Trên thực tế vi tảo được nuôi trong điều kiện môi trường tự dưỡng, cung cấp đủ ánh sang. Việc nuôi tảo tự dưỡng để thu sinh khối chiết tách dầu cần một diện tích đất rộng lớn, thời gian chiếu sang nhiều và tốn kém chi phí xây dựng. Điều này không phù hợp với các quốc gia có diện tích nhỏ, khu vực địa hình hiểm trở, điều kiện tự nhiên phức tạp và nền kinh tế chưa phát triển. Để khắc phục những nhược điểm trên các nhà khoa học đã thực nghiệm một hướng đi mới, chuyển các giống vi tảo từ môi trường tự dưỡng sang dị dưỡng. Mục đích chính của nghiên cứu này nhằm giải quyết vấn đề về an ninh năng lượng toàn cầu. Do đó cần khảo sát và so sánh lượng dầu của các loài vi tảo chiết tách từ các môi trường tự dưỡng và dị dưỡng để xem xét điều kiện nào thì tối ưu, thuận lợi và mang lại lợi ích kinh tế nhất. Vì vậy nhóm em chọn đề tài “Khảo sát khả năng tạo nhiên liệu sinh học từ vi tảo dị dưỡng” nhằm thực hiện mục đích trên.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Vật liệu trong nghiên cứu là các loài tảo thuộc ngành tảo lục, tảo nước ngọt, được thu ở địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh và tỉnh Bình Dương.
- Mẫu được tiến hành phân lập tại trung tâm phòng thí nghiệm CNSH và KTMT trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm.
Phương pháp nghiên cứu
Quá trình khảo sát sự tăng trưởng của vi tảo
TN1: Thu mẫu tảo ở các ao, hồ
Phân lập chọn loài tảo dị dưỡng
Khảo sát sự tăng trưởng sinh khối và sự tạo dầu theo thời gian
TN3: Nuôi dị dưỡng TN2: Nuôi hỗn dưỡng
BBM + glucose trong điều kiện có ánh sáng
TN 3.3: BBM + glycerine Nuôi nhân giống trong điều kiện tự dưỡng Đo Absλ
Sơ đồ 2 1 Khảo sát sự tăng trưởng, sự tạo dầu từ vi tảo
2.2.2 Thành phần môi trường BBM
Bảng 2.1 Thành phần các chất đa lượng (1 lít nước cất)
STT Hóa chất Khối lượng Ghi Chú
1 NaNO3 250mg Cho từng chất vào cốc khuấy tan hoàn toàn rồi mới cho tiếp các chất khác, FeSO4 nên cho sau cùng để hạn chế kết tủa.
Bảng 2.2 Thành phần các chất vi lượng (PIV)
STT Hóa chất Khối lượng Ghi chú
H3BO3 11,42g được hòa tan trong 1 ml PIV cho 1 lít dung dịch đa lượng Việc cân chính xác lượng chất vi lượng là rất quan trọng, vì dư thừa chất vi lượng có thể ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của vi tảo.
2.2.3 Thu và phân lập mẫu (Thí nghiệm 1)
Mẫu vi tảo được thu thập bằng lưới vớt phiêu sinh với kích thước mắt lưới phù hợp, thực hiện tại các ao hồ tự nhiên Kéo lưới từ 10m đến 20m để đảm bảo thể tích nước chứa vi tảo tối đa, sau đó chuyển mẫu vào chai PE sạch và bảo quản ở điều kiện thích hợp Thời gian lý tưởng để phân lập mẫu là từ 1 đến 2 ngày sau khi thu thập.
Thu mẫu tại 10 vị trí trong địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh và tỉnh Bình Dương (Phụ lục 1)
Phương pháp phân lập mẫu:
Mẫu sẽ được nuôi trong môi trường BBM (Basal Medium, Bischoff and Bold, 1963) với sự bổ sung glycerine hoặc natri acetate Mỗi mẫu sẽ được thử nghiệm trong hai chai: một chai sử dụng glycerine làm nguồn carbon và một chai sử dụng natri acetate Để thực hiện, rút 50 mL mẫu gốc và nuôi dị dưỡng trong chai thủy tinh với 100 mL dung dịch BBM cùng với 0,3 mL dung dịch glycerine hoặc 0,3 g natri acetate.
- Các chai mẫu được chỉnh pH 8,5 - 11 trong 24 giờ sau đó chỉnh đến pH 7 Mục đích loại bỏ các vi sinh gây bất lợi trong quá trình nuôi tảo.
