Nghiên cứu sự đa hình và mối liên quan đến độc tính thuốc của một số gen liên quan đến quá trình dược động học của 6 mercaptopurin từ dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen

TỔNG QUAN

Tổng quan về 6- mercaptopurin

6- mercaptopurin, với công thức phân tử C5H4N4S (Hình 1.1), tác động vào các quá trình sinh hóa có sự tham gia của purin nội sinh- là thành phần thiết yếu của ADN (Acid deoxyribonucleic), ARN (Acid ribonucleic) và các coenzym

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của 6- mercaptopurin [27]

Nhờ vào hoạt động của nhóm thiol, 6-MP có khả năng gây độc tế bào và ức chế miễn dịch thông qua việc ức chế tổng hợp protein, ADN và ARN Cơ chế này là yếu tố chính giúp 6-MP phát huy tác dụng trong điều trị.

6- MP có hiệu quả trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính (ALL) và bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (CML) Ngoài ra, 6- MP còn được sử dụng như một loại thuốc ức chế miễn dịch để điều trị các bệnh như xuất huyết giảm tiểu cầu vô căn (ITP), thiếu máu tan huyết tự miễn, bệnh Crohn và bệnh đa xơ cứng Do con đường chuyển hóa của 6- MP rất đa dạng, nghiên cứu về ảnh hưởng của sự đa hình và mối liên quan đến độc tính thuốc từ các gen liên quan đến quá trình dược động học của 6- mercaptopurin đang thu hút sự quan tâm lớn trên toàn cầu.

6- mercaptopurin có ba con đường chuyển hóa chính: Chuyển hóa bằng xanthin oxidase thành 6 TUA (Acid 6-thiouric), chuyển hóa bởi TPMT thành 6 MMP (6- methylmercaptopurin) và chuyển hóa bằng HGPRT (Hypoxanthin phosphoribosyl transferase) thành 6 TGN (6-thioguanin nucleotid) và các chất chuyển hóa khác (Hình 1.2) Mối quan hệ giữa 3 con đường chuyển hóa này có thể sử dụng để giải thích được

Có ba sự khác biệt chính trong đáp ứng điều trị và độc tính giữa các cá thể Khi thuốc được sử dụng qua đường tiêm tĩnh mạch, thời gian bán thải của nó khoảng 1 giờ ở người lớn Trong khi đó, thời gian bán thải khi dùng thuốc qua đường uống lên đến 6 giờ.

MP được chuyển hóa nhanh chóng qua gan nhờ sự hiện diện của enzyme XO (xanthin oxidase) tại niêm mạc ruột và gan, dẫn đến sinh khả dụng dưới 50% Thuốc được hấp thu nhanh, chỉ sau 1-2 giờ và phân bố chủ yếu vào các mô và hồng cầu Con đường chuyển hóa thông qua TPMT tạo ra dẫn chất 6MMP không có hoạt tính, trong khi con đường qua HGPRT sẽ tạo ra các sản phẩm khác.

6 TGN được tích hợp vào ADN tạo ra 6 TdGTP và ARN tạo ra 6 TGTP (6-thioguanin triphosphat), có tác dụng điều trị bạch cầu cấp và ức chế miễn dịch, gây độc tính với tủy xương 6 TGTP cũng ngăn chặn con đường Rac1 trong tế bào T, ức chế sự trình diện kháng nguyên của tế bào lympho T và phản ứng miễn dịch tiếp theo.

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa chính của 6- mercaptopurin [17]

Phân bố của 6-MP trong não được thực hiện thông qua hệ thống vận chuyển hiệu quả qua hàng rào máu não Thời gian bán hủy của 6-MP trong huyết thanh là dưới 2 giờ.

4 nhiên, các 6 TGN hoạt động tập trung ở trong các tế bào nên thời gian tác dụng kéo dài nhiều ngày [38]

6- MP được sử dụng với vai trò điều trị ALL, CML dựa vào cơ chế ngăn chặn tổng hợp ADN của các tế bào ác tính Enzym HGPRT chuyển 6- MP thành 6 TIMP (6- thioinosin monophosphat) 6 TIMP tích lũy nội bào và là cơ chất yếu cho MPK (Monophosphat kinase) nên 6 TIMP ức chế sự tổng hợp mới ribosyl-5-phosphate, cũng như sự chuyển hóa các nucleotid thành adenin và guanin 6 TGN sau các quá trình chuyển hóa trung gian sẽ được tích hợp vào ADN, gây ra đứt gãy sợi, làm hỏng ADN của tế bào ác tính [3]

6- MP còn được sử dụng với vai trò một thuốc ức chế miễn dịch, để điều trị một số bệnh như: xuất huyết giảm tiểu cầu vô căn, thiếu máu huyết tán tự miễn Ngoài ra, thuốc cũng đã được sử dụng thành công trong việc kiểm soát viêm cầu thận cấp thứ phát do bệnh lupus ban đỏ hệ thống, và trong một số trường hợp viêm khớp dạng thấp, bệnh Crohn (IBD), bệnh đa xơ cứng [38] 6- MP còn có tác dụng trong điều trị các bệnh đường ruột [38]

1.1.2.2 Độc tính Độc tính chính được ghi nhận của 6- mercaptopurin là ức chế tủy xương, với những biểu hiện bao gồm giảm bạch cầu, thiếu máu, tăng kích thước hồng cầu và giảm tiểu cầu Bệnh nhân giảm bạch cầu nặng có thể dẫn đến nhiễm trùng cơ hội [38]

Sử dụng 6-MP với liều cao có thể gây ra các triệu chứng như ban da, sốt, buồn nôn, nôn, tiêu chảy và các vấn đề tiêu hóa khác Ngoài ra, bệnh nhân cũng có thể gặp rối loạn chức năng gan, thể hiện qua nồng độ enzym phosphatase kiềm trong huyết thanh tăng cao và đôi khi xuất hiện vàng da nhẹ, đặc biệt ở những người có tiền sử rối loạn chức năng gan.

Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và giải trình tự toàn bộ hệ

1.2.1 Khái niệm NGS và WGS

Giải trình tự gen là quy trình xác định trình tự nucleotid của chuỗi ADN, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong đó, giải trình tự gen thế hệ đầu tiên có vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền và y học.

Có năm phương pháp phổ biến trong giải trình tự gen, bao gồm phương pháp hóa học do Maxam và Gilbert phát triển vào tháng 2/1977, và phương pháp giải trình tự Sanger được công bố bởi Sanger vào tháng 12/1977 Trong thập kỷ qua, phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (Next-generation sequencing - NGS) đã ra đời, cho phép thực hiện hàng loạt phản ứng song song để tạo ra một lượng lớn trình tự từ nhiều mẫu với thông lượng cao Một ứng dụng quan trọng của NGS là giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS), trong đó toàn bộ trình tự nucleotid của hệ gen được xác định đồng thời.

1.2.2 Ứng dụng NGS và WGS trong lĩnh vực hệ gen dược học

Trong trị liệu ung thư:

Bệnh ung thư xuất phát từ biến đổi ADN trong tế bào khối u, gây ra những hậu quả nghiêm trọng Do đó, nghiên cứu trong lĩnh vực hệ gen dược học chủ yếu tập trung vào nhóm bệnh nhân này Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và giải trình tự toàn bộ gen (WGS) giúp xác định các biến thể quan trọng ở bệnh nhân, bao gồm cả tế bào mầm và tế bào soma Các biến thể soma thường liên quan đến hiệu quả điều trị của thuốc đích, trong khi biến thể dòng tế bào mầm có thể đánh giá nguy cơ gặp tác dụng phụ nghiêm trọng do ảnh hưởng đến quá trình dược động học của thuốc.

