TỔNG QUAN
Chitin
1.1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên
Chitin là một polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên, đứng thứ hai sau cellulose Nó có mặt trong cả thực vật và động vật, đặc biệt là trong vỏ của tôm, cua và ghẹ, nơi mà chitin chiếm tỷ lệ từ 14-35% trọng lượng chất khô.
Chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ của nhiều động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Đối với động vật bậc cao, monome của chitin đóng vai trò chủ yếu trong mô da, hỗ trợ quá trình tái tạo và gắn kết các vết thương trên da.
Trong thực vật, chitin có ở thành tế bào nấm họ Zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo [13]
Hình 1.1: Chitin và vỏ tôm
Chitin là một polysaccharide không độc, có khối lượng phân tử lớn, được cấu tạo từ các monosaccharide N-acetyl-β-D-glucosamin liên kết với nhau qua các cầu nối β-1-4-glucozit, tạo thành mạng lưới sợi có tổ chức Chitin thường không tồn tại ở trạng thái tự do mà thường kết hợp với protein, CaCO và các hợp chất hữu cơ khác thông qua các cầu nối đẳng trị.
Chitin, lần đầu tiên được phát hiện bởi Braconnot vào năm 1821 trong dịch chiết từ nấm, đã được ông đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc Đến năm 1823, Odier đã phân lập một chất từ bọ cánh cứng và gọi nó là chitin.
Chitin, từ tiếng Hi Lạp có nghĩa là vỏ giáp, đã được nghiên cứu nhưng không phát hiện sự có mặt của nitơ Cuối cùng, cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận rằng chitin có công thức tương tự như cellulose.
1.1.2 Cấu trúc hóa học của chitin
Chitin 1 có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình: α, β, γ- chitin [15]
Chitin có ba dạng chính: α, β và γ, được phân biệt bởi cách sắp xếp của các mắt xích N-acetyl-β-D-glucosamin Trong đó, α-chitin có cấu trúc mạch xếp ngược chiều nhau đều đặn, tạo ra liên kết hydro mạnh mẽ giữa các lớp, làm cho nó bền vững và phổ biến trong tự nhiên Ngược lại, β-chitin có cấu trúc song song và γ-chitin là sự kết hợp giữa hai chuỗi song song và một chuỗi ngược chiều, không có liên kết hydro giữa các lớp Đặc biệt, β-chitin có thể chuyển đổi thành α-chitin thông qua quá trình acetyl hóa, giúp tạo ra cấu trúc tinh thể bền vững hơn.
Nghiên cứu về sự thủy phân chitin cho thấy chitin là một polymer cấu thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-glucosamin, được liên kết với nhau qua các liên kết β-(1-4) glycosid.
Hình 1.3: Cấu trúc mạch chitin
Tên gọi: Poly (1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose
1.1.3 Tính chất lý hoá của chitin
Chitin là một hợp chất có màu trắng hoặc trắng phớt hồng, tồn tại dưới dạng vảy hoặc bột, không có mùi vị và không tan trong nước, môi trường kiềm, axit loãng cũng như các dung môi hữu cơ như ete và rượu Tuy nhiên, chitin có thể tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN)2), tạo thành dung dịch keo Nó cũng tan trong hệ dimetylacetamid - LiCl 8%, hexafluoro-isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafluoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O) Đặc biệt, chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại với bước sóng từ 884 đến 890 cm-1.
Chitin có khả năng ổn định với các chất oxy hoá mạnh như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2) và nước javen (NaOCl - NaCl) Nhờ vào đặc tính này, các chất oxy hoá được sử dụng để khử màu cho chitin.
Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan:
Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt mạch thu được glucosamin:
- Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat
- Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat.
Enzyme chitinase
Chitinase, hay còn gọi là poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid glucanohydrolase, là một loại enzyme thuộc nhóm thủy phân (Hydrolase) Enzyme này có chức năng thủy phân chitin thành chitobiose bằng cách xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4-β-glucosid giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetylglucosamine liên kết với nhau trong chitin.
Hình 1.4: Cấu trúc bậc 3 của enzyme chitinase
1.2.2.1 Dựa vào phản ứng phân cắt
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-chitobiosidse, N- acetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase)
Endochitinase là nhóm enzyme có khả năng phân cắt chitin nội mạch một cách ngẫu nhiên, tạo ra các đoạn oligosaccharide Nghiên cứu về các enzyme này đã được thực hiện từ dịch chiết của môi trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum, bao gồm hai loại endochitinase: M1 với khối lượng phân tử 36kDa và điểm iso điện pI 5,3 ± 0,2, cùng với M2 có khối lượng phân tử 40kDa và điểm iso điện pI 3,9 Ngoài ra, enzyme từ Gliocladium viens cũng được nghiên cứu với khối lượng phân tử MAkDa và điểm iso điện pI 7,8.