- Nuôi các chai mẫu dị dưỡng trong tối với nhiệt độ môi trường 29 trong 1 tháng (trong quá trình nuôi, kiểm tra sự phát triển của tảo 3 lần/tuần).
Sau một tháng, mẫu được kiểm tra dưới kính hiển vi với các độ phóng đại 10x, 40x và 100x để quan sát sự phát triển của tảo dị dưỡng Kết quả cho thấy có những mẫu chứa tảo dị dưỡng đang sinh sống, và tiến hành cấy mẫu vào đĩa thạch petri.
Để pha chế môi trường đổ đĩa, cần chuẩn bị dung dịch BBM, agar và chất khử trùng theo tỷ lệ 1L BBM, 15g agar, 500mg ampicillin và 500mg cloramphenicol Nấu hỗn hợp này trên bếp điện cho đến khi agar hoàn toàn tan chảy Sau đó, hấp khử trùng môi trường và đĩa petri ở nhiệt độ trong 1,5 giờ Cuối cùng, đổ hỗn hợp vào đĩa thạch, để nguội và gói lại bằng giấy bảo quản trước khi sử dụng.
- Cấy mẫu vào đĩa petri: pha loãng mẫu ở các nồng độ 10-1;10-2; 10-3;10-4;10-
5 Rút 0,1mL dung dịch mẫu đã pha loãng vào đĩa thạch petri, dùng que trang trải đều mẫu khắp mặt thạch Ủ đĩa đã cấy mẫu ở nhiệt độ môi trường, trong một tuần ta sẽ được các khuẩn tảo riêng lẻ.
Khử trùng môi trường nuôi
Vô trùng là yếu tố quan trọng trong nuôi tảo, đặc biệt là tảo giống, để ngăn ngừa nhiễm tạp Mô hình nuôi được thực hiện trong phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Vật tại trường ĐH CNTP TP.HCM, nơi đảm bảo điều kiện vô trùng Các dụng cụ thí nghiệm như ống nghiệm và bình tam giác được khử trùng bằng cách hấp ở 105oC trong 45 phút.
Môi trường nuôi sinh khối tảo được khử trùng bằng cách cho vào nồi hấp khử trùng với nhiệt độ 121°C Thời gian hấp là 45 phút
Quan sát hình thái và định danh
Hình thái vi tảo được nghiên cứu qua kính hiển vi quang học với vật kính x10, cho phép quan sát rõ nét các đặc điểm tế bào trong các pha tăng trưởng Những đặc điểm này bao gồm màu sắc tế bào, kích thước, chuỗi và độ dài chuỗi, quá trình phân chia tế bào, cùng với các loại bào tử khác nhau.
Sự thay đổi hình thái tế bào vi tảo được quan sát và chụp ảnh mỗi ngày dưới kính hiển vi quang học ở vật kính x40 và vật kính x100.
Nuôi nhân giống trong điều kiện tự dưỡng
Trước khi tiến hành các nghiên cứu sinh lý, mẫu tảo được nuôi cho đến khi thích nghi ổn định với môi trường đã chọn:
Để nuôi tảo hiệu quả, bước đầu tiên là lấy mẫu tảo đã được phân lập và nuôi trong bình 250ml Cần sục khí liên tục và đặt ở nơi có ánh sáng từ 7 đến 10 ngày cho đến khi tảo phát triển xanh tốt Sau đó, chuyển sang nuôi trong bình 5 lít để tiếp tục quá trình phát triển.
Khi tảo trong bình 5 lít phát triển mạnh với màu xanh đậm, hãy chuyển chúng vào hồ lớn có kích thước 2,5m x 0,6m để nuôi thu sinh khối, với chiều cao môi trường khoảng 0,1 mét và thể tích nuôi khoảng 150 lít Trong quá trình nuôi, cần bổ sung định kỳ chất dinh dưỡng trong môi trường BBM hai lần mỗi tuần.
Bước 3: Sau thời gian từ 2 – 3 tuần, tảo trong hồ phát triển tốt, sinh khối nhiều sẽ tiến hành lấy mẫu đo TSS và thu sinh khối.
Bước 4: Thu toàn bộ lượng sinh khối trong hồ, để lắng 1 ngày, loại bỏ lớp nước trên bề mặt, tiến hành lọc thu sinh khối.
