MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu cụ thể
- Xác định kháng thể kháng virus LMLM có trong huyết thanh của trâu bò bằng phương pháp 3ABC ELISA
Xét nghiệm mẫu probang từ dịch hầu họng của trâu bò có huyết thanh dương tính với 3ABC nhằm xác định sự hiện diện của gen virus LMLM bằng phương pháp RT-PCR.
Nghiên cứu đã tiến hành xét nghiệm ngẫu nhiên các mẫu probang (dịch hầu họng) từ trâu bò có huyết thanh âm tính 3ABC để xác định sự hiện diện của gen virus LMLM bằng phương pháp RT-PCR Kết quả cho thấy khả năng chẩn đoán của hai phương pháp này có sự khác biệt đáng kể.
- Đề xuất các giải pháp phòng chống bệnh LMLM.
Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Trâu bò ở tất cả các lứa tuổi trên địa bàn 3 huyện: Sơn Tịnh, Bình Sơn và Đức Phổ của tỉnh Quảng Ngãi
Để thu huyết thanh và chiết xuất RNA tổng số, mỗi con trâu bò cần lấy 3 - 5 ml máu và 1 mẫu probang, trong đó mẫu RNA có thể bao gồm cả RNA virus.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát tình hình chăn nuôi và tình hình dịch bệnh LMLM tại tỉnh Quảng Ngãi qua các năm
Lấy mẫu huyết thanh từ trâu bò tại tỉnh Quảng Ngãi để xét nghiệm bằng phương pháp 3ABC ELISA nhằm xác định sự hiện diện của kháng thể kháng virus LMLM trong huyết thanh của chúng.
Xét nghiệm gen virus LMLM bằng phương pháp RT-PCR được thực hiện trên mẫu probang (dịch hầu họng) của tất cả trâu bò có kết quả huyết thanh 3ABC ELISA dương tính, tức là có kháng thể chống protein phi cấu trúc Ngoài ra, một số mẫu từ trâu bò âm tính (không có kháng thể chống protein phi cấu trúc) cũng được kiểm tra để xác minh kết quả.
- Đề xuất các giải pháp phòng chống bệnh LMLM.
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu thực địa được tiến hành tại ba huyện Sơn Tịnh, Bình Sơn và Đức Phổ, tỉnh Quảng Ngãi, bao gồm việc lấy mẫu máu và mẫu probang từ trâu bò, cũng như phỏng vấn chủ trâu bò và các bác sĩ thú y địa phương.
- Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm: gồm xử lý và xét nghiệm mẫu huyết thanh, mẫu probang được thực hiện tại phòng xét nghiệm - Cơ quan Thú y vùng IV
Nghiên cứu được thực hiện tại các hộ chăn nuôi, cơ sở mua bán và vận chuyển trâu bò, cũng như các điểm giết mổ trâu bò ở ba huyện Sơn Tịnh, Bình Sơn và Đức Phổ thuộc tỉnh Quảng Ngãi.
Nguyên liệu nghiên cứu
Để thực hiện quy trình lấy mẫu hiệu quả, cần chuẩn bị các vật dụng như gióng cố định trâu bò, bông thấm, cồn iode, cồn 70 độ, bơm kim tiêm nhựa, giá đỡ kim, kim lấy máu, ống chân không 10ml, giá và hộp đựng mẫu, cùng với ống nhựa Eppendorf 1,5 ml và 10 ml có nắp đậy Ngoài ra, thùng bảo ôn, đá lạnh, ống Eppendorf, ống PCR, găng tay, khẩu trang, dây cao su, bình giữ nhiệt, dụng cụ lấy mẫu probang, hai xô nhựa, hóa chất Virkon và dung dịch bảo quản mẫu probang PBS cũng là những vật dụng cần thiết cho quy trình này.
Theo các bảng biểu điều tra đã soạn, bút ghi chép
2.5.3 Các thiết bị và dụng cụ cần thiết cho phản ứng
Tủ đông, tủ sấy, máy lắc đĩa, máy hấp cao áp, máy li tâm lạnh, buồng cấy, cân điện tử, máy đo pH, máy đọc ELISA, máy rửa đĩa ELISA, máy lọc, máy cất nước, cân phân tích, tủ lạnh âm sâu, tủ lạnh thường, buồng cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng (autoclave), tủ ấm 37°C và bồn nước ấm là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm, phục vụ cho các nghiên cứu và phân tích khoa học.