Các liệu pháp điều trị đích dựa trên dấu ấn di truyền của tế bào soma đã trở thành tiêu chuẩn trong điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm các khối u rắn như u ác tính, ung thư vú, ruột kết, phổi, đường tiêu hóa, buồng trứng và cả ung thư bạch cầu.

Trong trị liệu các bệnh không phải ung thư:

Khoảng 80% thuốc được chuyển hóa bởi các enzym đa hình, dẫn đến sự khác biệt trong hiệu quả điều trị giữa các bệnh nhân Sự biến đổi này không chỉ làm giảm hiệu quả của thuốc mà còn có thể gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng Các hiệp hội chuyên môn uy tín trên thế giới đã khuyến nghị lựa chọn thuốc và liều dùng dựa trên kiểu gen của bệnh nhân Việc ứng dụng NGS và WGS trong thực hành lâm sàng sẽ giúp phân tích các biến thể gen quan trọng, từ đó điều chỉnh liều lượng thuốc hợp lý và cân bằng giữa lợi ích và tác dụng phụ.

Dự đoán hiệu quả điều trị và lựa chọn thuốc phù hợp với từng bệnh nhân trước khi sử dụng trên lâm sàng là rất quan trọng Các nghiên cứu có độ tin cậy cao cung cấp gợi ý về việc xét nghiệm gen liên quan đến tác dụng và độc tính của thuốc, nhằm cá thể hóa điều trị Đây là xu hướng mới trong y học toàn cầu.

1.2.3 Các công cụ phân tích dữ liệu WGS để nghiên cứu về mối liên hệ giữa đa hình gen và đáp ứng thuốc Đa phần những công cụ phục vụ cho mục đích này đều dựa theo công nghệ học máy Các kết luận được đưa ra dựa vào (i) hậu quả của sự thay thế trên cấp độ nucleotid và acid amin, (ii) ảnh hưởng của biến thể trên mức độ biểu hiện cũng như cấu trúc và chức năng của protein tương ứng Dựa vào vị trí của biến thể, các công cụ này được chia thành 2 nhóm chính: (1) nhóm đánh giá ảnh hưởng của các biến thể không đồng nghĩa (missense variant) lên chức năng, cấu trúc của protein mà chúng mã hóa và (2) nhóm các biến thể nằm trên vùng liên quan tới quá trình cắt nối (splicing) Ngoài ra, còn có một số công cụ mới đánh giá các biến thể nằm trên vùng không mã hóa [42]

Nhóm công cụ đánh giá ảnh hưởng của các biến thể không đồng nghĩa dựa trên tiêu chí như độ bảo tồn của nucleotid hoặc acid amin, vị trí trên chuỗi protein và hệ quả của sự thay thế acid amin Các công cụ này thường đạt độ chính xác từ 65-80% khi xác minh trên dữ liệu về các biến thể gây bệnh đã biết Một số công cụ tiêu biểu trong nhóm này bao gồm:

VEP (Ensembl Variant Effect Predictor) là công cụ chính được sử dụng trong khóa luận này, giúp chú giải thông tin về biến thể và dự đoán hậu quả của chúng lên gen, quá trình phiên mã, protein và vùng điều hòa Công cụ này dựa vào dữ liệu từ các công cụ thứ cấp khác như PolyPhen, CADD, và SIFT Chi tiết về từng công cụ thứ cấp trong VEP sẽ được trình bày ở mục 2.3.4.

VarSome là công cụ đánh giá hậu quả của biến thể theo hướng dẫn của Trường Cao đẳng Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG), phân loại biến thể thành 5 cấp độ: (i) gây bệnh, (ii) dường như gây bệnh, (iii) hậu quả không chắc chắn, (iv) gần như lành tính, và (v) lành tính Mỗi cấp độ đều có tiêu chí rõ ràng nhằm đảm bảo việc phân loại biến thể một cách chính xác nhất.

Có 7 thể có thể đáp ứng cả hai nhóm tiêu chí “lành tính” và “gây bệnh”, do đó chúng sẽ được phân loại vào nhóm (iii) hậu quả không chắc chắn Bảng 1.1 [42] sẽ trình bày các công cụ thứ cấp mà VarSome sử dụng để thực hiện đánh giá này.

Ngoài ra, còn một số các công cụ khác thuộc nhóm (1) như: Mutation Taster, FATHMM -MKL, EIGEN, PrimateAI, MVP, DANN

Nhóm công cụ đánh giá hậu quả của các biến thể trong quá trình cắt nối có độ nhạy cao (90 - 100%) và độ chính xác từ 60 - 80% Một số công cụ tiêu biểu như GeneSplicer, Human Splicing Finder, MaxEntScan, và NetGene2 sẽ được trình bày chi tiết trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1 Một số công cụ phân tích dữ liệu WGS để nghiên cứu về mối liên hệ giữa đa hình gen và đáp ứng thuốc [42]

Tên Loại thông tin đánh giá Nguồn

Các công cụ thuộc nhóm (1)

ConSurf Độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin [62]

FATHMM Độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin [63]

MutationAssessor Độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin [67]

PANTHER Độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin [78]

PhD-SNP Độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin [72]

SIFT Độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin [70]

SNPs&GO Cấu trúc/ chức năng protein mã hóa [73]

Align GVGD Cấu trúc/ chức năng protein mã hóa và độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin

MAPP Cấu trúc/ chức năng protein mã hóa và độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin

MutationTaster Cấu trúc/ chức năng protein mã hóa và độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin

MutPred Cấu trúc/ chức năng protein mã hóa và độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin

PolyPhen-2 Cấu trúc/ chức năng protein mã hóa và độ bảo tồn tiến hóa của nucleotid/ acid amin

PROVEAN Lắp ghép (alignment) và đánh giá mức độ tương đồng giữa các chuỗi chứa biến thể (variant sequence) và các protein tương đồng (protein sequence homolog)

[69] nsSNPAnalyzer Lắp ghép đa chuỗi (multiple sequence alignment) và phân tích cấu trúc protein thay thế

Condel Tổng hợp kết quả từ SIFT, PolyPhen-2 và

Các công cụ thuộc nhóm (2)

Sự phụ thuộc vị trí (position-dependent logic) [79]

MaxEntScan Nguyên tắc entrophy tối đa (maximum entropy principle)

NetGene2 Mạng neuron máy tính (neuron network) [75]

NNSplice Mạng neuron máy tính (neuron network) [76]

Tổng quan về các gen trong nghiên cứu

Enzym Thiopurin S-Methyltransferase (TPMT), được mã hóa bởi gen cùng tên trên nhiễm sắc thể số 13, đóng vai trò quan trọng trong việc xúc tác phản ứng gắn gốc methyl vào các hợp chất thiol thơm và dị vòng TPMT chuyển đổi 6-mercaptopurine (6-MP) thành 6-methylmercaptopurine (6-MMP) không hoạt động, từ đó loại bỏ tác dụng dược lý của thiopurin Ngoài ra, chất chuyển hóa thứ cấp 6-TIMP cũng là cơ chất của TPMT và có liên quan đến các chất chuyển hóa phosphoryl hóa như 6-MMPR, có hoạt tính dược lý chủ yếu là ức chế miễn dịch và tổng hợp purin nội sinh Việc thiếu hụt TPMT có thể dẫn đến tăng cường tạo thành 6-MMP, góp phần vào một số tác dụng phụ của 6-MP, bao gồm nhiễm độc gan.

TGN và các chất chuyển hóa khác có thể gây ra phản ứng bất lợi phụ thuộc vào liều lượng, thể hiện qua sự giảm bạch cầu Ngoài ra, sự gia tăng hoạt tính của TPMT dẫn đến mức độ 6 MMP và 6 MMPR cao hơn, điều này có liên quan đến nguy cơ nhiễm độc gan.

