Bài giảng Thực tập vi sinh vật kỹ thuật môi trường cung cấp cho người học những kiến thức như: Giới thiệu chung về các trang thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm. Nuôi cấy vi sinh vật. Lấy mẫu và phân tích vi sinh vật. Phương pháp kiểm nghiệm các loại vi sinh vật trong môi trường;...Mời các bạn cùng tham khảo!
Trang thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm
Máy móc
Nồi hấp vô trùng ở áp suất cao (autoclave) là thiết bị hiệu quả nhất để khử trùng nhiều loại dụng cụ và môi trường nuôi cấy nhờ vào hơi nước bão hòa ở áp suất cao Tủ sấy, làm bằng kim loại chịu nhiệt, được sử dụng để khử trùng và làm khô các dụng cụ bằng sắt và thủy tinh chịu nhiệt Tủ cấy vô trùng có cấu trúc dạng hộp bằng kính, sử dụng đèn tử ngoại hoặc hệ thống thổi khí vô trùng để duy trì môi trường vô trùng Dụng cụ lọc vi khuẩn giúp khử trùng các môi trường không chịu được nhiệt độ và áp suất cao Tủ ấm duy trì nhiệt độ thích hợp cho quá trình nuôi cấy, phục vụ nghiên cứu đặc điểm sinh lý vi sinh vật Máy lắc hỗ trợ nuôi cấy và nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc bình nuôi để tăng lượng oxy hòa tan Máy li tâm được sử dụng để tách sinh khối tế bào hoặc các tiểu phần có độ lắng khác nhau trong môi trường nuôi cấy Máy đo pH xác định độ pH của môi trường nuôi cấy vi sinh vật, trong khi cân phân tích giúp định lượng các chất trong quá trình nghiên cứu.
Các dụng cụ và thiết bị trong phòng thí nghiệm
Phiến kính được sử dụng làm tiêu bản trong nghiên cứu hình thái và sinh lý tế bào, trong khi lá kính giúp đậy lên vết bôi trên tiêu bản, tạo điều kiện thuận lợi cho việc quan sát vi sinh vật Phiến kính lõm hỗ trợ nghiên cứu khả năng di động, sự hình thành bào tử và đặc điểm sinh sản của tế bào vi sinh vật Hộp lồng (đĩa pêtri) là dụng cụ cần thiết để nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân lập tế bào vi sinh vật Bình tam giác, với các dung tích như 100 ml, 250 ml và 500 ml, chủ yếu được dùng để nuôi cấy và chứa các loại môi trường, trong đó loại 250 ml được ưa chuộng nhất Que gạt là công cụ dùng để phân lập và tuyển chọn tế bào vi sinh vật, trong khi que cấy có ba loại: que cấy đầu tròn, que cấy đầu nhọn và que cấy đầu hình thước thợ, chủ yếu được sử dụng để lấy giống, cấy truyền và làm tiêu bản vi sinh vật Các nguyên liệu và dụng cụ khác cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình nghiên cứu vi sinh vật.
- Agar: Thường dùng ở dạng thạch dùng để nấu môi trường
- Dầu bách hương: Dùng khi quan sát mẫu vật ở bội giác có độ phóng đại lớn của kính hiển vi
- Axeton: Dùng để lau vật kính và các tiêu bản có dầu
- Vải xô: Dùng để lọc tiêu bản và làm nút bông:
- Giấy báo cũ dùng để bao gói các dụng cụ
- Bông mỡ ( không thấm nước) để làm nút bông cho ống nghiệm và bình tam giác
- Các loại dụng cụ để chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật: dao, thớt, xoong nhôm, vá…
Kính hiển vi
Kính hiển vi là một công cụ thiết yếu trong nghiên cứu vi sinh vật, cho phép quan sát và nghiên cứu các đặc điểm hình thái cũng như sinh lý của tế bào Với khả năng phóng đại hình ảnh từ hàng chục đến hàng vạn lần, kính hiển vi giúp nhà nghiên cứu có cái nhìn sâu sắc hơn về mẫu vật.
