Sự khác nhau trong ngưỡng SNP giữa các nghiên cứu phụ thuộc vào mức độ biến đổi gen trong quần thể Từ ngưỡng 2 SNP, chúng tôi xác định được 12 cụm lây truyền liên quan đến 87 chủng VREfm, loại bỏ 17 chủng không gây lây truyền Các chủng trong cùng một cụm được coi là thỏa mãn điều kiện về trình tự gen trong quá trình xây dựng đường lây truyền.
3.2.3 Mô hình thông tin dịch tễ của bệnh nhân
Trong nghiên cứu, 48 bệnh nhân được điều trị tại bốn phòng ICU (HS1, HS2, HS3, HS4) Để dễ dàng kết hợp các yếu tố thời gian, không gian và trình tự gen, thông tin về thời gian nằm viện, vị trí giường, thời điểm phân lập và chủng VREfm từ bệnh nhân cũng như các chủng môi trường đã được mô hình hóa trong Hình 3.4.
A-D: Mô hình dịch tễ của các bệnh nhân tại phòng HS1-HS4
Hình 3.4 Mô hình dịch tễ của các bệnh nhân tại Khoa ICU
Kí hiệu: ND003: mã bệnh nhân;
L1: phân lập được VRE tại lần xét nghiệm thứ nhất;
T: mẫu bệnh phẩm nước tiểu, D: mẫu bệnh phẩm đờm/dịch hút phế quản Những chủng VRE không kí hiệu coi như lấy từ bệnh phẩm ngoáy trực tràng
Thời điểm vào nghiên cứu
Các bệnh nhân điều trị tại phòng HS1
Bàn luận chung
Một trong những chiến lược hiệu quả nhất để kiểm soát dịch bệnh do nhiễm khuẩn trong bệnh viện là phát hiện sớm nguồn lây và đường lây truyền, đặc biệt khi có bệnh nhân mang vi khuẩn đa kháng Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) được coi là phương pháp tối ưu để giải quyết vấn đề này, cung cấp thông tin về chủng vi khuẩn và xây dựng cây phân loài, từ đó xác định chính xác các chủng tham gia đợt dịch cũng như khả năng tiến hóa của hệ gen vi khuẩn Nghiên cứu của chúng tôi đã ứng dụng dữ liệu WGS của VREfm để xây dựng cây phân loài và đường lây truyền của VREfm ở các bệnh nhân điều trị tại Khoa ICU, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Kết quả nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu trước đó về E faecium, cho thấy việc điều trị cùng phòng với bệnh nhân mang VREfm là một yếu tố nguy cơ nhiễm VREfm trong bệnh viện.
Chúng tôi không chỉ dừng lại ở việc phân lập mẫu bệnh phẩm VREfm đầu tiên, mà còn thực hiện xét nghiệm hàng tuần cho đến khi bệnh nhân hoàn tất điều trị, bất kể có phát hiện vi khuẩn VREfm hay không Thiết kế nghiên cứu này giúp chúng tôi phát hiện các lần phơi nhiễm với các chủng vi khuẩn khác nhau, đặc biệt đối với bệnh nhân đã được xác định là mang VREfm Ngoài mẫu bệnh phẩm phân và ngoáy trực tràng thường được sử dụng trong các nghiên cứu về E faecium, chúng tôi còn mở rộng phạm vi nghiên cứu để thu thập thông tin toàn diện hơn.
Chúng tôi đã nghiên cứu các mẫu bệnh phẩm như nước tiểu, đờm/dịch hút phế quản và vết thương, phát hiện 3 bệnh nhân ND089, ND172 và ND202 có chủng VREfm giống hệt với mẫu bệnh phẩm ngoáy trực tràng Những bệnh nhân này, đặc biệt là ở Khoa ICU, có nhiều yếu tố nguy cơ dẫn đến việc mang vi khuẩn đa kháng tại nhiều vị trí, dễ gây nhiễm khuẩn và đe dọa sức khỏe Đường lây truyền trong nghiên cứu được xác định dựa trên 3 yếu tố: Thời gian, Không gian và Trình tự gen, nhằm đảm bảo độ tin cậy cao và loại bỏ các khả năng lây truyền thấp, từ đó nâng cao hiệu quả kiểm soát nhiễm.
Chúng tôi đã xây dựng cây phân loại từ dữ liệu SNP hệ gen cốt lõi để phân biệt các cụm VREfm gây ra lây truyền, xác định các cụm dựa vào ngưỡng SNP sai khác Phương pháp này tương tự như các nghiên cứu gần đây về đường lây truyền của vi khuẩn đa kháng, đặc biệt là VREfm Ngưỡng SNP được xác định bằng cách kết hợp nhiều phương pháp khác nhau Ngoài ra, chúng tôi đã xây dựng mô hình dịch tễ học cho 48 bệnh nhân tại Khoa ICU, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ tháng 6/2017 đến tháng 1/2018, phát hiện 22 đường lây truyền liên quan đến 27 bệnh nhân Việc áp dụng phương pháp này trong các nghiên cứu thời gian thực sẽ nâng cao hiệu quả kiểm soát nhiễm khuẩn do VREfm và các tác nhân đa kháng khác.
Nghiên cứu này có hạn chế khi chỉ phân tích đường lây truyền bên trong Khoa ICU, thiếu thông tin về lịch sử tiếp xúc của bệnh nhân và tình trạng mang VREfm của nhân viên y tế Do đó, không thể xem xét các đường lây truyền bên ngoài khoa, có thể dẫn đến việc bỏ sót một số khả năng lây truyền quan trọng.