- Chitin-1,4-chitobiosidse: là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer chitobiose[30]
- N-acetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase): là enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ một đầu cho snr phẩm chính là các monomer N-acetyl- β-D-glucosamin
Hình 1.5: Sơ đồ phân cắt chitin bởi các enzyme thuộc nhóm chitinase
1.2.2.2 Dựa vào cấu trúc phân tử
Enzyme chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase:
The Glycohydrolase 18 family is the largest group of chitinases, comprising approximately 180 genera characterized by a distinct structure of eight α/β helices This family is found across most Eukaryotic and Prokaryotic species, as well as in viruses It primarily includes chitinase enzymes, along with others such as chitodextrinase, chitobiase, and N-acetyl-β-D-glucosaminidase These chitinases function through a controlled mechanism that cleaves β-polymers, resulting in the production of β-anomers Notable sources of Glycohydrolase 18 chitinases include Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, and Serratia marcescens.
Hình 1.6: Mô hình cấu trúc không gian của enzyme chitinase Serratia marcescens
Họ Glycohydrolase 19 bao gồm hơn 130 chi, chủ yếu xuất hiện ở thực vật như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana) và đậu Hà Lan (Pisum sativum) Ngoài ra, chúng cũng được tìm thấy ở xạ khuẩn Streptomyces griceus và vi khuẩn Haemophilus influenzae Các enzyme trong họ này có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển.
Hình 1.7: Mô hình cấu trúc không gian của chitinase Hodeum vulgare
1.2.2.3 Dựa vào trình tự amoni acid
Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptid nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:
Nhóm I là các đồng phân enzyme có đầu N giàu cystein, kết nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl (C) gọi là peptid nhận biết Vùng cystein đóng vai trò quan trọng trong việc gắn kết enzyme với cơ chất chitin, mặc dù không cần thiết cho hoạt động xúc tác.
Nhóm II chitinase là các đồng phân enzyme có tâm xúc tác nhưng thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C Chúng có trình tự amino acid tương tự như chitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II tồn tại ở thực vật, nấm và vi khuẩn, và chúng thường được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài.
- Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II
- Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 –
47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I Phân tử này cũng chứa đoạn giàu cystein nhưng có kích thước nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.
Nhóm V cho thấy rằng, dựa trên dữ liệu trình tự, vùng gắn chitin, đặc biệt là vùng giàu cystein, đã giảm đáng kể qua quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao.
Hình 1.8: Mô tả trình tự amoni acid
Enzyme chitinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển với trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa Ở các loài động vật như thân mềm, chân đốt, cá, lưỡng cư và thú, một số chitinase có trọng lượng phân tử dao động từ 40-90 kDa, thậm chí có loại lên đến 120 kDa Trong khi đó, trọng lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có sự biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa.
Một số ezyme chitinase có trọng phân tử thấp có thể được tạo ra từ một enzyme lớn hơn bằng cách phân cắt một số protein[30]
1.2.3.2 Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis
Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện (pI) thay đổi đa dạng, từ 3-10 ở thực vật bậc cao và tảo, pI từ 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá, và pI từ 3,5-8,8 ở vi sinh vật Hằng số Michaelis của enzyme này nằm trong khoảng 0,010 – 0,011 g/100ml.
1.2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ
According to various studies, chitinase functions effectively within a temperature range of 20 to 50 degrees Celsius (Frandberg and Schnure, 1994; Huang et al., 1996; Bhushan and Hoondal, 1998; Wiwat et al., 1999; Bendt et al., 2001).
Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là
Chitinase của Aspergillus niger có nhiệt độ tối thích là 50°C khi hoạt động trên glycol chitin, mặc dù hầu hết các chitinase hoạt động hiệu quả ở 40°C Tuy nhiên, nhiệt độ tối thích của các enzyme chitinase có thể khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc Chitinase thuộc nhóm III từ thực vật và chitinase được phân lập từ Bacillus licheniformis ở suối nước nóng có khả năng chịu nhiệt lên đến 80°C.
(2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp từ 30-
45 0 C và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus sp BG-11 hoạt tính cao nhất ở 40-60 0 C
Nghiên cứu của Lorito (1998) về enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum Rifai cho thấy enzyme này hoạt động hiệu quả trong khoảng nhiệt độ từ 25 đến 60 độ C, với nhiệt độ tối ưu là 40 độ C.
Giá trị pH tối thích (pHop) của enzyme chitinase thay đổi tùy theo loại sinh vật: ở thực vật bậc cao và tảo, pHop nằm trong khoảng 4-9; trong khi đó, ở động vật, pHop dao động từ 4,8-7,5 và ở vi sinh vật, giá trị này là từ 3,5-8,0.
Theo các nhà khoa học, pH tối ưu của enzyme chitinase có thể thay đổi tùy thuộc vào loại cơ chất sử dụng Hầu hết các enzyme chitinase đã được nghiên cứu cho thấy pH tối ưu khoảng 5,0 khi cơ chất là glycol chitin, nằm trong khoảng pH kiềm yếu.
Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được trong khoảng pH từ 4,0-8,5 (Morrisey và cộng sự, 1976; Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt và cộng sự,
Glucosamin
1.3.1 Khái niệm, cấu trúc hóa học và tinh chất hóa lý của glucosamin
Glucosamin là một loại đường có nhóm amine (-NH2) gắn liền, đóng vai trò là tiền chất trong quá trình tổng hợp sinh học các protein và lipid được gắn thêm phân tử đường, được gọi là "glycosylated".
Công thúc cấu tạo của glucosamin:
- Tên UIPAC: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol
- Tên gọi khác: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine
Glucosamin là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy
88 0 C, điểm phân hủy 110 0 C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform
Một số phản ứng của glucosamin:
Giống như glucose, glucosamin cho phản ứng tráng bạc khá rõ ràng:
C 5 H 12 O 4 NCHO + 2[Ag(NH 3 )]OH 50 0 C C 5 H 12 O 4 NCOONH 4 + 2Ag + 3NH 3 +
• Phản ứng với Cu(OH) 2
Sản phẩm có màu xanh nhạt
Phản ứng xác nhận có mặt của NH 2 Bazơ Shiff tạo ra dưới dạng keo sánh màu nâu:
1.3.2 Cấu trúc hóa học và tính chất của một số mối Glucosamin
Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamin được sử dụng làm nguyên liệu làm thuốc
- Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride;
- Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine hydrochloride
- Công thức phân tử: C 6 H 13 O 5 N.HCl
- Phân tử lượng: Mglucosamin.HCl = 215.63
Glucosamin hydroclorua là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, không mùi
- Tan được trong nước 0,1g/ml
- Tên gọi khoa học: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosamine sulfate
- Công thức phân tử: C 6 H 13 O 5 N.H 2 SO 4
- Phân tử lượng: Mglucosamin.H2SO4 = 277,24
-Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; N-acetyl-D- (+)- glucosamine; N-acetyl-β-D-glucosaminide; N-acetylchitosamine
- Tan được trong nước: 0,1g/ml
Glucosamin, một aminomonosachaid tự nhiên, đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp proteoglycan Chất này kích thích tế bào sụn khớp tăng cường quá trình tổng hợp và trùng hợp, dẫn đến việc hình thành mucopolysachaid, thành phần thiết yếu của sụn khớp.
Glucosamin có khả năng ức chế các enzym gây hại cho sụn khớp như collagenase và phospholipase A2, đồng thời giảm thiểu gốc tự do superoxid làm tổn thương tế bào sụn Ngoài ra, glucosamin còn kích thích sự sinh sản của mô liên kết xương và làm chậm quá trình mất canxi trong xương.
Khi chúng ta già đi và lạm dụng hoạt động của khớp, các khớp có thể bị tổn thương, dẫn đến tình trạng thoái hóa Quá trình này làm cho sụn khớp mỏng đi, gây ra đau đớn tại các khớp bị ảnh hưởng.
Glucosamin giúp tăng cường sản xuất chất nhầy trong dịch khớp, từ đó cải thiện độ nhớt và khả năng bôi trơn của dịch khớp, góp phần giảm triệu chứng thoái hóa khớp Một ưu điểm nổi bật của glucosamin là tính an toàn, không gây độc hại cho người sử dụng.
1.3.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất glucosamin ở Việt Nam và trên thế giới 1.3.4.1 Sản xuất Glucosamin bằng phương pháp hóa học
Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến bắt đầu bằng việc ngâm vỏ tôm trong dung dịch HCl 10% với tỷ lệ w/v = 1/10 ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ để khử khoáng Sau đó, vỏ tôm được rửa sạch đến pH=7 Tiếp theo, quá trình khử protein kết hợp deacetyl hóa diễn ra trong NaOH 40% với tỷ lệ w/v = 1/10 ở nhiệt độ 95 – 100°C trong 6,5 giờ Cuối cùng, sản phẩm được tẩy màu, rửa sạch và sấy khô, sau đó chitosan được đun trong HCl 35% với tỷ lệ w/v thích hợp.
Quá trình tinh chế diễn ra bằng cách hòa tan chất cần xử lý với tỷ lệ 1/4 ở nhiệt độ 95 – 100°C trong 4 giờ Sau khi lọc bỏ cặn, hỗn hợp được làm lạnh từ 0 – 2°C trong 2 giờ để kết tinh xuất hiện Tiếp theo, tinh thể được lọc tách ra, hòa tan trong nước cất, khử màu bằng than hoạt tính, và cô cạn để thực hiện kết tinh lần nữa Quá trình này được lặp lại khoảng 3 lần cho đến khi thu được tinh thể trắng Cuối cùng, tinh thể được rửa bằng cồn và sấy khô ở nhiệt độ 50 – 60°C.
