Nguyễn Thị Thủy K13 Lớp 06-01 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----------Ñ&Ð---------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ƯA NHIỆT SINH α-AMYLAZA BỀN NHIỆT PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM” Hà Nội – 2010 Khoa Công nghệ sinh học 1 Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Thủy K13 Lớp 06-01 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----------Ñ&Ð---------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ƯA NHIỆT SINH α-AMYLAZA BỀN NHIỆT PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM” Người hướng dẫn : ThS.NCS. Nguyễn Thế Trang Sinh viên thực tập : Nguyễn Thị Thuỷ Lớp : KSCNSH 0601 Khóa : 13 Hà Nội - 2010 2 Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Thủy K13 Lớp 06-01 LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS. NCS. Nguyễn Thế Trang, PGS.TS. Trần Đình Mấn - Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu hoàn thành khoá luận. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã giúp tôi trong quá trình học tập và thực hiện khoá luận. Nhân dịp này tôi xin cảm ơn tập thể khoa học Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các nghiên cứu của khóa luận. Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2010 Sinh viên Nguyễn Thị Thuỷ i Khoa Công nghệ sinh học 1 Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Thủy K13 Lớp 06-01 MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình, đồ thị MỞ ĐẦU PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu α-amylaza bền nhiệt trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1. Tình hình nghiên cứu α-amylaza bền nhiệt trên thế giới 1.1.2. Tình hình nghiên cứu α-amylaza bền nhiệt ở Việt Nam 1.2. Phân bố vi khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp α-amylaza bền nhiệt ở Việt Nam 1.2.1. Vi sinh vật sinh α-amylaza bền nhiệt 1.2.2. Sự phân bố vi khuẩn ưa nhiệt sinh α-amylaza bền nhiệt ở Việt Nam 1.3. Alpha - amylaza bền nhiệt từ vi khuẩn 1.3.1. Khái niệm về α-amylaza bền nhiệt 1.3.2. Đại lượng đặc trưng cho độ bền nhiệt của α-amylaza 1.3.3. Ảnh hưởng của Ca 2+ lên hoạt tính và độ bền nhiệt của α-amylaza 1.3.4. Ảnh hưởng của cơ chất lên độ bền nhiệt của α- amylaza 1.3.5. Cơ chế bất hoạt hoá do nhiệt của α-amylaza 1.4. Alpha - amylaza bền nhiệt từ Bacillus 1.4.1. Đặc điểm phân loại của Bacillus 1.4.2. Alpha-amylaza bền nhiệt từ B. licheniformis i ii v vi vii 1 2 2 2 3 4 4 6 7 8 8 8 9 9 10 10 12 ii Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Thủy K13 Lớp 06-01 1.4.3. Alpha-amylaza bền nhiệt từ B. stearothermophilus 1.4.4. Alpha-amylaza bền nhiệt từ B. subtilis 1.4.5. Alpha-amylaza bền nhiệt từ B. amyloliquefaciens 1.4.6. Alpha-amylaza bền nhiệt từ các loài Bacillus khác 1.5. Alpha-amylaza bền nhiệt từ các loại vi sinh vật khác 1.5.1. Alpha-amylaza bền nhiệt từ vi sinh vật cổ 1.5.2. Alpha-amylaza bền nhiệt từ vi khuẩn kỵ khí 1.5.3. Alpha-amylaza bền nhiệt từ xạ khuẩn 1.5.4. Alpha-amylaza bền nhiệt từ nấm mốc 1.5.5. Alpha-amylaza bền nhiệt từ nấm men 1.5.6. Sinh tổng hợp α-amylaza bền nhiệt từ Bacillus 1.6. Một số ứng dụng của α-amylaza bền nhiệt 1.6.1. Ứng dụng α-amylaza trong công nghiệp dệt 1.6.2. Ứng dụng α-amylaza trong một số ngành công nghiệp khác PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Chủng giống vi sinh vật 2.1.2. Hóa chất dùng chính trong nghiên cứu 2.1.3. Thiết bị dùng chính trong nghiên cứu 2.1.4. Môi trường nghiên cứu 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tuyển chọn chủng sinh α-amylaza cao 2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn 2.2.3. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp α-amylaza từ chủng tuyển chọn 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ enzym α-amylaza 2.2.5. Nghiên cứu tính chất của α-amylaza từ chủng Geobacillus caldoxylosilyticus LP09 13 13 13 13 15 15 15 15 16 16 16 17 17 17 19 19 19 19 20 20 20 20 20 22 23 24 iii Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Thủy K13 Lớp 06-01 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp α- amylaza cao 3.2. Đặc điểm sinh học của chủng LP09 sinh tổng hợp α-amylaza cao 3.2.1. Đặc điểm hình thái 3.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 3.2.3. Phân loại chủng vi khuẩn LP09 3.3. Sinh tổng hợp α-amylaza từ chủng Geobacillus caldoxylosilyticus LP09 tuyển chọn 3.3.1. Chọn môi trường chứa cơ chất thay thế thích hợp 3.3.2. Chọn nồng độ cơ chất thích hợp 3.3.3. Chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 3.3.4. Chọn pH môi trường lên men thích hợp 3.4. Tính chất của α-amylaza từ chủng Geobacillus caldoxylosilyticus LP09 tuyển chọn 3.4.1. Ảnh hưởng pH lên hoạt tính α-amylaza 3.4.2. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính α-amylaza 3.4.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và chất hóa học lên hoạt tính α-amylaza bền nhiệt của chủng Geobacillus caldoxylosilyticus LP09 3.4.4. Khả năng dịch hóa tinh bột của α-amylaza bền nhiệt 3.4.5. Sơ đồ công nghệ lên men sinh tổng hợp α-amylaza bền nhiệt từ chủng Geobacillus caldoxylosilyticus LP09 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 25 27 27 27 28 31 35 35 36 37 38 39 39 40 41 42 43 44 45 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Thủy K13 Lớp 06-01 DE Dextrose equivalent DNSA Dintrosalixylic acid DNS Dinitrosalicylic OD Optical Density (Mật độ quang) pH opt pH tối ưu t o opt Nhiệt độ tối ưu v/p vòng/phút DANH MỤC CÁC BẢNG v Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Thủy K13 Lớp 06-01 Bảng Tên bảng Trang 1.1 Nhiệt độ tối đa đối với sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật 5 1.2 Đặc điểm của α-amylaza từ một số chủng B. licheniformis 12 1.3 Đặc điểm của α-amylaza bền nhiệt từ một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt 14 3.1 Vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 25 3.2 Một số đặc điểm phân loại của chủng LP09 so với chủng Geobacillus caldoxylosilyticus 33 3.3 Khả năng sử dụng cơ chất theo Kit API 50 CHB của chủng LP09 34 3.4 Ảnh hưởng của một số ion kim loại và chất hóa học lên hoạt tính α-amylaza của chủng Geobacillus caldoxylosilyticus LP09 41 3.5 Khả năng dịch hóa tinh bột của α-amylaza bền nhiệt từ chủng Geobacillus caldoxylosilyticus LP09 42 DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Suối nước nóng Bình Châu – Bà Rịa Vũng Tàu 7 vi Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Thủy K13 Lớp 06-01 3.1 Vòng phân giải tinh bột của 9 chủng nghiên cứu 26 3.2 Hình thái tế bào chủng vi khuẩn LP09 27 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn LP09 28 3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của chủng LP09 29 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng LP09 30 3.6 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của chủng LP09 31 3.7 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất lên hoạt tính α-amylaza 36 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột tan đến hoạt tính α- amylaza 37 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính α-amylaza 38 3.10 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến hoạt tính α- amylaza 39 3.11 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính α-amylaza 40 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính α-amylaza 40 3.13 Sơ đồ công nghệ lên men sinh tổng hợp α-amylaza bền nhiệt từ chủng ưa nhiệt Geobacillus caldoxylosilyticus LP09 43 vii Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Thủy K13 Lớp 06-01 MỞ ĐẦU Enzym α-amylaza là một trong số những enzym được nghiên cứu sớm nhất trên thế giới. Cùng với proteaza, α-amylaza có vai trò quan trọng cũng như được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp. Ngày nay có nhiều loại α-amylaza mới được tìm ra với các tính chất đặc biệt như bền nhiệt, bền axit, thích nghi lạnh, kiềm tính. Nhờ các tính chất này, lĩnh vực ứng dụng và nhu cầu về α-amylaza không ngừng tăng lên. Ở Việt Nam, những năm trước đây đã có một số kết quả trong nghiên cứu thu nhận α-amylaza để phục vụ sản xuất rượu, bia, đường glucoza từ tinh bột, đặc biệt là các nghiên cứu ứng dụng enzym những năm gần đây trong công nghiệp thực phẩm và trong công nghiệp dệt. Tuy nhiên từ khi mở cửa, α- amylaza của nước ngoài nhập vào đã làm cho các sản phẩm α-amylaza của Việt Nam mất khả năng cạnh tranh do năng suất của chủng giống không cao. Các nghiên cứu về α-amylaza bền nhiệt còn ít trong khi nhu cầu về loại enzym này ngày càng lớn, nên hàng năm chúng ta vẫn phải nhập một lượng lớn α-amylaza bền nhiệt ”Termamyl” của Đan Mạch. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về vi sinh vật ưa nhiệt còn ít. Đặc biệt chúng ta có rất nhiều suối nước nóng ở hầu khắp cả nước, đây chính là nguồn lý tưởng để phân lập các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, trong đó có các chủng sinh các enzym bền nhiệt. Nghiên cứu những vi khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp α-amylaza bền nhiệt từ suối nước nóng Việt Nam nhằm góp phần làm phong phú nguồn gen từ vi sinh vật. Chính vì vậy, chúng tôi được giao đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn ưa nhiệt sinh α-amylaza bền nhiệt phân lập ở Việt Nam” (*) -------------------------- (*) Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Khoa Công nghệ sinh học 1 Viện Đại học Mở Hà Nội