Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong đồ án này, chúng tôi có các nhiệm vụ:
- Tuyển chọn các chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cellulase cao
- Khảo sát, lựa chọn môi trường nuôi nấm thích hợp để chúng sinh tổng hợp cellulase cao nhất và thời điểm thu nhận cellulase từ dịch nuôi
- Nghiên cứu các tỉ lệ thích hợp để tinh sạch enzyme cellulase từ dịch nuôi của nấm Trichoderma reesei
- Nghiên cứu đặc tính cellulase từ trichoderma reesei
Vật liệu, phạm vi và nội dung nghiên cứu
Vật liệu
Các chủng nấm Tricoderma reesei đƣợc cung cấp bởi phòng giữ giống khoa
Nông lâm ngư - Trường đại hoc Vinh.
Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ thực phẩm, khoa Hóa Học, trường Đại học Vinh trong thời gian từ 20/6/ 2012 đến 20/12/2012.
Nội dung nghiên cứu
Đề tài đƣợc tiến hành với nội dung nhƣ sau:
- Tuyển chọn chủng nấm thuộc nhóm Trichoderma reesei có khả năng sinh tổng hợp cellulase có hoạt lực cao
- Khảo sát thời gian sinh hoạt tính enzyme cellulase là cao nhất
- Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường đến hoạt tính enzyme cellulase
- Tinh sạch cellulase từ dịch nuôi nấm bằng tác nhân muối ở các tỷ lệ khác nhau
- Khảo sát các điều kiện tối ƣu của enzyme cellulase tinh sạch đƣợc
Các khảo sát đã xác định các điều kiện tối ưu và nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số chất đặc trưng đến enzyme, nhằm ứng dụng chúng một cách hiệu quả nhất.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Đề tài này cung cấp những giá trị khoa học và thực tiễn quan trọng cho việc nghiên cứu enzyme cellulase từ nấm Trichoderma reesei Kết quả thu được sẽ bổ sung cho các nghiên cứu trước đó về loại nấm này, đồng thời tạo nền tảng vững chắc cho các nghiên cứu tiếp theo liên quan đến Trichoderma reesei.
Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu liên quan đến ứng dụng cụ thể của enzyme cellulase từ nguồn mới, nhằm áp dụng vào sản xuất và đời sống Điều này không chỉ giúp giảm chi phí chế phẩm mà còn nâng cao hiệu quả sử dụng của enzyme cellulase.
TỔNG QUAN
Nấm Trichoderma reesei
Trichoderma reesei là một loại nấm sợi sinh sản vô tính, được phân lập từ vải bông ở quần đảo Solomon trong thời kỳ Chiến tranh thế giới thứ II Loài nấm này, được biết đến với mã QM6a, là loài duy nhất của Trichoderma reesei và đã được phân loại theo các tiêu chí khoa học.
Sợi nấm ban đầu có màu trắng, sau đó chuyển sang màu xanh do sự hình thành của bào tử Cuống bào tử có dạng chùm, phân nhánh liên tục, tạo ra các thể bình hình tam giác, mỗi thể bình kết thúc bằng một thể bào Bào tử có hình cầu, đường kính từ 3,6 đến 4,5 mm, có màu xanh lục và bề mặt vách xù xì.
Hình 1.1 Hình thái Trichoderma reesei
1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Trichoderma reesei là một loại nấm có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 0°C, tối ưu từ 26 đến 30°C và tối đa từ 31 đến 37°C Nấm này phát triển với sợi nấm có sắc tố màu vàng cam trên môi trường PDA (Potato Dextrin Agar) Về đặc điểm sinh thái, Trichoderma reesei được phân bố rộng rãi ở các vùng cực Bắc, vùng núi và vùng nhiệt đới.
Nấm Trichoderma reesei xuất hiện phổ biến trong hầu hết các loại đất và nhiều môi trường sống khác Đây là loại nấm được nuôi cấy rộng rãi nhất hiện nay.
Nấm Trichoderma reesei phát triển mạnh ở vùng rễ cây, với một số giống có khả năng phát triển trực tiếp trên rễ Những giống này có thể được bổ sung vào đất hoặc hạt giống qua nhiều phương pháp khác nhau Khi tiếp xúc với rễ, Trichoderma reesei phát triển trên bề mặt hoặc vỏ rễ tùy thuộc vào từng giống Đặc biệt, những giống phù hợp có thể tồn tại và phát triển trên bề mặt rễ ngay cả khi rễ dài hơn 1m dưới mặt đất, duy trì hiệu lực lên đến 18 tháng sau khi sử dụng, mặc dù không phải giống nào cũng có khả năng này.
Nấm Trichoderma reesei không chỉ hình thành khuẩn lạc trên rễ mà còn tấn công và ký sinh, lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác Loài nấm này phát triển tốt nhất ở những nơi có rễ khỏe mạnh và sở hữu nhiều cơ chế để tấn công các nấm gây bệnh, đồng thời nâng cao sự sinh trưởng và phát triển của cây Nhiều phương pháp kiểm soát sinh học hiện đại đã chứng minh hiệu quả trong việc tăng cường sự sinh trưởng của cây, với quá trình này được điều khiển bởi nhiều gen và sản phẩm từ gen khác nhau Các cơ chế chính bao gồm ký sinh nấm, kháng sinh, cạnh tranh về chất dinh dưỡng và không gian, tăng cường khả năng chịu đựng điều kiện bất lợi, hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ, cảm ứng kháng bệnh, và bất hoạt enzyme gây bệnh.
Hầu hết các giống Trichoderma reesei sinh sản chủ yếu bằng phương pháp vô tính, mặc dù có một số giống sinh sản hữu tính được ghi nhận nhưng không phù hợp cho kiểm soát sinh học Phân loại truyền thống dựa vào hình thái bào tử vô tính, trong khi gần đây, các phương pháp phân loại dựa trên cấu trúc phân tử đã trở nên phổ biến Hiện tại, có ít nhất 33 loài nấm Trichoderma reesei được xác định.
Hệ enzyme cellulase
Enzyme là những chất xúc tác sinh học có nguồn gốc từ protein, tan trong nước và dung dịch muối loãng Với phân tử lượng lớn từ 20.000 đến 100.000 dalton, enzyme không thể xuyên qua màng bán thấm.
Cellulase là polysaccharid chính của màng tế bào thực vật, được cấu tạo từ các phân tử β-D glucose liên kết với nhau qua liên kết β-1,4-glycosid Chất này không hòa tan trong nước và khi được thủy phân bằng axit mạnh, sản phẩm cuối cùng là glucose Trong điều kiện thủy phân nhẹ nhàng, sản phẩm thu được sẽ là disaccharid cellobiose.
Phân tử cellulase có dạng hình sợi, liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và tạo thành từng nhóm gọi là mixel
Các dẫn xuất từ cellulase đƣợc dùng trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ:
- Nitrocellulose: dùng làm chất nổ, sợi nhân tạo
- Axetylcellulose: dùng làm sợi nhân tạo
- Cacboxymethyl cellulose, dietyllaminoetyl- cellulose: Dùng trao sắc khí, trao đổi ion
Một số dẫn xuất tan trong nước của cellulase như Natri carboxylmetyl – cellulase (NaCMC), hydroxyetyl cellulase (HEC) và Metylcellulase (MC) có nhiều ứng dụng trong công nghiệp NaCMC, một keo ưa nước, thường được sử dụng làm chất ổn định cho tẩy rửa tổng hợp và nhũ tương HEC được dùng làm chất làm đặc trong sơn latex và để ngăn chặn sự mất nước trong xi măng pooclant MC, không độc hại, được áp dụng trong sản xuất gốm để tăng độ kết dính và cũng là chất ổn định trong các loại sơn lót nhiều màu, đồng thời được sử dụng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm.
Quá trình thủy phân Cellulase được thực hiện nhờ hệ enzyme phức tạp, bao gồm enzyme C1, Cx và β-glucosidaza Enzyme C1 có tính chất không đặc hiệu, giúp hấp thụ nước và làm cho cellulase trương lên, chuẩn bị cho sự tác động của các enzyme khác Tuy nhiên, nếu tách riêng C1, tác dụng này không rõ ràng, cho thấy C1 chỉ là yếu tố hỗ trợ Enzyme Cx, còn gọi là β-1,4-glucanaza, có vai trò thủy phân cellulase ngậm nước thành cellulase Các enzyme này thường được chia thành hai loại chính, với chữ x biểu thị cho sự đa dạng trong thành phần enzyme.
Exo-β-1,4-glucanase và endo-β-1,4-glucanase là hai loại enzyme quan trọng trong quá trình phân hủy cellulose Exo-β-1,4-glucanase xúc tác việc cắt đứt các đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose, trong khi endo-β-1,4-glucanase có khả năng cắt liên kết β-1,4-glucosid ở bất kỳ vị trí nào trong chuỗi cellulose.
Cellulase là một polysacharit phức tạp và bền vững trong tự nhiên, nhưng có thể bị phân hủy bởi enzyme cellulase Quá trình thủy phân liên kết 1,4 β-glucosit trong cellulase tạo ra glucose, một sản phẩm quan trọng cho ngành công nghiệp lên men.
Cellulase là một loại enzyme chủ yếu được sản xuất bởi nấm, vi khuẩn và protozoans thông qua quá trình cellulolysis, tức là thủy phân cellulose Ngoài ra, một số sinh vật như loài mối và các vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối cũng sản xuất cellulase Có nhiều loại cellulase khác nhau, chúng có cấu trúc và cơ chế hoạt động khác nhau.
Năm loại chung của cellulase dựa vào loại phản ứng xúc tác:
- Endocellulase vỡ trái phiếu nội bộ để phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose và phơi bày chuỗi cellulose polysaccharide cá nhân
Exocellulase plays a crucial role in the breakdown of cellulose by cleaving two to four units from the ends of cellulose chains produced by endocellulase, resulting in tetrasaccharides or disaccharides, such as cellobiose There are two main types of exocellulases, also known as cellobiohydrolases (CBH): one type operates processively from the reducing end, while the other works processively from the non-reducing end of the cellulose molecule.
- Cellobiase hay -glucosidase hydrolyses sản phẩm exocellulase vào monosacarit cá nhân
- Cellulases oxy hóa depolymerize cellulose bằng các phản ứng cực đoan
Ví dụ : dehydrogenase cellobiose (chấp nhận)
- Cellulase phosphorylases depolymerize phosphat cellulose bằng cách sử dụng thay vì nước
Enzyme cellulase, đặc biệt là cellulase to-β glucose, đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải cellulose Loại enzyme này chủ yếu được sản xuất thông qua sự cộng sinh với vi khuẩn trong dạ dày của động vật nhai lại Tuy nhiên, hầu hết các loài động vật, bao gồm cả con người, không có khả năng tự sản xuất cellulase.
Trong cơ thể của họ, một số sinh vật chỉ có khả năng phá vỡ cellulose thông qua quá trình lên men, điều này hạn chế khả năng sử dụng năng lượng từ nguyên liệu thực vật sợi Enzym thủy phân cellulose, thường được gọi là hemicellulase, được phân loại chung theo cellulase Ngoài ra, enzyme tách lignin cũng thường được phân loại vào nhóm cellulase.
1.2.3 Tính chất lý hóa của enzyme cellulase
Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định
Nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến vận tốc phản ứng của enzyme, với hoạt tính enzyme chỉ tăng khi nhiệt độ tăng trong một giới hạn nhất định mà không làm thay đổi cấu trúc enzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở khoảng nhiệt độ 25-50°C Khi nhiệt độ cao, enzyme có thể bị biến tính, dẫn đến giảm hoạt tính hoặc mất hoàn toàn hoạt tính Ngược lại, ở nhiệt độ thấp dưới 0°C, hoạt tính enzyme giảm nhiều nhưng có thể phục hồi khi trở về nhiệt độ thích hợp Cụ thể, enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt hoạt tính tối đa ở 30°C.
Ảnh hưởng của pH đến khả năng hoạt động của enzyme là rất quan trọng, vì mỗi loại enzyme có mức pH tối ưu riêng để hoạt động hiệu quả Đối với enzyme cellulase từ Trichoderma reesei, pH tối ưu để enzyme hoạt động là trong khoảng 5,0-6,0, cho thấy rằng môi trường phản ứng có thể là trung tính, kiềm hoặc acid tùy thuộc vào bản chất của enzyme.
Ion kim loại có thể ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme bằng cách kìm hãm hoặc kích thích chúng Đặc biệt, các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có khả năng gây biến tính và ức chế không thuận nghịch enzyme, dẫn đến sự suy giảm chức năng sinh học.
Các dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính của enzyme Mức độ ảnh hưởng này phụ thuộc vào bản chất của cả dung môi và enzyme Các dung môi như methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, trong đó n-butanol là chất ức chế mạnh nhất, làm giảm hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63% Các chất tẩy rửa như tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 cũng làm giảm hoạt tính cellulase ở các mức độ khác nhau, với SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%.
Cơ chất của hệ enzyme cellulase
1.3.1.1 Khái niệm và cấu trúc
Cellulose là thành phần chủ yếu của tế bào thực vật, với tỷ lệ khác nhau trong các loại nguyên liệu Gỗ chứa khoảng 5% cellulose, trong khi sợi bông vải có hàm lượng lên tới 97-98% Các loại sợi như sợi lanh và sợi gai chứa từ 81-90% cellulose, sợi đay có 75%, và thân cây họ cói, họ lúa chứa từ 30-40%.
Cellulose là một loại polymer được hình thành từ các đơn phân glucose liên kết bằng liên kết β-1,4 glycoside, đóng vai trò chủ yếu trong cấu trúc vách tế bào thực vật và là nguồn carbohydrate phong phú nhất trong tự nhiên Mức độ polymer hóa của cellulose thường dao động từ 100 đến 20.000 Các chuỗi cellulose gần nhau liên kết với nhau thông qua liên kết hydrogen và liên kết Vander Waals, tạo thành các tấm cellulose với cấu trúc tinh thể và dạng sợi bền vững.
Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ đƣợc sắp xếp thành đơn vị lớn hơn gọi là sợi cơ bản, sau đó đƣợc bó thành sợi lớn hơn gọi là vi sợi và đƣợc cấu trúc thành những sợi cellulose Sợi cellulose bền vững bởi các liên kết nội phân tử cũng nhƣ liên kết hydrogen nội phân tử Sự xắp xếp các chuỗi riêng lẻ bên trong những sợi cơ bản đã đƣợc tìm hiểu từ sự phân tích tán xạ tia X [23]
Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm các vị trí cố định liên kết chặt chẽ, ngăn chặn sự xâm nhập của enzym và các phân tử nhỏ như nước Ngoài cellulose tinh thể, các sai sót trong cấu trúc đã tạo ra sợi cellulose vô định hình với nhiều cấu trúc bất quy tắc như chỗ xoắn, lỗ trống và hốc nhỏ Tổng diện tích tiếp xúc của sợi cellulose lớn hơn bề mặt tinh thể tương ứng, dẫn đến sự không đồng nhất trong cấu trúc, khiến sợi dễ bị hydrate khi tiếp xúc với môi trường lỏng và cho phép sự xâm nhập của các phân tử lớn, bao gồm enzym thủy phân cellulose.
Cellulose không cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể con người, nhưng nó có vai trò quan trọng trong tiêu hóa Mặc dù cơ thể không có enzyme để phân hủy cellulose, nhưng việc tiêu thụ cellulose từ rau và trái cây hàng ngày giúp cải thiện khả năng tiêu hóa, tăng cường lưu động ruột và hỗ trợ việc đào thải chất thải, từ đó ngăn ngừa táo bón.
Hàng năm, quá trình quang hợp ở thực vật tổng hợp khoảng 230 tỷ tấn chất hữu cơ, trong đó có tối đa 70 tỷ tấn (30%) là cellulose Cellulose là một polyme tự nhiên được hình thành từ β-D-glucose qua liên kết β-D-1,4-glucan, với mức độ polyme hóa dao động từ 200 đến 15,000, trung bình khoảng 3,000 Trọng lượng phân tử của cellulose có sự khác biệt lớn giữa các loài thực vật, dao động từ 50,000 đến 2,500,000.
Cellulose là một hợp chất tự nhiên bền vững, không tan trong nước nhưng có khả năng trương phồng khi hấp thụ nước Hợp chất này có thể bị phân hủy khi đun nóng với kiềm, axit hoặc tác động của các enzyme.
Phân tử cellulose có độ bền cao, với thời gian bán rã từ 5 đến 8 triệu năm để phân cắt liên kết β-1,4 glycoside ở nhiệt độ 25 độ C Ngược lại, quá trình phân hủy sinh học diễn ra nhanh hơn và thải ra carbon vào khí quyển.
1.3.1.2 Thành phần của sinh khối thực vật
Sinh khối thực vật chiếm giữ khoảng một nửa nguồn carbon trong sinh quyển Người ta ước tính rằng lượng carbon được thực vật đồng hóa hàng năm khoảng
200 tỷ tấn [29] Khoảng 70% sinh khối thực vật được cấu thành từ các đơn vị đường chứa 5, 6 carbon [27]
Phân tử cellulose tạo thành các sợi tinh thể, tạo nên bộ khung vững chắc cho vách tế bào thực vật Các sợi cellulose được liên kết chéo với hemicellulose, bao gồm xylan, glucomannan, xyloglucan và 1,3 cùng 1,4-glucan, nhằm tăng cường độ bền cho vách tế bào Hemicellulose chứa các đơn phân như -D-xylose, -D-mannose và -D-glucose với các liên kết khác nhau Ngoài ra, bộ khung cellulose và hemicellulose còn được kết hợp với pectin, giúp tăng cường tính liên kết trong vách tế bào.
Vách tế bào thực vật có thành phần và cấu trúc khác nhau giữa các loài, trong đó cellulose chiếm từ 35 đến 50% trọng lượng khô Ngoài ra, cellulose thường được kết hợp với các sợi sinh học khác như hemicellulose, chiếm khoảng 20 đến 35%, và lignin, chiếm khoảng 30% trọng lượng khô của thực vật.
Lignin là một hợp chất có mặt cùng với cellulose trong nhiều loài thực vật, đóng vai trò quan trọng trong việc làm cứng vách tế bào Thành phần lignin có sự khác biệt giữa các loại thực vật khác nhau Tuy nhiên, lignin cũng gây cản trở quá trình chuyển đổi các polysaccharide thành các đơn phân dưới tác động của enzym.
Hình1.4 Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật
Việc sử dụng sinh khối cellulose phức tạp hơn cellulose thuần khiết không chỉ do thành phần phức tạp mà còn vì cấu trúc đa dạng của tế bào thực vật Các tế bào thực vật có sự khác biệt lớn về kích thước và tổ chức, trong đó một số loại tế bào có vách mỏng và ít lignin hóa, dễ dàng bị thủy phân bởi các enzym thủy giải polysaccharide.
Sinh khối thực vật gặp khó khăn trong quá trình thủy giải do liên kết với hemicellulose, được bao bọc bởi lignin và có cấu trúc tinh thể hình thành nhiều liên kết hydrogen Để tăng cường hiệu quả thủy giải enzym, việc tiền xử lý là cần thiết nhằm loại bỏ lignin, hòa tan hemicellulose, phá vỡ cấu trúc tinh thể và tăng diện tích bề mặt cellulose.
1.3.2 Carboxymethyl cellulose (CMC) Định nghĩa
Carboxymethyl cellulose (CMC) là một polime, là dẫn xuất của cellulose với các nhóm carboxymethyl (-CH 2 COOH) liên kết với một số nhóm hydroxyl của các
24 glucopyranose monomer tạo nên khung sườn cellulose, nó thường được sử dụng dưới dạng muối natri carboxymethyl cellulose
Dạng natri carboxymethyl cellulose có công thức phân tử là [C 6 H 7 O 2 (OH) x (OCH 2 COONa) y ] n
Là chế phẩm ở dạng bột trắng, hơi vàng, hầu nhƣ không mùi, hạt hút ẩm Carboxymethyl cellulose tạo dung dịch dạng keo với nước, không hòa tan trong ethanol
Các tính chất hóa học của Carboxymethyl cellulose được xác định bởi mức độ thế của các cấu trúc cellulose, tức là số lượng nhóm hydro tham gia vào phản ứng thế Ngoài ra, độ dài chuỗi của các cấu trúc sườn cellulose và mức độ của các phân nhóm trong nhóm thế carboxymethyl cũng ảnh hưởng đến các tính chất này.
Carboxymethyl cellulose là một hợp chất có khả năng kết hợp dễ dàng với các thành phần hóa học trong thực phẩm, giúp làm chậm quá trình kết tinh của đường, protein, tinh bột và hầu hết các polymer trung tính.
Hệ enzyme cellulase của Trichoderma reesei
Trichoderma reesei là một loài nấm sợi quan trọng trong sản xuất enzyme cellulase, nổi bật với khả năng phân hủy cellulase mạnh mẽ Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng loài nấm này có khả năng tạo ra một lượng lớn enzyme cellulase với hoạt tính xúc tác cao.
Theo Saloheimo (1997), hệ enzyme cellulase của Trichoderma reesei bao gồm
Trong hệ enzyme cellulase, có 2 enzyme thuộc nhóm exoglucanase (CBHI và CBHII), 8 enzyme thuộc nhóm endoglucanase (EGI, EGII, EGIII, EGIV, EGV, CEL5B và CEL61B) và 2 enzyme nhóm D-glucosidase (BGLI và BGLII) Trong đó, exoglucanase chiếm 70-80%, endoglucanase khoảng 20% và D-glucosidase chỉ khoảng 1% Ba nhóm enzyme này hỗ trợ lẫn nhau trong việc chuyển hóa cellulose thành đường một cách hiệu quả Ngoài ra, Trichoderma reesei còn chứa các protein không phải enzyme như swollenin (SWO), giúp phân hủy cellulase bằng cách phá vỡ cấu trúc tinh thể, tạo điều kiện cho các enzyme cellulase hoạt động hiệu quả hơn.
Các enzyme cellulase của Trichoderma reesei được điều hòa chủ yếu ở mức phiên mã, với các gen mã hóa enzyme cellulase khác nhau được đồng điều hòa biểu hiện ở tất cả các môi trường với tỉ lệ tương đối như nhau (Ilmen, 1997; Foreman, 2003) Sự điều hòa biểu hiện cellulase theo nguồn carbon (CCR) xảy ra ở nhiều mức độ, bao gồm tiếp nhận chất cảm ứng, hình thành chất cảm ứng và ức chế trực tiếp cellulase Cellulase được kích hoạt thông qua các yếu tố như XYR1, ACE2 và phức hợp HAP, trong khi sự ức chế diễn ra thông qua các yếu tố CRE1 và ACE1 Ngoài ra, cellulase còn được kiểm soát ở mức nhiễm sắc chất bởi protein methyltransferase LAE1.
Enzyme cellulase được kích thích bởi cellulose và các nguồn carbon khác như sophorose, lactose, sorbitol và glycerol Trong số này, sophorose có khả năng kích thích biểu hiện enzyme cao nhất, trong khi glucose lại ức chế sự biểu hiện của hệ enzyme cellulase.
Dinh dưỡng và con đường trao đổi chất cơ bản của Trichoderma reesei
Theo lý thuyết sinh tổng hợp enzyme cảm ứng, để vi sinh vật cellulase phát triển trong môi trường nuôi cấy, cần có cellulase làm chất cảm ứng cùng với nguồn carbon.
Nguồn carbon có thể là: tinh bột, glucose, cám bổi, mùn cƣa, rơm, than bùn có tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển và tạo thành enzyme
Trichoderma reesei nổi bật với khả năng sản xuất enzyme phân hủy nhiều loại polysaccharide, bao gồm cellulose và hemicellulose, cũng như các polymer liên quan như cellulase Những enzyme này được công nhận có giá trị thương mại cao.
Manczinger and Pollner (1985) classified Trichoderma reesei strains based on carbon sources Their analysis revealed that all studied strains utilized various carbon sources, including D-glucose, D-galactose, D-fructose, D-mannose, D-cellobiose, trehalose, D-xylose, L-arabinose, D-mannitol, D-arabitol, glycerol, salicin, esculin, arbutin, glycerol-1-monoacetate, β-methyl-D-glucoside, and N-acetyl-β-D-glucosamine Overall, the most effective carbon sources identified were glucose, fructose, mannose, galactose, xylose, trehalose, and cellobiose.
Trichoderma có khả năng phát triển bằng cách sử dụng các nguồn nitơ phức tạp hoặc đơn giản Khi Trichoderma phát triển trên nguồn cacbon là carbohydrate, nó thường ưu tiên sử dụng ammonium thay vì nitrat Một số chủng như Trichoderma reesei (T.reesei) và T.koningii T-1 không thể sử dụng nitrat do thiếu enzyme nitrate permease.
Peptone, một nguồn nitơ hữu cơ, thường được sử dụng trong môi trường để hạn chế sự tăng trưởng chậm trên các cơ chất polymeric như cellulose Cần lưu ý rằng peptone không chỉ là nguồn nitơ mà còn là nguồn carbon, và được ưu tiên khi cung cấp đồng thời với polysaccharide Trong số các amino acid, alanin, acid aspartic và acid glutamic là những nguồn nitơ hữu cơ tốt nhất cho Trichoderma.
Nước chiết nấm men cũng có tác dụng kích thích sự tạo thành endoglucanase, do đó có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật
Hầu hết các chủng Trichoderma không cần yếu tố tăng trưởng phức tạp hay vitamin Gaunt và cộng sự (1984) đã phân tích thành phần ion kim loại của sợi nấm Trichoderma reesei, từ đó tính toán nhu cầu về ion kim loại Sắt là một trong những ion kim loại cần thiết cho sự tăng trưởng của nấm và có thể được tìm thấy ở nồng độ rất thấp trong môi trường.
Nồng độ thấp của các ion kim loại như Cd 2+ và Hg 2+ rất quan trọng cho sự phát triển, nhưng khi nồng độ cao từ 1 – 10mM, chúng lại gây ức chế sự tăng trưởng và tạo ra kiểu hình bất thường ở nấm.
Fe, Mn, Zn có tác dụng kích thích tạo thành enzyme này ở nhiều chủng Nồng độ tối thích của Zn là 0.11-2.2 mg/l, Fe 2-10 mg/l, Mn 3.4-27.2 mg/l
Trichoderma reesei, giống như các loài nấm khác, có khả năng bắt giữ các ion kim loại trong màng tế bào của chúng Phát hiện này đã được ứng dụng hiệu quả trong việc loại bỏ ion kim loại nặng khỏi nước thải công nghiệp thông qua hệ sợi nấm.
Trichoderma là một vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, mặc dù các chủng đã được phân lập thường sống trong môi trường có áp suất oxy rất thấp Nghiên cứu cho thấy việc cung cấp oxy và hoạt động của ti thể là những yếu tố quan trọng trong việc điều chỉnh sự hình thành cellulase của Trichoderma reesei, với nồng độ O2 ở mức dưới cực thuận được cho là phù hợp cho quá trình tổng hợp enzyme.
CO2 là sản phẩm cuối cùng của quá trình oxi hóa cacbon, và sự tích lũy của nó trong môi trường tăng trưởng rắn phụ thuộc vào pH và nhiệt độ Do đó, một số loài sẽ chịu ảnh hưởng khác nhau từ các yếu tố này.
Trichoderma spp bị ức chế bởi CO2 theo phương thức phụ thuộc vào pH, sự ức chế mạnh nhất trong môi trường kiềm nhẹ và trung tính
Môi trường khí trong lên men bán rắn, bao gồm O2 và CO2, đã thu hút sự chú ý của nhiều tác giả gần đây Nồng độ của chúng được thể hiện qua áp suất riêng phần, với không gian giữa các tiểu phần cơ chất là môi trường khí quan trọng nhất, nơi sinh khối phát triển O2 khuếch tán từ khoảng không giữa các hạt cơ chất vào sinh khối, trong khi CO2 khuếch tán ngược lại Phản ứng của vi sinh vật trong quá trình lên men bán rắn đối với môi trường khí phụ thuộc nhiều vào giống vi sinh vật và loại cơ chất được sử dụng.
Trong một số trường hợp, nồng độ O 2 thấp không kìm hãm sự sinh trưởng và trao đổi của vi sinh vật mà chủ yếu do nồng độ CO 2 cao
Môi trường khí ảnh hưởng lớn đến sinh khối và enzyme trong quá trình lên men bán rắn O2 từ khí quyển tự do thâm nhập vào cơ chất nhờ bề mặt tiếp xúc rộng giữa pha khí, cơ chất và hệ sợi.
1.5.5 Ảnh hưởng của yếu tố bên ngoài lên sự phát triển của nấm Trichoderma
Nồng độ ion H+ ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm, vì nhiều chất dinh dưỡng như đường và amino acid được hấp thụ thông qua quá trình đồng vận chuyển với H+ Do đó, nấm thường phát triển tốt trong môi trường có pH hơi acid, với mức pH tối ưu từ 4 đến 6,5 Một số chủng Trichoderma spp lại ưa thích môi trường có pH dưới 3.
Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của Trichoderma reesei là trong khoảng 26 – 30 0 C
Sự tăng trưởng phụ thuộc nhiệt độ là một hiện tượng có tính thích nghi ở
Trichoderma, là loài có nguồn gốc từ vùng khí hậu ấm áp, có nhiệt độ tối ƣu cao
Việc vi sinh vật phát triển trong môi trường lên men rắn tạo ra một lượng nhiệt đáng kể từ quá trình trao đổi chất Nhiệt độ này có thể đạt đến mức đủ cao để ức chế sự sinh trưởng hoặc thậm chí tiêu diệt vi sinh vật.
Các phương pháp tinh chế enzyme
Trong sản xuất, chế phẩm enzyme được sử dụng dưới nhiều dạng khác nhau Ở một số lĩnh vực công nông nghiệp, chế phẩm enzyme sấy khô có thể được áp dụng nếu không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Tuy nhiên, ngành sản xuất thực phẩm và công nghiệp nhẹ yêu cầu sử dụng chế phẩm enzyme tinh sạch, tức là đã loại bỏ hầu hết tạp chất Để tinh chế enzyme và loại bỏ tạp chất trong dịch enzyme thô, có thể áp dụng nhiều phương pháp như sắc ký, phân tách hệ lỏng – lỏng và kết tủa phân đoạn enzyme.
1.6.1 Phương pháp kết tủa đẳng điện
Protein hay protein enzyme thường hòa tan ít nhất ở điểm đẳng điện, nơi tổng điện tích của các phân tử bằng 0, dẫn đến việc không có lực đẩy tĩnh điện Điều này khiến các phân tử protein enzyme kết hợp với nhau và tạo ra kết tủa Do đó, có thể thu được kết tủa đẳng điện của enzyme cùng với các enzyme và protein tạp khác, và quá trình lọc hoặc ly tâm được sử dụng để thu hoặc loại bỏ các kết tủa này.
1.6.2 Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính (NH 4 ) 2 SO 4 để tách enzyme
Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 là kỹ thuật phổ biến để loại bỏ protein tạp trong các dịch enzyme, dựa trên sự khác biệt về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối xác định Các loại muối như Na2SO4 và MgSO4 cũng có thể được sử dụng, nhưng (NH4)2SO4 được coi là hiệu quả nhất vì nó không chỉ ổn định mà còn bảo vệ hầu hết các loại enzyme, với nồng độ bão hòa lên đến 767 g/l ở 25°C Nồng độ cần thiết để kết tủa enzyme khác nhau, ví dụ, protein từ nấm mốc có thể bị kết tủa ở nồng độ 70% (NH4)2SO4, cho thấy tính chọn lọc cao của muối này so với các muối khác.
Sau khi quá trình kết tủa hoàn tất, cần để lắng trong khoảng 2 giờ hoặc qua đêm để đảm bảo kết tủa hoàn toàn, trừ trường hợp sử dụng dung môi hữu cơ thì không cần thời gian lâu Kết tủa sau đó được thu gom bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc qua phểu Buckner.
1.6.3 Kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ
Phương pháp này dựa vào độ hòa tan của protein, liên quan đến sự tương tác giữa các nhóm tích điện trong phân tử protein và phân tử nước.
Sự hydrate hóa của enzyme sẽ giảm khi thêm dung môi hữu cơ như ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp rượu vào dung dịch Phương pháp này cần được thực hiện ở nhiệt độ thấp, từ 5°C trở xuống, và có thể tách phân đoạn ở nhiệt độ dưới 0°C, thậm chí đến -20°C Việc sử dụng dung môi hữu cơ giúp cải thiện độ ổn định của protein enzyme.
Khi kết tủa đã hình thành, cần nhanh chóng tách kết tủa ra khỏi dung môi bằng máy ly tâm Phương pháp này có ưu điểm là không cần loại bỏ muối, tuy nhiên, chi phí cao và dễ gây cháy là những nhược điểm cần lưu ý.
1.6.4 Sử dụng các chất trợ lọc (support) kết tủa enzyme Đối với các enzyme ngoại bào, ở quy mô công nghiệp người ta có thể thêm vào các chất nhƣ kiselgua, tinh bột, lactose, dextran sulfat hoặc ficoll để làm cho kết tủa tạo thành ở dạng hạt Thường người ta dùng các chất này khi có mặt rượu, natri sulfat, axit tanic [7]
1.6.5 Kết tủa bằng các polymer có khối lƣợng phân tử cao
Các polymer như dextran và polyetylenglycol được sử dụng rộng rãi như chất làm bền, chất làm đặc hoặc chất kết tủa Chúng có tính háo nước cao, làm mất vỏ nước của các phân tử sinh học, từ đó ảnh hưởng đến hằng số điện môi và các tương tác không gian của các nhóm háo nước trong polyme Polyetylenglycol với nồng độ 50% (w/w) trong nước có khả năng kết tủa hầu hết các protein với nồng độ từ 6-20% Quá trình kết tủa này chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ, lực ion, pH, nồng độ protein và khối lượng phân tử của enzym.
1.6.6 Thay đổi thành phần hóa học của môi trường để làm sạch enzyme
Khi thêm các chất đặc hiệu vào chương trình, có thể tạo ra kết tủa cho một số phân tử, ví dụ như muối kim loại (Mn 2+) tương tác với axit nucleic giúp tách biệt các enzyme nội bào Axit nucleic có thể được kết tủa bằng protein kiềm tính như protamin, khi các protein tích điện dương kết hợp với nhóm phosphat tích điện âm của axit nucleic Qua đó, enzyme có thể được tách ra khỏi hợp chất với axit nucleic, và sản phẩm tạo thành có thể được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm.
1.6.7 Sắc ký lỏng cao áp
Dưới áp suất cao, các protein có thể được sắc ký với hiệu suất phân giải cao và tốc độ phân tách lớn, tuy nhiên, chất mang cần có độ bền cơ học cao Thông thường, gel silic được sử dụng cho phương pháp này.
Khi gắn một phối tử đặc hiệu lên protein hoặc enzyme trên gel silic đã được tạo nhánh với glyceropropylsilan, có thể sử dụng sắc ký ái lực cao áp để tối thiểu hóa các tương tác phi đặc hiệu.
1.6.8 Sắc ký tương tác ưa béo
Các protein sẽ lần lượt được phân tách ra theo tương tác của chúng với một chất mang có chứa nhóm ưa béo (kị nước)
Các protein có bề mặt chứa các nhóm ưa béo, kết hợp với chất mang ưa béo và dung môi ưa nước, tạo thành một hệ ba thành phần tương tác với nhau Hệ này có thể bị rối loạn do sự thay đổi của pH, nhiệt độ hoặc lực ion.
Tăng cường lực ion sẽ làm tăng cường các tương tác, giúp giữ lại các protein Để rửa giải các protein này một cách chọn lọc, có thể giảm lực ion hoặc giảm độ phân cực của dung môi rửa Ngoài ra, có thể gắn các nhóm khác nhau lên chất mang để cải thiện hiệu quả.
Octylsepharose(R) CL-4B chứa các nhóm octyl và phenyl được gắn lên các đơn vị monosaccarit của agarose thông qua liên kết ete không tích điện và bền hóa học Ngoài ra, có thể sử dụng các nhóm ưa béo khác trên các chất mang khác.
Ứng dụng của enzyme cellulase
Enzym cellulase hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp và y học Các enzym này đã có mặt trên thị trường từ vài thập kỷ và chủ yếu được sản xuất từ các loài vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm lớn.
1.7.1 Cellulase với công nghiệp thực phẩm
Cellulase là thành phần thiết yếu trong tế bào thực vật, hiện diện trong tất cả các loại rau quả cũng như nguyên liệu và phế liệu từ ngành trồng trọt và lâm nghiệp Mặc dù cellulase có giá trị trong việc cải thiện quá trình tiêu hóa, nhưng con người và động vật không thể phân giải được enzyme này Khi tiêu thụ với lượng lớn, cellulase có thể trở nên vô ích hoặc thậm chí cản trở quá trình tiêu hóa.
Chế phẩm cellulase thường dùng để :
+ Tăng chất lƣợng thực phẩm và thức ăn gia súc
Cellulase được ứng dụng trong chế biến thực phẩm nhằm tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật, cải thiện độ hấp thu và nâng cao chất lượng hương vị Bên cạnh đó, enzyme này còn giúp làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, mang lại lợi ích đáng kể cho quá trình chế biến.
32 Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lƣợng thực phẩm đƣợc tăng lên
Nhiều quốc gia đã ứng dụng enzyme cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và các loại lương thực như gạo, cũng như trong việc xử lý chè và tảo biển Trong ngành sản xuất bia, cellulase hoặc phức hệ citase có chứa cellulase giúp phá hủy thành tế bào của hạt đại mạch, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tác động của protease và đường hóa.
Trong sản xuất agar-agar, chế phẩm cellulase có tác dụng làm tăng chất lượng sản phẩm so với phương pháp sử dụng acid để phá vỡ tế bào Việc sử dụng cellulase không chỉ giúp tận thu phế liệu thực vật mà còn hỗ trợ thủy phân, chế biến thức ăn gia súc và ứng dụng trong công nghệ lên men Mặc dù các ứng dụng của cellulase trong ngành thực phẩm đã đạt kết quả tốt, nhưng một trong những thách thức lớn nhất là khó khăn trong việc thu được chế phẩm cellulase với hoạt độ cao.
1.7.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong ngành sản xuất bột giấy và giấy, việc bổ sung enzyme trong quy trình nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy đóng vai trò quan trọng Nguyên liệu thô chứa nhiều lignin và hemicellulose khó tan, gây khó khăn trong việc tách sợi gỗ thành bột mịn Việc thêm endoglucanase trong quá trình nghiền bột giấy giúp thay đổi cấu trúc sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng Trước khi tiến hành nghiền hóa học, việc xử lý gỗ bằng endoglucanase và enzyme hemicellulase, pectinase sẽ cải thiện khả năng khuếch tán hóa chất và hiệu quả loại bỏ lignin.
Trong quy trình tái chế giấy, việc tẩy mực trên các loại giấy thải là rất quan trọng trước khi sản xuất giấy in và giấy viết Để thực hiện điều này, các enzyme như endoglucanase và hemicellulase đã được ứng dụng để làm trắng mực in trên giấy.
1.7.3 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Trong quá trình sản xuất nước quả và nước uống không cồn, việc trích li dịch quả từ thịt nghiền là rất quan trọng Các loại quả sau khi tách vỏ và bỏ hạt được nghiền thành dịch nhuyễn, từ đó ép bã để thu được dịch quả Dịch này chứa tế bào thịt quả và polysaccharide, làm tăng độ nhớt Để nâng cao hiệu suất trích li, giảm độ nhớt và cải thiện cảm quan, việc bổ sung endoglucanase là cần thiết Enzyme này giúp cải thiện hiệu suất dịch hóa, và sự kết hợp với glucanase và pectinase sẽ phá hủy màng tế bào Việc bổ sung hỗn hợp enzyme cellulase và hemicellulase trong giai đoạn dịch hóa sẽ nâng cao chất lượng nước quả có thịt.
Trong quy trình sản xuất bia, việc sử dụng các enzyme amylase, protease và glucanase giúp ngăn chặn sự hình thành diacetyl, từ đó giảm lượng diacetyl tạo ra và rút ngắn thời gian ủ bia.
Trong dịch lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia [6]
Trong quá trình sản xuất cà phê tại Việt Nam, phương pháp khô thường được sử dụng, nhưng chất lượng cà phê không cao Để cải thiện chất lượng, phương pháp lên men đã được áp dụng, sử dụng enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và tăng khả năng ly trích dịch quả Tuy nhiên, trong quá trình bóc vỏ, cellulose có thể gây hiện tượng thẫm màu, làm giảm chất lượng cà phê sau khi sấy và cản trở việc bóc vỏ hiệu quả.
A niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số lƣợng cà phê đƣợc bóc vỏ tăng, hạt cà phê đƣợc bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt nhƣ hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [10]
1.7.4 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Trong chăn nuôi động vật ăn cỏ, việc bổ sung cellulase vào thức ăn giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thụ dinh dưỡng, đặc biệt là cho động vật non, từ đó giảm chi phí thức ăn và thúc đẩy tăng trưởng nhanh hơn Ứng dụng cellulase trong việc phân giải nguồn thức ăn giàu cellulose như rơm, rạ, bã mía, bã khoai, và bã sắn đã được triển khai ở nhiều quốc gia, bao gồm sản xuất protein đơn bào cho gia súc, trong đó nấm sợi thường được sử dụng để lên men các nguồn phế thải giàu cellulose.
34 tạo ra sinh khối protein chứa hàm lƣợng các amino acid cân đối, các vitamin và tạo hương thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi [22]
1.7.5 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong quá trình sản xuất ethanol, amylase đóng vai trò chính trong việc thủy phân tinh bột Việc bổ sung các enzyme như cellulase và hemicellulase không chỉ giúp tăng lượng đường sản xuất mà còn cải thiện tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, từ đó nâng cao hiệu suất thu hồi rượu lên tới 1,5%.
1.7.6 Trong công nghệ xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh
Rác thải là nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường, dẫn đến mất cân bằng sinh thái và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Thành phần chính trong rác thải là cellulose, do đó, công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải là giải pháp hiệu quả để cải thiện môi trường Enzyme có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất lignocellulose và cellulose thành nguồn năng lượng, bao gồm đường, ethanol, khí sinh học và các sản phẩm giàu năng lượng khác.
Ngoài việc bổ sung vi sinh vật trực tiếp vào bể ủ để xử lý rác thải, việc nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm vi sinh chứa vi sinh vật sinh ra cellulase cũng đã được thực hiện.
Cellulase từ một số nguồn khác
Nguồn thu nhận enzyme celulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật trong đó nấm
Trichoderma là nguồn thu nhận của enzyme cellulase quan trọng vì enzyme có hoạt tính khá cao trong thời gian nuôi cấy
Quá trình phân giải cellulase bởi vi sinh vật là một trong những chu trình tự nhiên quan trọng nhất Vi sinh vật, bao gồm nấm mốc, vi khuẩn và một số loại nấm men, là nguồn enzyme phong phú nhất, cung cấp nguyên liệu lý tưởng cho sản xuất enzyme quy mô lớn phục vụ cho công nghiệp và đời sống.
Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính sau:
+ Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật
+ Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn; từ 16-100h nên có thể thu hoạch nhiều lần quanh năm
+ Có thể điểu khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)
Giá thành sản xuất chế phẩm enzyme tương đối thấp nhờ vào môi trường sản xuất đơn giản và dễ tổ chức Quá trình này bao gồm việc phân lập các giống vi sinh vật tự nhiên hoặc giống đột biến được lựa chọn để tối ưu hóa việc tổng hợp một loại enzyme cần thiết.
Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose, nhưng chỉ một số ít có khả năng phân hủy hiệu quả cellulose tinh thể Các sinh vật phân hủy cellulose hiếu khí như vi khuẩn và nấm sử dụng cellulose thông qua việc sản xuất một lượng lớn cellulase ngoại bào trong dịch nuôi cấy, mặc dù cũng có sự hiện diện trên bề mặt tế bào Hầu hết các loài nấm đều có khả năng sử dụng cellulose làm nguồn cơ chất cho sự phát triển, đặc biệt là nhiều loài nấm nguyên thủy.
Chytridomycete kị khí có khả năng thủy giải cellulose trong ruột của động vật nhai lại Nhiều loài nấm kị khí khác cũng sở hữu khả năng tương tự trong việc phân hủy cellulose.
Trong số khoảng 700 loài nấm Zygomycete, chỉ một vài loài thuộc giống Mucor có khả năng thủy giải cellulose Ngược lại, các ngành nấm Ascomycete, Basidiomycete và Deuteromycete, với hơn 15.000 loài mỗi ngành, cho thấy khả năng thủy giải cellulose mạnh mẽ Nhiều giống nấm như Chaetomium và Helotium (Ascomycete), Coriolus, Phanerochaete, Poria, Schizophyllum và Serpula (Basidiomycete), cũng như Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium và Trichoderma (Deuteromycete) đã thu hút nhiều nghiên cứu về hoạt tính thủy giải cellulose và gỗ.
Nhiều loại nấm sợi có khả năng sinh ra một lƣợng lớn cellulase thuộc giống alternaria trichoderma, aspergillus, pinicillum… Cellulase là enzyme đa cấu trúc gồm
: exoglucanase hay C1, endoglucanase hay Cx và β- glucosidase hoạt động phối hợp để thủy phân cellulase thành glucose
Phức hợp cellulase của Trichoderma reesei có khả năng chuyển đổi hoàn toàn cellulose tự nhiên và các dẫn xuất của nó thành glucose Sự phát triển của nấm và sản xuất enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn từ các yếu tố môi trường như thành phần môi trường, độ ẩm, pH, nhiệt độ, ánh sáng và không khí xung quanh.
Chủng Aspergillus fumigatus có khả năng sử dụng cellulose tinh thể như nguồn carbon duy nhất và sản xuất nhiều loại cellulase ngoại bào Trong số đó, có 6 vạch hoạt tính endoglucanase được phát hiện khi điện di trên gel polyacrylamide Hoạt tính CMCase đạt tối ưu ở nhiệt độ 65°C và pH 2, cho thấy loài vi sinh vật này là một sản phẩm endoglucanase ưa nhiệt và acid.
1.8.2 Vi khuẩn và xạ khuẩn
Trong số các loài vi khuẩn, khả năng thủy giải cellulose đƣợc tìm thấy ở hai bộ:
Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí Dựa vào các đặc điểm sinh lí, vi khuẩn thủy giải cellulose có thể thấy bao gồm những nhóm sinh lí sau [23]:
Các loại vi sinh vật phân giải Cellulase là:
- Vi sinh vật háo khí:
+ Niêm vi khuẩn: Cytophaga, Sporocytophaga, cellulomonas
+ Vi khuẩn : các giống bacillus, giống Clostridium
+ Nấm mốc : Aspergillus, Penicilium, Fusarium
- Vi sinh vật yếm khí :
+ Vi khuẩn dạ cỏ: giống ruminococcus
+ Vi sinh vật yếm khí sống tự do: Bacillus cellulosae hidrognicus, bacillus cellulosae methanicus
- Vi khuẩn ƣa nóng: Bacillus Cellulase thermophicus
Chỉ một số loài trong các giống vi khuẩn có khả năng thủy giải cellulose, và các vi khuẩn này có sự khác biệt về cách sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ muối và cellulose trong môi trường tự nhiên Việc phân loại các vi khuẩn kị khí sử dụng cellulose rất phức tạp, bởi nhiều chủng vi khuẩn không có khả năng thủy giải cellulose nhưng lại sở hữu hệ thống gen cellulosome không được biểu hiện do lỗi trong trình tự promoter, như trường hợp của Clostridium acetobutylicum.
Gần đây, chủng Bacillus subtilis DR được phân lập từ suối nước nóng đã sản xuất ra loại endocellulase CelDR bền nhiệt, với nhiệt độ tối ưu lên đến 50°C và vẫn duy trì 70% hoạt tính ở 75°C sau 30 phút ủ Khả năng chịu nhiệt cao của chủng vi khuẩn này cho thấy tiềm năng ứng dụng lớn trong ngành công nghiệp lọc dầu.
Chủng vi khuẩn ưa nhiệt Brevibacillus sp JXL có khả năng phân giải nhiều loại cơ chất như cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose, glucose và xylose Enzym của chủng này có độ bền nhiệt cao, giữ được 50% hoạt tính sau khi xử lý ở nhiệt độ 100°C trong một giờ.
Tình hình nghiên cứu thu nhận cellulase từ trichoderma trên thế giới và ở Việt
1.9.1 Lịch sử nghiên cứu về Trichoderma
Gần 200 năm trước, Trichoderma viride được phát hiện, nhưng mãi đến hơn 150 năm sau, nó mới thu hút sự chú ý từ các nhà khoa học Thế nhưng, trong Thế chiến II, quân đội Mỹ đã nhận thấy vấn đề mục nát của trang bị quân sự tại các vùng nhiệt đới, đặc biệt là Nam Thái Bình Dương Chương trình điều tra của họ đã xác định Trichoderma "viride" mã số QM 6a là loài nấm có khả năng phân hủy cellulose tại khu vực này.
Sự nhầm lẫn kéo dài suốt 20 năm đã được giải quyết khi chủng Trichoderma QM 6a được xác định và đổi tên thành Trichoderma reesei, nhằm tôn vinh Elwyn T Reese, người phát hiện ra loài này Ông làm việc tại viện nghiên cứu Natick cùng với Mary Mandels, nghiên cứu về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides liên quan đến Trichoderma reesei và các thể đột biến của nó.
Nhờ vào những công trình nghiên cứu này, nhiều phòng thí nghiệm tại Mỹ, Châu Âu và Châu Á đã tiếp tục tìm hiểu và khám phá hệ thống phân giải cellulose.
Vào cuối thập niên 60, Trichoderma đã được nghiên cứu và phân loại lần đầu tiên bởi Rifai và Webster ở Anh, khi họ mô tả 9 loài Trichoderma Việc nuôi cấy các loài này trở nên dễ dàng và thuận tiện.
Nghiên cứu về các chủng Trichoderma đã chuyển hướng từ ứng dụng phân giải cellulose sang khám phá khả năng kích thích tăng trưởng cây trồng và kháng bệnh nấm Những phát hiện quan trọng này đã giúp Trichoderma trở thành một tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả trong nông nghiệp Hiện nay, lĩnh vực này thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên toàn thế giới.
Hình 1.6 Ảnh nhìn qua kính hiển vi về những sợi tơ phát triển của dòng nấm
1.9.2 Tình hình nghiên cứu thu nhận cellulase từ trichoderma trên thế giới
Nghiên cứu về cellulase của Trichoderma bắt đầu từ thời kỳ chiến tranh thế giới thứ hai, do Reese và Mandel dẫn dắt Nhóm nghiên cứu đã tập trung vào việc kích thích biểu hiện cellulase ở nấm Trichoderma viride và khám phá cơ chế hoạt động của cellulase trong quá trình chuyển hóa cellulose thành đường.
Trichoderma viride của Reese đã được đổi tên thành Trichoderma reesei (Trichoderma reesei QM6a) Để nâng cao sản lượng cellulase, nhiều chủng biến đổi từ Trichoderma reesei QM6a hoang dã đã được phát triển, bao gồm các chủng như QM9123, QM9414, MCG80, Rut-NG14, Rut-C30, RLP37, L-37, và VTT-D-79124, CL-847.
Sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật di truyền đã dẫn đến việc sử dụng rộng rãi vi sinh vật trong sản xuất enzyme tái tổ hợp quy mô lớn Enzyme cellulase từ nấm mốc đã được tạo dòng biểu hiện thành công trên nhiều hệ thống tế bào khác nhau, bao gồm vi khuẩn E coli, nấm men S cerevisiae và nấm men P pastoris.
Kwon (1999) đã tạo dòng biểu hiện egll của Trichoderma viride HK-75 vào E.coli với kết quả protein thu đƣợc là 18.3mg/l hoạt tính EGI tái tổ hợp giảm còn
67.8% so với EGI tự nhiên [25] Nakazawa (2008) cũng nghiên cứu khả năng biểu hiện các trung tâm hoạt động EGI, EGII, EGIII của Trichoderma reesei trong E.coli
Do không có khả năng biến đổi cấu trúc protein sau dịch mã, hoạt tính enzyme của nấm mốc giảm khi được biểu hiện trong hệ thống này.
Nhiều nhóm tác giả đã thành công trong việc tạo dòng biểu hiện endoglucanase của Trichoderma trong nấm men, như egl4 và egVIII Ganiger và cộng sự (2008) đã tạo dòng biểu hiện β-1,6 endoglucanase của T.haizianum ở S.cerevisiae Quin và cộng sự (2007) đã biểu hiện egl2 của Trichoderma reesei trên Saccharomyces cerevisiae, với EGII thu được có trọng lượng phân tử 54kDa, cao hơn EGII từ Trichoderma reesei (48kDa) và vẫn giữ được 88% hoạt tính endoglucanase Trong hệ thống P.pastoris, các nhà nghiên cứu đã đạt nhiều thành công trong việc biểu hiện enzyme cellulase và hemicellulase Lui (2006) đã thành công trong việc biểu hiện protein lai giữa dòng endoglucanase.
The hybrid enzyme IV of Trichoderma reesei, featuring a catalytic center on the P pastoris system, exhibits an activity level four times greater than that of the natural endoglucanase IV enzyme, yielding a production of 0.12 g/L of protein Additionally, the enzyme cellobiohydrolase I (CBH I) plays a significant role in this process.
Fusicoccum sp tái tổ hợp đƣợc biểu hiện P.postoris có khả năng giữ đƣợc 50% hoạt tính sau khi xử lý 70-90 0 C trong 30 phút
Hoạt tính -glucosidase của Aspergillus vượt trội hơn so với Trichoderma Để nâng cao khả năng đường hóa cellulase, Nakazawa (2011) đã chuyển nạp -glucosidase 1 từ Aspergillus aculeatus vào Trichoderma reesei và thành công trong việc biểu hiện enzyme này.
Nghiên cứu về enzyme cellulase từ vi sinh vật đã được thực hiện nhằm giảm chi phí sản xuất bioethanol từ lignocellulose Ziegelhoffer (1999) đã thành công trong việc biểu hiện enzyme CBH II từ vi khuẩn Thermmonospora fusca trong lá cây thuốc và cỏ linh lăng Tương tự, Dai (1999) cũng đã biểu hiện CBH II của Trichoderma reesei ở lá và mô sẹo cây thuốc lá Ngoài ra, Hooker (2001) đã tiến hành biểu hiện enzyme endoglucanase (El), mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và ứng dụng enzyme cellulase trong sản xuất bioethanol.
Acidothermus cellulolyticus and cellobiohydrolase (CBH 1) from Trichoderma reesei are stored in the leaves of tobacco and potato plants, comprising approximately 0.05% and 2.6% of the total soluble protein, respectively.
1.9.3 Tình hình nghiên cứu thu nhận cellulase từ trichoderma ở Việt Nam
Trong nước đã có nhiều nghiên cứu về khả năng sản xuất enzyme cellulase từ
Nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và cộng sự (2007) cho thấy khi lên men bán rắn Trichoderma reesei VTT-D-80133, cellulase được thu nhận với hoạt tính 280.64 IU/g CMC và 5 IU/g FPU Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2010) đã khám phá khả năng xử lý vỏ cà phê bằng cellulase từ Trichoderma viride Đồng thời, Phạm Thị Hòa, Quyền Đình Thi và cộng sự (2011) đã phát triển dòng biểu hiện endoglucanase (EglA) của Aspergillus niger VTCC-F021 trên hệ thống P pastoris, với hoạt tính đạt 16.24 UI/mg, cao hơn so với EglA hoang dã là 14.1 UI/mg.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
- Các chủng nấm sợi Trichoderma reesei được thu thập tại vườn quốc gia Pù Mát Nghệ An, lưu giữ tại khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại Học Vinh
- Enzyme cellulase đƣợc chiết tách từ dịch nuôi cấy chủng Trichoderma reesei Vn1072
Hóa chất và thiết bị
Hóa chất sử dụng trong môi trường nuôi cấy bao gồm chiết nấm men, urea, glucose, agar, kalinatritatrat và một số hóa chất khác Tất cả các hóa chất này đều ở dạng tinh khiết, phục vụ cho mục đích phân tích và sản xuất, được cung cấp từ Đức và Trung Quốc.
- Dung dịch (A) : Dung dịch axit citric 0.1M : cân 21.01 gam C 6 H 8 O 7 H 2 O, hòa tan trong nước cất và định mức đến 1 lit
- Dung dịch (B) : Dung dịch Trinatricitrat 0.1M : cân 29.41 gam
C 6 H 5 O 7 Na 3 2H 2 O, hòa tan trong nước cất và định mức đến 1 lit
Dung dịch đệm citrat có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (A) và dung dịch (B) theo bảng :
- Dung dịch (A): Dung dịch Mononatriorthophosphate 0.2M: cân 27.8 gam NaH 2 PO 4 , hòa tan trong nước cất và định mức đến 1 lit
- Dung dịch (B): Dung dịch Dinatrihydrophosphate: cân 53.05 gam
Na 2 HPO 4 7H 2 O hoặc cân 71.7 gam Na 2 HPO 4 12H 2 O, hòa tan trong nước cất và định mức đến 1 lit
Dung dịch đệm citrat có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (A) và dung dịch (B) theo bảng :
Thuốc thử DNS (Dinitro salicylic)
Sử dụng nước cất làm dung môi, định mức cho đến 1lit
Cơ chất CMC 1% (cacboxymethyl cellulase) :
Cân 1 gam CMC hòa tan trong trong 20ml nước cất và định mức tới 100ml
- Cân phân tích điện tử
- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác như: Bình tam giác, pipet, ống đong, phễu, bình định mức…
- Các dụng cụ thông thường dùng trong nghiên cứu vi sinh
Các môi trường nuôi cấy
2.3.1 Môi trường giữ giống PGA (Potato Glucose Agar):
Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy, bạn cần 20g glucose, 20g agar và nước luộc khoai tây, cộng với nước đủ 1 lít Trộn đều các thành phần vào ống nghiệm và hấp vô trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1at trong 15 phút Sau khi hấp xong, đặt ống nghiệm nằm nghiêng cho đến khi môi trường đông hoàn toàn, sau đó cất vào tủ lạnh để sử dụng sau.
Môi trường nhân giống được chuẩn bị với các thành phần chính như (NH4)2SO4 19.6g, FeSO4.7H2O 0.07g, KH2PO4 28g, MgSO4.7H2O 4.2g, MnSO4.4H2O 0.021g, ure 4.2g, ZnSO4.7H2O 0.019g, CaCl2 0.028g, CoCl2 4.2g, chiết nấm men 7g và glucose 15g, sau đó được điều chỉnh thể tích bằng nước cất đến 1 lít Môi trường này được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 độ C, áp suất 1 atm trong 20 phút để đảm bảo tính vô trùng và hiệu quả trong quá trình nhân giống.