1.3.4.1.2 Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng
Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, sau đó đun sôi nguyên liệu với nước trong
Quá trình chiết xuất glucosamin bắt đầu bằng việc xử lý nguyên liệu khô trong HCl 5% để tách khoáng, sau đó rửa sạch đến pH 7 và sấy khô Tiếp theo, protein được khử hoàn toàn bằng NaOH 5% và đun sôi, sau đó rửa sạch và sấy khô để thu được chitin có màu trắng phớt hồng Chitin sau đó được chuyển hóa thành glucosamin thông qua quá trình thủy phân trong dung dịch axit HCl đậm đặc 36% ở nhiệt độ 100°C Sản phẩm được tẩy màu bằng than hoạt tính, kết tinh và lọc, cuối cùng sấy khô để thu được tinh thể glucosamin hydroclorua trắng với hiệu suất 51,4%.
1.3.4.2 Sản xuất glucosamin bằng phương pháp enzyme
Phương pháp enzymatic để thủy phân chitin thành Glucosamin có nhiều ưu điểm vượt trội so với phương pháp hóa học, bao gồm chi phí thấp, sản phẩm chất lượng cao và an toàn cho sức khỏe.
Hiện nay ở Việt Nam, phương pháp điều chế Glucosamin bằng phương pháp enzyme vẫn đang ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa được đưa vào thực tế sản xuất
Phương pháp điều chế Glucosamin bằng enzyme involves the use of enzymes to hydrolyze chitin chains into N-Acetyl-D-Glucosamin Các enzyme như chitinase, protease, papain và bromelain có thể được áp dụng trong quá trình này để đạt được sản phẩm cuối cùng hiệu quả.
- Trường đại học Nha Trang đã nghiên cứu thu nhận thành công chế phẩm enzyme chitosanse từ Streptomyces Griseus để thủy phân chitosan thành Glucosamin, hiệu suất là 94,14% [8]
- Viện nghiên cứu Hải sản cũng đã nghiên cứu thành công chế độ thủy phân đầu tôm bằng các enzyme papain, Bromelain, Neutraza
- Trên thế giới thì nhiều công trình nghiên cứu về việc sử dụng enzyme chitinase để thủy phân chitin thành Glucosamin
Trường Đại học Chulalongkom ở Thái Lan đã tiến hành nghiên cứu việc sử dụng chitinase từ chủng Aspergillus sp để thủy phân chitin thành glucosamin Quá trình thủy phân được thực hiện với tỉ lệ enzyme/substrate (E/S) là 22U/g trong môi trường đệm acetate có pH 4 Sau 2 ngày, hiệu suất thu hồi glucosamin đạt 65%.
Chitinase từ mực đã được nghiên cứu và ứng dụng để điều chế glucosamin bởi Masahiro Matsumiya từ trường đại học Nihon Enzyme chitinase được chiết xuất từ 2g mực và được sử dụng để thủy phân 50mg chitin trong 5 ngày ở nhiệt độ 37°C, với pH môi trường thủy phân là 4,5, đã thu được 26,8 mg đường Phân tích bằng sắc ký HPLC cho thấy sản phẩm chủ yếu là N-acetyl-D-glucosamin.
Ngoài ra còn nhiều công trình nghiên cứu khác về sử dụng enzyme trong việc thủy phân chitin để thu glucosamin
1.3.5 Một số ứng dụng của Glucosamin
1.3.5.1 Điều trị bệnh khớp từ thiên nhiên
Glucosamin là một hoạt chất ưu việt, ngày càng được sử dụng phổ biến trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh khớp.
Glucosamin là một amino-mono-saccharide hiện diện trong mọi mô của cơ thể con người Chất này đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất proteoglycan, các phân tử này kết hợp lại để tạo thành mô sụn.
Glucosamin được tổng hợp từ glucose trong cơ thể, giúp tăng cường sản xuất chất nhầy dịch khớp, từ đó cải thiện độ nhớt và khả năng bôi trơn của dịch khớp Việc này làm chậm quá trình thoái hóa xương khớp, cải thiện chức năng vận động và phục hồi cấu trúc sụn khớp, đồng thời ngăn chặn sự tiến triển của các bệnh xương khớp Nhờ những tác dụng này, glucosamin không chỉ giảm đau hiệu quả mà còn điều trị tận gốc nguyên nhân viêm khớp.
- Hỗ trợ điều trị và phòng ngừa thoái hóa khớp, đau khớp, viêm khớp
- Giúp gân cốt khỏe mạnh, tăng cường khả năng vận động của cơ thể
- Hỗ trợ điều trị Thoái hóa khớp, Gout, Viêm khớp
- Giúp gân cốt khỏe mạnh, tăng cường khả năng vận động của cơ thể
Công thức kết hợp 2 thành phần:
Thu nhận enzyme chitinase từ nấm sợi Trichoderma
1.4.1 Giới thiệu Nấm sợi Trichoderma
1.4.1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái của Trichoderma
Trichoderma là một loại vi nấm gây khó khăn trong việc phân loại do nhiều đặc điểm cần thiết cho quá trình này vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ.
Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma như sau:[15]
Ainsworth và Sussman lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromyctes, bộ
Theo nghiên cứu của hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva (1998), Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae và lớp Nấm túi Ascomycetes Các loài Trichoderma được phân thành 5 nhóm chính: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum Trong đó, ba nhóm Trichoderma, Pachybasium và Longibrachiatum có giai đoạn telemorph (hình thái sinh sản hữu tính) là Hypocrea, trong khi nhóm Hypocreanum hiếm khi xuất hiện dưới dạng teleomorph độc lập và nhóm Saturnisporum không có hình thức teleomorph.
Đặc điểm hình thái của Trichoderma
Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty [15]
Khuẩn ty của nấm Trichoderma không màu, với cuống sinh bào tử phân nhánh, tạo thành khối tròn mang bào tử trần không vách Bào tử có hình cầu, elip hoặc thuôn, và chúng liên kết thành chum nhỏ nhờ chất nhầy Khuẩn lạc nấm có màu từ trắng, lục trắng đến lục vàng, xanh, và lục đậm Các chủng Trichoderma phát triển nhanh, đạt đường kính khuẩn lạc từ 2 – 9 cm chỉ sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 20°C.
Hình 1.11: Sự phát triển của nấm Trichoderma trên đĩa thạch (a) và hình dạng sợi nấm Trichoderma (b)
1.4.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Trichoderma spp là nhóm vi nấm phổ biến trong các môi trường như đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng, đầm muối và đất sa mạc Chúng chủ yếu là vi sinh vật hoại sinh, nhưng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác Trichoderma hiếm khi được tìm thấy trên thực vật sống và không sống, và không ký sinh trên thực vật Chúng có thể tồn tại trong mọi vùng khí hậu, từ miền cực Bắc đến vùng núi cao và miền nhiệt đới, mặc dù có mối tương quan giữa sự phân bố các loài và điều kiện môi trường.
T.polysporum và T.viride có mặt ở vùng khí hậu lạnh, trong khi T.harzianum có ở các vùng khí hậu nóng Điều này tương quan với nhu cầu cần nhiệt độ tối đa cho từng loài
Các loài Trichoderma thường xuất hiện trong đất acid, với nghiên cứu của Gochenaur (1970) chỉ ra rằng có mối liên hệ giữa sự hiện diện của T viride và đất acid ở vùng khí hậu lạnh của Peru Trichoderma có khả năng phát triển ở bất kỳ pH nào nhỏ hơn 7 và có thể sinh trưởng tốt trong đất kiềm nếu có sự hiện diện của CO2 và bicarbonat.
Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ Carbonhydrat, amino acid đến ammonia
Trichoderma là một loại vi nấm ưa ẩm, thường phát triển mạnh mẽ ở các khu vực ẩm ướt như rừng Trong số các loài, T hamatum và T pseudokoningii có khả năng chịu được độ ẩm cao hơn Tuy nhiên, Trichoderma spp thường không chịu được môi trường khô hạn, dẫn đến sự suy giảm đáng kể số lượng của chúng ở những nơi có độ ẩm thấp.
Trichoderma spp khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau
Trichoderma spp có thể nhận diện trong đất thông qua mùi hương đặc trưng của chúng, cụ thể là hương dừa (6-pentyl-α-pyrone dễ bay hơi), thường được sản sinh trong quá trình phát triển của Trichoderma.
Phương pháp pha loãng cho thấy Trichoderma có thể chiếm tới 3% tổng số vi nấm trong đất rừng và 1,5% trong đất trồng cỏ.
Turner và cộng sự (1997) đã chỉ ra rằng T longibrachiatum và T citrinoviride có sự trùng lặp lớn về khu vực phân bố địa lý Sự phân bố này có thể được giải thích bởi hiệu quả phát tán thông qua gió hoặc côn trùng, hoặc có thể phản ánh một quá trình tiến hóa rất sớm.
Các chủng Trichoderma có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào như chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulose và protease, giúp phân hủy xác bã thực vật và vách tế bào nấm bệnh trong quá trình sống hoại sinh và ký sinh của chúng.
1.4.1.3 Dinh dưỡng và con đường trao đổi chất cơ bản của Trichoderma
Trichoderma nổi bật với khả năng sản xuất enzyme có khả năng phân hủy nhiều loại polysaccharide, bao gồm cellulose và hemicellulose, cũng như các polymer liên quan như chitin Những enzyme này không chỉ có vai trò quan trọng trong tự nhiên mà còn được công nhận có giá trị thương mại cao.
Manczinger và Pollner (1985) đã phân loại các giống Trichoderma dựa trên nguồn cacbon, trong đó tất cả các chủng nghiên cứu đều sử dụng các nguồn cacbon như D-glucose, D-galactose, D-fructose, D-mannose, D-cellobiose, trehalose, D-xylose, L-arabinose, D-mannitol, D-arabitol, glycerol, salacin, esculin, arbutin, glycerol-1-monoacetat, β-methyl-D-glucosid và N-acetyl-β-D-glucosamin Trong số này, các nguồn cacbon hiệu quả nhất là glucose, fructose, mannose, galactose, xylose, trehalose và cellobiose.
