Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch đối với Protein MBP-VT2eB trên heo.pdf

Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch đối với Protein MBP-VT2eB trên heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005

Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG THỊ THẢO UYÊN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005

LỜI CẢM ƠN

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập

- Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các Thầy Cô trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua luôn tận tình giảng dạy, giúp đỡ và động viên

- TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

- TS Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp HCM

- ThS Nguyễn Kim Dung cùng các anh chị thuộc phòng kiểm dịnh Vacxin, Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ trong thời gian thực hiện đề tài tại viện

- Anh Lê Quốc Thắng đã tạo điều kiện cho chúng tôi bố trí thí nghiệm tại trại

- Các Thầy Cô bộ môn Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã tận tình giúp đỡ

- Bạn Châu Thanh Duy, anh Vũ Lại Xuân Hiệp cùng tập thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên chúng tôi trong suốt thời gian làm đề tài Chân thành cảm ơn

Tháng 8 năm 2005 Trương Thị Thảo Uyên

TÓM TẮT

TRƯƠNG THỊ THẢO UYÊN, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO”

Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Hải

Sử dụng kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP-VT2eB pha trong keo phèn với liều 50µg/heo và 75µg/heo có lập lại và không lập lại gây đáp ứng miễn dịch trên heo Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên trên 25 cá thể với 5 lô thí nghiệm Sau đó thu kháng huyết thanh để định hiệu giá kháng thể theo 2 phương pháp: trung hòa độc tố trên tế bào vero và khuyếch tán kết tủa trên thạch

Kết quả thu được như sau:

- Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ở liều 50µg và 75µg/heo pha trong keo phèn là loại kháng nguyên an toàn với heo

- Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phương pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch

- Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phương pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero: huyết thanh phải bất hoạt trước khi thử nghiệm và không bổ sung sodium azid vào trong huyết thanh

- Liều tiêm 50µg và 75µg/heo có lập lại và không lập lại không tạo đủ lượng kháng thể để phát hiện bằng phương pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch và trung hòa độc tố trên tế bào vero

1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1

2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.4 PHẢN ỨNG TRUNG HÕA ĐỘC TỐ VEROTOXIN TRÊN TẾ BÀO

VERO 16

2.4.1 Sơ lược về tế bào Vero 16

2.4.2 Nguyên tắc phản ứng trung hòa độc tố 17

2.4.3 Đánh giá hiệu quả vacxin bệnh phù bằng phương pháp trung hoà độc tố verotoxin trên môi trường nuôi cấy tế bào vero 17

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 18

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 18

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18

3.4.6 Thực hiện phản ứng trung hòa độc tố 25

3.5 Các chỉ tiêu theo dõi 26

4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 CÁC TRIỆU CHỨNG CỦA HEO SAU KHI TIÊM VACXIN 27

4.2 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH THEO PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA KHUYẾCH TÁN TRÊN THẠCH 27

4.2.1 Với kháng nguyên là độc tố của E coli H28 27

4.2.2 Với kháng nguyên MBP-VT2eB 28

4.3 LIỀU TCID50 CỦA DỊCH LỌC VI KHUẨN 27 4.4 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH TRÊN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

TẾ BÀO 30

4.4.1 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid chƣa bất hoạt 30

4.4.2 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid và có bất hoạt 31

4.4.3 Thí nghiệm chứng minh sodium azid gây chết tế bào vero 33

4.4.3.1 Mẫu huyết thanh có sodium azid 33

4.4.3.1 Đối với mẫu không có sodium azid 33

4.4.4 Đối với mẫu huyết thanh không có sodium azid và có bất hoạt 33

Bảng phân tích biến lƣợng tăng trọng heo thí nghiệm 41

Bảng 3 Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodium azid, có bất hoạt 42

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 1 Tăng trọng của heo thí nghiệm trong thời gian thí nghiệm 25

Bảng 2 Kết quả đo OD trên đĩa nuôi cấy tế bào với dịch lọc vi khuẩn 27

Bảng 3 Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodiumazid 42

Bảng 4 Kết quả đo OD620nm đối với mẫu không có sodiumazid 43

Hình 4.1 Kết quả dương tính với huyết thanh thỏ 26

Hình 4.2 Kết quả âm tính trên huyết thanh heo 26

Hình 4.3 Hình tế bào vero chết do sodium azid 33

Hình 4.4 Hình tế bào vero chết do độc tố 33

Hình 4.5Giếng đối chứng độc tố đã nhuộm 33

Hình 4.6 Giếng đối chứng tế bào đã nhuộm 33

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Độc tố verotoxin VT2e do E coli tiết ra là tác nhân chính gây bệnh phù trên

heo sau cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo ở nước ta

Việc sử dụng kháng sinh để điều trị phù ở heo tuy có hiệu quả nhưng gây ra nhiều triệu chứng phụ như rối loạn tiêu hoá, tạo ra các chủng vi sinh vật kháng kháng sinh gây khó khăn cho những lần trị bệnh về sau Do đó sử dụng vacxin để phòng bệnh

phù do E coli trên heo được xem là liệu pháp thích hợp nhất Một số tác giả đã thử

nghiệm vacxin nhược độc, hoặc vacxin chết bước đầu ghi nhận hiệu quả bảo vệ nhất định Tuy vậy, các phản ứng phụ vẫn là những trở ngại lớn cho việc áp dụng rộng rãi những loại vacxin này Vacxin tái tổ hợp được tạo ra bằng cách loại bỏ yếu tố gây bệnh của vi sinh vật mà vẫn giữ được đặc tính kháng nguyên của chúng đang được các nhà khoa học quan tâm nhằm khắc phục những nhược điểm nói trên

Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra

được E coli mang gen mã hoá cho tiểu phần B của độc tố VT2e và tinh sạch được

protein này Từ thực tế đó, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, với

sự hướng dẫn của TS Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên heo ”

1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU

- Mục tiêu

Đánh giá khả năng ứng dụng protein tái tổ hợp MPB-VT2e trong sản xuất vacxin

phòng bệnh phù do E coli trên heo

- Yêu cầu

 Xây đựng thí nghiệm kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của MBP-VT2eB trên heo

 Định tính kháng huyết thanh bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch

 Kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng MBP-VT2eB bằng phương pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero

b Tính chất của kháng nguyên

vào:

Trọng lượng phân tử : kháng nguyên phải có trọng lượng phân tử đạt tối thiểu là 10.000Da Tuy nhiên có một số chất có trọng lượng phân tử nhỏ nhưng có tính sinh miễn dịch vì chúng gắn với protein khác để trở thành kháng nguyên hoàn chỉnh, ngược lại một số chất có trọng lượng phân tử lớn nhưng không có tính sinh miễn dịch

Lượng epitope khác loài vì hệ thống miễn dịch không phản ứng với các epitope cùng loài

Tính đặc hiệu của kháng nguyên do những epitope quyết định Các epitope là vị trí để kháng thể hay các lympho T mẫn cảm gắn với kháng nguyên một cách đặc hiệu

Tính đặc hiệu của kháng nguyên rất nghiêm ngặt tuy nhiên đôi khi vẫn xảy ra hiện tượng hai kháng nguyên khác nhau có thể cho phản ứng chéo nhau

2.1.2.2 Kháng thể[4]

a Định nghĩa

Kháng thể (immunoglobin Ig) là protein dạng cầu được tổng hợp bởi tế bào lympho và tế bào plasma khi bị kích thích bởi kháng nguyên Nó được tạo ra để giúp sinh vật chống đỡ các yếu tố kháng nguyên có hại vào cơ thể

b Cấu trúc tổng quát của kháng thể

Phân tử immunoglobulin gồm một hay nhiều đơn vị hình thành, chúng có cấu trúc tương đối giống nhau Mỗi đơn vị là một phân tử protein có 4 chuỗi polypeptit giống nhau từng đôi một: 2 chuỗi nhẹ và 2 chuỗi nặng, chúng được nối với nhau bằng những cầu nối disulfua

Kháng thể được cấu tạo từ hai loại chuỗi polypeptit là chuỗi nặng và chuỗi nhẹ

Các chuỗi nhẹ bao gồm hai dạng κ, λ, hai dạng này chung cho tất cả các loại kháng thể Các chuỗi nhẹ đều được cấu tạo từ hai phần:

amin tương đối không đổi

trong vùng này thay đổi từng nhóm một, rất khác nhau từ cá thể này đến cá

thể khác và ngay trong một cá thể, phần này được kí hiệu Vκ (cho type

Có các kiểu chuỗi nặng như: µ, δ, γ1, γ2, γ3, γ4, α, ε và dạng của chuỗi nặng sẽ qui định phân loại lớp như IgM, IgD, IgG, IgA, và IgE và dưới lớp như IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 (5) Các chuỗi nặng được cấu tạo từ hai vùng: vùng hằng định (CH) và vùng dễ biến đổi (VH), các vùng dễ biến đổi có khu vực tận cùng là N Các vùng dễ biến đổi bao gồm 3 vùng siêu biến (hypervariable) được tách biệt bằng các vùng bảo thủ hơn (framework regions) ở giữa Những vùng này là những vùng liên kết với kháng nguyên hay còn gọi là paratop, vì vậy nó còn được gọi là vùng định tính bổ sung (complementarity-detemining regions) [15] Vùng nằm giữa CH1 và CH2 của chuỗi H đựơc gọi là vùng khớp hay vùng bản lề đảm bảo cho tính mềm dẻo của các phân tử kháng thể đồng thời là hai cánh tay (VL, CL, VH, CH1) di động trong không gian

2.1.2.3 Cơ chế đáp ứng miễn dịch

Khi cơ thể đã được miễn dịch thì khi tác nhân gây bệnh xâm nhập, chúng sẽ không thực hiện đựơc quá trình gây bệnh và nhanh chóng bị loại trừ khỏi cơ thể Như vậy vacxin là yếu tố khởi phát của quá trình đáp ứng miễn dịch và kháng nguyên là thành phần cơ bản của vacxin Khi đưa vacxin vào cơ thể cũng có nghĩa là đưa một loại kháng nguyên lạ vào cơ thể, kháng nguyên này sẽ kích thích cơ

Hình 2.1 Cấu trúc kháng thể

(Timothy G Standish, 2003)

thể thú sản xuất ra một loại protein mới có chức năng bảo vệ và tham gia miễn dịch là kháng thể (antibody)

Như vậy việc tiêm vacxin vào cơ thể thú chính là việc tập dượt cho cơ thể thực hiện quá trình đáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh khi chúng xâm nhập vào những lần sau đó Hay còn gọi là gây miễn dịch chủ động

Khi cơ thể tiếp nhận vacxin, miễn dịch được tạo ra chính là sự huy động toàn bộ hệ thống miễn dịch tham gia Bao gồm hệ thống miễn dịch trung ương, hệ thống miễn dịch ngoại biên và nhiều loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác Do đó quá trình đáp ứng miễn dịch chính là sự hoạt động của hệ miễn dịch, là sự phối hợp nhịp nhàng của hệ thống tủy xương nhằm tạo ra các loại tế bào nguồn, rồi từ đó chuyển hóa thành các tế bào có thẩm quyền miễn dịch bao gồm tế bào lympho B, lympho T, đại thực bào và một số tế bào chuyên biệt khác Đáp ứng miễn dịch còn được hổ trợ và tham gia của các cơ quan như hạch, lách, các mô lymphô đường ruột, đường hô hấp, cũng như tế bào tua (dendric cells), các tế bào trình diện kháng nguyên (antigen presenting cells-APC) và một số thành phần khác

Cả hai quá trình cá thể thu nhận được: miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian tế bào chính là hệ quả của sự tiếp nhận kháng nguyên, hoạt hóa, biệt hóa và sự tham gia của các tế bào lympho B, lympho T

Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể do tế bào lymphô B đảm nhận Từ tế bào nguồn tủy xương biệt hóa thành tế bào lympho B khởi thủy (pro-B) sau đó thành tiền lymphoB (pre- B) Tiếp theo các tế bào này sẽ được biệt hoá thành lympho B chưa chín có bộc lộ bề mặt IgM Sau đó lympho B chín muồi đã bộc lộ IgM và IgD bề mặt Nếu lympho B chín không gặp kháng nguyên sẽ bị phân hủy Lympho B khi gặp kháng nguyên và được sự hợp tác hổ trợ của lympho T giúp (helper T for B cell) hoặc hợp tác giúp đỡ của lympho T hổ trợ sẽ tiếp tục được biệt hóa thành nguyên bào (B-blast) và tế bào plasma (plastmocyte) Chỉ có tế bào plasma mới có khả năng tiết kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên lạ Các kháng thể này đi vào máu và tồn tại trong huyết thanh hoặc chất dịch của cơ thể Mặt khác nguyên bào B sẽ trở thành tế bào B ghi nhớ (memory- B) để khi gặp kháng nguyên vào nhắc nhở, chúng có thể nhanh chóng nhớ lại và sản xuất kháng thể nhanh và nhiều hơn [5]

Miễn dịch trung gian tế bào do tế bào lympho T đảm nhận Các tế bào nguồn bắt đầu từ tủy xương di tản xuống tuyến ức và được tuyến ức huấn luyện, biệt hóa rồi non hóa trở lại để trở thành tiền lympho T Các tiền lympho T tiếp tục được biệt hóa thành ở vùng vỏ tuyến ức để trở thành lympho T chưa chín Các lympho T chưa chín được biệt hóa tiếp tục để trở thành lympho T chín đi vào hệ máu ngoại vi và đi đến các cơ quan tổ chức khác cư ngụ tại các vùng phụ thuộc tuyến ức của lách và hạch Khi đại thực bào đưa thông tin kháng nguyên đến các lympho T tiếp nhận, rồi biệt hóa để trở thành nguyên bào lympho T rồi tiếp tục trở thành nhóm tế bào mẫn cảm với kháng nguyên có chức năng như một kháng thể đặc hiệu Như vậy kháng thể tế bào là loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch lympho T đã được biến đổi, biệt hóa trở thành tế bào gây độc có tác dụng tiêu diệt kháng nguyên Đặc biệt, lympho T sau khi được biệt hóa tiếp xúc với kháng nguyên đặc hiệu còn có khả năng sản xuất một số chất dịch ngoại bào [1] Các chất này có tác dụng trợ giúp đắc lực và tăng cường quá trình đáp ứng miễn dịch còn được gọi là lymphokin, đặc trưng là các loại cytokine (gồm các loại interleukin IL-1, IL-2 ), chemokin và các yếu tố gây hoại tử tế bào (TNF) Một số nguyên bào T mẫn cảm cũng trở thành “ tế bào nhớ”, có vai trò trong “trí nhớ miễn dịch” Ngoài ra còn có một số tế bào T khác làm nhiệm vụ duy trì đáp ứng

Để tạo khả năng phòng hộ có hiệu quả cho cơ thể thú thì vacxin phải đảm bảo các yêu cầu sau:

hại trên cơ thể của thú

được chọn làm vacxin mà không bị nhiễm tạp các loại khác

lực thực chất là mức độ biểu hiện gây miễn dịch của kháng nguyên Vacxin có hiệu lực cao hay thấp, tức là nói đến mức độ gây miễn dịch của vacxin

Khả năng phòng hộ của vacxin phụ thuộc vào yếu tố quyết định tính miễn dịch của chế phẩm Yếu tố này chính là thành phần protein đặc biệt có trên bề mặt

của tác nhân gây bệnh hay trên bề mặt của chế phẩm vacxin của chính tác nhân gây bệnh đó Thành phần này còn được gọi là kháng nguyên do một gen hay một số gen của vi sinh vật tổng hợp nên Những gen này được gọi là gen kháng nguyên Người ta có thể clone gen này và chuyển vào một hệ thống vectơ thích hợp để sản xuất ra loại protein của gen kháng nguyên làm vacxin Protein này còn được gọi là protein tái tổ hợp dùng sản xuất vacxin tái tổ hợp [3]

2.1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch [4]

Bản thân túc chủ

Những loài khác nhau thì khả năng đáp ứng miễn dịch khác nhau Ở những cá thể khác nhau thì tính sinh miễn dịch cũng khác nhau, do:

tuyển chọn những nhóm giống có khả năng đáp ứng miễn dịch cao Tùy cơ địa của từng cá thể mà có thể có hiện tượng dị ứng khi gây miễn dịch

thống cơ quan miễn dịch của thú chưa phát triển hoàn chỉnh Hơn nữa những thú nhỏ đều có kháng thể do mẹ truyền nên những kháng thể này có thể trung hòa kháng nguyên đưa vào

cao hơn những thú bị bệnh hay sức khỏe yếu Do đó chỉ gây miễn dịch với những thú có sức khỏe tốt , không mắc các bệnh truyền nhiễm khác

dịch tốt hơn những thú không được chăm sóc tốt Kháng nguyên

Đáp ứng miễn dịch xảy ra khi có sự khác biệt chủng loài giữa kháng nguyên và túc chủ Khả năng đáp ứng miễn dịch tăng khi kháng nguyên càng lạ

Kháng nguyên có bản chất protein hay polysaccharide thì khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao cả khi chúng ở dạng hòa tan hay trong cấu tạo phức tạp Các kháng nguyên được tổng hợp từ một loại axit amin thì khả năng kích ứng miễn dịch thấp hơn so với những kháng nguyên được tổng hợp từ hai loại axit

amin và từ những axit amin mạch vòng (đặc biệt là tyrozine) Các polypeptide được tổng hợp từ axit amin dạng D thì khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao vì ít bị biến đổi

Các kháng nguyên có bản chất là lipit, steroid, axit nucleic khả năng kích ứng miễn dịch thấp hay không có trừ khi chúng được gắn với protein tải

Kháng nguyên có kích thước càng lớn và cấu trúc càng phức tạp thì khả năng kích ức miễn dịch càng cao vì một phân tử kháng nguyên càng lớn thì nó càng có cấu trúc phức tạp và có nhiều quyết định kháng nguyên Đây là yếu tố đảm bảo tính sinh miễn dịch

Hơn nữa kháng nguyên có cấu trúc phân tử càng lớn thì càng dễ bị đại thực bào phát hiện và xử lý nên nó khả năng kích ứng miễn dịch cao Những kháng nguyên có cấu trúc phân tử nhỏ dễ bị đại thực bào bỏ qua nên khả năng kích ứng miễn dịch thấp

Cách gây miễn dịch và liều lượng kháng nguyên

mạnh, đưa kháng nguyên vào đường mạch máu có thể dễ dàng gây đáp ứng miễn dịch: như vi khuẩn, virus, tế bào Những kháng nguyên hòa tan thì phải có quy trình gây miễn dịch thích hợp tốt nhất là đường tiêm trong da, dưới da

đủ gây đáp ứng miễn dịch Ngược lại nếu lượng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch

phân tử kháng nguyên Cùng một loại kháng nguyên nếu gây miễn dịch trên hai qui trình khác nhau thì khả năng gây đáp ứng miễn dịch khác nhau Mỗi một loại kháng nguyên thích hợp với một qui trình gây miễn dịch riêng Đối với những kháng nguyên yếu thì phải tuân theo một qui trình miễn dịch nghiêm ngặt và phải chủng nhiều lần mới có hiệu quả Trong khi đó những kháng nguyên mạnh thì chỉ cần chủng một lần

Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên

loại kháng nguyên cùng lúc cho thú thì lượng kháng thể đặc hiệu sinh ra tương

ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng hay nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình Đây là hiện tượng cộng lực kháng nguyên Tuy nhiên đối với những kháng nguyên có cấu trúc hóa học gần giống nhau thì xảy ra hiện tượng cạnh tranh kháng nguyên Nếu cùng một lúc mẫn cảm hai loại kháng nguyên: một liều mạnh, một liều nhẹ thì thú có thể chỉ phản ứng với kháng nguyên liều mạnh

Phản ứng thứ phát

kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều hơn nếu thú gặp lại kháng nguyên đó Đó là nhờ tế bào lympho có khả năng nhớ để khi gặp lại kháng nguyên đó thì sẽ lập tức tăng sinh thành dòng tế bào có hoạt tính miễn dịch

Chất bổ trợ

nguyên Vì tá chất tăng khả năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên, tăng khả năng tồn tại của kháng nguyên trong cơ thể thú và gây phản ứng viêm không đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn dịch

2.1.3 Phân loại

Có nhiều cách để phân loại vacxin như dựa theo phương pháp sản xuất, bản chất sinh học của kháng nguyên hay nguồn cung cấp kháng nguyên Nếu phân loại theo tính chất sinh học thì vacxin được phân làm 3 nhóm sau:

2.1.3.1 Vacxin sống (lived vaccine)

Vacxin cường độc [4]

Đây là loại vacxin được lấy từ những chủng vi sinh vật gây bệnh có độc lực cao Tuy nhiên, các nhà miễn dịch học đã dùng số lượng rất nhỏ để vi sinh vật không đủ sức gây bệnh nhưng lại gây được đáp ứng miễn dịch Hiện nay,vacxin này không còn được sử dụng vì độ an toàn không cao

Vacxin nhược độc (attenuated vaccine)[4]

Vacxin nhược độc được tạo ra từ những chủng vi sinh vật có độ lực thấp hoặc từ những chủng vi sinh vật có độc lực cao được làm yếu đi để chúng không có khả năng gây bệnh mà vẫn giữ được đặc tính kháng nguyên Các chủng vi sinh vật này được tạo ra bằng cách nuôi các chủng vi sinh vật có độc lực cao trong môi

trường không thích hợp, các vi sinh vật này sẽ thích nghi dần dần và trở thành không độc Vì vi sinh vật vẫn còn sống và có khả năng sinh sản trong cơ thể kí chủ nên nó kích thích các tế bào nhớ sản xuất kháng thể liên tục Tuy nhiên, số lượng vi sinh vật phát triển trong cơ thể kí chủ khó có thể kiểm soát và trong một số trường hợp các vi sinh vật có thể phục hồi gây bệnh Vacxin này không nên dùng cho những con thú bị suy giảm miễn dịch Hiện nay, người ta dùng một số phương pháp công nghệ sinh học để loại bỏ gene gây bệnh để tạo ra vacxin an toàn hơn

2.1.2.2 Vacxin vô hoạt (inactivated vaccine)

Tác nhân gây bệnh sẽ bị giết hay bất hoạt bằng phóng xạ, formalin, nhiệt độ không còn khả năng nhân lên trong vật chủ nhưng vẫn đảm bảo đặc tính kháng nguyên của chúng Vacxin này an toàn hơn so với vacxin sống, dễ sản xuất và sử dụng Tuy nhiên nó không có khả năng hoặc nếu có thì rất ít kích thích tế bào T gây độc và phải sử dụng lập lại nhiều lần

2.1.2.3 Vacxin phân tử

a Vacxin kết hợp (conjugate vaccine)[10]

Người ta chỉ sử dụng những phần của tác nhân gây bệnh có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch như protein hay carbonhydrate Các vi sinh vật gây bệnh sẽ bị phá vỡ từng phần và các thành phần sẽ được tinh sạch Người ta chỉ sử dụng một vài thành phần để tiêm Bằng cách này người ta sẽ tránh được những nguy cơ tiềm ẩn của độc tố và những thành phần che khuất kháng nguyên ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch bị loại bỏ Tính chất kháng nguyên của các thành phần này phải được kiểm tra khả năng tạo đáp ứng miễn dịch chính xác và hiệu quả

Dựa trên hiện tượng một số vi khuẩn bị đột biến mất vỏ thì không có khả năng gây bệnh, người ta đã dùng vỏ polysaccharide như một kháng nguyên để làm vacxin Tuy nhiên polysaccharide là những kháng nguyên độc lập với tế bào T (T-independent antigenes) Do đó khả năng nhớ là không có hay nếu có thì rất thấp và việc tiêm lập lại nhiều lần để tăng hàm lượng kháng thể cũng không hiệu quả Người ta sử dụng thêm protein mang để liên kết với đường Việc này sẽ chuyển kháng nguyên độc lập với tế bào T thành kháng nguyên phụ thuộc tế bào T nhờ việc tạo ra những epitope của tế bào T

Kỹ thuật này đã thành công trên những loại vacxin viêm gan B,viêm gan A,

Salmonella typhi

b.Vacxin tái tổ hợp (recombinant vaccine)[17]

Cùng với sự tiến bộ vượt bậc của các kỹ thuật sinh học phân tử, xu hướng sản xuất vacxin tái tổ hợp ngày càng được ứng dụng rộng rãi Việc sản xuất vacxin bằng các công nghệ truyền thống có nhiều hạn chế không chỉ do tính an toàn mà còn do nhiều tác nhân gây bệnh không thể nuôi cấy trên qui mô lớn Gen mã hóa cho protein immunoprotective (những kháng nguyên tạo ra phản ứng miễn dịch tự nhiên) trên vi sinh vật gây bệnh sẽ được clone Những gen này sau đó được tái tổ hợp với DNA của một vector của loài vi khuẩn hay virus khác, thường là plasmid rồi được đưa vào tế bào vi sinh vật tạo nên dòng vi sinh vật tái tổ hợp Những vi sinh vật tái tổ hợp này sẽ được nuôi cấy trong các bình lên men lớn để có thể thu được lượng lớn protein tái tổ hợp mà sau đó sẽ được tinh sạch dễ dàng Bằng kỹ thuật này người ta có thể sản xuất vacxin trên qui mô công nghiệp với giá thành

thấp Hiện nay, người ta đã thành công trong việc sản xuất vacxin hepatitis B, B pertussis, bằng phương pháp này Tuy nhiên việc nghiên cứu vacxin này đòi hỏi

tốn nhiều thời gian, tài chính, trang thiết bị đắt tiền

Người ta cũng có thể dùng kỹ thuật công nghệ sinh học để loại bỏ những gen mã hóa cho những protein “không cần thiết” Do đó có thể làm giảm tính độc của vi sinh vật

c.Vacxin peptide tổng hợp [17]

Hướng sản xuất vacxin này phát triển nhanh nhờ sự tiến bộ của kỹ thuật tạo dòng và giải trình tự của DNA Người ta nghiên cứu các cấu trúc không gian và trình tự của các epitope của kháng nguyên được nhận biết bởi tế bào B và tế bào T Nhóm này có thành phần vào khoảng 8-12 axit amin Sau khi được tổng hợp các axit amin này phải được gắn vào giá đỡ, thường là các hạt polyme có khả năng hấp phụ cao và sử dụng chung với các loại chất bổ trợ tốt Ưu điểm của loại vacxin này là an toàn, ổn định, dễ bảo quản và vận chuyển Tuy nhiên việc sản xuất vacxin này đòi hỏi kỹ thuật cao

d.Vacxin DNA [17]

Khi đưa DNA của một loại plasmid vectơ có chứa gen kháng nguyên vào cơ thể thì thấy có hiện tượng gen kháng nguyên đó tổng hợp ra protein kháng nguyên

và kích thích cơ thể sinh miễn dịch chống lại protein do gen kháng nguyên kích thích sinh ra Dựa trên hiện tượng này, người ta tạo ra vacxin DNA bằng cách tái tổ hợp gen kháng nguyên của một plasmid vectơ với một hệ thống promotor mạnh Loại kháng nguyên này sẽ kích hoạt tiết interleukin 12 Interleukin này sẽ tác động vào những tế bào chết tự nhiên gây phân tiết interferon-g kích thích sự phát triển của tế bào trợ giúp T Vacxin này có ưu thế lớn với phương thức gây miễn dịch đơn giản, bền với nhiệt độ do chỉ chứa DNA thuần khiết.Vacxin DNA an toàn đối với những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch Tuy nhiên việc đưa một DNA lạ vào cơ thể đôi khi gặp nguy hiểm do sự nhạy cảm của tế bào miễn dịch đối với chính DNA đó

e.Vacxin phối hợp với công nghệ chuyển gen thực vật[3]

Nhờ công nghệ gen người ta có thể chuyển nhiều gen quý giá vào hệ gen thực vật tạo nên nhiều loại cây có khả năng sản xuất ra nhiều sản phẩm có giá trị

thông qua hệ thống plasmid Ti và Agrobacter tumefaciens Dựa vào cách này

người ta đã chuyển một hay nhiều gen kháng nguyên của vacxin động vật và người vào thực vật, thường chú trọng vào những loại cây thực phẩm Nhờ đó có thể thu được vacxin thông qua thực vật

Ưu điểm của vacxin này là an toàn, dễ sử dụng Tuy nhiên, việc tạo vacxin này đòi hỏi kỹ thuật cao

2.2 BỆNH PHÙ VÀ ĐỘC TỐ VT2e

Bệnh phù ở heo xuất hiện ở heo sau cai sữa với các triệu chứng phù ở nhiều vị trí như: mi mắt, sống mũi và trán, thành dạ dày, màng treo ruột và cuối cùng rối loạn thần kinh Bệnh này liên quan độc tố VT2e không bền nhiệt được tạo ra bởi một vài

chủng E coli như: O138:K81; O139:K82; O141: K85 [11] Độc tố này tác động lên

các tế bào ruột, đồng thời chúng cũng tác động lên nội mô thành mạch máu, hậu quả là làm giảm sự hấp thu do các tế bào nhung mao ruột bị tổn thương Sự hư hại của các tế bào nội mô mạch máu sẽ gây ra triệu chứng xuất huyết (Nguyễn Ngọc Hải, 1999) Lượng độc tố cần thiết để có thể dẫn đến các triệu chứng và các thương tổn thần kinh

tiêm tĩnh mạch là 3ng/kg thể trọng (MacLeod và cộng sự, 1991)

VT2e hay còn gọi là SLT-IIv là nhóm độc tố vero, được Konowalchuk và cộng

sự đặt tên đầu tiên năm 1977 Độc tố này chung họ với nhóm của Shigella và có đặc

trưng gây độc trên môi trường nuôi cấy tế bào vero (African green monkey kidney) hơn là trên tế bào Hela, do đó còn được gọi là độc tố VT2e Độc tố VT2e bị trung hòa một phần bởi kháng thể của SLT-II và không bị trung hòa bởi kháng thể của SLT-I VT2e được cấu tạo từ hai thành phần: một đơn vị A nặng 32kDa và năm đơn vị B (7.7kDa/ đơn vị) Tiểu phần A mã hóa cho enzyme RNA N-glycosidase Enzyme này sẽ phân cắt một liên kết N-glycosidic trên tiểu phần 28S của rRNA Sự phân cắt này sẽ làm sai hỏng yếu tố kéo dài EF1 (elongation factor 1) liên kết aminoacyl-tRNA với tiểu phần 60S của RNA ribosome Do đó ức chế sự tổng hợp protein và gây chết tế bào Những tiểu phần B chịu trách nhiệm cho khả năng kết dính những thụ thể bản chất glycolipid có sẵn trên bề mặt của tế bào ruột cũng như trên các tế bào vero Các độc tố SLT-I và SLT-II chỉ liên kết với Gal 1-4Gal -4Glc 1-1Cer (globotriosyl ceramid- Gb3), trong khi độc tố VT2e liên kết với cả Gb3 và GalNAc 1-3Gal 1-4Gal 1-4Glc 1-Cer (globotetraosyl ceramid-Gb4), Gal 1-3GalNAc 1-3Gal 11-4Gal 1-aGlc 1-1Cer (globopenosyl- Gb5) trên tế bào vero [13] Các tế bào của lớp nội mô ở heo nhạy cảm với độc tố VT2e Và độc tố này gây ra những tổn thương chủ yếu trên lớp nội mô của mạch máu, làm biến đổi khả năng thấm của mạch máu và hậu quả gây nên chứng phù

Năm 1988, trình tự của một operon mã hóa cho độc tố VT2e đã đựơc báo cáo Trình tự axit amin của tiểu đơn vị A của VT2e dài hơn một axit amin và tương đồng 94% so với SLT-II Trong khi tiểu đơn vị B của VT2e ngắn hơn hai axit amin, và tương đồng 87% với SLT-II [7]

Việc phòng bệnh phù nhờ vacxin dựa vào độc tố VT2e cũng đã được nghiên cứu MacLeod và Gyles đã chứng minh được khả năng bảo vệ heo con bằng cách tiêm tĩnh mạch độc tố VT2e bị vô hoạt bởi glutaraldehyde Gordon và cộng sự đã phát hiện độc tố VT2e sau khi xử lý với formaldehyde có thể tạo miễn dịch trên heo con [9] Tuy

nhiên cách này có thể gây tồn dư độc tố in vivo Người ta cũng có thể sử dụng một

kháng nguyên từ độc tố VT2e đã bị thay đổi một axit amin (Glu167 >Gln) trên vùng hoạt động của tiểu đơn vị A Việc miễn dịch này có thể bảo hộ cho heo con khỏi bệnh phù bằng đường miệng và không tạo các phản ứng phụ [7] Tuy nhiên, cho đến nay

vẫn chưa thấy loại vacxin dựa vào độc tố VT2e nào hiệu quả trong việc phòng chống bệnh phù trên heo

2.2 PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB[6]

Protein MBP-VT2eB là protein tái tổ hợp được tổng hợp từ gen MPB-VT2eB có trọng lượng phân tử 47kDa Gen này được mang bởi vectơ pMal-c2X chứa trong chủng E coli DH5 do TS Nguyễn Ngọc Hải tạo ra tại Pháp

Gen MPB-VT2eB được cấu thành từ gen mục tiêu VT2eB và gen MBP có sẵn trong vectơ pMal-c2X Trong đó gen VT2eB mã hóa cho tiểu phần B của độc tố

VT2eB Tiểu phần B qui định khả năng kết dính của độc tố đối với các thụ thể có bản chất glycolipid trên tế bào đích Do đó protein tiểu phần B không có khả năng gây bệnh và mang đặc tính kháng nguyên cho độc tố này Việc gắn kết gen mục tiêu với

gen MBP sẽ tạo nên hệ thống protein dung hợp với MBP (maltose binding protein) Hệ

thống này sẽ biểu hiện khi gen được cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) và tổng hợp protein dung hợp mang protein MPB ở đầu amin và protein mục tiêu ở đầu carboxyl Protein sinh ra sẽ tích lũy trong vùng chu chất (periplasm) nằm giới hạn giữa màng trong và màng ngoài của vi khuẩn MPB có trung tâm cơ chất có ái lực cao đối với maltose và amylose, do đó có thể tinh sạch được protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với MPB thông qua sắc ký ái lực Ngoài ra, trên protein tái tổ hợp còn mang vị trí nhận biết đặc hiệu của một protease, do đó có thể phân cắt protein mục tiêu dễ dàng Hệ thống gen chung VT2eB-MPB được mang bởi vectơ plasmid pMal-C2X Gen mục

tiêu VT2eB sẽ được tái tổ hợp với gen malE nhờ các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn trên các polylinker Gen malE qui định cho việc tổng hợp protein MBP và hoạt động dưới sự kiểm soát của gen khởi động ptac Gen này được hoạt hóa bởi IPTG Do đó khi có mặt IPTG, gen ptac sẽ kích ứng sự tổng hợp protein tái tổ hợp MBP-VT2eB

Protein này sẽ được tinh sạch bằng cách cho qua các cột sắc ký mang hạt amylose Protein mục tiêu có ái lực với amylose sẽ được giữ lại Sau đó, tiếp tục cho dung dịch đệm maltose chạy qua cột sắc ký sẽ thu được protein này

Cấu trúc phân tử của agar

Cấu trúc phân tử đặc trưng của agar hay agarose cho phép các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 200 kDa khuyếch tán dễ dàng qua các khoảng trống giữa chúng Nhờ vậy mà các phân tử kháng nguyên hay kháng thể có thể khuyếch tán qua gel tùy theo nồng độ ban đầu và bán kính Stoke, trong khi đó những phân tử ở dạng kết hợp có kích thước lớn sẽ không thể di chuyển

Liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể

Kháng nguyên liên kết với epitop kháng thể thông qua vị trí paratop theo nguyên tắc bổ sung không gian tương tự liên kết giữa “ổ khóa- chìa khóa” Sự liên kết được thiết lập và duy trì là nhờ các lực hấp dẫn có năng lượng nhỏ như:

trong các chuỗi polypeptit

Sự liên kết giữa các kháng nguyên- kháng thể là một phản ứng phát nhiệt, giải phóng ra năng lượng từ khoảng 2- 40Kcal/mol Sự liên kết giữa kháng nguyên- kháng thể là một phản ứng cân bằng, có thể được biểu diễn như sau:

2.3.2 Định tính kháng nguyên- kháng thể bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch

Các thử nghiệm này được thực hiện bằng cách cho kháng nguyên hay kháng thể vào các giếng nhỏ được cắt trên agar hay agarose Dung dịch kháng nguyên hay kháng thể chuẩn được cho vào các giếng trung tâm, kháng thể hay kháng nguyên cần tìm sẽ được cho vào các giếng xung quanh Chúng sẽ khuyếch tán trong thạch Nếu chúng gặp nhau ở cùng một tỉ lệ tương đương thì sẽ tạo nên một vạch có thể quan sát bằng mắt thường

2.4 PHẢN ỨNG TRUNG HÕA ĐỘC TỐ VEROTOXIN TRÊN TẾ BÀO VERO 2.4.1 Sơ lược về tế bào vero

Dòng tế bào biểu mô vero nhạy cảm với độc tố SLT được Y Yasumura và Y Kawakita phát hiện đầu tiên vào năm 1962 ở trường đại học Chipa (Nhật Bản) Tế bào này thu được từ mô tế bào thận khỉ Châu Phi trưởng thành (African green

monkey) (Cercopithecus) [13] Dòng tế bào này có nhiều Gb3 và Gb4 trên màng tế

bào chất do đó nên chúng được dùng để phát hiện các VT2e Người ta có thể phát hiện sự hiện diện của SLT trong mẫu thông qua việc ủ dịch này trên môi trường nuôi cấy tế bào vero đơn lớp mỏng Thông thường các thử nghiệm được tiến hành trên những đĩa polystyren 96 giếng Việc phát hiện sự hiện diện của độc tố này dựa trên sự phân tách tế bào vero sau khi ủ 48-72 giờ

Hình 2.2 Liên kết kháng nguyên- kháng thể

2.4.2 Nguyên tắc phản ứng trung hòa độc tố [4]

Khi kháng thể đặc hiệu gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm mất hoạt tính của độc tố Do đó độc tố không còn gây độc đối với cơ thể động vật Phản ứng đó được gọi là phản ứng trung hòa độc tố

Huyết thanh chứa kháng thể kháng độc tố là huyết thanh kháng độc tố Người ta có thể định hiệu giá kháng thể kháng độc tố dựa trên phản ứng trung hòa xảy ra khi kháng độc tố kết hợp với độc tố tương ứng

2.4.3 Đánh giá hiệu quả vacxin bệnh phù bằng phương pháp trung hoà độc tố verotoxin trên tế bào vero

Phương pháp trung hòa độc tố verotoxin trên tế bào vero được sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá hiệu giá của kháng huyết thanh mang kháng thể của độc tố vero Nguyên tắc của phản ứng này như sau:

Trên tế bào vero, độc tố verotoxin sẽ liên kết với các thụ thể đặc hiệu có trên màng tế bào rồi cản trở sự tổng hợp protein của tế bào gây chết tế bào Nếu độc tố này được ủ với kháng huyết thanh chứa kháng thể của độc tố này, thì kháng thể có trong huyết thanh sẽ liên kết với độc tố làm bất hoạt độc tố và tế bào không bị chết Dựa trên sự quan sát độ phân tách của tế bào người ta có thể biết được là nó chết hay không Căn cứ trên nồng độ huyết thanh trung hòa được lượng độc tố ở liều

của vacxin

Protein MBP-VT2eB được tạo ra dựa trên tiểu phần B của độc tố VT2e qui định khả năng liên kết với các thụ thể đặc trưng trên tế bào đích Do đó khi tiêm protein MBP-VT2eB trên heo thì heo sẽ tạo ra kháng thể chống lại tiểu phần B của độc tố VT2e Do đó, độc tố này không có khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên tế bào gốc nên mất khả năng gây bệnh Dựa trên phản ứng trung hòa độc tố verotoxin trên tế bào vero, có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh Nhờ đó đánh giá được khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein MBP-VT2eB trên heo