Nhiệm vụ đồ án
Trong khóa luận này, chúng tôi thực hiện các nhiệm vụ sau :
- Nghiên cứu tổng quan về Nấm, giá trị và thành phần dinh dƣỡng của Nấm
- Nghiên cứu các tính chất vật lý, hóa học và các phương pháp xác định các loại protein và axit amin
- Tách và xác định đồng thời các loại axit amin bằng phương pháp HPLC
- Kiểm tra, đánh giá phương pháp và các điều kiện phân tích với quá trình thực hiện và kết quả thu đƣợc
- Xử lý kết quả và một số đề xuất kiến nghị
Luận văn này nhằm mục đích bổ sung và hoàn thiện dữ liệu trong bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, đồng thời cung cấp thông tin quan trọng cho các nghiên cứu dinh dưỡng liên quan đến nấm.
Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu nấm được thu thập từ rừng Bắc Trung Bộ, sau đó được phân lập và nuôi cấy tại phòng thí nghiệm vi sinh của Trung tâm thực hành thí nghiệm, Trường Đại học Vinh Danh sách các mẫu nấm bao gồm nhiều loài với tên khoa học khác nhau.
- Mẫu nấm lỗ - Hexagonia apiaria
- Mẫu nấm HKG 401 - Ganoderma pfleifferi
- Mẫu nấm HKG 406 - Amauroderma schmburgki
Hình ảnh các mẫu nấm nghiên cứu :
Hình 1: Mẫu nấm 01 Hình 2: Mẫu nấm 02
Hình 3: Mẫu nấm 608 Hình 4: Mẫu nấm 619
Hình 5: Mấu nấm 621 Hình 6: Mẫu nấm HKG 401
Hình 7: Mẫu nấm HKG 406 Hình 8: Mẫu nấm lỗ
TỔNG QUAN
Tổng quan về Nấm
1.1 Giới thiệu về giới nấm
Nấm là một giới sinh vật đa dạng, với khoảng 1,5 triệu loài, trong đó đã được mô tả 69.000 loài (theo Hawksworth, 1991) Chúng tồn tại khắp nơi trên Trái đất, từ các hốc tường cho đến thực vật, động vật và con người, bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn.
Nấm ban đầu được phân loại vào giới thực vật, nhưng quan điểm này đã thay đổi Hiện nay, nhiều nhà phân loại học đề xuất xếp nấm vào một giới riêng, gọi là giới nấm Sự phân loại này xuất phát từ nhiều điểm khác biệt giữa nấm và thực vật, cho thấy nấm có những đặc điểm độc đáo không thể xếp vào hai giới còn lại.
Không có lục lạp và sắc tố quang hợp, nên các sinh vật này không thể tự tổng hợp các chất hữu cơ từ thực vật và động vật.
- Không có sự phân hoá cơ quan thành thân, rễ, lá, hoa
Phần lớn vách tế bào không chứa cellulose mà chủ yếu được cấu tạo từ chitin và glucan Chitin, một hợp chất phổ biến hơn ở động vật so với thực vật, đặc biệt tập trung ở nhóm giáp xác và côn trùng, tạo thành lớp vỏ hoặc cánh cứng cho các loài này.
- Nấm dự trữ đường dưới dạng glycogen thay vì tinh bột như ở thực vật
- Nấm cũng không có một chu trình phát triển chung nhƣ các loài thực vật
Nấm cũng không đƣợc xếp vào giới động vật vì:
- Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử (hữu tính hay vô tính) giống hạt phấn của thực vật
Sự sinh dưỡng của nấm phụ thuộc vào hệ sợi nấm, trong đó nấm hấp thụ các chất dinh dưỡng qua màng tế bào của sợi nấm, tương tự như cơ chế hấp thụ của rễ thực vật.