Trichoderma spp có khả năng phát triển trên cả nguồn nitơ phức tạp và đơn giản Khi sử dụng carbohydrate làm nguồn cacbon, Trichoderma thường ưu tiên ammonium thay vì nitrat Một số chủng như T reesei và T koningii T-1 không thể sử dụng nitrat do thiếu enzyme nitrate permease.
Peptone, một nguồn nitơ hữu cơ, thường được sử dụng trong môi trường để hạn chế sự tăng trưởng chậm trên các chất nền polymeric như cellulose Tuy nhiên, cần lưu ý rằng peptone không chỉ cung cấp nitơ mà còn là nguồn cacbon, và được ưu tiên sử dụng khi kết hợp với polysaccharide Trong số các amino acid, alanin, acid aspartic và acid glutamic là những nguồn nitơ hữu cơ tốt nhất cho Trichoderma.
Ngoài amino acid thì T.lignorum ( = T.viride) được báo cáo là có thể sử dụng bazơ purin, purin nucleoside và nucleotide tương ứng như là nguồn nitơ duy nhất[23]
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu, hóa chất và môi trường
- Các chủng nấm sợi Trichoderma được thu thập tại ruộng lạc ở Nghệ An, lưu giữ tại khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại Học Vinh
- Enzym chitinase được chiết tách từ dịch nuôi cấy chủng Trichoderma 095(2) TH
- Nguồn chitin được điều chế (từ vỏ tôm thu thập tại thành phố Vinh, Nghệ An) tại phòng thí nghiệm Hóa học, trường Đại học Vinh
2.1.2 Hóa chất và thiết bị
Hóa chất sử dụng trong môi trường nuôi cấy bao gồm pepton, ure, glucose, agar, chitin và nhiều hóa chất khác, tất cả đều ở dạng tinh khiết phục vụ cho phân tích và nghiên cứu Các sản phẩm này được sản xuất tại Đức và Trung Quốc.
Hóa chất dùng để điều chế chitin gồm:
- HCl 10% : Lấy 277,78ml HCl đậm đặc cho vào bình định mức 1000ml, sau đó dùng nước cất định mức tới vạch
- NaOH 3%: Cân 30g NaOH, hòa tan bằng nước cất, cho vào bình định mức 1000ml sau đó định mức tới vạch
- KMnO 4 1%: Cân 10g KMnO 4 , hòa tan bằng nước cất, cho vào bình định mức 1000ml sau đó định mức tới vạch
- HOOC-COOH 1% : Cân 10g HOOC-COOH, hòa tan bằng nước cất, cho vào bình định mức 1000ml sau đó định mức tới vạch
Hóa chất dùng để xây dựng đường chuẩn và xác định hoạt độ:
Để chuẩn bị dung dịch 2,4-pentadion, bạn cần hòa tan 10,59g Na2CO3 trong nước cất, sau đó chuyển vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch Tiếp theo, lấy 2ml acetyl acetol cho vào 50ml dung dịch Na2CO3 1M và bảo quản hỗn hợp trong tủ lạnh.
- Elich I : Cân 530mg p- Dimethylaminobenzaldehyde ( DMAB ) cho vào 20ml ethanol 99% + 15ml HCl đậm đặc, bảo quản ở 0 o C trong vòng 1 tháng
Trộn X ml dung dịch Natri acetat 2M (dung dịch A) với Y ml dung dịch acid acetic 2M (dung dịch B) Sau đó định mức thành 100ml như bảng sau: pH A B pH A B
- Hệ đệm photphat-citrat pH Dung dịch natri photphat 0.2M
- Máy UV - ViS 190 - 1100 nm Mã hiệu: HSO 960428819
- Cân phân tích điện tử
- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác như: Bình tam giác, pipet, ống đong, phễu, bình định mức…
- Các dụng cụ thông thường dùng trong nghiên cứu vi sinh
2.1.3 Các môi trường nuôi cấy
2.1.3.1 Môi trường giữ giống PGA (Potato Glucose Agar)
Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy, bạn cần 20g glucose, 20g agar và nước luộc khoai tây, thêm nước để đủ 1 lít Hỗn hợp này được cho vào các ống nghiệm và hấp vô trùng ở 121 độ C, 1 atm trong 20 phút Sau khi hấp xong, đặt ống nghiệm nằm nghiêng cho đến khi môi trường đông hoàn toàn, sau đó cất vào tủ lạnh để sử dụng sau.