2.5.3.2 Dụng cụ cần thiết cho phản ứng Ống Eppendorf, ống nghiệm, bình tam giác các loại, ống đong các loại, pipet thủy tinh các loại, micro pipet các cỡ (loại 1, 8, 12 kênh), đầu típ nhựa các cỡ dùng cho micro pipet, đĩa nhựa polystyren 96 lỗ đáy chữ U, đĩa PCR 96 giếng, kit ELISA phát hiện kháng thể kháng virus LMLM, máy đọc kết quả RT-PCR, máy RT-PCR, hóa chất, dung dịch cần thiết khác trong phòng thí nghiệm, mẫu huyết thanh, mẫu probang trâu bò.
Phương pháp nghiên cứu
2.6.1.1 Thiết kế chọn mẫu xét nghiệm
Công thức tính số lượng mẫu cần lấy để xác định bệnh (có biến đổi huyết thanh):
Trong đó: n : dung lượng mẫu cần lấy
N : dung lượng quần thể trâu bò
CI : Khoảng tin cậy, ở đây CI = 0,95 (CI = Confidence Interval) d : Tỷ lệ lưu hành ước đoán
2.6.1.2 Phương pháp lựa chọn huyện để kiểm tra
Chọn những huyện đã từng xảy ra dịch trong những năm gần đây
2.6.1.3 Phương pháp lựa chọn các hộ gia đình trong huyện
Lập danh sách các hộ gia đình trong thôn nuôi trâu bò từ 6 tháng tuổi trở lên Chọn ngẫu nhiên các hộ gia đình có trâu bò trên 6 tháng tuổi, ưu tiên những hộ nuôi riêng trâu hoặc bò Nếu số lượng không đủ, tiếp tục chọn các hộ nuôi cả trâu và bò.
2.6.1.4 Thiết kế biểu mẫu điều tra
Biểu mẫu điều tra được thiết kế để phỏng vấn gia chủ, nhằm thu thập thông tin chi tiết về từng con trâu bò, bao gồm loài vật, lứa tuổi theo tháng, tính biệt và nguồn gốc của chúng, từ đó phục vụ cho việc lấy máu.
Biểu mẫu điều tra được phát triển để phỏng vấn trưởng thôn hoặc nhân viên thú y tại xã, phường, nhằm thu thập thông tin về tình hình tiêm phòng, dịch LMLM và các hoạt động liên quan đến buôn bán, vận chuyển, tiêu thụ trâu bò trong khu vực địa phương.
Số lượng mẫu: 288 mẫu, trong đó mẫu huyết thanh: 144 mẫu và mẫu probang: 144 mẫu
2.6.3 Phương pháp lấy mẫu huyết thanh và mẫu probang
2.6.3.1 Phương pháp lấy mẫu huyết thanh
Cố định trâu bò trong gióng giá và sát trùng tĩnh mạch cổ hoặc tĩnh mạch đuôi bằng bông cồn ethylic 70% Tiến hành đưa mũi kim vào tĩnh mạch để hút 3-5 ml máu, sau đó cho vào ống nghiệm 10 ml vô trùng Đặt ống máu nghiêng 45 độ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 2 giờ để máu đông, sau đó bảo quản ống máu ở nhiệt độ 4 độ C và chuyển đến phòng xét nghiệm.
Cách chắt huyết thanh: Ly tâm các ống máu ở tốc độ 1.500 vòng/phút trong
10 phút, sau đó chắt huyết thanh cho vào ống nhựa Eppendorf 2ml, có nắp, vô trùng đã chuẩn bị sẵn
Để bảo quản mẫu huyết thanh, nên lưu trữ ở ngăn mát tủ lạnh Nếu cần bảo quản lâu dài, hãy giữ huyết thanh ở nhiệt độ -20°C và hạn chế việc lấy huyết thanh ra khỏi tủ lạnh không quá 3 lần, vì hiện tượng đông tan có thể làm giảm hiệu giá kháng thể.
2.6.3.2.Phương pháp lấy mẫu mẫu probang
Probang cup là dụng cụ chuyên dụng để thu thập mẫu dịch nhầy ở hầu Để đảm bảo an toàn, cần sát trùng probang cup bằng hóa chất Virkon trước khi rửa lại bằng nước sạch.
Cố định trâu bò trong gióng giá, đứng bên cạnh và cầm dây mũi để kiểm soát Sử dụng một tay để giữ dụng cụ lấy mẫu probang, đưa vào miệng con vật với ngón tay giữ mép miệng mở ra Đưa probang vào sâu khoảng 2/3 chiều dài, sau đó đẩy xuống và kéo lên từ từ theo nhịp thở của con vật khoảng 4-5 lần để thu thập dịch nhầy trong họng vào cốc Cuối cùng, lấy probang ra từ từ theo nhịp thở của con vật.