Nghiên cứu cho thấy rằng sự đa hình của gen TPMT đóng vai trò quan trọng trong việc xác định khả năng dung nạp 6-MP ở bệnh nhân Những bệnh nhân mang hai alen TPMT mất chức năng có nguy cơ tử vong cao do suy tủy khi sử dụng liều 6-MP.

Khoảng 30 - 60% bệnh nhân có kiểu gen chứa một alen phổ biến và một alen giảm chức năng, dẫn đến không thể dung nạp liều 6-MP thông thường Alen không có chức năng phổ biến nhất trong quần thể người da trắng là một yếu tố quan trọng cần lưu ý.

TPMT*3A là đột biến phổ biến nhất của gen TPMT, bao gồm hai SNP chính là rs1800460 và rs1142345 Khi cả hai SNP này xuất hiện trên cùng một alen, alen đó được gọi là TPMT*3A Ngược lại, nếu mỗi SNP nằm trên hai alen khác nhau, chúng sẽ được gọi lần lượt là TPMT*3B và TPMT*3C Mối liên hệ giữa các kiểu gen và hoạt tính của TPMT được tổng hợp trong Bảng 1.2.

Bảng 1.2 Mối liên hệ giữa kiểu gen và hoạt tính của TPMT [40]

Kiểu hình Kiểu gen Ví dụ kiểu gen

Người mang 2 alen bình thường về chức năng *1/*1

Người mang 1 alen bình thường về chức năng và 1 alen không có chức năng

Người mang 1 alen chưa xác nhận được/ không biết chức năng và 1 alen không có chức năng

Người mang 2 alen không có chức năng *3A/*3A,

Người mang 2 alen chưa xác nhận được/ không biết chức năng

1 alen chức năng bình thường và 1 alen không biết chức năng

Báo cáo đầu tiên về đa hình của enzym TPMT trên quần thể người da trắng chỉ ra ba cấp độ hoạt tính: cao, trung bình và thấp, với khoảng 89% mẫu có hoạt tính cao, 11% trung bình và chỉ 0,3% mang hoạt tính thấp Khi nghiên cứu trên các quần thể người khác, kết quả phân bố hoạt tính không còn giống như ở người da trắng, dẫn đến giả thuyết rằng sự đa hình TPMT có thể bị ảnh hưởng bởi yếu tố quần thể Hàng loạt nghiên cứu đã được thực hiện trên toàn cầu để xác định tần suất kiểu gen, và hiện tại đã có hơn 40 alen TPMT khác nhau được báo cáo Hầu hết các alen này liên quan đến sự giảm hoạt tính so với alen phổ biến tự nhiên TPMT*1, trong đó TPMT*2 là một trong những alen chính gây giảm hoạt tính.

TPMT*3A và TPMT*3C là hai alen chính ảnh hưởng đến hoạt động của gen TPMT, trong khi các alen khác hiếm gặp hơn Tần suất của bốn alen chính, bao gồm TPMT*2, *3A, *3B và *3C, đã được ghi nhận trong một số quần thể, được trình bày chi tiết trong Phụ lục.

1 Do tính quần thể trong biểu hiện của TPMT, các nghiên cứu trên từng quốc gia vẫn đang được tiếp tục tiến hành và những báo cáo về biến thể mới của TPMT vẫn đang được cập nhật thường xuyên trên cơ sở dữ liệu: https://www.imh.liu.se/TPMTalleles/tabell-over-TPMT-alleler?l=en

Các báo cáo về dân số Nhật Bản chỉ ra rằng, bên cạnh sự thiếu hụt hoạt tính của TPMT, cần có các biến thể di truyền khác để giải thích hiện tượng giảm bạch cầu do thiopurin, điều này cũng xảy ra ở bệnh nhân Đông Á.

Enzym ATP Binding Cassette Subfamily C Member 4 (ABCC4), hay còn gọi là MRP4, được mã hóa bởi gen ABCC4, là một phần của nhóm vận chuyển thuốc đa chủng loại ABC Enzym này đóng vai trò quan trọng trong quá trình dược động học của thiopurin Gen ABCC4 được biểu hiện tại các vị trí then chốt như gan và thận, nơi có ảnh hưởng lớn đến việc xử lý và tác động của thuốc.

ABCC4 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi độc tính của thiopurin bằng cách loại bỏ các chất chuyển hóa hoạt động thiopurin thông qua con đường HGPRT Nghiên cứu cho thấy, những con chuột thiếu ABCC4 gặp phải độc tính thiopurin do sự tích tụ 6 TGN trong các tế bào tủy.

Kháng thuốc phổ rộng là một thách thức lớn trong điều trị ung thư, liên quan đến hoạt động của nhóm vận chuyển ABC Mức độ kháng thuốc của tế bào ung thư phụ thuộc vào sự biểu hiện của các protein trong nhóm này và bị ảnh hưởng bởi các SNP trong gen mã hóa chúng Gen ABCC4, nằm trên nhiễm sắc thể 13, có tính đa hình cao với hơn 90 biến thể, trong đó các biến thể như rs11568658, rs753414892, rs11568668, rs3765534, rs146708960 và rs1156864 có liên quan đến giảm chức năng của enzym ABCC4, dẫn đến suy tủy nghiêm trọng khi sử dụng 6-MP Biến thể SNP rs3765534 gây thiếu hụt ABCC4 đã được đề cập trong nghiên cứu của Krishnamurthy và cộng sự, cho thấy nồng độ 6 TGN cao hơn ở những người mang biến thể này Điều này giải thích tỷ lệ giảm bạch cầu do thiopurin ở bệnh nhân Nhật Bản mắc IBDs cao hơn so với các quần thể khác, do tần suất rs3765534 ở dân số Nhật Bản (0,18) cao hơn so với quần thể da trắng (0,01) và da đen (0).

ABCC4 mã hóa enzym có hoạt tính mạnh hơn so với kiểu hình phổ biến, dẫn đến hiện tượng kháng 6- MP ở bệnh nhân Sự đào thải mạnh 6- MP gây mất tác dụng của thuốc.

Inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPA) là một enzym được mã hóa bởi gen

ITPA nằm trên nhiễm sắc thể số 20, ITPA được biểu hiện trong bạch cầu và hồng cầu

Enzym ITPA xúc tác quá trình thủy phân 6-thioinosin triphosphat (6 TITP) thành 6-thioinosin monophosphat (6 TIMP), với khả năng tích hợp vào ADN và ARN, dẫn đến cạnh tranh với 6 TdGTP, chất chuyển hóa của 6-mercaptopurine (6-MP) Bệnh nhân mang alen biến thể gây thiếu hụt hoạt tính ITPA thường gặp các tác dụng phụ như giảm bạch cầu, viêm tụy và triệu chứng giả cúm Nghiên cứu của Kakuta và cộng sự (2017) cho rằng các tác dụng phụ này có thể do sự tích lũy 6 TITP Trong một nghiên cứu trên chuột, Matimba et al (2015) đã chỉ ra rằng việc loại bỏ ITPA có ảnh hưởng đến tình trạng này.

Sự tăng giá trị IC50 trong các tế bào OVCAR10 và U251 cho thấy có sự giảm biểu hiện của ITPA trong khối u, điều này dẫn đến kháng thiopurin.