Thành phần dinh dưỡng bao gồm (NH4)2SO4 1,4g, FeSO4.7H2O 5mg, KH2PO4 2g, MgSO4.7H2O 0,3g, MnSO4.4H2O 1,6mg, ure 0,03g, ZnSO4.7H2O 1,4mg, CaCl2 0,3g, CoCl2 2mg, và pepton 0,75g Bổ sung chitin huyền phù 1% đến 1 lít với pH 5 Hỗn hợp cần được hấp khử trùng ở 121 độ C, áp suất 1atm trong 20 phút Sau khi hấp, để nguội và kiểm tra xem có nhiễm khuẩn không, sau đó cất vào tủ lạnh để sử dụng.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống
Chuẩn bị môi trường PGA (mục 2.1.3.1)
Chủng nấm sợi Trichoderma được lấy từ nơi giữ giống và cấy chuyền trên môi trường PGA ở nhiệt độ 30°C trong 2 đến 3 ngày để phát triển Sau đó, nấm được bảo quản trong tủ lạnh ở 10°C Để tránh già hóa giống và mất hoạt tính, cần thực hiện cấy chuyền sau 7 đến 10 ngày.
2.2.2 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma trên môi trường lỏng cho STH chitinase
Các chủng vi nấm Trichoderma được nuôi cấy trong bình tam giác 100ml, chứa 50ml môi trường lỏng đã được hấp ở 121 oC trong 20 phút Quá trình nuôi cấy diễn ra trên máy lắc ổn nhiệt với tốc độ 180 vòng/phút và nhiệt độ 30 oC trong 5 ngày Thao tác cấy chuyền được thực hiện trong tủ cấy vô trùng để đảm bảo điều kiện vô khuẩn.
2.2.3 Điều chế chitin từ vỏ tôm
Vỏ tôm sau khi thu nhận về ta tiến hành rửa sạch và xử lý theo các bước sau:
Bước 1: Xử lý sơ bộ
- Vỏ tô được rửa sạch, sấy khô rồi đưa đi xay nhỏ
Bước 2: Loại khoáng và tạp chất
- Ngâm trong dung dịch HCl 10% ở nhiệt độ thường trong vòng 12 giờ
- Sau 12 giờ lấy ra rửa sạch với nước cho đến pH = 7
- Đun cách thủy trong dung dịch NaOH 3% ở nhiệt độ 100 0 C, trong 4 giờ Trong quá trình đun có lắp sinh hàn
- Sau 4 giờ lấy ra rửa lại với nước cho đến pH = 7
- Ngâm trong dung dịch KMnO 4 1% ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ
- Sau 1 giờ lấy ra rửa lại với nước nhiều lần
- Ngâm trong dung dịch acid oxalic 1% ở 60 0 C cho đến khi sản phẩm có màu trắng
- Sau đó lấy ra rửa lại với nước cho đến khi pH = 7
- Chitin thu được đưa đi sấy khô ở nhiệt độ 50 - 60 0 C
- Bảo quản ở nơi khô ráo
Chitin sau khi thu nhận được dùng làm cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp enzyme chitinase và cơ chất phản ứng để điều chế N-acetyl-D-glucosamin
2.2.4 Xác định hoạt độ enzyme chitinase ( phương pháp Elson – Morgan)
Hoạt tính enzyme chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm N - acetyl- D- Glucosamin của quá trình phân giải chitin
Phương pháp này dựa trên sự hình thành các dẫn xuất pyrole khi glucosamin được đun nóng với thuốc thử 2,4-pentadion Các dẫn xuất pyrole này sẽ phản ứng tạo màu với thuốc thử Erlich I.
Cường độ màu của phản ứng tương ứng với một hàm lượng Glucosamin nhất định
- Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1%
Do đặc tính của chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt độ của enzyme chitinase cần huyền phù hóa chitin
Hòa tan 5g chitin trong 50ml HCl đậm đặc và khuấy liên tục trong 3 phút ở nhiệt độ 40°C Sau đó, tạo chitin huyền phù bằng cách từ từ thêm nước lạnh (5°C) cho đến khi đạt 500ml.
Dịch huyền phù được thu hồi bằng cách lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm ở tốc độ 3500 vòng/phút Sau khi rửa nhiều lần với nước cất cho đến khi đạt pH khoảng 5,0, dịch huyền phù cần được bảo quản trong điều kiện lạnh.
- Xác dịnh hoạt tính enzyme chitinase
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1ml dịch huyền phù chitin 1% và 1ml dịch enzyme, được ủ ở 30°C trong 20 phút Phản ứng được ngừng lại bằng cách đun sôi trong 3 phút Lượng glucosamin tạo thành sau phản ứng thủy giải bởi enzyme chitinase được xác định theo phương pháp Elson – Morgan.
+ Hút 2ml thuốc thử 2,4 –pentadion cho vào mẫu sau khi phản ứng, đem đun cách thủy ở 100 0 C trong 1h Sau đó là mát dưới dòng nước
+ Thêm 2ml thuốc thử Erlich I để hiện màu, sau đó đem đun cách thủy ở 70 0 C trong 20 phút
Đo mật độ quang của mẫu đã được hiện màu để xác định giá trị ∆OD, từ đó suy ra hàm lượng glucosamin và hoạt tính của enzyme tương ứng.