Người nghiên cứu có thể lựa chọn nhiều loại kính hiển vi khác nhau tùy theo yêu cầu nghiên cứu Kính hiển vi thông thường sử dụng ánh sáng thường từ dưới chiếu lên, giúp quan sát hình thái và cấu tạo tế bào, phổ biến trong giảng dạy Kính hiển vi nền đen cũng dùng ánh sáng thường nhưng chiếu từ bên, cho phép nhìn thấy cấu trúc khó quan sát trên tiêu bản không nhuộm màu và tế bào sống Kính hiển vi đổi pha sử dụng ánh sáng thường và cấu trúc đặc biệt, giúp nhìn rõ các cấu trúc nhỏ như ti thể và lớp màng Kính hiển vi huỳnh quang dùng tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm, cho phép phân biệt các cấu trúc trong tế bào qua màu sắc phát quang khác nhau Cuối cùng, kính hiển vi điện tử sử dụng chùm tia điện tử với độ phân giải cao, cho phép phóng đại mẫu vật từ 30-50 vạn lần.
- Kính hiển vi điện tử truyền suốt: Dùng để nghiên cứu các đại phân tử sinh học
Kính hiển vi điện tử quét là công cụ quan trọng trong việc nghiên cứu các cấu trúc lớn hơn các đại phân tử sinh học Tuy nhiên, thiết bị này thường chỉ có tại các phòng thí nghiệm quy mô lớn, nơi có đội ngũ cán bộ chuyên môn có trình độ và kinh nghiệm phù hợp để sử dụng hiệu quả.
Quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi
Phương pháp làm tiêu bản vi sinh vật
1.2.1.1 Phương pháp làm tiêu bản tạm thời:
- Cách làm tiêu bản giọt ép:
+ Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi
Đặt lá kính lên giọt canh trường một cách nhẹ nhàng để tránh tạo bọt khí, bằng cách để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính và từ từ hạ xuống Sau đó, đưa tiêu bản lên để quan sát trên kính hiển vi.
- Cách làm tiêu bản giọt treo:
Theo dõi sự sinh sản, hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các kích thích là rất quan trọng trong nghiên cứu vi sinh.
+ Dùng phiến kính đặc biệt có lõm hình tròn ở giữa
+ Bôi vazolin quanh phần lõm của phiến kính
+ Cho một giọt canh trường lên giữa lá kính
+ Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía đươi rồi đặt lên phần lõm của phiến kính
- Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu: a Nguyên tắc:
Phương pháp nhuộm này sử dụng thuốc nhuộm ít độc hoặc không độc hại cho vi sinh vật, được pha loãng ở nồng độ an toàn để đảm bảo tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động bình thường sau khi nhuộm.
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh meetylen 0,001% lên phiến kính
+ Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm
+ Đậy lá kính lên giọt dịch
+ Quan sát tiêu bản ở vật kính (x10) rồi (x40)
1.2.1.2 Phương pháp làm tiêu bản cố định:
- Các bước tiến hành làm tiêu bản cố định:
+ Cố định bằng hóa chất:
* Phương pháp này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi cấu trúc tế bào và không làm đứt các tiên mao
* Người ta thường dùng các hóa chất là rượu và axeton để cố định vết bôi
* Cách cố định: Có thể thực hiện một trong những cách sau:
Nhúng vết bôi vào rượu Với rượu 95 0 ngâm vết booit ừ 5-15 phút Với rượu
CH3OH ngâm khoảng 2-5 phút
Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton trong 5 phút
Nhỏ vài giọt rượu 90-95 0 lên vết bôi Đốt cháy và dập tắt ngay Làm như vậy vài lần rồi để khô.