Giới Nấm đƣợc chia làm 4 giới phụ: Giới phụ Nấm nhầy - Gymnomycetoida; giới phụ Nấm tảo - Phycomycetoida; giới phụ Restomycetoida và giới phụ Nấm thật - Eumycetoida
Giới phụ Nấm nhầy – Gymnomycetoida
Giới phụ Nấm nhầy - Gymnomycetoida có cấu trúc cơ thể là khối chất nguyên sinh lớn, dạng cộng bào, với màu sắc vàng hoặc hồng và kích thước có thể lên tới vài decimet Chúng di chuyển tương tự như amíp và thường sống ở những môi trường ẩm thấp, tối tăm như hốc cây mục hoặc vỏ cây.
Giới phụ Nấm tảo – Phycomycetoida
Giới phụ Nấm tảo - Phycomycetoida đặc trưng bởi giai đoạn dinh dưỡng dạng sợi không có vách ngăn, chúng sống bám và chỉ hình thành vách ngăn khi phát triển các cơ quan sinh sản.
Giới này gồm những nấm đơn bào, ở nước hoặc ở cạn, sống hoại sinh hay kí sinh trên cơ thể tảo hoặc thực vật bậc cao
Giới phụ Nấm thật - Eumycetoida
Giới phụ Nấm thật - Eumycetoida đặc trưng với cấu trúc dạng sợi, có thể phân nhánh và có hoặc không có vách ngăn, với màng tế bào chủ yếu là kitin Nấm thật sinh sản vô tính thông qua bào tử và có nhiều hình thức sinh sản hữu tính khác nhau Ban đầu, nấm thật sống trong môi trường nước, sau đó tiến hóa để sinh sống ở môi trường cạn.
1.3 Các đặc điểm sinh học của nấm [11, 12]
1.3.1 Đặc điểm cấu tạo tế bào
Cơ thể của nấm là một tản, tức là một cơ thể có bộ máy sinh dƣỡng chƣa phân hoá thành các cơ quan khác nhau
Hình 9: Cấu trúc tế bào nấm ( Nguyễn Lân Dũng, 2002)
1.3.2 Đặc điểm về dinh dưỡng
Nấm, bao gồm cả nấm trồng, có đặc tính chung là tiêu thụ xác bã thực vật và động vật Chúng có khả năng chuyển hóa các chất này thành các thành phần đơn giản để hấp thụ dễ dàng.
Các loài nấm gây bệnh chủ yếu sống ký sinh trên cơ thể các sinh vật khác như động vật, thực vật hoặc các loài nấm khác Chúng lấy dinh dưỡng từ cơ thể ký chủ, dẫn đến việc làm suy yếu hoặc tổn thương cho ký chủ đó.
Cộng sinh là mối quan hệ đặc biệt giữa nấm và cơ thể chủ, trong đó nấm lấy thức ăn từ cơ thể chủ và đồng thời cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể chủ Hình thức quan hệ này thể hiện sự hỗ trợ lẫn nhau giữa các sinh vật, giúp chúng cùng phát triển một cách hiệu quả.
1.4 Thành phần dinh dưỡng của nấm
Nấm được coi là loại rau cao cấp, mặc dù hàm lượng đạm trong nấm thấp hơn thịt cá nhưng lại vượt trội hơn so với các loại rau quả khác Nấm chứa gần như đầy đủ các loại axit amin không thay thế, bao gồm 9 loại axit amin thiết yếu cho con người Đặc biệt, nấm rất giàu leusin và lysin, hai axit amin hiếm gặp trong ngũ cốc, cho thấy chất lượng đạm trong nấm không thua kém gì đạm động vật Việc bổ sung đạm trong nguyên liệu trồng nấm có thể làm thay đổi lượng axit amin, nhưng không ảnh hưởng đến hàm lượng đạm trong nấm.
Nấm chứa ít đường, với hàm lượng dao động từ 3-28% trọng lượng tươi Đặc biệt, ở nấm rơm, lượng đường tăng lên trong giai đoạn phát triển từ dạng nút sang dạng kéo dài, nhưng lại giảm khi nấm trưởng thành Nấm cũng dự trữ đường dưới dạng glucogen, tương tự như động vật, thay vì tinh bột như ở thực vật.
Nấm là nguồn cung cấp phong phú các loại vitamin, bao gồm B, C, K, A, D, E, với vitamin B chiếm ưu thế, đặc biệt là B1, B2, axit nicotinic và axit pantothenic Đặc biệt, chỉ cần tiêu thụ 3g nấm tươi, bạn đã có đủ lượng vitamin B12 cần thiết cho nhu cầu hàng ngày, trong khi rau củ thường thiếu vitamin này.
Nấm, giống như nhiều loại rau cải khác, là nguồn cung cấp khoáng chất phong phú, đặc biệt là kali (K), canxi (Ca) và magiê (Mg), chiếm từ 56-70% tổng lượng tro Phosphat và sắt thường có mặt ở phiến và nhũ nấm Ở quả thể trưởng thành, lượng natri (Na) và photpho (P) giảm, trong khi K, Ca và Mg vẫn duy trì Việc tiêu thụ nấm giúp đảm bảo cung cấp đầy đủ khoáng chất cần thiết cho cơ thể hàng ngày.
Như vậy ngoài việc cung cấp đạm và đường nấm còn góp phần bồi bổ cơ thể nhờ vào sự dồi dào về khoáng và sinh tố
Ngoài giá trị cung cấp các chất dinh dƣỡng cần thiết cho cơ thể, nấm ăn còn có nhiều tác dụng dƣợc lý khá phong phú nhƣ:
Tổng quan về Protein và axitamin
2.1 Lịch sử phát hiện ra Protein và acid amin [1, 2, 14]
Protein, hay còn gọi là đạm, là một khái niệm quen thuộc trong đời sống hiện nay, nhưng trước đầu thế kỷ 19, nó vẫn được xem là một vấn đề bí ẩn và khó hiểu.
Quan niệm xưa của Hippocrates cho rằng mọi thức ăn chỉ chứa một chất dinh dưỡng đã tồn tại cho đến thế kỷ XIX Tuy nhiên, vào năm 1816, nhà y học Pháp François Magendie đã chỉ ra rằng các chất chứa nitơ trong thực phẩm là thiết yếu đối với chó Đến năm 1834, nhà y học Anh William Prout phát hiện ra saccarin, chất béo và albumin trong nhóm các chất dinh dưỡng Nhà hóa học và y học Hà Lan Gerard Mulder cũng có những đóng góp quan trọng trong lĩnh vực này.
Vào năm 1839, nhà khoa học (1802 – 1880) đã lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ "protein", xuất phát từ từ "protot" trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là "đầu tiên" Từ đó, protein được công nhận là một trong những chất dinh dưỡng quan trọng nhất.
Vào thế kỷ XIX, nhiều axit amin đã được phân lập và xác định cấu trúc Năm 1906, nhà hóa sinh F.G Hopkins phát hiện rằng ngô, mặc dù là nguồn protein, không đủ để duy trì sự sống của súc vật nếu thiếu tryptophan, từ đó khẳng định tính thiết yếu của một số axit amin Phát hiện này đã mở ra nhiều nghiên cứu về giá trị sinh học của protein, chủ yếu do các nhà khoa học Mỹ thực hiện từ 1890 đến 1924.
Sau khi hai axit amin cuối cùng được xác định là methionin vào năm 1922 và threonin vào năm 1935, việc điều chỉnh chất lượng protein dựa trên thành phần các axit amin cần thiết đã trở nên khả thi Điều này đã mở ra cơ hội cho các nghiên cứu xác định nhu cầu axit amin cho động vật thực nghiệm và con người, như được ghi nhận bởi W.C Rose vào năm 1957.
2.2 Định nghĩa và phân loại protein [2, 10, 14]
Protein là polyme sinh học của L-α- axitamin kết hợp với nhau bằng liên kết peptit
Protein có nhiều loại phức tạp, với hầu hết các cấu trúc hóa học vẫn chưa được làm rõ Chúng được phân chia thành hai loại chính: protein đơn giản và protein phức tạp, dựa trên mức độ phức tạp của thành phần hóa học.
