KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ VÀ NHIỆT ĐỘ Ủ ĐẾN MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẬU ĐỎ NẢY MẦM Ngành : QLCL ATTP Giáo viên hướng dẫn : Th.S HOÀNG LAN PHƯỢNG TS. LẠI THỊ NGỌC HÀ Địa điểm thực tập : KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và chưa hề được sử dụng. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn khóa luận này đã được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được khóa luận này, bên cạnh sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được nhiều sự động viên và giúp đỡ tận tình của thầy cô, bạn bè và người thân. Đầu tiên tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn Th.S Hoàng Lan Phượng, TS. Lại Thị Ngọc Hà, Bộ môn Hóa sinh Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ không mệt mỏi để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Trần Thị Hoài giảng viên Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ, hỗ trợ, giúp tôi những thao tác kỹ thuật trong quá trình làm khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Xuân Bắc, kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện để tôi sử dụng thiết bị thí nghiệm một cách tốt nhất. Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa học và Công nghệ thực phẩm, anh chị kỹ thuật viên đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi sử dụng thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn bố mẹ, gia đình đã luôn động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii I. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu về đậu tương và đậu đỏ 3 2.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm thực vật học 3 2.1.2. Thành phần hóa học 5 2.1.3. Dược tính của đậu 12 2.1.3.1. Dược tính của đậu tương 12 2.1.3.2. Dược tính của đậu đỏ 13 2.1.4. Các cách sử dụng đậu 14 2.2. Giới thiệu về quá trình nảy mầm 16 2.2.1. Biến đổi hóa lý và hóa sinh trong quá trình hạt nảy mầm 17 2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nảy mầm của hạt 19 III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 3.1.1. Đối tượng 22 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 3.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 22 3.2.1. Thiết bị 22 3.2.2. Hóa chất 22 3.2.3. Dụng cụ 23 3.3. Nội dung nghiên cứu 23 3.4. Phương pháp nghiên cứu 24 3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 24 3.4.2. Phương pháp xác định tỷ lệ nảy mầm 25 3.4.3. Phương pháp xác định khối lượng trung bình 5 hạt nảy mầm 25 3.4.4. Phương pháp xác định kích thước mầm 25 3.4.5. Phương pháp xác định hàm lượng chất khô tổng số 25 3.4.6. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol 26 3.4.7. Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hoá 27 3.3.8. Phương pháp xác định hàm lượng phytic acid 29 3.4.9. Phương pháp xử lý số liệu 30 IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1. Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến khối lượng trung bình 5 hạt của đậu trong quá trình nảy mầm 31 4.2. Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến hàm lượng chất khô tổng số của hạt đậu 32 4.3. Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu 33 4.4. Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến kích thước mầm của hạt đậu. .......................................................................................................................................35 4.5. Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến làm lượng polyphenol của hạt đậu nảy mầm. 36 4.6. Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến khả năng kháng oxi hóa của hạt đậu nảy mầm. 37 4.7. Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến làm lượng phytic acid của hạt đậu nảy mầm 39 V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1. Kết luận 42 5.2. Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤC LỤC 47 Phục lục 1: Bảng ảnh hưởng bởi thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến một số chỉ tiêu của đậu tương và đậu đỏ nảy mầm 47 Phục lục 2: Hình ảnh 51 Phục lục 3: Xử lý số liệu thống kê bằng SAS 9.4 52
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Giống đậu tương ĐT26 của Trung tâm Nghiên cứu và phát triển đậu đỗ - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm.
Giống đậu đỏ được trồng tại Tân Dân, Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên.
3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa sinh - Khoa Công nghệ thực phẩm Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa học và Công nghệ thực phẩm Khoa Công nghệ thực phẩm - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Thời gian: từ tháng 03/2020 đến tháng 08/2021.
Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu được giới thiệu ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
STT Thiết bị Nguồn gốc
1 Đèn UVC Sankyo Denki G15T8 Nhật Bản
2 Cân phân tích Tolero Trung Quốc
4 Tủ sấy Binder ED115 Đức
6 Máy ly tâm lạnh Mikro 220R Đức
7 Máy lắc Amerex Instruments Trung Quốc
8 Máy quang phổ Shimadzu UV 1800 Nhật Bản
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu được giới thiệu ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
STT Hóa chất Nguồn gốc
8 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Nhật Bản
- Ống nghiệm, ống đong 10 ml/ 50 ml/ 250 ml;
- Bình tam giác 100 ml/ 250 ml;
- Ống falcon 15 ml, ống eppendorf 2 ml;
- Bình định mức 50 ml/ 100 ml/ 250 ml/ 500 ml;
- Nhiệt kế, hộp bảo quản.