NUÔI CẤY VI SINH VẬT
Chuẩn bị dụng cụ và nuôi cấy vi sinh vật
Qúa trình chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy bao gồm các bước sau:
Các loại dụng cụ dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, thật sạch và trong, không bị nứt mẻ
Phương pháp xử lý gồm 2 giai đoạn: trung tính dụng cụ và rửa dụng cụ a) Phương pháp trung tính dụng cụ:
- Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH = 7
- Hấp khử trùng dụng cụ ở 120 0 C trong 30 phút bằng nồi hấp
- Lấy dụng cụ ra để nguội rồi kiểm tra pH của nước trong dụng cụ
- Nếu nước có pH > 7 thì tiếp tục ngâm dụng cụ vào dung dịch HCl 2% cho đến khi kiểm tra pH = 7 thì thôi
- Rửa kĩ bằng nước nhiều lần là dùng được b) Phương pháp rửa dụng cụ:
- Với phiến kính cũ( đã dùng làm tiêu bản)
+ Chùi sạch mỡ hoặc vazolin trên phiến kính bằng miếng vải tẩm xilen hoặc ngâm tiêu bản vào dung dịch sunphôbicromat trong 48h
+ Ngâm tiêu bản vào nước xà phòng và đun sôi trong 1h
+ Ngâm tiêu bản vào cồn 90 0 trong 12h
+ Lau khô chúng bằng vải mịn rồi sấy khô
- Với phiến kính mới cần kiểm tra độ pH và xử lý để đạt độ trung tính
- Với các ống nghiệm cũ đã bị nhiễm khuẩn :
+ Lấy ra và đổ các vật phẩm trong ống nghiệm đi
+ Ngâm ống nghiệm vào nước ấm
+ Rửa ống nghiệm bằng cách:
Dùng chổi chấm xà bông hay tro bếp cọ xát vào thành ống đều khắp nhiều lần
Rửa nước 2- 3 lần Úp ống nghiệm cho thật ráo nước và khô
- Với các ống nghiệm không nhiễm khuẩn hay chứa các vi khuẩn không gây bệnh thì không phải hấp khử trùng và tiến hành rửa như trên
- Đặt ngữa đĩa petri trong lòng bàn tay trái
- Tay phải dùng dẻ có chấm tro hoặc xà bông xát vào 2 mặt của đĩa, các khe ở chân đĩa và thành đĩa
- Úp nghiêng các đĩa trong giỏ nhựa cho thật khô
* Các dụng cụ thủy tinh khác: phễu, chai lọ, bình cầu, bình tam giác
- Dùng giẻ với nước xà bông cọ rửa phần ngoại dụng cụ
- Dùng nước xà bông đặc lắc kĩ để rửa phần trong dụng cụ
- Rửa nước nhiều lần cho sạch và để ráo
- Phân loại các dụng cụ này theo kích thước to, nhỏ, tốt, xấu, sạch hay bẩn
- Ngâm từng loại riêng vào nước ấm ( 50 – 80 0 C) trong 3- 4 h
- Cọ rửa kĩ trong nước xà bông
- Rửa nước lã nhiều lần
- Phơi nắng 2 -3h rồi cất đi dùng dần
- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô
Việc bao gói dụng cụ sau khi khử trùng cần phải thực hiện thật kín và cẩn thận, nhằm đảm bảo rằng chúng vẫn giữ được tính vô trùng trong lớp giấy gói Điều này giúp việc lấy ra và sử dụng dụng cụ trở nên dễ dàng và an toàn hơn.
2 Phương pháp bao gói dụng cụ
Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:
- Làm nút bông : cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que gạt
- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh
- Sau khi khử trùng cần đảm bảo:
+ Sự vô trùng tuyệt đối cho các vật phẩm và các dụng cụ
+ Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật
2 Các phương pháp khử trùng
Khi thực hiện khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt, trong khi các bào tử vẫn có thể tồn tại ngay cả ở nhiệt độ đó.
Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào:
- Độ pH của vật định khử trùng
Để khử trùng bằng nhiệt hiệu quả, cần xác định ngưỡng nhiệt độ tối thiểu và thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật cùng bào tử của chúng trong dụng cụ khử trùng.
2.1.2 Chuẩn bị môi trường để nuôi cấy vi sinh vật
- Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào
Môi trường dinh dưỡng là sự kết hợp của các chất dinh dưỡng thiết yếu, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì trạng thái oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và ổn định độ pH của môi trường sống.
2 Các yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng
- Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết
- Có độ pH thích hợp
- Có độ nhớt nhất định
- Không chứa các yếu tố độc hại
3 Phân loại môi trường dinh dưỡng
Người ta dựa trên cơ sở khác nhau để phân loại môi trường a) Căn cứ theo thành phần và nguồn gốc: Có 3 loại môi trường là:
Môi trường tự nhiên bao gồm các sản phẩm như sữa, trứng, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường và cám Thành phần hóa học của môi trường này khó xác định chính xác do tính chất không ổn định của các sản phẩm tự nhiên.
Môi trường tổng hợp là một hệ thống bao gồm các chất hóa học, trong đó thành phần được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác.
Môi trường bán tổng hợp là loại môi trường có thành phần bao gồm cả hóa chất và các chất hữu cơ tự nhiên Dựa vào tính chất lý học, môi trường này có thể được phân chia thành ba loại khác nhau.
- Môi trường lỏng ( dịch thể):
Thành phần môi trường này không chứa thạch và thường được dùng để nghiên cứu quá trình vi tổng hợp của vi sinh vật
Trong thành phần môi trường này chứa 1,5 -2% agar hoặc 10 -20% gelatin và dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí của vi sinh vật
Môi trường này chứa 0,35 – 0,7% agar c) Căn cứ vào công dụng : Có thể gồm các loại môi trường sau:
- Môi trường cơ bản: Thích hợp cho nhiều vi sinh vật khác nhau:
- Môi trường chọn lọc: Là môi trường đảm bảo cho sự phát triển ưu thế của 1 loài hay một nhóm vi sinh vật xác định nào đó
Môi trường kiểm định là môi trường giúp phân biệt các đặc điểm của nhiều loại vi khuẩn cần xác định Thông thường, người ta sử dụng chất chỉ thị màu hoặc một số hóa chất để tạo ra các phản ứng màu sắc đặc trưng.
Ví dụ: Môi trường kiểm định kháng sinh, môi trường lên men các loại đường
4 Phương pháp làm môi trường
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được thiết kế để phân lập, nhân giống và bảo tồn giống vi sinh vật, đồng thời phục vụ cho việc nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng Nguyên tắc chế tạo môi trường bao gồm việc lựa chọn thành phần dinh dưỡng phù hợp và điều chỉnh các yếu tố như pH, nhiệt độ để tối ưu hóa sự phát triển của vi sinh vật.
- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật
Để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật, việc điều chỉnh tỉ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường là rất cần thiết.