Một đơn vị hoạt tính (đvht) của enzyme chitinase tương ứng với 1g glucosamin tạo ra trong thời gian thủy phân chitin 1 phút ở nhiệt độ phản ứng
UI (àmol/ml/phỳt) được tính dựa trên hàm lượng glucosamin (àg/ml) trong dịch thí nghiệm, trong đó n là hệ số pha loãng Do hoạt tính enzyme chitinase của chủng Trichoderma trong nuôi cấy lỏng thường không cao, các khảo sát thường sử dụng n = 1.
V 1 : là thể tích dung dịch phản ứng ban đầu (ml)
V 2 : là thể tích dịch enzym thí nghiệm (ml)
T : là thời gian phản ứng (phút), T = 20 phút
221.21: Khối lượng phân tử của N-acetyl-D-glucosamin
2.2.5 Xây dựng đường chuẩn glucosamine Để xác định được hàm lượng Glucosamin tạo thành sau quá trình thủy phân ta dựa vào phương trình đường chuẩn Glucosamin Tiến hành xây dựng đường chuẩn Glucosamin như sau:
Để pha dung dịch glucosamin nồng độ 0,5 mg/ml, cần cân chính xác 0,5g N-acetyl-D-Glucosamin và hòa tan vào 1000 ml nước cất Từ dung dịch này, có thể pha chế các dung dịch glucosamin chuẩn với nồng độ từ 300 đến 500 µg/ml.
Bảng 2.1: Cỏch pha nồng độ glucosamin 300 - 500àg/ml Nồng độ Glucosamin chuẩn (àg/ml) 0 300 350 400 450 500 Thể tích dung dịch Glucosamin (ml) 0 60 70 80 90 100
Thể tích nước cất (ml) 100 40 30 20 10 0
Sử dụng pipet để hút 1ml mẫu theo các nồng độ đã chỉ định, cho vào bình tam giác 50ml Tiếp theo, thêm 2ml thuốc thử 2,4-pentadion, lắc đều hỗn hợp và đun cách thủy ở 100°C trong 1 giờ Cuối cùng, làm nguội hỗn hợp dưới dòng nước mát.
- Thêm 2ml thuốc thử Erlich I, lắc đều, đem đun cách thủy ở 70 0 C trong 20 phút
- Để nguội bình tam giác, sau đó đo cường độ màu đỏ trong bình bằng máy đo mật độ quang, ở bước sóng 450 - 600 nm
Hình 2.3: Màu đỏ của mẫu sau khi bỏ thuốc thử Irlich I
2.2.6 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme chitinase
Mục đích: Xác định được điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng nấm Trichoderma
095(2)TH để sinh tổng hợp enzyme chitinase
2.2.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzym chitinase
+ Mục đích: Xác định thời gian thích hợp để thu hồi enzyme có hoạt tính cao nhất
- Chuẩn bị 500ml môi trường nuôi cấy, sử dụng môi trường tuyển chọn
- Cấy chủng Trichoderma 095(2)TH vào môi trường, tiến hành nuôi cấy lắc, tốc độ vòng quay là 180 vòng/phút ở nhiệt độ 30 0 C
Sau 3 đến 7 ngày nuôi cấy, tiến hành lọc dịch enzyme và xác định hoạt độ của enzyme chitinase Dịch enzyme có hoạt tính cao nhất sẽ được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình thủy phân.
2.2.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzym chitinase
+ Mục đích: Xác đinh nhiệt độ nuôi cấy tối ưu để quá trình sinh tổng hợp enzyme chitinase đạt cao nhất
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tuyển chọn ( mục 2.1.3.2) Cấy chủng
Trichoderma 095(2)TH được đưa vào môi trường nuôi cấy và nuôi lắc ở tốc độ 180 vòng/phút tại các nhiệt độ khác nhau: 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 độ C cho đến khi đạt thời gian nuôi cấy tối ưu Sau đó, tiến hành thu canh trường và xác định hoạt độ của enzyme.
2.2.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzym chitinase
Mỗi loại nấm có mức pH sinh trưởng tối ưu riêng Việc khảo sát khả năng tổng hợp enzyme chitinase ở các mức pH khác nhau, kết hợp với thời gian nuôi cấy thích hợp, giúp xác định pH lý tưởng cho môi trường nuôi cấy nhằm đạt được hoạt tính cao nhất của enzyme chitinase.
Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp, cần điều chỉnh pH ở các mức 3, 4, 5, 6, 7, và 8 Quá trình nuôi cấy lắc nên được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu và tốc độ lắc 180 vòng/phút cho đến khi đạt thời gian nuôi cấy tối ưu Sau đó, tiến hành thu canh trường và xác định hoạt độ của enzyme.
2.2.7 Nghiên cứu các đặc tính của enzyme chitinase chiết tách từ chủng nấm
+ Mục đích: Tìm được nhiệt độ tối ưu và pH tối ưu của enzyme chitnase tách chiết từ chủng nấm Trichoderma 09(2)TH
+ Mục đích : Thuận tiện cho các nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đên hoạt độ của enzyme chitinase