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến sự thay đổi khối lượng trung bình của 5 hạt đậu tương và đậu đỏ trong quá trình nảy mầm Kết quả sẽ giúp hiểu rõ hơn về điều kiện tối ưu cho sự phát triển của hai loại hạt này, từ đó cải thiện hiệu quả canh tác.
- Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến hàm lượng chất khô của đậu tương và đậu đỏ trong quá trình nảy mầm.
- Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến tỷ lệ nảy mầm của đậu tương và đậu đỏ trong quá trình nảy mầm.
- Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến kích thước mầm của đậu tương và đậu đỏ trong quá trình nảy mầm.
Xử lý sơ bộ nguyên liệu Đậu tương Đậu đỏ
- Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến khả năng kháng OXH của đậu tương và đậu đỏ trong quá trình nảy mầm.
- Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến hàm lượng polyphenol của đậu tương và đậu đỏ trong quá trình nảy mầm.
- Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ và nhiệt độ ủ đến hàm lượng phytic acid của đậu tương và đậu đỏ trong quá trình nảy mầm.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm Để khảo sát sự biến đổi về hàm lượng các chất trong quá trình nảy mầm của đậu tương bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, chúng tôi thực hiện làm nảy mầm đậu tương và đậu đỏ ở 3 nhiệt độ 25℃, 30℃ và 35℃.
Hình 3.1 Quy trình thu mẫu để phân tích các chỉ tiêu hóa sinh
Chuẩn bị cốc nhựa có đục lỗ sẵn dưới đáy cốc, mỗi cốc đựng 50 hạt đậu tương.
Mã hóa mẫu bằng x-y-z, sau đó cân khối lượng từng cốc riêng biệt.
Trong đó: x: số ngày ủ mẫu; y: nhiệt độ ủ (với 1: nhiệt độ 25℃; 2: nhiệt độ
Đậu tương và đậu đỏ được rửa bằng dung dịch NaOCl 0,7% trong 10 phút, sau đó rửa lại với nước RO 5 lần Tiếp theo, đậu tương được ngâm trong 10 giờ và đậu đỏ trong 6 giờ ở nhiệt độ 25°C trước khi tiến hành đo khối lượng.
Sau khi ngâm, hạt được ủ ở ba nhiệt độ khác nhau là 25℃, 30℃ và 35℃ Sử dụng cốc đục lỗ, trải một lớp khăn xô và xếp hạt thành một lớp mỏng, sau đó đậy một lớp khăn xô lên trên và ủ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối Cần tưới nước để giữ ẩm cho mẫu, thực hiện hai lần mỗi ngày Đối với đậu tương và đậu đỏ, sau khi đo các chỉ tiêu về khối lượng và kích thước mầm, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -20°C.
3.4.2 Phương pháp xác định tỷ lệ nảy mầm
Chúng tôi đã tiến hành thu mẫu từ các mẫu thí nghiệm vào ngày 1, 2, 3 và 4, đồng thời loại bỏ những hạt không nảy mầm hoặc có kích thước mầm khác biệt quá lớn Sau khi thu thập, chúng tôi đếm số hạt nảy mầm trong tổng số hạt đã thu được.
% Trong đó: a1: số hạt nảy mầm a: số hạt mang đi ủ
3.4.3 Phương pháp xác định khối lượng trung bình 5 hạt nảy mầm
Để xác định khối lượng trung bình của 5 hạt nảy mầm, tiến hành lấy ngẫu nhiên 5 hạt từ mỗi cốc, sau đó cân chúng bằng cân phân tích Quá trình này cần được lặp lại 3 lần cho mỗi cốc để đảm bảo độ chính xác của kết quả.
3.4.4 Phương pháp xác định kích thước mầm
Tiến hành đo kích thước mầm theo nguyên tắc lấy hạt ở trong cốc ra và đo kích thước mầm bằng thước kẻ có chia kẻ vạch.
3.4.5 Phương pháp xác định hàm lượng chất khô tổng số
Tổng lượng chất khô được xác định theo TCVN 10696:2015.