- Đảm bảo các điều kiện hóa lí cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật b) Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng:
Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự + Môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi hòa tan vào nước
Cân agar rồi ngâm vào nước
Cân hóa chất rồi hòa tan trong nước
Vớt agar ra, vắt khô, bỏ vào xoong môi trường để đun
Việc làm trong môi trường sẽ giúp dễ dàng quan sát sự phát triển của vi sinh vật, bao gồm các bước sau:
+ Cách 1 : Lọc bằng bông, vải thưa hay giấy lọc
+ Cách 2: Lọc bằng lòng trắng trứng gà
Cứ 1 lít môi trường dùng lòng trắng trứng gà.Lấy lòng trắng trứng + lượng nước bằng lượng lòng trắng đánh tan cho sủi bọt Đỗ hỗn hợp dịch trứng và nước trên vào môi trường.Trộn đều, đun sôi 10- 15 phút.Để lắng rồi mới lọc
- Điều chỉnh độ pH của môi trường:
+ Người ta dùng HCl 10% hay NaCl 10% Ngoài ra có thể dùng một số hóa chất khác như H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3…
+ Sử dụng máy đo pH, và giấy quỳ để kiểm tra độ pH
- Phân phối môi trường vào dụng cụ:
Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác Trình tự phân bố như sau:
+ Môi trường cần được đun cho hóa lỏng rồi đổ qua phễu thủy tinh vào các dụng cụ + Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường
+ Tay phải kẹp nút bông và kéo ra
+ Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại
Khi sử dụng ống nghiệm, nếu áp dụng môi trường làm thạch nghiêng, lượng môi trường phân phối sẽ chiếm toàn bộ thể tích của ống nghiệm Ngược lại, nếu làm thạch đứng, lượng môi trường cần phân phối sẽ từ ½ đến 1/3 thể tích ống nghiệm.
Đối với bỡnh cầu hay bỡnh tam giỏc, lượng mụi trường được phõn phối chiếm ẵ - 2/3 thể tích của bình
Các thao tác phân phối môi trường cần được thực hiện nhanh chóng và khéo léo để tránh việc môi trường dính vào miệng dụng cụ hoặc các nút bông Quan trọng là phải hoàn thành việc phân phối trước khi môi trường bắt đầu đông đặc.
Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau
Các phương pháp khử trùng phổ biến bao gồm phương pháp Pasteur, phương pháp Tyndal, phương pháp lọc vi khuẩn và phương pháp hấp hơi nước bão hòa dưới áp suất cao.
Đối với các dụng cụ chịu nhiệt ( sứ, vải, thủy tinh) khử trùng ở 1,5 atm / 20 phút -30 phút
Đối với dụng cụ chứa 1l môi trường trở lên thì hấp ở 1atm/30 phút
Với các loại môi trường chứa đường dễ bị biến chất ở nhiệt độ cao thì hấp khử trùng ở 0,5 – 0,6 atm/15 phút
- Làm thạch nghiêng, thách đứng, đổ thạch vào đĩa Pêtri:
+ Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc
Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng, nhưng không được để môi trường chạm vào nút bông
Để yên cho đến khi mặt thạch đông đặc, yêu cầu mặt thạch phải thẳng, nhẵn liên tục
+ Làm thạch đứng: Đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc
+ Đổ thạch vào đĩa pêtri:
Toàn bộ quy trình đỗ thạch vào đĩa pêtri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng và gồm các thao tác sau:
Mở bao giấy gói các đĩa pêtri
Tay phải cầm dụng cụ (bình tam giác) chứa môi trường
Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn
Nghiêng bình và rót nhẹ một chút môi trường vào đĩa pêtri sau khi tay trái mở hé nắp trên của đĩa
Đậy nắp trên lại, xoay tròn đĩa pêtri để môi trường được phân phối đều trên mặt đĩa
Để yên cho môi trường nguội và đông đặc
Lật ngược cho đáy dưới của đĩa pêtri lên trên để hơi nước bốc ra và khô dần đi + Chú ý:
Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm bẩn
Mặt thạch phải thẳng, nhẵn cú độ dày khoảng 2mm Thụng thường cứ ẳ lit mụi trường có thể phân phối được 22 – 25 đĩa pêtri
Sau khi đổ môi trường vào đĩa pêtri, cần kiểm tra lại sau 1 - 2 ngày để xác định xem môi trường có bị nhiễm khuẩn hay không trước khi sử dụng cho việc cấy hoặc phân lập.