Sau khi lọc, bước 5 là phơi khô lượng sinh khối thu được và chia thành hai phần: một phần để tách lipid, phần còn lại để lưu trữ sinh khối khô.
2.2.4 Nuôi tảo trong môi trường hỗn dưỡng (Thí nghiệm 2)
Để tiến hành xử lý mẫu, bước đầu tiên là lấy mẫu từ hồ đã đạt yêu cầu, sau đó lắc đều và chia thành ba phần Mỗi phần sẽ được đựng trong chai 500ml có chứa môi trường BBM bổ sung glucose.
Bước 2: Để ngoài sáng sục và khí nhẹ cả ngày
Trong bước 3, tiến hành đo Abs liên tục trong 7 đến 9 ngày để khảo sát sự sinh trưởng của vi tảo Tiếp theo, ở bước 4, tách lipid vào các ngày 1, 3, 5 và 7 để đánh giá hàm lượng lipid của tảo.
2.2.5 Nuôi tảo trong môi trường dị dưỡng (Thí nghiệm 3)
Bước 1: Lấy mẫu trong hồ đã đạt yêu cầu đem xử lý, lắc đều sau đó chia thành 3 phần cho 3 môi trường dinh dưỡng khác nhau
+ TN 3.1: Lấy một phần mẫu tiếp tục chia 3 phần đựng vào chai 500ml có chứa môi trường BBM bổ sung glucose.
+ TN 3.2: Làm tương tự thí nghiệm 3.1 nhưng với môi trường BBM bổ sung glyceryl.
+ TN 3.3: Môi trường BBM bổ sung natri acetate.
Bước 2: Để trong tối, sục khí nhẹ (6 - 8 giờ/ngày).
Bước 3: Tiến hành đo Abs cách ngày mộtj, khảo sát sự sinh trưởng của vi tảo. Bước 4: Tách lipid vào các ngày 1, 3, 5 ,7, 9, 11, khảo sát hàm lượng lipid của tảo.
2.2.6 Khảo sát sự tăng trưởng của tảo (Abs và TSS) theo thời gian:
Phương pháp đo độ hấp thụ (Absorbance) được sử dụng để xác định nồng độ sinh khối trong môi trường thông qua việc phân tích độ hấp thụ quang của sắc tố Chlorophyll trong tế bào Các sắc tố này có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 670nm, được đo bằng máy quang phổ UV/Visible Ultrospec 2000.
Trước khi lấy mẫu vào ống nghiệm, cần lắc đều và lặp lại thao tác này trước khi cho mẫu vào cuvet Lưu ý không đổ quá đầy mẫu vào cuvet Sau đó, điều chỉnh bước sóng ở mức λ = 670 nm và ghi lại kết quả hiển thị trên màn hình máy.
Xác định hàm lượng sinh khối
Kết quả phân lập và xác định hình thái
Sau khi phân lập tảo trong đĩa petri và nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, hình thái, hàm lượng lipid cũng như khả năng sinh trưởng, giáo viên hướng dẫn đã hỗ trợ nhóm trong việc định danh và lựa chọn loại vi tảo phù hợp cho đề tài nghiên cứu.
Kết quả định danh bằng phương pháp hình thái
Vi tảo đã phân lập thuộc:
- Là giống tảo đơn bào thuộc loài tảo lục, tồn tại ở dạng 2 – 4 -8 tế bào Có dạng hỡnh trụ, oval hay oval kộo dài, kớch thước tế bào 5 -10 x 12-24 àm.
- Ở Việt Nam: chúng sống ở môi trường nước ngọt, phân bố dạng trôi nổi hoặc đáy của các thủy vực.
Môi trường hỗn dưỡng
3.2.1 Kết quả hàm lượng sinh khối trong môi trường hỗn dưỡng bổ sung glucose
Sự biến động lipid của môi trường hỗn dưỡng bổ sung glucose được thể hiện qua hình dưới đây:
Hình 3.2 Biến động sinh khối trong môi trường hỗn dưỡng bổ sung glucose
- Biểu đồ cho thấy: từ ngày 1 đến ngày 3 hàm lượng sinh khối tăng từ 1.250 g /l -7.667 g/l.
- Từ ngày 3 đến ngày 5 hàm lượng sinh khối tăng từ 7.667 g/l – 9.933 g/l.
- Từ ngày 5 đến ngày 7 hàm lượng sinh khối giảm từ 9.933 g/l – 6.600 g/l.