Lấy ngẫu nhiên 10 hạt và cân khối lượng đĩa ban đầu (m0) Sau đó, cho mẫu vào đĩa và cân khối lượng tổng (m1) trước khi sấy Tiến hành sấy sơ bộ mẫu ở nhiệt độ 105°C trong 6 giờ Sau thời gian này, lấy mẫu ra và cân lại khối lượng tổng (m2) cho đến khi khối lượng mẫu không thay đổi.
Ts : Hàm lượng chất khô tổng số (%) m0 : Khối lượng của đĩa (g) m1 : Khối lượng của đĩa và mẫu trước sấy (g) m2 : Khối lượng của đĩa và mẫu sau sấy (g).
3.4.6 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định bằng phương pháp Folin -Ciocalteu (Singleton & cs, 1965) Gallic acid được dùng làm chất chuẩn.
Phản ứng oxi hóa hợp chất phenol bằng thuốc thử Folin-Ciocalteu tạo ra sản phẩm màu xanh thẫm, với cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ polyphenol trong một khoảng nhất định Bằng cách đo cường độ màu ở bước sóng 755nm và sử dụng đồ thị chuẩn của acid gallic với thuốc thử Folin-Ciocalteu, có thể xác định hàm lượng polyphenol trong hạt đậu nảy mầm.
Pha loãng dịch chiết từ quả ra 2 lần.
Tiến hành phản ứng trong ống nghiệm theo tỷ lệ các chất như sau:
+ 0, 5ml dung dịch chiết + 0,25ml Folin - Ciocalteu 1N + 1,25ml Na2CO3 7,5% +Vortex cho dung dịch đồng nhất
+ Để 30 phút trong bóng tối cho ổn định màu
+ Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 755nm
Gallic acid được sử dụng làm chất chuẩn trong thí nghiệm này Dãy chuẩn gallic acid được tạo ra bằng cách pha loãng dung dịch gallic acid (1 mg/ml) trong nước để đạt được 6 nồng độ khác nhau: 0, 20, 40, 60, 80 và 100 (µg/ml) Dựa trên kết quả thu được và đường chuẩn gallic acid, hàm lượng polyphenol tổng số được tính toán và biểu diễn theo mg GAE/g CK (GAE - Gallic Acid Equivalent).
X: Hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g CK)
OD: Độ hấp thụ quang của mẫu ở bước sóng 765nm c: Độ pha loãng dịch chiết (lần)
V: Thể tích dịch chiết (ml)
Nồng độ dung dịch gallic acid (àg /�� ) w: hàm ẩm có trong mẫu (%) a: Hệ số a của phương trình đường chuẩn gallic acid (y= ax+b) m: Khối lượng mẫu dùng để chiết dịch (g)
Hình 3.1 Đường chuẩn axit gallic Đường chuẩn của các chất chuẩn trong phân tích hàm lượng polyphenol tống số có dạng y = ax + b, với các đại lượng:
- y là giá trị hấp thụ quang A 755
- x là nồng độ axit gallic (àg/ml)
- Các hệ số a và b cho chất chuẩn như sau:
Từ giá trị hấp thụ quang A755 và đường chuẩn ta tính được nồng độ từng chất trong dịch chiết:
3.4.7 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hoá
Phương pháp xác định: xác định bằng phương pháp DPPH (Tabart et al., 2009). Nguyên tắc:
DPPH là một gốc tự do bền, có màu tím và hấp thụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 517 nm Các chất kháng oxy hóa có khả năng trung hòa gốc DPPH bằng cách cung cấp hydrogen, dẫn đến sự giảm độ hấp thụ và làm nhạt màu dung dịch từ tím sang vàng nhạt Để đảm bảo độ chính xác của kết quả thí nghiệm, thuốc thử DPPH nên được pha chế ngay trước khi thực hiện.
Pha dung môi chiết: 50 ml aceton 100%, 49 ml nước, 1 ml acetic acid
Cân 0.075g mẫu vào ống eppendof sau đó lên thể tích 1,5 ml với dung môi đã pha lắc 30 phút ở nhiệt độ 37°C, 200 vòng/phút Sau đó ly tâm ở nhiệt độ 4°C, 6000 vòng/phút trong 10 phút Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho vào ống fancol 15ml Chiết mẫu 3 lần Dịch chiết được lên thể tích 5ml bằng dung môi chiết.