Nhớ viết vào nhãn: Tên môi trường …
Khử trùng: ngày … tháng … năm
Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện cho việc theo dõi, sử dụng và bảo quản
- Bảo quản và kiểm tra môi trường:
+ Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ 0 – 5 o C và không để môi trường bị khô
LẤY MẪU VÀ PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
Phương pháp lấy mẫu để phân tích vi sinh vật
3.1.1 Xác định số lượng mẫu và dụng cụ để lấy mẫu
+ Xác định số lượng mẫu cần lấy:
- Phụ thuộc vào mục tiêu, nội dung nghiên cứu mà định ra yêu cầu số lượng và vị trí lấy mẫu phải đại diện
Việc lấy mẫu phân tích cần phụ thuộc vào điều kiện cụ thể của khu vực ngoài thực địa Quan trọng nhất là người lấy mẫu phải đảm bảo rằng mẫu được lấy là đồng nhất và đại diện cho khu vực, khoanh đất hoặc cơ chất tương ứng.
Số lượng các mẫu cơ chất trong các đống phế thải và rác thải được thu thập từ khu vực đã khảo sát và sau đó được trộn để tạo thành một mẫu đại diện.
+ Các vật liệu cần chuẩn bị để lấy mẫu
- Dụng cụ lấy mẫu ( dao, kéo, lõi trụ, mai thuồng…)
Các mẫu ngẫu nhiên có thể chỉ để trộn đều nếu chúng được lấy từ một khu vực đồng nhất và đại diện
Khi lấy mẫu đất để phân tích vi sinh vật, cần xem xét các yếu tố như mục tiêu nghiên cứu, độ chính xác yêu cầu, số lượng mẫu cần lấy và diện tích của từng khu vực đất.
- Độ sâu theo tầng phẫu diện đất
- Loại hình sử dụng đất
Các mẫu đất cần được lấy một cách cẩn thận để đảm bảo tính chính xác Những khác biệt lớn trong khu vực lân cận cần phải được loại trừ khỏi mẫu Nếu những khác biệt này có tầm quan trọng đặc biệt, các mẫu nên được thu thập riêng biệt để đảm bảo độ tin cậy của kết quả.
3.1.2 Phương pháp lấy mẫu và vận chuyển mẫu
Để đảm bảo tính đại diện của mẫu, việc phân bố các điểm lấy mẫu cần phải ngẫu nhiên trong khu vực điều tra Phương pháp lấy mẫu theo đường chéo là lựa chọn tối ưu khi địa hình đồng nhất và diện tích nhỏ hơn 1000 m², với 5 điểm đại diện được khuyến nghị.
- Lấy mẫu không nên gần bờ ruộng hoặc đường, vì số lượng VSV trong mẫu đất đó sẽ không đại diện cho khoang đất ở chính vùng đó
Khi lấy mẫu, cần loại bỏ lớp rễ bề mặt (nếu có) và cắt vuông xuống phía dưới Hãy cố gắng lấy càng nhiều điểm mẫu càng tốt Ngay khi lấy được điểm nào, hãy cho ngay vào túi đựng mẫu để tránh nhiễm tạp.
Khi lấy mẫu từ ruộng thâm canh các loại cây trồng cạn, nếu mặt ruộng không đồng nhất, cần phải khảo sát thực địa kỹ lưỡng để đảm bảo việc lấy mẫu được đồng nhất và chính xác.
Khi lấy đất để trồng cây như khoai, ngô, sắn, đậu, lạc, rau, cần lưu ý không lấy đất ở mặt luống hoặc dưới rãnh luống Thay vào đó, đất nên được lấy từ sườn luống và tránh khu vực gần gốc cây trồng.
Để có kết quả phân tích đất chính xác, việc lấy mẫu nên được thực hiện khi đất ở trạng thái tương đối ổn định, tức là khi người dân chưa tác động nhiều vào đất, thường là sau mùa thu hoạch.
Khi lấy mẫu từ các cơ chất như đống rác thải và phế thải, cần thực hiện một cách cụ thể và cẩn thận để đảm bảo mẫu đại diện cho khu vực nghiên cứu Trọng lượng mẫu cần lấy khoảng 200 gram mỗi lần.