- Hàm lượng sinh khối ở ngày 5 là cao nhất 9.933 g/l vì vậy để hàm lượng sinh khối tăng ổn định nên bổ sung dinh dưỡng vào ngày thứ 5.
3.2.2 Kết quả lipid trong môi trường hỗn dưỡng bổ sung glucose
Sự biến động lipid của môi trường hỗn dưỡng bổ sung glucose được thể hiện qua hình dưới đây:
Hình 3.3 Biến động lipid trong môi trường glucose hỗn dưỡng
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 1 đến ngày 3 tăng từ 16 % – 27,823 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 3 đến ngày 5 giảm từ 27,823 %– 21,812%.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 5 đến ngày 7 tăng từ 21,812 %- 36,191 %.
- Nên tiến hành thu lipid vào ngày 7 vì hàm lượng lipid tối ưu nhất.
Môi trường dị dưỡng
3.3.1 Kết quả hàm lượng sinh khối trong môi trường dị dưỡng bổ sung natri acetate
Sự biến động sinh khối trong môi trường dị dưỡng bổ sung natri acetate được thể hiện qua hình dưới đây:
Hình 3.4 Biến động của hàm lượng sinh khối trong môi trường dị dưỡng bổ sung natri acetate
- Từ ngày 1 – ngày 3 hàm lương sinh khối tăng từ 1.250 g/l – 4.067 g/l
- Từ ngày 3 – ngày 5 hàm lượng snh khối tăng từ 4.067 g/l – 8.367 g/l.
- Từ ngày 5 – ngày 7 hàm lượng sinh khối giảm từ 8.367 g/l – 4.933 g/l.
- Từ ngày 7 – ngày 9 hàm lượng sinh khối tăng từ 4.933 g/l – 9.317 g/l.
- Từ ngày 9 ngày 11 hàm lượng sinh khối giảm từ 6.317 g/ l – 3.883 g/l.
- Hàm lượng sinh khối tối ưu nhất là ngày 5, cần bổ sung dinh dưỡng để suy trì sinh khối.
3.3.2 Kết quả hàm lượng sinh khối trong môi trường dị dưỡng bổ sung glyceryl
Sự biến động hàm lượng sinh khối trong môi trường dị dưỡng bổ sung glyceryl được thể hiện qua hình dưới đây:
Hình 3.5 Biến động của hàm lượng sinh khối trong môi trường dị dưỡng bổ sung glyceryl.
- Từ ngày 1 – ngày 3 hàm lương sinh khối tăng từ 1.250 g/l – 6.067 g/l
- Từ ngày 3 – ngày 5 hàm lượng snh khối tăng từ 6.067 g/l – 9.773 g/l.
- Từ ngày 5 – ngày 7 hàm lượng sinh khối giảm từ 9.773 g/l – 5.933 g/l.
- Từ ngày 7 – ngày 9 hàm lượng sinh khối tăng từ 5.933 g/l – 7.800 g/l.
- Từ ngày 9 ngày 11 hàm lượng sinh khối giảm từ 7.800 g/ l – 5.550 g/l.
- Hàm lượng sinh khối tối ưu nhất là ngày 5, cần bổ sung dinh dưỡng để suy trì sinh khối.
3.3.3 Kết quả hàm lượng sinh khối trong môi trường dị dưỡng bổ sung glucose
Sự biến động hàm lượng sinh khối trong môi trường dị dưỡng bổ sung glucose. được thể hiện qua hình dưới đây:
Hình 3.6 Biến động của hàm lượng sinh khối trong môi trường dị dưỡng bổ sung glucose
- Từ ngày 1 – ngày 3 hàm lương sinh khối tăng từ 1.250 g/l – 4.517 g/l
- Từ ngày 3 – ngày 5 hàm lượng snh khối tăng từ 0.475g/l – 7.917 g/l.
- Từ ngày 5 – ngày 7 hàm lượng sinh khối giảm từ 7.917 g/l – 6.150 g/l.
- Từ ngày 7 – ngày 9 hàm lượng sinh khối tăng từ 6.150 g/l – 7.600g/l.
- Từ ngày 9 ngày 11 hàm lượng sinh khối giảm từ 7.600 g/ l – 4.85 g/l.
Hàm lượng sinh khối tối ưu nhất là ngày 5, cần bổ sung dinh dưỡng để suy trì sinh khối.