Môi trường cơ chất và khoáng bao gồm : Cám mỳ 10g, tinh bột 5%, chiết nấm men 1%, CạCl 2 0.2%, CoCl 2 0.2%, MgSO 4 7H 2 O 0.2%, KH 2 PO 4 0.2%
Thành phần: (NH 4 ) 2 SO 4 1,4g, FeSO 4 7H 2 O 5mg, KH 2 PO 4 2g, MgSO 4 7H 2 0: 0,3g, MnSO 4H 0 1,6mg, Ure 0,03g; ZnSO 7H O 1,4mg; CaCl 0,3g; CoCl 2mg;
44 pepton 0,75g Bổ sung CMC 1% đến 1 lít , pH = 5 Hấp khử trùng ở 121 o C, áp suất 1atm trong 20 phút.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp nuôi cấy trichoderma thu cellulase trên môi trường lỏng và rắn
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
- Phân bố môi trường vào các bình tam giác 250 ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trường
- Cấy chủng Trichoderma vào các bình tam giác Nuôi trên máy lắc ổn nhiệt tốc độ
180 vòng/phút, nhiệt độ chọn thử nghiệm nuôi cấy ban đầu là nhiệt độ phòng
Chủng vi nấm Trichoderma reesei được nuôi cấy trong bình tam giác 500ml với 10 gam cám mỳ và 12ml khoáng, đã được hấp ở 121 o C trong 20 phút Thời gian thử nghiệm trong các lần nuôi cấy ban đầu được thực hiện ở nhiệt độ phòng.
2.4.2 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống
Chủng nhận từ nơi giữ giống cần cấy chuyền trên môi trường PGA giữ ở nhiệt độ
Để nấm phát triển, cần giữ ở nhiệt độ 30 độ C trong 2 đến 3 ngày Sau đó, chuyển nấm vào tủ lạnh bảo quản ở 10 độ C Sau 7 đến 10 ngày, cần thực hiện cấy chuyền để tránh tình trạng già hóa giống và mất hoạt tính của chủng nấm.
2.4.3 Xác định hoạt độ cellulase
Hoạt tính của enzyme cellulase được đánh giá thông qua việc định lượng lượng glucose được giải phóng trong quá trình thủy phân cơ chất, trong đó cơ chất sử dụng là CMC, một dẫn xuất của cellulose.
- Lấy 1ml dịch enzyme cho vào ống nghiệm + 1ml dung dịch đệm citrat pH = 5.0 + 1ml cơ chất CMC 1%
- Hỗn hợp đƣợc ủ ở 50 o C trong 30 phút
- Xác định lượng đường khử có trong mẫu
Một đơn vị hoạt tính (đvht) của enzyme cellulase được xác định là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μmol glucose trong 1 ml dung dịch trong vòng 1 phút.
- Đối với môi trường lỏng :
Hoạt tính cellulase (mol/ml/phút) 30 180
- Đối với môi trường rắn :
Ta có : Cứ 10gam cám mỳ 50ml đệm citrat
Cứ 1gam cám mỳ 5ml đệm citrat
Hoạt tính cellulase (mol/g/phút) 30 180
B : Hàm lượng đường khử dựa vào giá trị OD của đường chuẩn
2.4.4 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Dinitro Salicylic
Phương pháp xác định hàm lượng đường khử dựa trên phản ứng tạo màu với thuốc thử axit dinitro salycylic (DNS) cho thấy cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một khoảng nhất định Bằng cách sử dụng đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết kết hợp với thuốc thử DNS, ta có thể tính toán chính xác hàm lượng đường khử trong mẫu nghiên cứu.
Để chuẩn bị dung dịch glucose chuẩn, bạn cần cân 1 gram glucose và pha loãng với nước cất cho đủ 100ml, tạo ra dung dịch có nồng độ 10 mg/ml Từ dung dịch này, bạn có thể pha loãng để thu được các nồng độ glucose khác nhau, dao động từ 0.2 đến 1.0 mg/ml.
Nồng độ Glucose (mg/ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ glucose và giá trị OD
Cho vào 6 ống nghiệm, mỗi ống chứa 1ml dung dịch glucose pha loãng với các nồng độ khác nhau, cùng với 2ml đệm citrat 0.1M có pH = 5.0 Sau đó, thêm vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS để tiến hành thí nghiệm.
- Lắc đều, đun cách thủy ở 100 o C trong 15 phút, rồi cho thêm 1ml kalinatritatrat 40%
- Làm lạnh ở nhiệt độ phòng và được tiến hành đo bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540nm
- Nồng độ glucose thủy phân xác định dựa vào đường chuẩn glucose
- Chuẩn bị mẫu đối chứng bằng cách thay 1ml glucose bằng 1ml nước cất
+ Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm
- Lấy 1ml dịch enzyme cho vào ống nghiệm + 1ml dung dịch đệm citrat pH = 4.8 + 1ml cơ chất CMC 1%
- Hỗn hợp đƣợc ủ ở 50 o C trong 30 phút
- Cho thêm 3ml thuốc thử DNS
- Sau khi ủ cho thêm 3ml DNS Tiếp tục đun sôi trong 15 phút Sau đó cho thêm 1ml kalinatritatrar 40%
- Làm lạnh ở nhiệt độ phòng và đem đo ở bước sóng 540nm
Lượng đường khử tạo thành sau phản ứng thủy giải bởi enzyme cellulase được xác định theo phương pháp định lượng dường khử bằng Axit Dinitro Salycylic (DNS)
2.4.5 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase trên môi trường rắn
2.4.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian thu nhận
Chuẩn bị môi trường sinh tổng hợp bằng cách cấy chủng nấm sợi Trichoderma reesei vào môi trường chứa 10 gam cám mỳ và khoáng, thực hiện trong tủ cấy vô trùng Thu dịch chiết enzyme tại các thời điểm nuôi cấy 3, 4, 5, 6, 7 và 8 ngày, sau đó thêm 50ml đệm citrat với pH = 5.0.
Xác định sự biến thiên hoạt độ cellulase theo thời gian nuôi cấy
Enzyme này, sau khi được thu nhận vào ngày nuôi cấy với hoạt tính cao nhất, sẽ được sử dụng để nghiên cứu tác động của một số yếu tố đến quá trình thủy phân.
2.4.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm
Độ ẩm là yếu tố quyết định trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Khi độ ẩm quá thấp, nước bị mất ra khỏi tế bào nấm mốc, dẫn đến tế bào chết và hạn chế sự phát triển Ngược lại, độ ẩm quá cao cũng không có lợi cho sự sinh trưởng Ở mức độ ẩm tối ưu, hoạt động trao đổi chất diễn ra hiệu quả nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển mạnh mẽ.
Xác định độ ẩm nuôi cấy tối ƣu để quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase đạt cao nhất
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp với các độ ẩm khác nhau (50, 60, 70, 80, 90) để xác định thời gian nuôi cấy tối ưu Sau đó, tiến hành thu hoạch và xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp định lượng đường khử sử dụng DNS.
2.4.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ
Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu để quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase đạt cao nhất
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy phù hợp và tiến hành nuôi ở các nhiệt độ khác nhau như 25, 30, 35, 40, 45 độ C để tìm ra thời gian nuôi cấy tối ưu Sau đó, thu canh trường và xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp định lượng đường khử thông qua DNS.
2.4.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng pH
Mỗi loại nấm có một mức pH tối ưu cho sự phát triển Nghiên cứu về khả năng tổng hợp enzyme cellulase ở các mức pH khác nhau, cùng với thời gian nuôi cấy thích hợp, nhằm xác định pH lý tưởng cho môi trường nuôi cấy, giúp thu nhận enzyme cellulase với hoạt tính cao nhất.
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy với các pH 3, 4, 5, 6, 7 và 8, sau đó tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C Khi đạt thời gian nuôi cấy tối ưu, thu hoạch canh trường và xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp định lượng đường khử qua DNS.
2.4.5.5 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cơ chất khác nhau
Xác định nguồn cơ chất nuôi cấy tối ƣu để quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase đạt cao nhất
Chuẩn bị môi trường nhân giống và cấy trichoderma reesei Vn1072, nuôi trong 48 giờ Sau đó, chuyển vào môi trường rắn với các nguồn cơ chất như cám mỳ, bã mía và mụn cưa Tiến hành nuôi ở 30°C trong 5 ngày để xác định nguồn cơ chất tối ưu có hoạt tính cellulase cao nhất, sử dụng phương pháp định lượng đường khử bằng DNS để xác định hoạt độ enzyme.