Khi lấy mẫu phân tích vi sinh vật (VSV), cần tuân thủ nguyên tắc vô trùng để tránh nhiễm tạp Sau khi lấy mẫu, phải ngay lập tức cho vào phích lạnh để bảo quản, vì VSV sinh sản rất nhanh Nếu không được bảo quản trong điều kiện lạnh ngay, số liệu phân tích sẽ không chính xác Vận chuyển mẫu cũng cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo chất lượng.
Để phân tích vi sinh vật (VSV) hiệu quả, mẫu cần được lấy và chuyển ngay về phòng phân tích để bảo quản Trong quá trình vận chuyển, cần chú ý không làm hỏng thùng hoặc túi đựng mẫu và luôn giữ mẫu trong phích lạnh nhằm ngăn chặn sự sinh trưởng và phát triển của VSV.
Khi mẫu đã được chuyển đến phòng thí nghiệm, việc xử lý và phân tích mẫu cần được thực hiện ngay lập tức Điều này rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích, và quá trình xử lý mẫu phải diễn ra trong môi trường vô trùng nhằm tránh sự xâm nhập của tạp khuẩn.
- Nếu không kịp phân tích thì phải bảo quản mẫu ở tủ lạnh, nhiệt độ < 3 0 C Mẫu được bảo quản không quá 30 ngày, tốt nhất phân tích càng sớm càng tốt.
PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM CÁC LOẠI VI SINH VẬT
3.1 Phương pháp lấy mẫu để phân tích vi sinh vật
3.1.1 Xác định số lượng mẫu và dụng cụ để lấy mẫu
+ Xác định số lượng mẫu cần lấy:
- Phụ thuộc vào mục tiêu, nội dung nghiên cứu mà định ra yêu cầu số lượng và vị trí lấy mẫu phải đại diện
Việc lấy mẫu phân tích cần phải dựa vào điều kiện cụ thể của khu vực ngoài thực địa Người thực hiện lấy mẫu phải đảm bảo rằng mẫu được thu thập đồng nhất và đại diện cho khu vực, khoanh đất hoặc cơ chất mà họ đang nghiên cứu.
Số lượng các mẫu cơ chất tương ứng trong các đống phế thải và rác thải được thu thập từ khu vực khảo sát và sau đó được trộn để tạo thành một mẫu đại diện.
+ Các vật liệu cần chuẩn bị để lấy mẫu
- Dụng cụ lấy mẫu ( dao, kéo, lõi trụ, mai thuồng…)
Các mẫu ngẫu nhiên có thể chỉ để trộn đều nếu chúng được lấy từ một khu vực đồng nhất và đại diện
Khi lấy mẫu đất để phân tích vi sinh vật, cần xem xét các yếu tố như mục tiêu nghiên cứu, độ chính xác yêu cầu, số lượng mẫu cần lấy và diện tích của từng khu vực đất.
- Độ sâu theo tầng phẫu diện đất
- Loại hình sử dụng đất
Các mẫu đất cần được lấy một cách chính xác và khác biệt Những sự khác biệt lớn trong khu vực xung quanh cần được loại trừ khỏi mẫu Nếu những khác biệt này có tầm quan trọng đặc biệt, thì mẫu đất cần được lấy riêng biệt để đảm bảo tính chính xác trong phân tích.
3.1.2 Phương pháp lấy mẫu và vận chuyển mẫu
Để đảm bảo tính đại diện của mẫu, các điểm lấy mẫu cần được phân bố ngẫu nhiên trong khu vực điều tra Phương pháp lấy mẫu hiệu quả nhất là theo đường chéo, đặc biệt khi địa hình đồng nhất và diện tích nhỏ hơn 1000 m², trong trường hợp này nên lấy 5 điểm đại diện.