3.3.4 So sánh hàm lượng sinh khối trong các môi trường khác nhau
Hình 3 7 Biểu đồ so sánh hàm lượng sinh khối trong các môi trường dị dưỡng
- Mức độ tăng trưởng của natri acetate là thấp nhất, kế đến là glucose và glyceryl là cao nhất
- Từ ngày 1 – ngày 5 hàm lượng sinh khối của tất cả các môi trường đều tăng và giảm ở ngày 7.
- Từ ngày 7 – ngày 9 lượng sinh khối tăng trở lại và sau cùng giảm ở ngày 11.
3.3.5 Kết quả lượng lipid thu được trong môi trường dị dưỡng bổ sung natri acetate
Sự biến động lipid của môi trường dị dưỡng bổ sung natri acetate được thể hiện qua hình dưới đây:
Hình 3 8 Biến động lipid trong môi trường dị dưỡng bổ sung natri acetate
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 1 đến ngày 3 tăng từ 16 % – 31.77 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 3 đến ngày 5 tăng từ 31.77 % – 34.67 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 5 đến ngày 7 tăng từ 34.67 % - 41.89 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 7 đến ngày 9 giảm từ 41.89 % – 29.95 %
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 9 đến ngày 11 giảm từ 29.95 % - 21.03 %.
- Nên tiến hành thu lipid vào ngày 7 vì hàm lượng lipid tối ưu nhất.
3.3.6 Kết quả lượng lipid thu được trong môi trường dị dưỡng bổ sung glyceryl
Sự biến động lipid của môi trường dị dưỡng bổ sung glyceryl được thể hiện qua hình dưới đây:
Hình 3.9 Biến động lipid trong môi trường dị dưỡng bổ sung glyceryl
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 1 đến ngày 3 tăng từ 16 % – 26.98 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 3 đến ngày 5 tăng từ 26.98 % – 32.07 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 5 đến ngày 7 tăng từ 32.07 % - 41.04 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 7 đến ngày 9 tăng từ 41.04 % – 50.18 %
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 9 đến ngày 11 giảm từ 50.18 % - 32.40 %.
- Nên tiến hành thu lipid vào ngày 9 vì hàm lượng lipid tối ưu nhất.
3.3.7 Kết quả lượng lipid thu được trong môi trường dị dưỡng bổ sung glucose
Sự biến động lipid của môi trường dị dưỡng bổ sung glucose được thể hiện qua hình dưới đây:
Hình 3.10 Biến động lipid của môi trường dị dưỡng bổ sung glucose
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 1 đến ngày 3 tăng từ 16 % – 27.52 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 3 đến ngày 5 tăng từ 27.52 % – 31.68 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 5 đến ngày 7 tăng từ 31.68 % - 35.75 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 7 đến ngày 9 giảm từ 35.75 % – 32.54 %.
- Hàm lượng lipid thu được từ ngày 9 đến ngày 11 giảm từ 32.54 % - 32.71 %.
- Nên tiến hành thu lipid vào ngày 7 vì hàm lượng lipid tối ưu nhất.
3.3.8 So Sánh hàm lượng sinh khối trong các môi trường dị dưỡng
Hình 3.11 Biến động hàm lượng lipid trong các môi trường dị dưỡng
- Hàm lượng lipid thu được trong môi trường có bổ sung glyceryl là cao nhất
- Từ ngày 1 – ngày 7 lượng lipid của tất cả các môi trường đều tăng.
- Từ ngày 7 – ngày 9 lượng lipid trong môi trường glyceryl tăng, 2 môi trường còn lại giảm.
- Từ ngày 9 – ngày 11 lipid trong môi trường glucose tăng, 2 môi trường còn lại giảm.
Kết quả về thành phần và tỉ lệ các chất trong dầu tảo được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3 1 Các thành phần và tỉ lệ trong dầu tảo
Thành phần và tỉ lệ các chất trong dầu tảo được thể hiện trong hình dưới đây:
Hình 3 12 Biểu đồ thể hiện thành phần và tỉ lệ các chất trong dầu tảo
Kết quả phân tích cho thấy dầu tảo Scenedesmus sp2 chứa các acid béo mạch dài từ C12 đến C24, với tỷ lệ cao của các acid palmitic (C16:0), acid oleic (C18:1), acid linoleic (C18:2) và acid linolenic (C18:3).
- Acid palmitic (C16:0) là 16.54%, acid oleic (C18:1) là11.93%, acid linoleic
Dầu nhiều nối đôi dễ bị oxy hóa, và mẫu dầu này đã được phân tích tại trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm ở thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp sắc ký khí.