Mỗi mẫu lặp lại 3 lần.
- Cân 0,1g vitamin C định mức lên thể tích 100ml bằng nước
- Pha loóng vitamin C 10 lần: 100 àl Vitamin C gốc và 900 àl H 2 O
- Xây dựng đường chuẩn Vitamin C
Cân 0,4g DPPH lên thể tích 100ml bằng methanol Sau đó pha loãng dung dịch DPPH 10 lần: 25ml dung dịch DPPH và 225 ml methanol
Pha loóng dịch chiết 10 lần, với 100 àl dịch chiết và 900 àl H2O Hỗn hợp 0,1ml dịch chiết được trộn với 2,9ml dung dịch DPPH đã pha loãng và để trong bóng tối trong 30 phút Đối chứng được chuẩn bị bằng cách sử dụng 0,1ml nước cất kết hợp với 2,9ml dung dịch DPPH, cũng để trong bóng tối trong 30 phút Cuối cùng, độ hấp thụ được đo ở bước sóng 517nm bằng máy đo quang phổ.
Khả năng kháng oxi (μM VitaCE/100 g mẫu) được tính theo công thức:
AA%: % Kìm hãm, tính theo công thức:
V: Thể tích dung dịch chiết (mL) dF: Độ pha loãng dịch chiết trước khi tiến hành phản ứng
100: Hệ số tính trong 100 g mẫu a: Hệ số độ dốc của phương trình đường chuẩn Vitamin C m: Khối lượng mẫu (g)
1000: Hệ số chuyển đổi từ mL sang L dịch chiết.
3.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng phytic acid
Hàm lượng PA được phân tích bằng phương pháp so màu được trình bày bởi Gao
& cs (2007) có thay đổi để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm (Nguyễn Đức Doan & Đỗ Thị Hà, 2020):
Cân 0,5 g mẫu vào ống falcon 15 ml, thêm 10 ml acid HCl 2,4% và lắc ở tốc độ 220 vòng/phút trong 16 giờ Sau khi ly tâm ở 1000 vòng/phút tại 10°C trong 20 phút, gạn lấy dịch trong và cho vào ống ly tâm Tiếp theo, thêm 0,5 g NaCl (99,5% tinh khiết) và lắc vortex ở 350 vòng/phút trong 20 phút cho tan muối, sau đó ủ mẫu ở -20 °C trong 20 phút Cuối cùng, ly tâm mẫu ở 1000 vòng/phút trong 20 phút tại 10 °C và tách lấy dịch trong.
Lấy 1 ml dịch trong pha loãng với 24 ml nước cất siêu sạch, sau đó lấy 3 ml đã pha loãng thêm 1 ml dung dịch Wade (0,03% FeCl 3 6H2O + 0,3% axit sulfosalicylic) cho vào ống falcon và lắc đều Đem mẫu đi ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 10°C Các dung dịch chuẩn phytic acid được chuẩn bị bằng cách pha natri phytate chuẩn với nước cất siêu sạch để đạt được nồng độ 0; 5; 10; 20; 40; 80 àg/ml Mỗi dung dịch chuẩn được thờm dung dịch Wade và tiến hành như trờn Mỗi thớ nghiệm được phân tích lặp lại 3 lần Mẫu phân tích và mẫu chuẩn được tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm bằng máy quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-1800,Shimadzu, Nhật Bản).
Dãy chuẩn phytic acid được tạo ra bằng cách pha loãng dung dịch sodium phytate trong nước với 6 nồng độ khác nhau: 0, 5, 10, 20, 40, và 80 mg/l Từ các kết quả thu được, hàm lượng phytic acid trong 1g chất khô của hạt đậu tương được tính toán và biểu diễn dưới dạng mg/g CK.
Hàm lượng phytic acid (mg/g CK) = 100
V là thể tích dịch chiết m là khối lượng mẫu đem chiết (g)
CK là hàm lượng chất khô trong mẫu (%)
C là nồng độ acid phytic tính theo (àg/ml).
3.4.9 Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu được phân tích bằng Microsoft Excel và phần mềm SAS 9.4, với kết quả trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (TB ± SD) Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ ủ đến các chỉ tiêu hóa sinh trong hạt đậu tương và đậu đỏ được xác định thông qua phân tích ANOVA với ba yếu tố.
1 0.5 0 ngày 0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 Đậu tươngĐậu đỏ
