Luận văn tốt nghịêp Lời cảm ơn Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn Dơng Tuệ đã quan tâm hớng dẫn tận tình và giúp đỡ em trong suốt thời gian xây dựng và hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng thí nghiệm Di truyền Vi sinh, các thầy cô giáo trong khoa đã hết sức giúp đỡ, tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn này. Cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ, động viên của tất cả bạn bè đồng nghiệp trong suốt thời gian qua. Vinh, ngày 21 tháng 4 năm 2005 Sinh viên Lê Thị Linh Sinh viên: Lê Thị Linh Lớp 42B 1 - Sinh 1 Luận văn tốt nghịêp Phần I Đặt vấn đề Nitơ là nguyên tố dinh dỡng quan trọng đối với sinh vật trên trái đất. Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn. Nitơ phân tử chiếm 78,16% thể tích của không khí. Trong bầu khí quyển bao la của trái đất có tới khoảng 4x10 15 tấn nitơ. Nếu cây trồng có khả năng đồng hoá nó, lợng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồng tới hàng chục triệu năm. Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 10 25 x 10 9 tấn. Cây trồng không đồng hoá đợc trực tiếp nitơ hữu cơ. Nhờ quá trình phân giải của vi sinh vật, từ các hợp chất chứa nitơ giải phóng ra NH 3 , một nguồn dinh dỡng nitơ rất tốt đối với thực vật. Quá trình phân giải này gọi là quá trình amôn hoá. Nếu trong đất có đầy đủ oxy thì NH 3 sinh ra sẽ tiếp tục đợc vi sinh vật chuyển hoá thành nitrat. Quá trình này đợc gọi là quá trình nitrat hoá. Nitrat là hợp chất nitơ đợc thực vật hấp thu rất dễ dàng nhng cũng rất dễ bị rửa trôi xuống các lớp đất sâu hơn. Ngợc lại với quá trình nitrat hoá là quá trình phản nitrat hoá do vi sinh vật gây nên. Sau quá trình khử nitrat, nitrat sẽ chuyển thành nitơ phân tử bay vào không khí. Sự mất nitơ do quá trình phản nitrat hoá gây nên đợc bù đắp lại nhờ quá trình cố định nitơ, tức là quá trình chuyển hoá nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ. Các vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình này gọi là vi sinh vật cố định nitơ. (Đờng Hồng Dật, Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đờng, Nguyễn Thị Thanh Phụng, Trần Thị Cẩm Vân, Hoàng Lơng Việt, Vi sinh trồng trọt, 1979) [2]. Ngời ta nhận thấy rằng, hàng năm vi khuẩn nốt sần cộng sinh trong rễ cây bộ đậu có thể làm giàu thêm cho đất khoảng 50 600kg nitơ/ha. Qua đây ta thấy đợc vai trò vô cùng quan trọng của vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ đậu trong việc phục hồi lại nguồn dinh dỡng nitơ cho cây trồng. Đối với Việt Nam ,do sự tác động, khai thác không hợp lý của con ngời làm cho đất ngày Sinh viên: Lê Thị Linh Lớp 42B 1 - Sinh 2 Luận văn tốt nghịêp càng suy thoái, gần 50% diện tích đất đang trong tình trạng suy thoái nghiêm trọng. Để đối phó với thực trạng trên việc đa những cây trồng thuộc bộ đậu trồng ở những vùng đất thoái hoá bạc màu là cần thiết góp phần vào công cuộc cải tạo đất nông nghiệp hiện nay. Vi sinh vật cố định nitơ còn góp phần quan trọng trong việc tăng năng suất những cây trồng thuộc bộ đậu nh cây lạc, đậu tơng, đậu xanh trong đó cây lạc là một trong những cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao đối với nớc ta. Lạc là cây lấy dầu quan trọng nhất. Hạt lạc chứa trung bình 50% chất lipít, 22 25% Prôtêin. Lạc còn cung cấp một số vitamin và khoáng chất. Dầu lạc là một loại lipít dễ tiêu do chứa nhiều axit béo không no nh axit Linoic,Linoleic, Arachidonic, Olêic. Đây là những axit tạo nên vitaminF. Lạc là nguyên liệu quan trọng dùng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là chế biến dầu, từ dầu sẽ thúc đẩy các ngành công nghiệp khác nh công nghiệp xà phòng, mỹ phẩm, hoá học Lạc sau khi thu hoạch để lại cho đất một lợng đạm lớn do nốt sần của bộ rễ và do thân lá để lại, cho nên các cây trồng sau lạc đều sinh trởng tốt và cho năng xuất cao. Từ những dẫn liệu trên ta có thể thấy tầm quan trọng về kinh tế của cây lạc và việc nghiên cứu vi sinh vật cố định nitơ trên cây lạc là việc làm cần thiết. (Nguyễn Danh Đông, Giáo trình cây lạc, 1984 ) [7]. Theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1981) có nhiều phơng pháp để sử dụng vi khuẩn nốt sần nhng phơng pháp tốt nhất là nhiễm vi sinh vật cho hạt giống vì nếu phun cho cây trồng thì cứ 100m 2 phải 10 lít nớc và 1ha phải 10.000 lít nớc (10 tấn nớc). Nhng xử lý hạt giống ngay lúc thúc mầm thì hầu nh (với 30 lít thúc mầm/ha) không tốn kém gì mà lại có ngay vi khuẩn cố định nitơ ở hạt lạc, vì trong thực tế có vùng đất không có vi khuẩn cố định nitơ nên lạc là cây bộ đậu nhng vẫn phải bón phân đạm. Do thấy đợc vai trò to lớn của vi khuẩn nốt sần trong việc làm giàu dinh dỡng nitơ trong đất cho cây trồng và ảnh hởng đến sự sinh trởng, phát triển của Sinh viên: Lê Thị Linh Lớp 42B 1 - Sinh 3 Luận văn tốt nghịêp cây đặc biệt là cây lạc, cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu lớn. Chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm mục tiêu sau: 1. Phân lập đợc vi khuẩn nốt sần Rhizobium vigna ở lạc. 2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn nốt sần Rhizobium vigna. 3. Thử nghiệm vi khuẩn nốt sần đã phân lập đợc xử lý hạt giống trớc khi đem gieo, theo dõi sự nảy mầm và quá trình hình thành nốt sần ở thí nghiệm nhiễm vi khuẩn nốt sần và đối chứng. 4. Rèn luyện cho bản thân một số kỹ năng, thực hành, thí nhiệm, làm quen với phơng pháp nghiên cứu khoa học. Sinh viên: Lê Thị Linh Lớp 42B 1 - Sinh 4 Luận văn tốt nghịêp Phần II Tổng luận I. Sơ lợc về vi khuẩn nốt sần ở cây bộ đậu. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh với cây bộ đậu. Năm 1886 hai nhà khoa học Đức là H.Hellriegel và H.Wilfarth lần đầu tiên dùng thực nghiệm để chứng minh đợc rằng cây bộ đậu khác thực vật khác ở chỗ chúng có khả năng sử dụng nitơ trong không khí. Hai năm sau 1888 nhà khoa học Hà Lan M. W.Beijerinck đã phân lập đợc loại vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ cây thuộc bộ đậu (đậu Hoà Lan, đậu tằm, đậu thiên lý, đậu cô ve, đậu chân lùn ). Ông đặt tên cho loại vi khuẩn này Bacillus radicicola. Năm 1889 vi khuẩn này xếp vào một chi riêng là chi Rhizobium (B.Frank - 1889). Từ phát hiện này đã 108 năm . Trong hơn một thế kỷ qua ngời ta đã nghiên cứu khá kỹ về các loài vi khuẩn đặc biệt này cũng nh mối quan hệ cộng sinh giữa chúng và cây bộ đậu. Ngời ta đã miêu tả đợc 11.000 loài thuộc bộ đậu những chỉ mới điều tra về khả năng tạo thành nốt sần ở 1200 loài trong số này. Có khoảng 133 loài đợc chứng minh là không có khả năng tạo thành nốt sần (12/134 ở họ trinh nữ, 67/97 ở muồng và 57/969 ở họ đậu). Căn cứ vào các tài liệu hiện có thì vi khuẩn nốt sần khi còn non có tế bào hình que, kích thớc vào khoảng 0,5 0,9 x 1,2 3,0 à m, bắt màu đồng đều và có khả năng di động nhờ tiêm mao. Vi khuẩn nốt sần có loại đơn mao, có loại chu mao và cũng có loại tiêm mao mọc thành chùm ở gần đầu. Khi về già vi khuẩn nốt sần trở nên bất động. Trên môi trờng nhân tạo cũng nh trong nốt sần ngời ta thờng gặp những tế bào là thể giả khuẩn (bacteroides). So với tế bào hình que bình thờng thì thể giả khuẩn có kích thớc lớn hơn, thờng phân nhánh và chứa nhiều glicogen, votutin và lipoprotein hơn (Hình 1). Sinh viên: Lê Thị Linh Lớp 42B 1 - Sinh 5 Luận văn tốt nghịêp Hình 1: Các vi khuẩn nốt sần 1- Các vi khuẩn từ những nốt sần còn non 2- Các vi khuẩn từ những nốt sần già (Theo Nguyễn Quang Hào, Vơng Trọng Hào, Thực hành VSVH, 1980) [9]. Khi theo dõi sự phát triển của vi khuẩn nốt sần trên các môi trờng dinh dỡng nhân tạo ngời ta chia chúng thành hai nhóm: - Nhóm mọc nhanh (vi khuẩn nốt sần ở ba lá, đậu Hà Lan, đậu Côve, mục túc ) Nhóm này thuộc Rhizobium . - Nhóm mọc chậm (vi khuẩn nốt sần đậu tơng, lạc, đậu đũa ) Nhóm này thuộc chi Bradryrhizobium. Trên môi trờng thạch đặc, vi khuẩn nốt sần thờng có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, vô màu. Chất nhầy do vi khuẩn nốt sần gây ra thuộc một loại polisacarit cấu tạo bởi Hexoza, pentoza và axit uronic 1. Quá trình xâm nhập của vi khuẩn nốt sần vào rễ cây bộ đậu. Theo Nguyễn Thành Đạt (2000). Dới ảnh hởng của vi khuẩn nốt sần rễ cây bộ đậu sẽ tiết ra enzim poligalacturonaza, enzim này phân huỷ thành lông hút và giúp cho vi khuẩn nốt sần có điều kiện xâm nhập vào rễ. Trong lông hút, Sinh viên: Lê Thị Linh Lớp 42B 1 - Sinh 6 Luận văn tốt nghịêp vi khuẩn nốt sần sẽ tạo thành một cái gọi là dây xâm nhập, đó là một khối chất nhầy dạng sợi bên trong chứa đầy các vi khuẩn hình que ở trạng thái phát triển nhanh chóng. Dây xâm nhập di dần vào bên trong vào bên trong rễ với vận tốc khoảng 5 8 à /h.Sự vận động của dây xâm nhập đợc sinh ra do sự phát triển của vi khuẩn bên trong dây. Một số dây sẽ tiếp tục phát triển và lọt vào đến lớp nhu mô, ở đây vi khuẩn nốt sần sẽ kích thích các tế bào thực vật bị chúng xâm nhiễm cũng nh các tế bào lân cận. Kết quả làm cho chúng phân chia nhanh chóng thành nhiều tế bào mới. Vi khuẩn nốt sần thoát khỏi dây xâm nhập và đi vào tế bào chất. Cũng theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1981) khi vi khuẩn xâm nhập vào rễ, chúng trao đổi hệ gen vi khuẩn vào genom tế bào từ đó tạo nên đột biến đa bội và phân chia mạnh tạo nên nốt sần. 2. Cấu tạo của nốt sần. Nghiên cứu cấu tạo tế bào nốt sần ngời ta thấy rõ các vùng sau đây: - Vỏ nốt sần: Gồm vài lớp tế bào không bị vi khuẩn xâm nhiễm. Những tế bào này thờng có kích thớc nhỏ hơn tế bào vỏ rễ. Sau khi hình thành vỏ nốt sần vỏ rễ bị nát đi, một ít còn lại sẽ dính vào bên ngoài phần vỏ của nốt sần. - Vùng phân cách mạnh mẽ: Vùng này gồm những tế bào không bị xâm nhiễm, nằm trên dới lớp vỏ nốt sần.Từ các tế bào của vùng này về sau sẽ phân hoá và tạo thành các tế bào vỏ nốt sần,các tế bào chứa vi khuẩn và các tế bào mạch dẫn. - Vùng mô bị xâm nhiễm: Trong vùng này các tế bào chứa vi khuẩn nằm xen lẫn với tế bào không chứa vi khuẩn. Thể tích mỗi tế bào chứa vi khuẩn có thể lớn hơn gấp 8 lần so với tế bào không chứa vi khuẩn . - Hệ thống mạch dẫn của nốt sần: Khi nốt sần phát triển một số tế bào nằm giữa phần vỏ nốt sần và phần mô bị xâm nhiễm sẽ phân hoá và phân cắt thành các tế bào mạch dẫn của nốt sần. Về sau các mạch dẫn sẽ liên kết với mạch dẫn của rễ cây. Số bó mạch trong mỗi nốt sần thay đổi trong khoảng 1 12 bó tuỳ loại cây [3]. II. Một số đặc điểm của cây lạc. Sinh viên: Lê Thị Linh Lớp 42B 1 - Sinh 7 Luận văn tốt nghịêp Cây lạc thuộc bộ đậu Leguminoseae. Ngày nay căn cứ trên các tài liệu về khảo cổ học và thực vật dân tộc học về ngôn ngữ học, về sự phân bố các kiểu giống lạc, mặc dầu trên thế giới cha tìm thấy loại A.hypogeae ở trạng thái hoang dại ngời ta đã khảng định A.hypogeae có nguồn gốc tại Nam Mỹ. Trên thế giới, cây lạc đợc phân bố rộng rãi từ vĩ độ 56 0 Bắc và Nam ,từ vùng nhiệt đới nóng ẩm và nóng khô, tới vùng á nhiệt đới tơng đối ẩm và có nhiều ma. Cây lạc không đòi hỏi nghiêm ngặt về đất thậm chí cả loại đất bị rửa trôi thoái hoá vẫn trồng đợc lạc, chỉ cần thành phần cơ giới của đất tơng đối nhẹ, có đủ độ ẩm và trong thời gian sinh trởng của lạc có đủ nhiệt độ và lợng ma cần thiết (Nguyễn Danh Đông,1984) [7]. ở lạc có những đặc điểm sau: - Rễ cây lạc thuộc loại rễ cọc và gồm có ba phần là cổ rễ, rễ chính và rễ phụ. Sau khi hạt mọc cổ rễ vơn dài 2 4cm đa lá mầm vơn khỏi mặt đất. Rễ chính có trớc, rễ phụ có sau, khi lạc có hoa nhiều rễ phụ mới mọc ra từ cổ rễ. Từ lúc bắt đầu mọc đến khi có 5 lá, rễ mọc nhanh hơn thân lá. Lúc cây có 3 4 lá, trọng lợng rễ bằng 50% trọng lợng cả cây. Từ khi có 8 lá trở đi thân lá mọc nhanh hơn rễ, lúc cây có 8 lá trọng lợng rễ bằng 60% và lúc ra hoa thì bằng 10% trọng lợng cả cây. Rễ lạc có đặc điểm không có biểu bì, không có lông hút thật. Nớc và chất dinh dỡng vào trong cây trực tiếp qua nhu mô vỏ nhng ở một số hoàn cảnh, rễ cây lạc cũng có lông hút. - Thân lạc mềm, lúc còn non thì tròn lúc già có cạnh và ruột rỗng. Thân chính có hai thời kỳ sinh trởng mạnh và nhanh là lúc cây bắt đầu ra hoa và lúc có nhiều tia. Cây lạc phân cành ngay từ gốc cây. - Lá lạc thuộc lá kép hình lông chim. Mỗi lá thờng có 4 cũng có 3 hoặc 6 lá chét. Mỗi giống đều có những đặc điểm riêng của hình lá, mũi lá, màu lá, cỡ lá, hình lá kèm, tỷ lệ giữa chiều dài với chiều rộng lá và tỷ lệ giữa cuống lá với trụ lá. - Hoa lạc gồm những bộ phận chính nh đài hoa, tràng hoa, nhị đực và nhụy cái. Đài có 5 thuỳ, tràng hoa có 5 cánh. Nhuỵ cái phần dới là bầu, phần trên là nuốm hơi cong, phần giữa là vòi nhuỵ khá dài luồn suốt dọc ống dài giữa Sinh viên: Lê Thị Linh Lớp 42B 1 - Sinh 8 Luận văn tốt nghịêp các nhị đực. Nhị đực có 10 nhng teo đi không túi phấn còn lại 8 xen kẽ với nhau. Cây lạc là cây tự thụ phấn nghiêm ngặt nhng tỉ lệ ngoại phấn cũng tới 0,25%. - Quả lạc hình kén, dài từ 1 8cm, rộng từ 0,5 2cm, một đầu có vết dính với tia, một đầu là mỏ quả. Thực nghiệm về nhiễm vi khuẩn nốt sần cho hạt giống cây lạc cũng đã đ- ợc chú ý. Năm 1958 thí nghiệm đầu tiên về nhiễm vi khuẩn nốt sần cho lạc giống đỏ 4 tháng trên đất cát khô bạc màu ở xã Đồng Xuân Kim Anh Vĩnh Phúc đã thu đợc những kết quả khả quan. Nhờ biện pháp này mà năng suất đã tăng từ 13 26% [11]. Theo Bùi Huy Đáp (1975) cấy vi sinh vật khi gieo ở đất rừng, đất bãi, đất cỏ tranh thấy rằng những cây lạc cấy vi sinh vật nốt sần hình thành sớm hơn 5 ngày, số lợng cũng nhiều hơn, cây mọc tốt hơn, lá xanh, hoa quả nhiều hơn rõ rệt so với đất cha trồng lạc. Nếu cấy vi sinh vật có bón vôi năng suất tăng 40% trong khi không bón vôi chỉ tăng 26%. Trong sản xuất, cấy vi sinh vật tăng năng suất 10 20%, có trờng hợp tăng gấp rỡi. Do đó, sử dụng vi khuẩn nốt sần ở lạc nhiễm cho hạt lạc giống không chỉ có ý nghĩa về khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Phần III: Sinh viên: Lê Thị Linh Lớp 42B 1 - Sinh 9 Luận văn tốt nghịêp Đối tợng địa điểm và phơng pháp nghiên cứu. I. Đối tợng nghiên cứu. Đối tợng nghiên cứu ở đây là nốt sần Rhizobium vigna ở cây lạc Arachis hypogeaeL. 1. Cây lạc nguồn thu nhận vi khuẩn nốt sần. Cây lạc thuộc bộ đậu Leguminoseae. Cây lạc hút các nguyên tố khoáng trong dung dịch đất nhờ rễ và tia lạc. Cây lạc cũng có thể hút một vài nguyên tố dinh dỡng qua bộ lá. Những nguyên tố dinh dỡng chính của cây lạc gồm: đạm, lân, kali, magiê, lu huỳnh. - Đạm: cây lạc chứa một lợng nitơ khá lớn trong lá và trong hạt. Phần lớn nitơ đợc nằm trong hạt dới dạng prôtêin. Lạc là cây bộ đậu nên lấy đợc một lợng đạm nào đó trong khí quyển thông qua hoạt động của Rhizobium. Những cây không có nốt sần chứa một lợng đạm rất thấp và bộ rễ rất nhỏ, xanh nhợt do quá trình hình thành diệp lục bị kìm hãm. - Lân: Lân ảnh hởng tới sự phát triển của rễ và nốt sần của cây lạc, thúc đẩy sự ra hoa quả và làm giảm tỷ lệ óp lép. - Kali: Lợng chứa kali trong cây có thể thay đổi nhiều, cây phải hút nhiều kali nếu sống trong môi trờng giàu kali. ở nơi có lợng lân cao, cây có thể có triệu chứng thiếu kali. Thiếu kali xuất hiện nhiều quả 1 hạt. Đối với cây lạc không có bằng chứng cho thấy kali làm tăng tính chống hạn của cây. - Canxi, magiê và lu huỳnh: Chúng hoạt động với hai chức năng điều chỉnh pH đất và là những nguyên tố dinh dỡng chính cho cây. Ngoài những nguyên tố đa lợng trên sự sinh trởng và phát triển của cây lạc còn cần một số nguyên tố vi lợng nh Bo, Môlip đen, Mangan, Đồng, Kẽm, Sắt 2. Vi khuẩn nốt sần ở cây lạc Rhizobium vigna. Vi khuẩn nốt sần Rhizobium vigna ở lạc thuộc chi Bradyrhizobium, nhóm mọc chậm. 2.1. Hình thái cấu tạo. Sinh viên: Lê Thị Linh Lớp 42B 1 - Sinh 10 . giả khuẩn thể phân nhánh và đó chính là giai đoạn vi khuẩn nốt sần cố định nitơ nhiều nhất. 2.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn nốt sần. Vi khuẩn nốt sần. sinh học của vi khuẩn nốt sần Rhizobium vigna. 3. Thử nghiệm vi khuẩn nốt sần đã phân lập đợc xử lý hạt giống trớc khi đem gieo, theo dõi sự nảy mầm và quá