- Lấy mẫu không nên gần bờ ruộng hoặc đường, vì số lượng VSV trong mẫu đất đó sẽ không đại diện cho khoang đất ở chính vùng đó
Khi lấy mẫu, cần gạt bỏ lớp rễ bề mặt (nếu có) và cắt vuông xuống phía dưới Tiến hành lấy nhiều điểm mẫu càng tốt, và ngay khi có điểm nào, hãy cho ngay vào túi đựng mẫu để tránh nhiễm tạp.
Khi lấy mẫu từ ruộng canh tác các loại cây trồng cạn, nếu mặt ruộng không đồng nhất, cần phải xem xét kỹ lưỡng thực địa để đảm bảo việc lấy mẫu được thực hiện một cách đồng nhất và chính xác.
Khi lấy đất cho các luống cây như khoai, ngô, sắn, đậu, lạc, rau, cần chú ý không lấy đất từ mặt luống và dưới rãnh luống Thay vào đó, hãy lấy đất từ sườn luống và tránh việc lấy đất gần gốc cây trồng.
Để phân tích đất một cách hiệu quả, việc lấy mẫu nên được thực hiện khi đất ở trong trạng thái ổn định, tức là sau khi người dân đã thu hoạch và không có tác động lớn đến đất.
Khi lấy mẫu từ các cơ chất như đống rác thải hay phế thải, cần xem xét kỹ lưỡng thực địa để đảm bảo mẫu được thu thập chính xác và đại diện cho khu vực nghiên cứu Trọng lượng mẫu cần lấy khoảng 200 gram cho mỗi lần lấy mẫu.
Khi lấy mẫu phân tích vi sinh vật (VSV), cần tuân thủ nguyên tắc vô trùng để tránh nhiễm tạp Sau khi lấy mẫu, cần ngay lập tức cho vào phích lạnh để bảo quản, vì VSV sinh sản rất nhanh và nếu không được bảo quản đúng cách, số liệu phân tích sẽ không chính xác Việc vận chuyển mẫu cũng cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo chất lượng mẫu.
Để đảm bảo chất lượng mẫu phân tích vi sinh vật (VSV), cần nhanh chóng chuyển mẫu về phòng phân tích để bảo quản Trong quá trình vận chuyển, cần tránh làm hư hại thùng hoặc túi đựng mẫu và luôn giữ mẫu trong phích lạnh nhằm kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV.
Khi mẫu đã về tới phòng thí nghiệm, việc xử lý và phân tích mẫu cần được thực hiện ngay lập tức Điều này rất quan trọng vì công việc xử lý mẫu phải diễn ra trong môi trường vô trùng để tránh sự xâm nhập của tạp khuẩn vào mẫu phân tích.
- Nếu không kịp phân tích thì phải bảo quản mẫu ở tủ lạnh, nhiệt độ < 3 0 C Mẫu được bảo quản không quá 30 ngày, tốt nhất phân tích càng sớm càng tốt
3.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật
Bình tam giác, bình cầu và ống nghiệm với dung tích 10ml, 100ml và 250ml là những dụng cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm Ngoài ra, pipet chia độ từ 0,1 - 1,0 ml, 2 ml, 5ml, 10 ml, cùng với hộp nhôm, que cấy, que gạt, bi thủy tinh, giấy quỳ, khay men, cuốc và khoan cũng rất quan trọng Tất cả các dụng cụ này đều phải được tiệt trùng để đảm bảo an toàn và chính xác trong quá trình thí nghiệm.
+ Môi trường nuôi cấy VSV đã khử trùng
3.2.1.2 Chuẩn bị bình nước vô trùng làm dãy pha loãng:
Chuẩn bị 10 bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 100ml hoặc 250ml, cho vào mỗi bình 90ml nước máy (thường là 92ml) Tiến hành tiệt trùng các bình ở áp suất 1atm (121°C) trong 30 phút Sau khi tiệt trùng, lấy bình ra để nguội, tạo thành dãy pha loãng và đánh số thứ tự từ 1 đến 10.
1.3 Xác định độ ẩm cần phân tích: