Ứng dụng dấu chuẩn phân tử trong chọn giống cà chua cho năng suất cao

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây cà chua

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nơi các loài cà chua hoang dại gần gũi được mang đến Trung Mỹ và Mexico Sau đó, người Tây Ban Nha đã đưa cà chua về châu Âu, đặc biệt là vùng Địa Trung Hải, nơi nó được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau Vào năm 1554, nhà thực vật học Pier Andrea Mattioli đã giới thiệu các giống cà chua từ Mexico với màu vàng và đỏ nhạt Đến năm 1650, ở Bắc Âu, cà chua chỉ được sử dụng để trang trí và thỏa mãn sự tò mò của mọi người.

Thomas Jefferson (1710) đã thử trồng cà chua nhưng không đạt được kết quả như mong đợi trong việc cải tiến giống Mặc dù cà chua được sử dụng làm thực phẩm ở Anh từ năm 1750, nhưng vẫn bị xem là không an toàn do liên quan đến cây cà độc dược Đến cuối thế kỷ 18, cà chua mới được chấp nhận ở Nga và Italia Đến thế kỷ 19 (1830), cà chua đã trở thành thực phẩm thiết yếu trong bữa ăn hàng ngày Năm 1860, các giống cà chua mới được giới thiệu tại Mỹ và trong thời gian này, cà chua cũng trở thành cây trồng chủ lực tại Pháp.

Quá trình cải tiến giống cà chua được thực hiện liên tục bởi các nhà chọn tạo, dẫn đến sự phong phú và đa dạng của các giống cà chua, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng toàn cầu.

1.1.2 Đặc điểm thực vật học

Hệ rễ cây cà chua thuộc loại rễ chùm, có khả năng ăn sâu trong đất Rễ phụ cấp

Rễ cà chua phân bố dày đặc trong đất trong thời kỳ sinh trưởng mạnh, có khả năng ăn sâu tới 1,5m, nhưng dưới 1m thì ít rễ và khả năng hút nước, chất dinh dưỡng ở tầng đất 0,5m yếu Hệ rễ cà chua có khả năng tái sinh mạnh mẽ, khi rễ chính bị đứt, rễ phụ sẽ phát triển mạnh Do đó, nhà vườn có thể nhổ cây giống ở giai đoạn 2-3 lá thật và trồng "tạm" ở nơi có diện tích dinh dưỡng rộng hơn trong vườn ươm để kích thích sự phát triển của hệ rễ.

Cây cà chua có khả năng ra rễ bất định, chủ yếu tập trung ở đoạn thân dưới 2 lá mầm Nhờ đặc điểm này, kỹ thuật trồng trọt có thể áp dụng phương pháp nhân giống vô tính Để thực hiện, cắt những đoạn thân có tuổi sinh trưởng trung bình thành từng đoạn ngắn từ 15-18cm, sau đó trồng vào hàng Khi trồng, cần đặt xiên và vùi sâu vào đất từ 5-7cm để tạo điều kiện thuận lợi cho rễ phát triển.

Hệ rễ của cây cà chua chịu ảnh hưởng lớn từ điều kiện môi trường, đặc biệt là nhiệt độ và độ ẩm của đất Khi nhiệt độ đất ở mức 18-20°C, rễ phụ phát triển mạnh mẽ, nhưng nếu nhiệt độ giảm xuống 14-16°C, sự phát triển của rễ sẽ chậm lại từ 15-20 ngày Nhiệt độ cao trên 35°C có thể gây cản trở sự phát triển của rễ và thậm chí dẫn đến chết rễ Mặc dù rễ cà chua tương đối chịu hạn, nhưng chúng phát triển tốt nhất trong đất có khả năng giữ ẩm từ 70-80%.

Cây cà chua có thân bò lan hoặc mọc thành bụi, với đặc điểm thay đổi theo giống, điều kiện môi trường như nhiệt độ và dinh dưỡng Ở giai đoạn cây con, thân cây tròn, màu tím nhạt, phủ lông tơ dày, giòn và dễ gãy, dễ bị tổn thương.

Khi trưởng thành, cây cà chua có màu xanh nhạt hơi tối và có tiết diện đa giác, với phần gốc hóa gỗ cứng cáp Thân cây phát triển theo kiểu lưỡng phân, tạo ra các chùm hoa trên thân chính và các cành, do đó, thân chính đóng vai trò quan trọng trong sản lượng của cây Các chồi phát triển mạnh ở nách lá, đặc biệt trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm không khí phù hợp.