Kiểm tra mẫu phù hợp là rất quan trọng: mẫu cần có dịch nhầy và không chứa máu hoặc quá nhiều thức ăn ở dạ cỏ Nếu mẫu đạt yêu cầu, đổ dịch thu được từ cốc vào ống thu thập mẫu; nếu không, cần thực hiện lại việc lấy mẫu.
Cho dung dịch vận chuyển mẫu vào ống nghiệm đã có sẵn dung dịch bảo quản PBS.Giữ mẫu trong thùng giữ lạnh và chuyển đến phòng xét nghiệm
Để đảm bảo vệ sinh trong quá trình lấy mẫu, cần sát trùng dụng cụ probang bằng cách ngâm vào dung dịch thuốc sát trùng đã chuẩn bị Sau đó, rửa sạch dụng cụ để sẵn sàng cho việc lấy mẫu từ trâu bò khác.
2.6.4.1 Phương pháp xét nghiệm bằng phản ứng 3ABC-ELISA
Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzyme để kết hợp với kháng nguyên Sau đó, khi thêm cơ chất vào, enzyme sẽ phân hủy cơ chất tạo ra màu sắc Màu sắc này được đo bằng quang phổ kế, cho phép định lượng mức độ phản ứng.
* Nguyên liệu: Cung cấp trong bộ Kít, bộ Kít chẩn đoán KIT PARA và các dụng cụ thông thường sử dụng trong phòng thí nghiệm
- Dung dịch pha loãng mẫu (Sample Dilutions): Một lọ 300ml
- Conjugate: Một lọ 60 ml được cung cấp sẵn trong bộ Kít Dung dịch này không pha loãng
- Nước rửa: Pha loãng 1/10 trong nước cất 2 lần, nước rửa này có thể giữ 1 tuần ở nhiệt độ 22 ± 3 o C
- Chất phát màu – substrate TMB N.12: Một lọ chứa 600ml substrate TMB N.12
- Dung dịch dừng phản ứng: Một lọ chứa 100ml
- Đối chứng dương tính: Một lọ chứa 0,4 ml
- Đối chứng âm tính: Một lọ chứa 0,4 ml
- Đĩa ELISA được gắn kháng nguyên 3ABC: 5 đĩa
- Kiểm tra tình trạng mẫu;
- Nếu mẫu huyết thanh còn lẫn máu thì phải xử lý mẫu trước khi làm phản ứng bằng cách li tâm mẫu ở 1000g trong 15 phút để làm sạch huyết thanh
- Sau khi xử lý, mẫu được giữ tạm ở +4°C và ghi lại kí hiệu mẫu
Tất cả các nguyên liệu đưa về nhiệt độ phòng 22 ±3 o C khoảng 20 phút và lắc đều trước khi sử dụng
- Pha loãng mẫu với tỷ lệ: 1/100 và đối chứng huyết thanh dương và đối chứng huyết thanh âm
- Chuyển 100àl dung dịch mẫu đó pha loóng, đối chứng huyết thanh dương và đối chứng huyết thanh âm vào các giếng của đĩa ELISA đã được bố trí
- Dán kín đĩa bằng miếng dán có sẵn trong bộ kít và ủ đĩa ở nhiệt độ 37 o C ±
3 thời gian 60 phút ± 10 (trong hộp giữ ẩm)
- Rửa đĩa phản ứng 3 lần bằng dung dịch rửa (300àl/giếng)
- Cho 100 àl conjugate vào tất cả cỏc giếng của đĩa ELISA
- Dán kín đĩa bằng miếng dán có sẵn trong bộ kít và ủ đĩa ở nhiệt độ 37 o C ±
3 thời gian 60 phút ± 10 (trong hộp giữ ẩm)
- Rửa đĩa phản ứng 3 lần bằng dung dịch rửa (300àl/giếng)
- Cho 100àl TMB (chất phỏt màu) vào tất cả cỏc giếng Ủ ở nhiệt độ 18 -
- Cho 100àl dung dịch Stop vào tất cả cỏc giếng lắc đều trước khi cho vào máy đọc
- Đọc kết quả phản ứng bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm
Giá trị mật độ quang (OD) của mỗi giếng được đọc ở bước sóng 450nm, sau khi màu phát triển đã được dừng lại
Tính toán giá trị tỷsuất mật độ quang của từng mẫu (so với đối chứng dương) được tính theo công thức:
Giá trịtỷ suất mật độ quang của mẫu(%OD)OD sple -OD neg × 100
OD pos - OD neg Trong đó: ODsple:giátrị mật độ quang của mẫu xét nghiệm,
OD pos :giátrị mật độ quang của đối chứng dương,
OD neg :giátrị mật độ quang của đối chứng âm
Nếu OD ≥ 30%kết quả được coi là dương tính
Nếu OD < 20% kết quả được coi là âm tính
Nếu 20% ≤ OD < 30%kết quả được coi là nghi ngờ
* Sơ đồ bố trí phản ứng trên một khay ELISA như sau:
Mỗi khay chứa 8 dãy, mỗi dãy có 12 lỗ giếng, tổng cộng 46 mẫu huyết thanh được xét nghiệm, với mỗi mẫu được lặp lại 2 lần để tính giá trị OD trung bình Kết quả được so sánh song song với từng cặp đối chứng âm (N) và đối chứng dương (P).
3.6.4.2 Phương pháp xét nghiệm bằng phương pháp RT-PCR
- Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS)
Để chuẩn bị dung dịch, cho lượng hóa chất vào bình thủy tinh và thêm nước cất 2 lần cho đủ 1 lít, sau đó khuấy đều Tiến hành hấp cao áp tiệt trùng ở 110C trong 15 phút và điều chỉnh pH về mức 7,3 ± 0,1.
- Dung dịch chiết tách theo bộ kit InviMAG Virus RNA Kit KFFlex96
- Hóa chất tạo MasterMix theo QIAGEN ® OneStep RT-PCR Kit, Catalogue Number: 210212;
- Hóa chất tạo MasterMix theo Invitrogen SuperScript® III Platinum® One- Step Quantitative RT-PCR System, Catalogue Number: 11732-020
- Đoạn mồi (primers) và Đoạn dò (probe)
- Đối chứng dương: Chia nhỏ vào các tube 0,5 ml, dán nhãn và giữ ở tủ lạnh -80 o C
Trước khi tiến hành pha chế Master Mix, cần xác định thể tích của từng loại nguyên liệu dựa trên số mẫu xét nghiệm sẽ thực hiện Nguyên tắc tính toán là: N phản ứng = số mẫu xét nghiệm + 02 mẫu đối chứng + 01 mẫu hao hụt.
Kết quả tớnh phải được ghi vào cột thể tớch cho N phản ứng (àl) vào phiếu rồi mang vào phòng Master Mix để thực hiện
- Dùng cồn 70 độ để vệ sinh micropipette, mặt bằng làm việc trong PCR Cabinet
- Kiểm tra số lượng các loại tip micropipette
- Chuẩn bị “cool box” để chứa các tube nguyên liệu, tube master mix, đĩa PCR 96 giếng
- Chuẩn bị túi chứa tip micropipette sau khi dùng
- Lấy nguyên liệu từ ngăn âm 20 o C của tủ lạnh để vào ngăn +4 o C để rã đông Vẫn giữ Enzyme Mix ở ngăn âm 20 o C
- Trộn đều nguyên liệu bằng Votex và ly tâm bằng Quick spin để kéo nguyên liệu xuống đáy tube
Các nguyên liệu đã được rã đông ở nhiệt độ +4°C cần được bảo quản trong "cool box" khi đưa vào tủ PCR để chuẩn bị Master Mix Đối với nước không chứa RNA, không cần thiết phải giữ lạnh.
- Căn cứ vào “Tổng thể tích Master Mix cho N phản ứng” để chọn tube chứa Master Mix cho phù hợp
Lấy các nguyên liệu theo thứ tự trong phiếu và cho vào tube chứa Master Mix Do Enzyme Mix không cần đông đá ở âm 20 độ C, nên có thể giữ ở ngăn âm.
20 o C đến khi sử dụng Thể tích của từng loại nguyên liệu theo cột “Thể tích cho N phản ứng (àl)”
Chuẩn bị Master Mix bằng kit Invitrogen
Stt Nguyên liệu Dung dịch mẹ
Thể tích cho 1 phản ứng (àl)
Thể tích cho N phản ứng (àl)
1 Nước không có RNA và DNA 5,5
4 Mồi xuụi FMDV_Callahan 3DF 20 àM 0,5
5 Mồi ngược FMDV_Callahan 3DR 20 àM 0,5
6 Đoạn dũ FMDV_Callahan 3DP 6 àM 0,5
8 Mồi ngược FMDV_SA-IR-315-293R 20 àM 1
9 Đoạn dò FMDV_SAmulti2-P-IR-
Tổng thể tích Master mix cho 1 phản ứng 20
Tổng thể tích cho 1 phản ứng 25
- Để các tube nguyên liệu (dung dịch mẹ) trở lại ngăn âm 20 o C của tủ lạnh, đúng vị trí quy định