Protein đơn giản: đƣợc tạo thành chỉ từ các α-amino axit , polypeptid gồm hai hay vài chục amino acid liên kết với nhau
Protein phức tạp: đƣợc tạo thành từ các protein đơn giản kết hợp với các phân tử không phải protein (phi protein) nhƣ axit nucleic, lipit, cacbohiđrat…
Nếu dựa vào tính chất lý hoá, protein còn có thể đƣợc chia thành 7 loại là anbumin, globulin, prolamin, histon, protamin và scleroprotein
Về dinh dưỡng, protein thức ăn được phân loại dựa trên giá trị dinh dưỡng của chúng thành ba loại: protein hoàn toàn, protein nửa hoàn toàn và protein không hoàn toàn.
2.3 Cấu tạo phân tử protein [5, 10, 14, 30, 31, 32, 33]
2.3.1 Thành phần nguyên tố của protein
Tất cả các protein đều bao gồm các nguyên tố carbon (C), hydro (H), oxy (O) và nitơ (N), trong khi một số loại protein còn chứa một lượng nhỏ lưu huỳnh (S) Tỷ lệ phần trăm khối lượng của các nguyên tố này trong cấu trúc phân tử protein có sự phân bố nhất định.
Ngoài các nguyên tố trên, một số protein còn chứa một lƣợng rất nhỏ các nguyên tố khác nhƣ: P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca…
2.3.2 Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein – axit amin
Protein có cấu trúc đa dạng và đảm nhận nhiều chức năng khác nhau, chủ yếu được hình thành từ 20 L-α-axitamin thông qua liên kết peptit Các axitamin này có thể được coi là sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân peptit và protein.
Axit amin là những hợp chất hữu cơ mạch thẳng hoặc mạch vòng trong phân tử có chứa ít nhất một nhóm amin (-NH2) và một nhóm cacboxyl (-COOH)
Các axit amin thường gặp trong các protein (trong tự nhiên) là những L-α- axitamin có nhóm amin dính vào nguyên tử cacbon α đứng cạnh nhóm cacboxyl
Công thức cấu tạo tổng quát của axit amin:
R: đƣợc gọi là mạch bên hay nhóm bên, các axit amin chỉ khác nhau ở mạch R Đa số các protein được cấu tạo từ 20 L-α- axitamin và 2 amit tương ứng
- Dựa vào khả năng tổng hợp protein trong cơ thể, người ta chia axitamin làm hai loại: axit amin thiết yếu và axit amin không thiết yếu
Acid amin không thiết yếu ( có thể thay thế )
- Cơ thể không thể tổng hợp đƣợc chúng để tạo protein
- Hoàn toàn phụ thuộc vào sự cung cấp từ thức ăn bên ngoài đƣa vào cơ thể
- Có 10 loại axit amin thiết yếu:
- Cơ thể có thể tổng hợp chúng với số lƣợng đầy đủ từ các phân tử khác trong cơ thể
- Không bắt buộc hiện diện trong chế độ ăn
- Các loại acid amin không thiết yếu : Alanin, Glycin, Serin, Tyrosin, Polin, Cystein, Cystin
Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 axit amin cơ bản thành các nhóm Một trong các cách phân loại là 20 axit amin đƣợc phân thành 5 nhóm nhƣ sau:
Nhóm 1: các axit amin có gốc R không phân cực kị nước, thuộc nhóm này có 6 axit amin : Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), ILe (I), Pro (P)
Nhóm 2: các axit amin có gốc R là nhân thơm, thuộc nhóm này có 3 axit amin :
Nhóm 3: các axit amin có gốc R bazơ, tích điện dương, thuộc nhóm này có 3 axit amin : Lys (K), Arg (R), His (H)
Nhóm 4: các axit amin có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này có 6 axit amin : Ser (S), Thr (T), Cys (C), Met (M), Asn (N), Gln (Q)
Nhóm 5: các axit amin có gốc R axit, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2 axit amin :
Cấu tạo của chúng tương đồng với nhau khi đều có nhóm cacboxyl – COOH và nhóm amin – NH2 gắn vào nguyên tử carbon ở vị trí α, nhưng khác biệt ở cấu tạo mạch bên R.
Peptid là các phân tử sinh học được hình thành từ một hoặc nhiều axit amin Chúng được tạo ra thông qua phản ứng kết nối giữa đầu -NH2 của một axit amin và đầu -COOH của axit amin khác, tạo thành liên kết peptid.
Ngoài liên kết peptid, axit amin còn có thể hình thành liên kết disunfua giữa các gốc cystine Liên kết này đóng vai trò quan trọng trong việc cấu trúc không gian của nhiều protein, đặc biệt là protein ngoại bào, có chức năng sinh học thiết yếu như hormone, immunoglobulin và kháng thể.
Các peptid bị thủy phân hoàn toàn bởi dung dịch HCL 6M ở 110 o C trong 24h, hoặc bởi dung dịch kiềm để cho các axit amin tự do
Liên kết peptid bị thủy phân bởi enzym proteazơ, có mặt trong tất cả các tế bào và mô tế bào, đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải protein.
2.4 Cấu trúc phân tử protein [5, 10, 14]
2.4.1 Cấu trúc bậc một của protein
Cấu trúc bậc 1 của protein được hình thành từ sự liên kết giữa các axit amin, tạo thành chuỗi thông qua liên kết peptit (-CO - NH-) Liên kết này xảy ra giữa nhóm COOH của axit amin trước và nhóm NH2 của axit amin kế tiếp.
2.4.2 Cấu trúc bậc hai của protein
Cấu trúc bậc 2 của protein là dạng cấu trúc có chu kỳ của chuỗi polypeptit, được sắp xếp gọn gàng trong không gian, đặc biệt là trong môi trường sinh vật và mô bào Cấu trúc này có những hình thù nhất định, bền vững hơn, giúp protein thực hiện chức năng của chúng hiệu quả hơn.
Trong cơ thể, xét về cấu trúc bậc 2, protein có thể chia ra làm 3 loại:
- Loại hoàn toàn cấu tạo từ xoắn α
- Loại hoàn toàn cấu tạo từ gấp nếp β
- Loại chứa cả xoắn α và gấp nếp β
2.4.3 Cấu trúc bậc ba của protein
Tổng quan về phương pháp định lượng protein và axit amin
Các phương pháp truyền thống chủ yếu dựa vào sự hiện diện của nitơ trong cấu trúc phân tử của axit amin Do khối lượng phân tử của các axit amin khác nhau, kết quả thường được biểu thị dưới dạng nitơ axit amin.
3.1 Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl [5, 6, 8, 9]
Phương pháp định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjeldahl đơn giản và dễ thực hiện
Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hoặc trong các mô được gọi là nitơ tổng số Trong đó, nitơ có trong thành phần axit amin của protein được gọi là nitơ protein Ngược lại, nitơ không nằm trong thành phần của protein, bao gồm các muối vô cơ, axit nitric, amin tự do, peptit, urê, các dẫn xuất của urê, ancaloit, cũng như các bazơ purin và pyrimidin, được gọi là nitơ phi protein.
Nitơ tổng số được tính bằng tổng của nitơ protein và nitơ phi protein Để định lượng nitơ protein, người ta thường sử dụng phương pháp Kjeldahl để xác định nitơ tổng số và nitơ phi protein, sau đó lấy hiệu số giữa hai dạng nitơ này và nhân với hệ số tương ứng.
3.1.1 Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl
Mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có sự tham gia của chất xúc tác Quá trình vô cơ hóa diễn ra thông qua các phản ứng cụ thể.
Oxi được hình thành trong quá trình oxy hóa các nguyên tố khác Khi các phân tử chứa nitơ tác dụng với H2SO4, chúng tạo ra NH3 Ví dụ, các protein bị thủy phân thành axit amin, trong đó cacbon và hydro của axit amin chuyển hóa thành CO2 và H2O, trong khi nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 NH3 sau đó kết hợp với H2SO4 dư để tạo thành (NH4)2SO4 hòa tan trong dung dịch.
Sau khi nitơ được vô cơ hóa thành muối amoni sunfat ((NH4)2SO4), một kiềm mạnh như NaOH hoặc KOH được sử dụng để chuyển đổi NH4+ thành NH3 tự do Quá trình này cho phép xác định lượng NH3 bằng phương pháp titration với axit.
(NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH Na 2 SO 4 + H 2 O + 2NH 3
2NH 4 OH + H 2 SO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 + H 2 O
Từ số ml axit dùng để chuẩn độ tính ra đƣợc nitơ toàn phần trong mẫu thử
3.1.2 Xác định nitơ phi protein Để xác định nitơ phi protein cần dùng dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitơ phi protein (ví dụ dung môi là etanol 70%) Tuy nhiên, trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại protein, vì vậy cần dùng chất kết tủa để tách phần protein hòa tan trong quá trình chiết rút Sau khi đã loại bỏ kết tủa dịch lọc chỉ còn dạng nitơ phi protein Đem vô cơ hóa dịch này và tiếp tục tiến hành xác định hàm lượng nitơ theo phương pháp Kjeldahl
3.1.3 Định lượng protein trong nguyên liệu
Nitơ tổng số bao gồm cả nitơ phi protein và nitơ protein Để xác định hàm lượng nitơ trong nguyên liệu, cần phải đo lường cả nitơ phi protein và nitơ tổng số.
Hàm lƣợng protein trong mẫu đƣợc tính theo công thức sau:
Protein (mg) = (N tổng số - N phi protein ) 6,25
Protein (mg) = (N tổng số - N phi protein ) 5,95
3.2 Định lượng protein hòa tan [8]
Phương pháp định lượng protein hòa tan bao gồm việc tách và kết tủa protein khỏi mẫu thử, sau đó xác định lượng nitơ trong kết tủa protein bằng phương pháp Kjeldahl.
3.2.1 Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp thông thường
Chiết protein từ thực phẩm bằng cách đun sôi với nước Kết tủa protein bằng
CuSO 4 trong môi trường kiềm Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch kết tủa bằng nước cất Định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp Kjedahl
Phương pháp dùng axit tricloacetic (theo Greenwald) [8]
Chiết protein từ thực phẩm bằng nước sôi và kết tủa protein bằng axit tricloacetic qua đêm Sau đó, tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc và rửa sạch kết tủa bằng axit tricloacetic loãng Cuối cùng, định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjeldahl.
Phương pháp sử dụng tananh (theo Mothes) [8]
Chiết xuất protein từ thực phẩm bằng cách sử dụng nước sôi và kết tủa protein bằng tananh Sau đó, tách kết tủa thông qua quá trình lọc bằng giấy lọc và rửa sạch kết tủa bằng nước cất Cuối cùng, tiến hành định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjeldahl.
Phương pháp sử dụng natrisulfat và cồn ở môi trường axit [8]
Kết tủa protein được thực hiện bằng dung dịch ntrisulfat bão hòa và cồn ở nhiệt độ 78 độ C trong môi trường axit Để định lượng phần nitơ phi protein trong dịch lọc, phương pháp Kjedahl được áp dụng Nitơ protein được tính bằng cách lấy nitơ tổng số trừ đi nitơ phi protein.
3.2.2 Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp so màu [8]
Trong môi trường kiềm protein kết hợp với Cu 2+ thành phức chất màu tím (phản ứng Biure)
Màu sắc của phức tỷ lệ với số lượng mạch peptid (-CONH-) của protein, gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin Bằng cách so sánh tỷ lệ màu của dãy chuẩn protein với mẫu thử protein tách ra từ thực phẩm qua máy quang kế ở bước sóng = 550 nm, có thể tính được hàm lượng protein hòa tan trong thực phẩm.
3.3 Định lượng protein tiêu hóa bằng pepsin [8]
Mẫu thực phẩm được trộn với men pepsin trong cốc thủy tinh và ủ ở nhiệt độ 37 – 40 độ C trong 48 giờ, thỉnh thoảng lắc đều Sau đó, lọc để tách phần không hòa tan, chứa protein không tiêu hóa bởi pepsin, và xác định lượng nitơ trong phần này bằng phương pháp Kjeldahl Nitơ của protein tiêu hóa bởi pepsin được tính bằng tổng nitơ trừ đi nitơ của phần không hòa tan.
3.4 Định lượng nitơ axit amin bằng phương pháp chuẩn độ
3.4.1 Định lượng nitơ formol (hóa sinh học ) [8]