Ứng dụng của sự khác biệt trong tần suất một số gen liên quan đến quá trình dược động học của 6-MP trong phác đồ điều trị và lâm sàng

1.4.1 Ứng dụng trên thế giới

Các nghiên cứu cho thấy biến thể di truyền trong dòng tế bào mầm ảnh hưởng đến tính nhạy cảm, đáp ứng thuốc và độc tính khi điều trị bệnh bạch cầu cấp tính (ALL) Mối liên hệ giữa các đa hình gen mã hóa enzym liên quan đến dược động học của 6-MP và độc tính đã được xác lập Dựa trên những kết quả này, khuyến cáo điều trị thiopurin liên quan đến đa hình TPMT đã được áp dụng trong các phác đồ điều trị ALL cho trẻ em Liều khởi đầu và duy trì được điều chỉnh dựa trên chỉ định lâm sàng và hoạt tính của TPMT và/hoặc NUDT15 Thông thường, liều khởi đầu 6-MP cao do khoảng 90% dân số có kiểu hình TPMT và NUDT15 tự nhiên với hoạt tính cao, cho phép dung nạp liều tối đa Mức độ dung nạp thiopurin có mối tương quan chặt chẽ với kiểu gen di truyền, do đó liều khởi đầu có thể khác nhau theo vùng địa lý và thực hành lâm sàng.

Hiệp hội thực hành gen dược lâm sàng (CPIC) đưa ra khuyến cáo về liều dùng dựa trên việc xem xét các bằng chứng từ dữ liệu lâm sàng, dữ liệu chức năng tiền lâm sàng và các hướng dẫn sử dụng thuốc đã được đồng thuận.

Các khuyến cáo về liều khởi đầu theo kiểu gen chủ yếu áp dụng cho bệnh nhân được xét nghiệm TPMT và NUDT15 Bệnh nhân mang 2 alen quy định hoạt tính trung bình cho cả hai gen này thường dung nạp thiopurin kém hơn so với những người chỉ mang 1 alen, mặc dù bằng chứng cho việc điều chỉnh liều khởi đầu còn hạn chế Theo khuyến cáo của FDA, bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử alen hoạt tính giảm cần giảm ít nhất 10% liều tiêu chuẩn, trong khi bệnh nhân dị hợp tử nên điều chỉnh liều dựa trên khả năng dung nạp Hầu hết bệnh nhân dị hợp tử chỉ 1 trong 2 gen có thể dung nạp liều 6-mercaptopurin, nhưng một số bệnh nhân cần giảm liều đáng kể, đặc biệt là những người dị hợp tử đối với cả TPMT và NUDT15.

1.4.2 Ứng dụng tại Việt Nam

Bộ Y tế đã công bố hướng dẫn điều trị mới nhất cho bệnh bạch cầu cấp dòng lympho trong tài liệu “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị một số bệnh lý huyết học” Mặc dù tài liệu này chưa đề cập đến sự khác biệt trong tần suất các gen liên quan đến dược động học 6-MP, nhưng việc chỉ định và lựa chọn liều dùng thuốc dựa trên kiểu gen của bệnh nhân đã được triển khai tại Việt Nam cho một số nhóm thuốc điều trị ung thư và chống đông máu, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ cho bệnh nhân.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

The genomic sequencing data is sourced from the open database of the "1000 Genomes" project, conducted by the International Gene Sample Resource (IGSR) at https://www.internationalgenome.org/data This data was extracted from phase 3 of the "1000 Genomes" project, which spanned from 2008 to 2015.

Nội dung nghiên cứu

Quá trình xử lý dữ liệu được thực hiện tại Viện Big Data - Vingroup và Bộ môn Hóa Sinh của Đại học Dược Hà Nội, như thể hiện trong Hình 2.1.

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu

Thu thập các biến thể từ dữ liệu của dự án "1000 Genomes"

Lọc ra các biến thể của 4 gen liên quan đến dược động học của 6-MP

Tính F ST giữa các quần thể Lọc ra các biến thể có tần suất > 0,01

Phân loại biến thể dựa vào thông tin y văn

Phân tích cấu trúc, chức năng và lâm sàng của các biến thể gen thông qua công cụ tin sinh học giúp hiểu rõ hơn về tác động của chúng Nghiên cứu này tập trung vào ảnh hưởng của các biến thể gen đến độc tính của thuốc, đặc biệt là trong việc đánh giá mức độ liên quan của các biến thể trong quần thể người Việt khi sử dụng 6-MP.

Phân tích được sự khác biệt về tần suất alen của 4 gen liên quan đến dược động học của 6–MP

2.2.2 Các nội dung nghiên cứu

Mục tiêu của nghiên cứu là phân tích sự khác biệt về tần suất alen của bốn gen liên quan đến dược động học của 6–MP giữa quần thể người Việt Nam (99 mẫu) và các quần thể khác trên thế giới, bao gồm châu Phi (671 mẫu), châu Mỹ (348 mẫu), châu Âu (522 mẫu), Đông Á (511 mẫu) và Nam Á (492 mẫu).

- Đánh giá chỉ số thể hiện sự khác biệt về tần suất alen giữa 2 quần thể: FST

- Lọc ra các đa hình có tần suất > 0,01

Mục tiêu 2: Đánh giá được mức độ liên quan của một số biến thể trong quần thể người Kinh Việt Nam tới độc tính khi sử dụng 6- MP

- Đánh giá ảnh hưởng của biến thể đến cấu trúc và chức năng của gen tương ứng

- Đánh giá ảnh hưởng của biến thể đến cấu trúc và chức năng của protein mã hóa

- Đánh giá ảnh hưởng có thể có của biến thể trên lâm sàng.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Lọc ra các biến thể so với hệ gen tham chiếu GRCh38

2.3.1.1 Lọc dữ liệu các vùng exon

Dữ liệu được quản lý dưới dạng file vcf, liệt kê các biến thể trên từng nhiễm sắc thể Sử dụng các công cụ vcftools và bcftools, thông tin về vị trí vùng exon trên 4 gen được lọc để nghiên cứu các biến thể cần thiết trong tất cả các mẫu Vị trí các vùng exon trên nhiễm sắc thể của 4 gen được lấy từ trang web Genome UCSC.

2.3.1.2 Lọc dữ liệu theo quần thể

Sử dụng các công cụ như vcftools và bcftools, chúng tôi tiến hành lọc dữ liệu biến thể theo 6 vùng quần thể: người Kinh Việt Nam (KHV), người gốc Đông Á (EAS), người gốc châu Phi (AFR), người gốc châu Âu (EUR), người gốc châu Mỹ (AMR) và người gốc Nam Á (SAS) Sau khi lọc dữ liệu ở bước 2.3.1.1, các biến thể trong mẫu được phân chia thành các file vcf riêng biệt dựa trên thông tin quần thể.

Sau 2 bước lọc này, dữ liệu về exon các biến thể trên 4 gen tham gia quá trình dược động học của 6- MP sẽ được chia thành 6 vùng quần thể khác nhau (5 quần thể lớn và dữ liệu trên người Kinh Việt Nam)

2.3.2 So sánh tần suất biến thể giữa các quần thể

FST là chỉ số đo lường sự khác biệt về tần suất của một alen giữa hai quần thể khác nhau, với giá trị nằm trong khoảng từ 0 đến 1 Chỉ số này được tính toán thông qua một công thức cụ thể.

Trong đó: H S : tổng tần số dị hợp tử thực tế quan sát được trong quần thể

H T : tổng tần số dị hợp tử được ước tính theo lý thuyết 𝛿: số lượng chênh lệch tần số alen giữa các quần thể

Theo phân loại của Hartl D.L cùng cộng sự (1997) [11], mức độ khác biệt giữa tần suất alen sẽ được chia làm 5 nhóm:

(1) FST = 0: không có sự khác biệt

(2) 0 < FST ≤ 0,05: có sự khác biệt nhỏ

(3) 0,05 < FST ≤ 0,15: có sự khác biệt tương đối

(4) 0,15 < FST ≤ 0,25: có sự khác biệt lớn

(5) 0,25 < FST ≤ 1: có sự khác biệt rất lớn

Trong khóa luận này, hai quần thể sẽ được phân tích dựa trên sự khác biệt về tần suất alen, với chỉ số FST lớn hơn 0,15, cụ thể là ở mức (4) và (5) theo phân loại đã nêu.

FST giữa quần thể KHV và các quần thể khác được tính toán bằng bcftools và vcftools cho tất cả các biến thể trong vùng exon của 4 gen liên quan đến dược động học của 6-MP Dữ liệu FST của các biến thể trong vùng exon sẽ được trực quan hóa dưới dạng biểu đồ Manhattan bằng công cụ R theo từng gen Các biến thể có FST giữa quần thể KHV và quần thể khác lớn hơn 0,15 sẽ được ghi nhận.

2.3.3 Xác định biến thể đa hình

Các đa hình được xác định là những biến thể có tần suất lớn hơn 0,01 Sử dụng công cụ vcftools và bcftools để lọc dữ liệu từ người Việt theo mục 2.3.1.2, danh sách các đa hình trong quần thể người Việt sẽ được thống kê cho các phân tích tiếp theo.

2.3.4 Phân tích mối liên hệ giữa biến thể và độc tính khi dùng 6- MP

Các biến thể được phân loại thành hai nhóm dựa trên thông tin y văn hiện có Thông tin này sẽ được truy vấn từ cơ sở dữ liệu dbSNP của Trung tâm Thông tin y sinh Quốc gia Hoa Kỳ (pubmed) Sau khi xem xét các bài báo và tài liệu liên quan, việc phân loại sẽ được thực hiện một cách chính xác.

Trong nghiên cứu này, 19 biến thể được xác định liên quan đến dbSNP và được phân loại thành hai nhóm Nhóm 1 bao gồm các biến thể đã được ghi nhận trong tài liệu y khoa có liên quan đến độc tính của thuốc 6-MP Chúng tôi sẽ cung cấp thêm thông tin từ các nghiên cứu đã công bố về ảnh hưởng của những biến thể này đến vùng ADN, cũng như tác động của sự thay thế acid amin do biến thể mã hóa lên cấu trúc và chức năng của protein Ngoài ra, ảnh hưởng của chúng đến thực hành lâm sàng sẽ được phân tích thông qua công cụ VEP (Ensembl Variant Effect Predictor).

Thông tin về một số trường kết quả của VEP như sau:

PolyPhen (Polymorphism Phenotyping) là công cụ dự đoán tác động của sự thay thế acid amin đến cấu trúc và chức năng của protein Điểm số PolyPhen, dao động từ 0,0 đến 1,0, đánh giá khả năng gây mất chức năng của protein do sự thay thế acid amin Càng cao điểm số, biến thể càng có khả năng ảnh hưởng xấu đến chức năng protein Điểm số này có thể được phiên giải theo các ngưỡng nhất định.

 Điểm từ 0 – 0,15: Hệ quả được đự đoán là “an toàn”

 Điểm từ 0,15 - 0,85: Hệ quả được dự đoán là “có thể gây hại”

 Điểm từ 0,85 – 1,0: Hệ quả được dự đoán là “gây hại”

Condel, or the Consensus Deleteriousness Score for non-synonymous single nucleotide variants, is a scoring system that evaluates the impact of a non-synonymous variant on the function of its corresponding protein The Condel score ranges from 0.0 to 1.0, with higher scores indicating a greater negative effect on protein function This score can be interpreted based on specific thresholds.

 Điểm 0,0: Hệ quả được dự đoán là “an toàn”

 Điểm từ 0 - 0,469: Hệ quả được dự đoán là có tác động “trung bình”

 Điểm từ 0,469 - 1,0: Hệ quả được dự đoán là “gây hại”

The SIFT score (Sorting Intolerant From Tolerant) predicts the impact of amino acid substitutions on the functionality of encoded proteins This score ranges from 0 to 1 A lower SIFT score indicates a greater potential negative effect on protein function.

 Điểm từ 0 - 0,05: Hệ quả của biến thể được đánh giá là “nguy hại”

 Điểm từ 0,05 - 1,0: Hệ quả của biến thể được đánh giá là “lành tính”

Điểm CADD (Combined Annotation Dependent Depletion) sử dụng công nghệ học máy để đánh giá mức độ gây hại của các biến thể di truyền Mô hình này được xây dựng dựa trên dữ liệu của những biến thể đã được nghiên cứu trước đó, từ đó xếp hạng các biến thể theo mức độ gây hại Công thức tính điểm CADD được xác định là: Điểm = −10 log(xếp hạng biến thể / tổng số biến thể).

 Điểm CADD > 10: biến thể nằm trong top 10% biến thể có hậu quả nghiêm trọng nhất

 Điểm CADD > 20: biến thể nằm trong top 1% biến thể có hậu quả nghiêm trọng nhất

 Điểm CADD > 30: biến thể nằm trong top 0,1% biến thể có hậu quả nghiêm trọng nhất

Nhóm 2: các biến thể chưa được ghi nhận trong y văn sẽ được đánh giá mức độ liên quan bằng công cụ VarSome (https://varsome.com/)

VarSome phân chia hậu quả do biến thể thành 5 phân nhóm, như đã nêu trong mục 1.2.3 Các tiêu chí đánh giá quan trọng giúp phân loại biến thể bao gồm nhiều yếu tố khác nhau.

PM2: Nếu một biến thể không được phát hiện hoặc có tần suất thấp hơn ngưỡng của một kiểu hình lặn trong cơ sở dữ liệu quy định, điều này có thể được coi là bằng chứng cho thấy tác động có hại.

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Sự đa hình của 4 gen liên quan đến dược động học của 6–MP giữa quần thể người Việt Nam và một số quần thể người khác

Chỉ số FST phản ánh sự khác biệt về tần suất alen giữa hai quần thể khác nhau, và để đánh giá sự đa hình của bốn gen liên quan đến dược động học của 6-MP, chúng tôi đã so sánh chỉ số FST của các gen này giữa quần thể người Kinh Việt Nam và năm quần thể lớn trên thế giới, bao gồm người gốc Đông Á (EAS), người gốc châu Phi (AFR), người gốc châu Âu (EUR), người gốc châu Mỹ (AMR) và người gốc Nam Á (SAS) Kết quả được trình bày thông qua biểu đồ Manhattan trong các hình 3.1 - 3.4.

Nhận xét: Trên vùng exon của gen TPMT, chỉ có duy nhất biến thể rs9465100 có chỉ số FST > 0,15 Sự khác biệt này nằm ở quần thể người châu Phi.

Hình 3.1 F ST các biến thể trên gen TPMT

Kết quả phân tích trên vùng exon của gen ABCC4 cho thấy có 7 biến thể với chỉ số FST > 0,15 giữa hai quần thể, bao gồm các biến thể rs1189448, rs1189468, rs4148499, rs6650282, rs1557070, rs3751333 và rs11568658 Đặc biệt, biến thể rs1189448 cho thấy sự khác biệt giữa quần thể KHV và 4/5 quần thể còn lại, ngoại trừ quần thể người Đông Á.

Hình 3.3 F ST các biến thể trên gen NUDT15

Trên exon của gen NUDT15, chỉ có biến thể rs11685532 có chỉ số FST > 0,15, tương tự như gen TPMT, và biến thể này chủ yếu xuất hiện trong quần thể người châu Phi.

Hình 3.2 F ST các biến thể trên gen ABCC4

Hình 3.4 F ST các biến thể trên gen ITPA

Trong nghiên cứu về vùng exon của gen ITPA, đã phát hiện 4 biến thể có FST > 0,15, bao gồm: rs8362, rs1127354, rs9101 và rs13830 Đặc biệt, hai biến thể rs8362 và rs13830 cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa hai quần thể.

Trên vùng exon của gen TPMT và NUDT15, chỉ có một biến thể có sự khác biệt về tần suất alen khi so sánh với năm quần thể lớn khác, trong khi đó, gen ABCC4 lại có số lượng biến thể khác biệt về tần suất rất lớn (7) Thông tin chi tiết về các biến thể này được trình bày trong Bảng 3.1.

Giữa quần thể người Kinh Việt Nam và người gốc Đông Á không có sự khác biệt đáng kể về tần suất alen Phần lớn các biến thể có FST lớn tập trung ở dân số gốc Phi Các quần thể khác như người Nam Á, châu Âu và châu Mỹ có số lượng biến thể khác biệt tương đối ít So sánh với hai quần thể EAS (gần gũi về địa lý với Việt Nam) và EUR (đã có nhiều thông tin lâm sàng), một số kết quả đáng chú ý đã được thu thập.

- Với quần thể Đông Á (EAS):

+ Không có sự khác biệt đáng kể trong tần suất TPMT

+ Không có sự khác biệt đáng kể trong tần suất ITPA, ABCC4, NUDT15

- Với quần thể da trắng (EUR):

+ Không có sự khác biệt đáng kể trong tần suất TPMT

+ Có sự khác biệt đáng kể trong tần suất ITPA, ABCC4, NUDT15.

Bảng 3 1 Thông tin về các biến thể có F ST > 0,15

Tên gen chứa biến thể

Tên biến thể FST Tần suất trên

Để phân tích sự đa hình của các gen, chúng tôi không chỉ lập danh sách các biến thể có sự khác biệt về tần suất alen so với các quần thể khác mà còn xây dựng danh sách đa hình của 4 gen trong quần thể người Việt Kết quả được trình bày trong Bảng 3.2.

Bảng 3 2 Các đa hình trong quần thể người Kinh Việt Nam rsID Nucleotid tham chiếu

Tần suất alen nguyên thủy

Tần suất alen đa hình

Gen TPMT rs7886 T 0,242 A 0,758 SNP rs1142378 T 0,222 G 0,778 SNP rs1142345 T 0,975 C 0,025 SNP rs2842934 G 0,238 A 0,763 SNP

Gen NUDT15 rs116855232 C 0,939 T 0,061 SNP rs17071169 T 0,919 G 0,081 SNP

Gen ABCC4 rs3770 G 0,525 A 0,475 SNP rs558773807 C 0,985 T 0,015 SNP rs9516519 T 0,985 G 0,015 SNP rs9516520 T 0,985 C 0,015 SNP rs1059751 A 0,490 G 0,510 SNP rs9516521 T 0,985 C 0,015 SNP rs4148553 C 0,490 T 0,510 SNP rs546378962 A 0,990 T 0,010 SNP rs4148551 T 0,525 C 0,475 SNP rs3742106 A 0,525 C 0,475 SNP rs143080903 C 0,990 T 0,010 SNP rs9302044 A 0,899 G 0,101 SNP

The article presents a detailed analysis of various single nucleotide polymorphisms (SNPs) along with their respective allele frequencies Notable SNPs include rs1189448 with a C allele frequency of 0.904 and a T allele frequency of 0.096, and rs9561773 showing C at 0.687 and T at 0.313 Other significant SNPs are rs1751034 with C at 0.172 and T at 0.828, and rs1189466 displaying A at 0.157 and G at 0.843 The data also highlights rs1678339 with T at 0.157 and C at 0.843, and rs6650282 which has T at 0.783 and C at 0.217 Additionally, rs3765534 shows a high C frequency of 0.970, while rs4148499 has T at 0.899 and C at 0.101 The frequencies for rs2274405 and rs2274406 are both 0.460 for T and 0.540 for C Furthermore, rs2274407 presents C at 0.813 and A at 0.187, and rs899494 has A at 0.111 and G at 0.889 The analysis continues with rs11568658 at C 0.884 and A 0.116, and rs11568689 showing a G frequency of 0.990 and C at 0.010 Lastly, rs11568681 has G at 0.960 and T at 0.040, while rs3751333 displays G at 0.833 and A at 0.167 The article concludes with rs4148552, which shows an AT frequency of 0.475 and A at 0.525, indicating a single nucleotide deletion.

Gen ITPA rs1127354 C 0,808 A 0,192 SNP rs8362 G 0,359 A 0,641 SNP rs4815576 G 0,404 C 0,596 SNP rs9101 G 0,510 A 0,490 SNP rs13830 G 0,803 A 0,197 SNP

Trong quần thể người Việt, đã ghi nhận 42 đa hình, với gen ABCC4 chiếm ưu thế nhất với 31 đa hình Các gen khác như TPMT, NUDT15 và ITPA có số lượng đa hình ít hơn, lần lượt là 4, 2 và 5.

- Có 18 alen đa hình có tần suất lớn hơn alen nguyên thủy Trong đó, có một số đa hình có tần suất rất cao > 0,8: rs1751034, rs1189466, rs1678339, rs899494

Không phát hiện được đa hình gen mới ở người Kinh Việt Nam khi tiến hành truy vấn trong cơ sở dữ liệu của Trung tâm thông tin sinh học quốc gia Hoa Kỳ.

- Có 1 đa hình kiểu xóa 1 nucleotid (rs4148552), còn lại là các SNP.

Mức độ liên quan của một số biến thể trong quần thể người Việt tới độc tính khi sử dụng 6- MP

Mức độ liên quan tới độc tính của các biến thể phụ thuộc vào ảnh hưởng của chúng lên vùng gen, loại acid amin và protein mà chúng mã hóa, cùng với các kết quả lâm sàng đã ghi nhận Thông tin này sẽ được phân tích bằng các công cụ tin sinh học Sau khi phân tích các biến thể và đa hình trong phần 3.1, chúng sẽ được đánh giá về mức độ liên quan đến độc tính khi sử dụng 6-MP Các biến thể sẽ được chia thành hai nhóm khác nhau trong phần này.

Nhóm 1: những biến thể từng được ghi nhận trong y văn là có liên quan đến độc tính/ cần giảm liều trong quá trình điều trị sử dụng 6- MP Bao gồm: (1) TPMT: rs7886, rs1142345; (2) ABCC4: rs11568658, rs2274407, rs3765534; (3) NUDT15: rs116855232; (4) ITPA: rs1127354, rs9101, rs8362, rs13830

Nhóm 2: những biến thể còn lại, là những biến thể chưa từng được ghi nhận trong y văn là có liên quan đến độc tính/ cần giảm liều trong điều trị sử dụng 6- MP

3.2.1 Phân tích mức độ liên quan tới độc tính khi sử dụng 6- MP của các biến thể trong nhóm đã từng được đề cập trong y văn

Các biến thể trong nhóm này sẽ được giải thích về ảnh hưởng đối với vùng ADN, acid amin, cấu trúc và chức năng của protein tương ứng, cùng với các thông tin lâm sàng được thu thập qua công cụ VEP Kết quả của các chú giải được trình bày trong các Bảng 3.3 - 3.6.

3.2.1.1 Các biến thể nằm trên gen TPMT

Bảng 3 3 Chú giải các biến thể nằm trên gen TPMT bằng công cụ VEP rsID Hậu quả Mức độ Điểm SIFT Điểm

Hậu quả trên LS Điểm Condel

CADD PHRED rs7886 biến đổi ở đầu 3' vùng UTR* bổ sung - - Giảm chuyển hóa Thiopurin

3,418 rs1142345 thay thế acid amin tương đối có ảnh hưởng xấu

(0) có ảnh hưởng xấu (0,998) xuất hiện phản ứng thuốc gây mất chức năng (0,919)

Chú thích: (*) Một vùng thuộc ARN thông tin, thường chứa các vùng điều hòa biểu hiện gen

(**) Có ghi nhận tình trạng giảm hoạt tính TPMT ở những bệnh nhân ALL sử dụng 6- MP

Biến thể rs11432345 ảnh hưởng đến acid amin mã hóa, trong khi biến thể rs1142345 gây ra sự thay đổi ở đầu 3’ vùng UTR.

Biến thể rs11432345 có ảnh hưởng đáng kể đến chức năng của protein mà nó mã hóa Cụ thể, điểm SIFT cho thấy ảnh hưởng xấu với giá trị 0, trong khi điểm Polyphen cũng chỉ ra tác động tiêu cực với giá trị 0,998 Hơn nữa, điểm Condel cho thấy biến thể này gây mất chức năng với giá trị 0,919, khẳng định rõ ràng tác động bất lợi của SNP này đối với protein.

 Ảnh hưởng trên thực hành lâm sàng: Có ghi nhận tình trạng giảm hoạt tính TPMT ở những bệnh nhân ALL sử dụng 6-

Biến thể rs1142345 của gen MP có điểm CADD PHRED là 26,2, cho thấy nó nằm trong top 0,1 - 1% các biến thể có hậu quả nghiêm trọng nhất Ngoài ra, bệnh nhân mang biến thể rs7886 ghi nhận tình trạng giảm chuyển hóa thiopurin.

3.2.1.2 Các biến thể nằm trên gen ABCC4

Bảng 3 4 Chú giải các biến thể nằm trên gen ABCC4 bằng công cụ VEP rsID Hậu quả Mức độ Điểm SIFT Điểm PolyPhen Điểm Condel Điểm CADD

Biến thể PHRED rs11568658 gây ra sự thay thế amino acid, ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình phân rã các mARN vô nghĩa Tác động này có thể dẫn đến mất chức năng với mức độ ảnh hưởng xấu cao (0,937) và khả năng gây mất chức năng (0,828).

Biến thể di truyền rs3765534 có ảnh hưởng tương đối xấu đến chức năng, với tỷ lệ không có ảnh hưởng là 0 và tỷ lệ có hại là 0,009, trong khi tỷ lệ trung tính là 0,863 Biến thể rs2274407 cũng cho thấy ảnh hưởng tương đối xấu, với tỷ lệ không có ảnh hưởng là 0, có hại là 0,371 và gây mất chức năng là 0,562.

Biến thể gen ảnh hưởng đến vùng ADN chứa chúng, dẫn đến sự thay thế acid amin tương ứng Cụ thể, biến thể rs11568658 gây ra một đột biến trong vùng chịu trách nhiệm phân rã mARN vô nghĩa, làm cho quá trình dịch mã tạo ra các protein không chức năng, bao gồm các enzym ABCC4 không hoạt tính.

Biến thể rs11568658 và rs2274407 đã được đánh giá qua các chỉ số SIFT và Condel, cho thấy chúng có khả năng gây mất chức năng và ảnh hưởng xấu đến protein mã hóa Điều này lý giải tại sao các đột biến này được xem là có tác động tương đối (moderate) lên protein tương ứng Hơn nữa, cả hai biến thể này đều có điểm CADD PHRED xếp hạng trong top 0,1 - 1% các biến thể có hậu quả nghiêm trọng.

 Ảnh hưởng trên thực hành lâm sàng của cả 3 biến thể này đều chưa được ghi nhận

3.2.1.3 Các biến thể nằm trên gen NUDT15

Bảng 3 5 Chú giải biến thể nằm trên gen NUDT15 bằng công cụ VEP rsID Hậu quả Mức độ Kiểu cắt nối ARN

Hậu quả trên LS Kiểu hình Điểm Condel 9 Điểm CADD

PHRED rs116855232 đột biến thay thế tương đối * giảm dung nạp thuốc

Chú thích: (*) Kiểu cắt nối thường gặp nhất

Giảm chuyển hóa thiopurin có thể yêu cầu điều chỉnh liều 6-MP, vì điều này liên quan đến độc tính Sử dụng 6-MP trong điều trị bệnh viêm ruột, đặc biệt là bệnh Crohn, có thể dẫn đến tình trạng giảm bạch cầu cấp nhẹ và rụng tóc sớm.

Nhận xét: Chỉ có duy nhất biến thể rs116855232

 Ảnh hưởng của biến thể đến acid amin mã hóa: đây là một biến thể làm thay thế acid amin được mã hóa

Biến thể gen có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein thông qua việc thay thế các acid amin Sự thay đổi này dẫn đến ảnh hưởng tương đối của SNP đối với vùng protein.

Biến thể này có ảnh hưởng đáng kể đến thực hành lâm sàng, gây giảm chuyển hóa thiopurin và dẫn đến phản ứng phụ cần điều chỉnh liều 6-MP, liên quan đến độc tính như giảm bạch cầu cấp sớm và rụng tóc ở bệnh nhân viêm ruột, đặc biệt là bệnh Crohn Điểm CADD_PHRED của biến thể là 22,2, cho thấy nó nằm trong nhóm 0,1 - 1% biến thể có hậu quả nghiêm trọng nhất.

3.2.1.4 Các biến thể nằm trên gen ITPA

Bảng 3 6 Chú giải các biến thể nằm trên gen ITPA bằng công cụ VEP rsID Hậu quả Mức độ Kiểu cắt nối

Kiểu hình Điểm Condel Điểm CADD PHRED rs1127354 đột biến thay thế tương đối - có ảnh hưởng xấu (0,791) giảm dung nạp thuốc

22,1 rs8362 đột biến đồng nghĩa thấp ** - - - - 10,32

33 rs9101 đột biến vùng điều hòa thấp ** - - - - 13,05 rs13830 đột biến đầu 3' vùng UTR bổ nghĩa ** - - - - 0,953

Chú thích: (*) Giảm biểu hiện ITPA, nghi ngờ liên quan phản ứng phụ khi dùng MP

(**) Kiểu cắt nối thường gặp nhất

Biến thể gen có ảnh hưởng đáng kể đến vùng ADN chứa chúng Biến thể rs9101 nằm trong vùng điều hòa biểu hiện gen, trong khi biến thể rs13830 xảy ra ở đầu 3’ của vùng UTR, nơi chứa các vị trí điều hòa sau phiên mã, có khả năng tác động đến quá trình biểu hiện gen Thêm vào đó, ba biến thể rs8362, rs9101 và rs13830 đều có điểm chung là ảnh hưởng đến kiểu cắt nối ARN chính.

 Ảnh hưởng của biến thể đến acid amin mã hóa: Biến thể rs1127354 là một đột biến gây thay thế acid amin được mã hóa

Bàn luận

3.3.1 Về sự đa hình của một số gen liên quan đến quá trình dược động học của 6- mercaptopurin ở người Kinh Việt Nam

Tần suất các biến thể gen phụ thuộc vào nguồn gốc tổ tiên, vùng địa lý Với riêng

Mối quan hệ giữa độc tính của 6-mercaptopurin và tần suất alen của các gen liên quan đến dược động học đã được xác lập tại nhiều quốc gia và quần thể khác nhau, góp phần vào việc điều chỉnh liều lượng và thay thế thuốc cho bệnh nhân Để tối ưu hóa việc sử dụng thuốc cho bệnh nhân ALL tại Việt Nam, việc sàng lọc các dấu ấn sinh học có tần suất cao là rất cần thiết, đặc biệt trong bối cảnh xét nghiệm gen chưa được áp dụng rộng rãi Tuy nhiên, hiện nay vẫn thiếu nghiên cứu về đa hình gen này trong quần thể người Việt Nam So sánh tần suất các biến thể gen liên quan đến dược động học của 6-mercaptopurin giữa người Việt Nam và các quần thể đã được công bố sẽ giúp xác định những đa hình quan trọng, từ đó xây dựng bộ xét nghiệm và hướng dẫn sử dụng thuốc phù hợp cho người Việt Nam.

Nghiên cứu của chúng tôi đã so sánh tần suất các alen của 4 gen liên quan đến dược động học của 6-MP ở quần thể người Việt Nam với 5 quần thể lớn khác Vai trò quan trọng của 4 gen này trong quá trình dược động học của 6-MP đã được xác nhận từ lâu Kết quả cho thấy, khi so sánh với quần thể người gốc Đông Á, không có sự khác biệt đáng kể trong tần suất của cả 4 gen Tuy nhiên, khi so sánh với quần thể người gốc châu Âu, đã phát hiện sự khác biệt đáng kể trong tần suất.

Trong 10 năm qua, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các đa hình gen NUDT15, ABCC4 và ITPA có liên quan đến độc tính thuốc trong quần thể người Đông Á Đặc biệt, việc sàng lọc các biến thể gen này trên quần thể người Việt Nam là cần thiết, đặc biệt là các biến thể có tần suất cao như rs8362 (0,641) và rs9101 (0,490) trên gen ITPA, đã được xác nhận mối liên hệ với độc tính thuốc qua các tài liệu y khoa.

Tần suất các alen trong nghiên cứu của chúng tôi có sự chênh lệch không lớn so với số liệu từ nghiên cứu trên 504 người Việt Nam của Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn - Vingroup, với phần lớn độ lệch nằm dưới 15% Biến thể rs9465100 ghi nhận độ lệch lớn nhất, nhưng xét trên tổng số mẫu, sự khác biệt chỉ là không đáng kể.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có 7 alen trên 99 người, và đối với những đột biến có độ lệch lớn hơn 15%, sự khác biệt về số lượng alen vẫn thấp khi xét trên tổng số mẫu Điều này cho thấy kết quả của chúng tôi khá tương đồng với nghiên cứu của viện Dữ liệu lớn – Vingroup, nghiên cứu duy nhất hiện có về quần thể người Việt Nam liên quan đến những đột biến mà chúng tôi quan tâm.

Nghiên cứu của chúng tôi đã xác định danh sách 42 đa hình trong quần thể người Kinh Việt Nam liên quan đến quá trình dược động học của 6-MP, đánh dấu đây là nghiên cứu đầu tiên trong lĩnh vực này Trước đây, các nghiên cứu về các gen này chỉ tập trung vào một số biến thể cụ thể như rs1142345 và rs1800460 (gen TPMT), rs1127354 (gen ITPA) Đặc biệt, có tới 42% đa hình có tần suất lớn hơn so với alen trên hệ gen tham chiếu, cho thấy sự phong phú trong di truyền học của quần thể này.

38 khẳng định tính đặc trưng về quần thể trong các gen liên quan tới quá trình dược động học của 6- MP của người Kinh Việt Nam

3.3.2 Về mối liên quan đến độc tính thuốc của 6- mercaptopurin trên quần thể người Kinh Việt Nam

3.3.2.1 Về những biến thể đã được ghi nhận là có liên quan đến độc tính thuốc

Trong thời gian gần đây, sự phát triển nhanh chóng của công nghệ giải trình tự gen đã làm giảm đáng kể chi phí, giúp phương pháp cá thể hóa điều trị trở nên dễ tiếp cận hơn Việc đánh giá mối liên hệ giữa biến thể gen và độc tính thuốc là rất quan trọng trong cá thể hóa điều trị, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chức năng của vùng ADN, loại đột biến, và ảnh hưởng của biến thể đến chức năng protein Đặc biệt, trong bối cảnh thiếu nghiên cứu về độc tính thuốc của 6-MP trên quần thể người Kinh Việt Nam, việc sử dụng công cụ VEP để đánh giá các biến thể gen tại Việt Nam sẽ mang lại giá trị khoa học và thực tiễn cao.

Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng công cụ VEP để chú giải các biến thể liên quan đến độc tính của 6-MP, nhằm cung cấp cái nhìn toàn diện cho người thực hành lâm sàng tại Việt Nam Trong nghiên cứu, 10 biến thể đã được chú giải, với nhiều kết quả phù hợp so với các công bố trước đây Biến thể rs1127354 được ghi nhận có ảnh hưởng đến vùng protein mà nó mã hóa, gây thay thế acid amin, dẫn đến giảm chuyển hóa thiopurin và xuất hiện phản ứng phụ như giảm dung nạp khi sử dụng 6-MP Hậu quả lâm sàng là giảm dung nạp thuốc và giảm biểu hiện ITPA, có thể liên quan đến phản ứng phụ khi dùng 6-MP, tương đồng với ghi nhận trong y văn về biến thể này.

Biến thể gen rs116855232 ảnh hưởng đến hoạt tính enzym, với 25% hoạt tính trên bệnh nhân dị hợp và hầu như mất hoạt tính hoàn toàn ở bệnh nhân đồng hợp Mặc dù có mối liên hệ giữa biến thể này và độc tính, các nghiên cứu trên quần thể người Nhật Bản và Hàn Quốc cho thấy tác dụng phụ, trong khi quần thể Trung Quốc không ghi nhận mối liên quan Biến thể này gây giảm chuyển hóa thiopurin, dẫn đến phản ứng phụ cần thay đổi liều 6-MP, như giảm bạch cầu và rụng tóc trong bệnh viêm ruột Điểm CADD_PHRED của biến thể là 22,2, nằm trong 0,1 - 1% biến thể có hậu quả nghiêm trọng Hướng dẫn điều trị 6-MP khuyến cáo xét nghiệm kiểu gen biến thể này để tối ưu hóa điều trị Các biến thể rs8362, rs9101, rs13830 và rs7886 cũng ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện gen, với rs13830 và rs7886 nằm trên vùng UTR 3' có thể ảnh hưởng đến điều hòa sau phiên mã Những phát hiện này hỗ trợ các nghiên cứu trước đó về mối liên hệ giữa các biến thể này và độc tính khi sử dụng 6-MP.

Hai biến thể rs3765534 và rs2274407 không chỉ ảnh hưởng xấu đến acid amin mà còn tác động đến chức năng protein, được xác định qua các chỉ số như SIFT, Polyphen, Condel và CADD Biến thể rs3765534 đã được ghi nhận ở tất cả bệnh nhân giảm bạch cầu khi sử dụng 6-MP trong nghiên cứu trên quần thể Nhật Bản, với 57,1% bệnh nhân phải giảm liều vào ngày 168 Trong khi đó, biến thể rs2274407 có mối liên hệ với thời gian sống thêm không tiến triển bệnh ở bệnh nhân ALL trong nghiên cứu trên quần thể Iran Những phát hiện này phù hợp với dự đoán từ công cụ VEP.

3.3.2.2 Về mối liên hệ đến độc tính của 6- MP ở các biến thể chưa được ghi nhận trong y văn

Việc sử dụng công cụ tin sinh học để chú giải các biến thể chưa được ghi nhận không chỉ cung cấp thông tin về ảnh hưởng của chúng mà còn giúp xác định những biến thể quan trọng liên quan đến độc tính thuốc trong lâm sàng.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các biến thể được đánh giá bởi công cụ VarSome được phân loại thành ba nhóm chính: (i) lành tính, (ii) gần như lành tính, và (iii) không chắc chắn về hậu quả Nhóm (i) bao gồm các biến thể có tần suất lớn hơn 5%, trong khi các biến thể còn lại được phân loại vào nhóm (ii) và (iii chủ yếu do các tiêu chí như PM2, BP4 và PP3 Sự không nhất quán trong kết quả giữa các công cụ tin sinh thứ cấp đã dẫn đến nhiều biến thể bị xếp vào nhóm (iii) không chắc chắn về hậu quả, do thiếu dữ liệu y văn để đánh giá ảnh hưởng trên quần thể Kết quả là, các công cụ tin sinh không có đủ thông tin để đánh giá chính xác ảnh hưởng của các biến thể này, dẫn đến sự không đồng nhất trong kết quả.