Lá cà chua là đặc điểm chính để phân biệt các giống cà chua khác nhau, thuộc loại lá kép lông chim lẻ với mỗi lá hoàn chỉnh có 3-4 đôi lá chét Tùy thuộc vào giống, ngọn lá có thể có một phiến lá riêng gọi là lá đỉnh, và giữa các đôi lá chét thường có lá giữa, trong khi trên gốc lá chét có những phiến lá nhỏ gọi là lá bên Bộ lá không chỉ có hình thái đặc trưng mà còn ảnh hưởng lớn đến năng suất, vì số lượng lá trên cây ít và khi lá bị bệnh sẽ tác động tiêu cực đến sản lượng quả.

Số lượng lá của cây không chỉ phụ thuộc vào đặc tính di truyền của giống mà còn bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ Để cây hình thành được 10 lá đầu tiên sau khi trồng, nhiệt độ trung bình cần đạt trên 13°C Để hình thành 20 lá, nhiệt độ trung bình ngày và đêm phải đạt khoảng 24°C Nếu nhiệt độ thấp hơn 13°C, quá trình xuất hiện lá mới sẽ bị chậm lại.

Hoa cà chua là hoa hoàn chỉnh với cấu trúc bao gồm lá đài, cánh hoa, nhị và nhụy, chủ yếu tự thụ phấn do đặc điểm cấu tạo Nhụy thường nằm ở vị trí thấp hơn các bao phấn, trong khi hoa cà chua nhỏ, không có màu sắc sặc sỡ và không có mùi thơm, điều này khiến chúng ít hấp dẫn côn trùng.

Hoa cà chua mọc thành chùm và được gắn kết bởi cuống ngắn Khi gặp điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi như nhiệt độ, độ ẩm và chất dinh dưỡng, một lớp tế bào ở cuống hoa sẽ phình to và hình thành tầng rời, dẫn đến hiện tượng hoa rụng Để giảm thiểu tình trạng này trong quá trình ra hoa, việc áp dụng các biện pháp kỹ thuật tiên tiến là rất cần thiết.

Cà chua có ba loại chùm hoa: chùm đơn giản, chùm trung gian và chùm phức tạp Chùm đơn giản có một trục chính với hoa mọc so le, trong khi chùm trung gian thường có hai nhánh chính Chùm phức tạp thì phân chia thành nhiều nhánh Số lượng chùm hoa trên cây trong một chu kỳ sống có thể lên tới 20 chùm hoặc nhiều hơn, tùy thuộc vào giống, điều kiện ngoại cảnh và kỹ thuật trồng trọt.

Quả cà chua chín thuộc loại quả mọng bao gồm: vỏ, thịt quả, vách ngăn, giá noãn

Quả cà chua được cấu tạo từ 2 ngăn đến nhiều ngăn Hầu hết các giống trồng trọt, loại quả trung bình trở lên có trên 3 ngăn

Khối lượng quả cà chua có sự chênh lệch lớn giữa các loài, dao động từ 2-3g đến 200-300g Dựa vào khối lượng, quả cà chua được phân loại thành ba cấp: quả nhỏ dưới 50g, quả trung bình từ 50-100g và quả to trên 100g.

Hình dạng quả có sự đa dạng giữa các loài và ngay cả trong cùng một loài, chủ yếu bao gồm các dạng tròn, tròn bẹt, o van, hình quả lê và dạng quả anh đào.

Giá trị dinh dƣỡng và ý nghĩa kinh tế của cà chua

Cà chua là một loại rau dễ chế biến, cung cấp nguồn dinh dưỡng quý giá cho người tiêu dùng trên toàn thế giới Mỗi 100g cà chua chín chứa 94g nước, 0,6g protide, 4,2g gluxid, 12mg canxi, 26mg photpho, 1,4mg sắt, 2mg caroten, 0,06mg B1, 0,04mg B2 và 40mg vitamin C Cà chua nổi bật với hàm lượng caroten cao và khả năng hấp thu tốt cho mọi lứa tuổi, trong khi vitamin C trong cà chua ít bị hao hụt khi nấu Người dùng có thể thưởng thức cà chua dưới dạng tươi, nấu chín hoặc chế biến công nghiệp.

Cà chua là một trong những loại rau có giá trị kinh tế cao, lý do khiến nó được trồng trên diện tích lớn hơn so với nhiều loại rau phổ biến khác Trong danh sách các loại rau thường dùng, cà chua đứng đầu về diện tích trồng trọt, cho thấy tầm quan trọng của nó trong sản xuất nông nghiệp.

Bảng 1.1 Diện tích rau trồng trên thế giới [25]

Rau trồng Diện tích trồng trọt

Cà chua là một trong những nông sản có giá trị xuất nhập khẩu cao, bao gồm cả dạng tươi và chế biến Năm 1986, lượng cà chua tươi giao dịch trên thị trường quốc tế đạt từ 21,6 đến 22,7 triệu tấn Đặc biệt, khoảng 98-99% lượng cà chua Mỹ nhập khẩu trong mùa đông đến từ Mexico, trong khi 96% cà chua nhập khẩu của Singapore có nguồn gốc từ Malaysia Đài Loan cũng đóng góp vào thị trường với giá trị xuất khẩu hàng năm đạt 952.000 USD cho cà chua tươi và 40.800 USD cho cà chua chế biến.

Thu nhập của nông dân từ việc trồng cà chua trên mỗi hecta ở các quốc gia khác nhau có sự chênh lệch đáng kể: Đài Loan đạt 4.860 USD, Nigeria từ 2.700-3.000 USD, Ethiopia là 5.251 USD, và Thái Lan chỉ khoảng 672 USD Đặc biệt, sản xuất hạt giống cà chua mang lại cho nông dân Thái Lan lợi nhuận cao hơn, dao động từ 6.000-10.000 USD/ha.

Tình hình phát triển sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam

Cà chua đã trở thành món ăn phổ biến trên toàn thế giới hơn 150 năm qua và là cây rau ăn quả được trồng rộng rãi Trong 5 năm gần đây, diện tích trồng cà chua toàn cầu ổn định và có xu hướng tăng từ năm 2007 đến 2011 Sản lượng cà chua toàn cầu đã tăng đáng kể, từ 137,29 triệu tấn năm 2007 lên 152,96 triệu tấn năm 2009, sau đó tiếp tục tăng với tốc độ chậm hơn.

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới trong những năm gần đây [35]

Cà chua là loại cây trồng được canh tác quanh năm trên toàn cầu, mặc dù nhạy cảm với sương giá, nhưng vẫn có thể phát triển thành công từ Ecuador đến Alaska nhờ vào các biện pháp che chắn Hiện nay, sản xuất cà chua đã trở nên chuyên môn hóa cao, với việc ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật vào quy trình canh tác.

Bảng 1.3 Diện tích trồng cà chua của các nước dẫn đầu thế giới từ năm 2007-2011 (ngàn ha) [35]

Mặc dù Châu Á là nơi phát triển cà chua muộn, nhưng đây lại là châu lục có diện tích trồng cà chua lớn nhất thế giới, gấp 4-5 lần so với các châu lục khác Trong số các quốc gia có diện tích trồng cà chua lớn, Trung Quốc đứng đầu với diện tích trồng cà chua lớn nhất.

Sản lượng cà chua toàn cầu có sự biến đổi qua các năm, với Trung Quốc dẫn đầu về sản lượng, theo sau là Ấn Độ và một số quốc gia khác Từ năm 2007 đến 2011, sản lượng cà chua của Trung Quốc đã tăng mạnh từ 36,10 triệu tấn lên 48,57 triệu tấn, góp phần lớn vào sự tăng trưởng toàn cầu Sự phát triển này nhờ vào diện tích trồng cà chua rộng lớn và ứng dụng công nghệ khoa học kỹ thuật tiên tiến trong sản xuất và lai tạo giống mới.

Bảng 1.4 Sản lượng cà chua của các nước dẫn đầu thế giới (triệu tấn) [35]

Cà chua là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao tại Việt Nam, với diện tích trồng tăng mạnh từ 7.509 ha năm 1996 lên 17.834 ha năm 2001, và đạt 24.850 ha vào năm 2008 Sản lượng cà chua cũng tăng đáng kể, từ 118.523 tấn năm 1996 lên 535.438 tấn năm 2008 Tuy nhiên, trong những năm gần đây, diện tích trồng cà chua đã tương đối ổn định và có xu hướng giảm trên toàn quốc Trong 15-20 năm qua, nghề trồng cà chua ở các tỉnh phía Nam đã trải qua những thay đổi lớn.

Diện tích trồng cà chua ở các tỉnh đồng bằng Nam bộ đang giảm dần, nhường chỗ cho các loại cây rau khác có hiệu quả kinh tế cao hơn và dễ trồng hơn như dưa leo, khổ qua và các loại rau ăn lá Cụ thể, trước đây TP Hồ Chí Minh, Long An, Tiền Giang mỗi năm có hàng trăm hecta trồng cà chua, nhưng hiện nay chỉ còn khoảng vài chục hecta.

Lâm Đồng đã có sự phát triển mạnh mẽ, không chỉ bù đắp cho diện tích giảm của các tỉnh đồng bằng mà còn mở rộng gấp đôi so với trước đây Cụ thể, vào đầu những năm 2000, diện tích của Lâm Đồng chỉ khoảng 3.000 - 4.000 ha, nhưng đến cuối những năm 2010, con số này đã tăng lên 6.000 ha.

Sự thay đổi trong sản xuất nông nghiệp ở các tỉnh đồng bằng do việc sử dụng giống cây chịu nóng ẩm có năng suất thấp và rủi ro bệnh tật Lâm Đồng, với lợi thế nhiệt độ thấp, đã nhanh chóng thay thế nghề trồng cà chua nhờ công nghệ trồng cây ghép, giảm thiểu rủi ro héo rũ vi khuẩn Năng suất cà chua ở Lâm Đồng đạt gần gấp đôi so với các tỉnh đồng bằng, cho thấy sự thay đổi này là bền vững Lâm Đồng chiếm hơn 70% diện tích cà chua miền Nam và có xu hướng phát triển mạnh với công nghệ cao, cho phép trồng quanh năm ở các vùng cao như Đắc Lắc, Gia Lai, Kon Tum và vụ Đông Xuân ở miền Trung Các thí nghiệm trồng giống cà chua từ Lâm Đồng tại Quảng Ngãi và Đăk Lắc đạt năng suất 35 tấn/ha và 50 tấn/ha, chứng minh sự phù hợp của giống này.

Bảng 1.5 Tình hình sản xuất cà chua của Việt Nam những năm gần đây

Sản xuất cà chua ở Việt Nam hiện gặp nhiều khó khăn, bao gồm việc thiếu giống tốt phù hợp cho từng vụ trồng, quy trình sản xuất còn manh mún và chưa có sản phẩm hàng hóa lớn phục vụ cho chế biến công nghiệp Ngoài ra, quá trình canh tác và thu hái vẫn diễn ra hoàn toàn thủ công.

Việt Nam sở hữu lợi thế rõ rệt trong sản xuất cà chua nhờ vào khí hậu, thời tiết và đất đai phù hợp, điều này giúp nâng cao năng suất nếu được đầu tư đúng mức Diện tích trồng cà chua còn rất lớn, đặc biệt trong vụ Đông mà không ảnh hưởng đến hai vụ lúa, mang lại sản phẩm trái vụ so với Trung Quốc, quốc gia dẫn đầu về sản lượng cà chua toàn cầu Hơn nữa, các vùng trồng cà chua có nguồn lao động dồi dào và nông dân có kinh nghiệm canh tác, từ đó tạo ra khả năng cạnh tranh cao về giá thành.

Vai trò của dấu chuẩn phân tử trong chọn giống thực vật

Dấu chuẩn phân tử là đặc điểm hóa học hoặc cấu trúc phân tử được di truyền cho thế hệ sau, tương tự như các nhân tố di truyền của Mendel, nhưng có thể định lượng Có hai loại dấu chuẩn phân tử cơ bản.

Isozyme là các enzyme có khả năng xúc tác cho cùng một phản ứng hóa học nhưng bị ức chế bởi những phân tử khác nhau Về mặt di truyền, isozyme có thể được phân chia thành hai dạng khác nhau.

Isozyme đơn gen là những isozyme được kiểm soát bởi một gen duy nhất Mặc dù chúng được hình thành từ một chuỗi polypeptide đơn, nhưng có thể tồn tại các kiểu phân tử khác nhau do sự khác biệt về thành phần và trật tự acid amin Những khác biệt này cho phép chúng được phân tách bằng phương pháp điện di.

Isozyme đa gen là các isozyme được mã hóa bởi hai hoặc nhiều gen khác nhau Chúng có thể được phân biệt thông qua các đặc điểm hóa miễn dịch hoặc các tính chất enzyme Dấu chuẩn phân tử DNA cũng đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và phân tích các isozyme này.

Khác với dấu chuẩn isozyme, dấu chuẩn phân tử DNA rất đa dạng, ổn định và không phụ thuộc vào yếu tố môi trường Chúng được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài khác nhau, từ đó hỗ trợ phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa (Ahn et al, 1993; Dunforal et al, 1995) Ngoài ra, các dấu chuẩn này còn giúp trong việc lựa chọn tổ hợp lai Dấu chuẩn phân tử được chia thành hai nhóm lớn.

Dấu chuẩn dựa trên lai DNA hoặc chỉ thị RFLP có ưu điểm trong việc phát hiện cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử, đồng thời phân biệt được giữa đồng hợp tử trội và đồng hợp tử lặn, vì vậy được gọi là dấu chuẩn đồng trội Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là quy trình phức tạp, khó tự động hóa, tốn kém và yêu cầu sử dụng chất đồng vị phóng xạ nguy hiểm cho con người.

Dấu chuẩn phân tử dựa trên nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR đã được phát triển đa dạng, bao gồm các phương pháp như AFLP, RAPD và SSR Những kỹ thuật này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và phân tích các đặc điểm di truyền.

1.4.2 Chọn lọc nhờ dấu chuẩn SSR dựa vào PCR

Tính biến dị di truyền giữa các giống trong một loài cây có thể được phát hiện thông qua sự khác biệt về chiều dài đoạn DNA được nhân bản bằng phương pháp PCR với cùng một cặp primer Sự khác biệt này xuất phát từ việc thay thế bazo nito tại các điểm liên kết primer hoặc do sự sắp xếp lại trật tự DNA trong khu vực chứa các điểm đó.

SSR (Simple Sequence Repeats), hay còn gọi là vi vệ tinh (microsatellites), là đoạn DNA với sự lặp lại của trật tự nucleotide đơn giản, phổ biến ở sinh vật Eukaryote, bao gồm động vật và thực vật Các kiểu lặp lại của SSR rất đa dạng, chủ yếu được phân thành ba loại: lặp lại hoàn toàn, lặp lại không hoàn toàn và lặp lại phức tạp SSR thường xuất hiện tại các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể, như vùng tâm động và đầu mút, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa phiên mã các gen và tăng cường tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào Ngoài ra, chúng cũng có thể chứa thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở động vật và thực vật.

Kỹ thuật SSR cho phép phát hiện tính đa hình về độ dài các trật tự nucleotide đơn giản thông qua nguyên tắc PCR và phương pháp điện di trên gel Sự khác biệt về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại giúp phát hiện đa hình SSR sau quá trình điện di Theo McCouch (1996), kỹ thuật này hiệu quả trong phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài do tính đa dạng giữa các alleles thuộc cùng một locus Ở một số cây trồng, các dấu chuẩn SSR đã được sử dụng để xây dựng bản đồ di truyền liên kết, như ở cà chua với 32 SSR mang các đơn vị lặp lại (GACA) và (GATA) SSR cũng cho thấy ưu thế hơn so với các dấu chuẩn RAPD trong việc phân biệt sự sai khác giữa các thứ cây trồng (Havey, 1997) Một ứng dụng quan trọng khác của SSR là xác định giới tính ở thực vật.

Giới thiệu về dấu chuẩn SSR

1.5.1 Cơ chế hình thành dấu chuẩn SSR

Cơ chế hình thành microsatellites vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn, nhưng các nghiên cứu di truyền cho rằng chúng xuất hiện chủ yếu do hai quá trình: bắt chéo lỗi trong giảm phân và trượt lỗi trong sao mã Trong đó, trượt lỗi trong sao mã, xảy ra trên mạch chậm (lagging strand), được xem là nguyên nhân chính Quá trình này liên quan đến việc enzyme polymerase trượt lỗi trên phân tử DNA mới tổng hợp, dẫn đến việc tạo ra các phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong sửa lỗi hoặc kéo dài thêm ở mạch đối diện, tạo thành các đoạn lặp lại dài hơn.

Hình 1.2 Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân [5]

Hình 1.3 Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã [5]

1.5.2 Vai trò của dấu chuẩn SSR

Nhiều microsatellites đã được phát hiện ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã trong vùng mang mã, tuy nhiên chức năng của chúng vẫn chưa được làm rõ Những vùng này tồn tại giữa các exon và có liên quan đến các bệnh di truyền.

Microsatellites được sử dụng như dấu chuẩn di truyền trong nghiên cứu di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa và lập bản đồ gen, đồng thời cũng có vai trò như yếu tố mang mã và nhân tố điều hòa Chúng xuất hiện phổ biến ở vùng khởi đầu sao mã và một số liên quan đến vùng mã hóa Sự khác biệt về số lượng các đoạn lặp lại microsatellites trong vùng mã hóa ảnh hưởng đến biểu hiện và chức năng của gen Thay đổi trong các đơn vị lặp lại microsatellites có thể làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor, với vị trí của chúng gần hay xa promotor cũng tác động đến hoạt động này Vùng điều khiển chứa microsatellites thúc đẩy quá trình phiên mã, và các đột biến mất đoạn microsatellites có thể làm giảm chức năng của gen.

1.5.3 Ƣu và nhƣợc điểm của dấu chuẩn SSR

Thuận lợi to lớn của sự phân tích microsatellites là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình

Microsatellites là dấu chuẩn đồng trội, giúp xác định dị hợp tử một cách dễ dàng Tính đồng trội của microsatellites nâng cao hiệu quả và độ chính xác trong các phép tính toán di truyền quần thể, so với những dấu chuẩn khác.

Phương pháp microsatellites gặp hạn chế khi không thể áp dụng phân tích cho các hệ thống lớn với nhiều loài có quan hệ di truyền xa Nguyên nhân là do tỷ lệ đột biến cao của microsatellites gây ra hai trở ngại chính Thứ nhất, trình tự vùng flanking ở hai bên microsatellites thường khác nhau giữa các loài, làm cho việc sử dụng primer microsatellites của một loài cho loài khác trở nên khó khăn Thứ hai, khi hai loài có cùng kết quả phân tích với một trình tự microsatellites, chẳng hạn như AC 19, chúng ta không thể khẳng định rằng chúng có cùng nguồn gốc tổ tiên, vì có thể một loài đã phân ly từ tổ tiên chung của chúng.

AC 18 rồi đột biến thành AC 19 còn 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC 20 rồi đột biến thành AC 19 [7].

Phương pháp ly trích DNA

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử bắt đầu bằng việc thu nhận DNA tinh sạch với chất lượng cao Kỹ thuật tách chiết DNA cần chú trọng vào việc giữ cho các phân tử DNA nguyên vẹn, tránh bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học và hóa học Để đạt được điều này, quá trình tách chiết cần tuân theo các bước cơ bản nhằm đảm bảo hiệu quả và chất lượng của DNA thu được.

1.6.1 Phá vỡ màng tế bào và nhân

Nghiền tế bào trong nitơ lỏng hoặc đá lạnh kết hợp với dung dịch chiết xuất chứa muối NaCl, Tris-HCl, EDTA, SDS và protein K giúp phá vỡ màng tế bào và nhân, từ đó giải phóng DNA Nhiệt độ lạnh cùng với các hóa chất này có tác dụng hiệu quả trong quá trình chiết xuất DNA.

- Nhiệt độ lạnh và EDTA làm giảm hoạt tính của men phân giải DNA (DNAse)

SDS kết hợp với protein K có khả năng phân giải và làm biến tính protein liên kết với DNA Khi SDS bao bọc protein, nó sẽ phá vỡ tất cả các liên kết không cộng hóa trị.

- NaCl và Tris-HCl có tác dụng tẩy rửa carbohydrate, lipid và tinh bột

1.6.2 Hòa tan DNA và loại bỏ tạp chất

Khi chiết xuất DNA, mẫu thường chứa protein, RNA, carbohydrate và lipid, do đó cần loại bỏ các tạp chất này Hiện nay, phenol/chloroform/isoamyl (PIC) với tỷ lệ 25:24:1 được sử dụng để tách DNA và kết tủa các tạp chất Sau khi ly tâm, phần dung dịch nước phía trên ống nghiệm sẽ chứa DNA hòa tan, trong khi phần kết tủa ở đáy ống nghiệm là các tạp chất không mong muốn.

Mục đích của việc kết tủa DNA là thu được DNA ở dạng cô đặc, bảo vệ khỏi sự phân hủy bởi enzyme DNAse và cho phép hòa tan lại theo nồng độ mong muốn khi cần Để thực hiện quá trình này, chúng ta có thể sử dụng hai hóa chất.

Kết tủa DNA bằng ethanol lạnh 100% giúp thu được DNA hoàn toàn, với khả năng quan sát DNA dưới dạng vẩn đục mờ Ngoài ra, ethanol còn có tác dụng loại bỏ một số muối (ngoại trừ NaCl) và nhiều phần tử hữu cơ nhỏ khác.

Kết tủa DNA bằng isopropanol với tỷ lệ dung dịch mẫu tương đương là một phương pháp phổ biến, nhưng gặp khó khăn trong việc loại bỏ một số muối khó tan Những muối này thường kết tủa cùng với DNA, do đó cần thực hiện nhiều lần rửa để loại bỏ hoàn toàn các tạp chất còn sót lại.

Sau khi thực hiện bước kết tủa, DNA sẽ được thu nhận dưới dạng pellet qua quá trình ly tâm Tiếp theo, pellet này cần được rửa nhiều lần bằng ethanol 70% và để khô tự nhiên cho đến khi ethanol bay hơi hoàn toàn Cuối cùng, DNA pellet được hòa tan trong dung dịch TE (gồm 10mM Tris-HCl, pH 8.0 và 1mM EDTA) và được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -4 0 C hoặc -20 0 C.

Phương pháp PCR

Phương pháp PCR, được phát minh bởi Kary Mullis và cộng sự vào tháng 10 năm 1985, đã tạo ra một bước đột phá lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử và kỹ thuật gen Nguyên tắc của PCR dựa trên tính chất biến tính, hồi tính và nguyên lý tổng hợp DNA.

Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase, enzyme có khả năng sử dụng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới Để tạo ra các sợi DNA mạch đơn, dung dịch DNA mạch kép cần được đun nóng đến gần nhiệt độ sôi.

Tất cả các DNA polymerase cần có sự hiện diện của mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn mẫu Mồi là các đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, từ đó DNA sẽ kéo dài mồi để hình thành mạch mới Trong quá trình này, hai mồi chuyên biệt được sử dụng: một mồi xuôi và một mồi ngược, với “xuôi” và “ngược” được hiểu theo chiều phiên mã của gen.

1.7.2 Nguyên lý chung của phương pháp PCR

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

Giai đoạn biến tính (Denaturation) xảy ra ở nhiệt độ cao từ 94°C đến 95°C, vượt quá nhiệt độ nóng chảy của DNA khuôn, dẫn đến sự đứt gãy các liên kết hydro trong phân tử DNA, làm cho hai mạch DNA tách rời Đặc biệt, các đoạn khuôn DNA có nhiều nucleotide giống nhau hoặc tỷ lệ G-C cao sẽ có nhiệt độ biến tính cao hơn.

Giai đoạn gắn mồi (Annealing ) : ở nhiệt độ khoảng 55 0 C – 65 0 C để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn Giai đoạn này khoảng 30 – 60 giây

Giai đoạn tổng hợp (Elongation) diễn ra ở nhiệt độ 72°C, tối ưu cho hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA Thời gian cho giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.

Phản ứng PCR thường trải qua 20-40 chu kỳ, trong đó mỗi đoạn DNA khuôn có thể tạo ra từ 2^20 đến 2^40 bản sao DNA Trong quá trình thực hiện phản ứng, cần chú ý rằng lượng khuôn sẽ tăng lên trong khi lượng mồi và dNTP tự do giảm, đồng thời hoạt động của enzyme DNA polymerase cũng yếu dần Do đó, việc tính toán hàm lượng mồi, dNTP và enzyme là rất quan trọng để đảm bảo phản ứng PCR đạt hiệu quả tốt nhất.

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng PCR [36]

Phương pháp phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc

Sự phát triển của sinh học phân tử đã thúc đẩy việc phân nhóm đa dạng di truyền ở cấp độ phân tử, mang lại độ chính xác cao hơn so với các phương pháp truyền thống dựa vào tính trạng hình thái học.

Các phương pháp nghiên cứu sự đa dạng của quần thể cung cấp dữ liệu phân tử phức tạp như band vạch trên bảng điện di hoặc thông tin trình tự DNA, RNA, protein Để trích xuất thông tin sinh học từ dữ liệu thô này, các nhà khoa học cần sự hỗ trợ của máy tính và các phần mềm phân tích dữ liệu thực nghiệm.

Phần mềm NTSYSpc là ứng dụng phổ biến giúp giải thích sự đa dạng của các tập hợp sinh vật thông qua mối quan hệ tiến hóa của chúng Ứng dụng này cho phép xây dựng cây tiến hóa dựa trên dữ liệu mô tả các tập hợp sinh vật Phân tích nhóm (cluster analysis) là phương pháp sắp xếp các giống thành cụm dựa trên mức độ tương đồng theo quy ước Quy trình phân tích nhóm được thực hiện theo các bước cụ thể để đảm bảo độ chính xác và tính khoa học.

- Tìm các cặp (i, j) có giá trị khoảng cách nhỏ nhất (hoặc giống nhau nhất)

- Nhập các cặp này thành một nhóm

- Tạo ra các nhóm lớn hơn ứng với nhóm mới sao cho các cặp (i, j) mới tương thích với mức độ giống nhau

NTSYSpc sử dụng phương pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic) để xếp nhóm di truyền một cách đơn giản và nhanh chóng, với cách tính khoảng cách trung bình dựa trên giá trị số đại số.

Cách tính phương pháp UPGMA bằng tay: [2]

- Tìm giá trị khoảng cách nhỏ nhất trong ma trận khoảng cách

- Xếp hai nhóm isolate này lại với nhau, theo giá trị khoảng cách cụ thể ghi giữa hai điểm

Xây dựng ma trận khoảng cách mới bằng cách phối hợp giữa hai isolate gần nhất trong một nhóm riêng Khoảng cách giữa hai nhóm mới và một isolate khác sẽ được ghi nhận dựa trên giá trị khoảng cách trung bình của isolate mới so với các isolate trong nhóm.

- Lập lại quy trình cho đến hết

Ví dụ: ma trận khoảng cách có 5 isolate

Trong đó, dij là khoảng cách giữa isolate i và isolate j

Ví dụ: khoảng cách giữa isolate 3 và 4 (d 34 ) là ngắn nhất Hai isolate này được xếp vào một nhóm với khoàng cách điểm nhánh là (d 34 /2)

Ma trận khoảng cách mới trên cở sở nhóm (3, 4) và những isolate khác

Trong ma trận mới, tìm giá trị khoảng cách nhỏ nhất Ví dụ ở đây là d 12 , như vậy có nhóm (1,2) được hình thành

Như vậy có thêm một ma trận khoảng cách mới

Trong đó, d(1,2)5 được tính toán giống như trên, trong khi đó d(1,2)(3,4) được tính toán bằng cách lấy trung bình của d 1(3,4) và d 2(3,4)

Khi phân tích giá trị khoảng cách của ma trận mới, chúng ta nhận thấy rằng cặp (1,2) và (3,4) có khoảng cách ngắn nhất Điều này cho thấy rằng hai nhóm (1, 2) và (3, 4) thuộc cùng một nhóm ((1,2),(3,4)) với khoảng cách tối thiểu.

Ma trận mới được tính toán bằng cách lấy trung bình của d 5(1,2) và d 5(3,4)

Giá trị khoảng cách d5((1,2),(3,4)) =[ d 5(1,2) + d 5(3,4) ] / 2 cuối cùng ta có giản đồ phân 5 nhóm như sau :

Hàm lượng thông tin tính đa hình PIC (Polymorphic Information Content) cho mỗi locus SSR (i) được tính theo công thức (Weir, 1996):

PIC (i) = 1- Σ P ij 2 Trong đó : P ij làtần suất alen thứ j với locus SSR thứ i [8]

1.9 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền ở cà chua trên thế giới và Việt Nam

Do số lượng dấu chuẩn SSR trong nghiên cứu chọn giống cà chua còn hạn chế, C He và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu nhằm phát triển thêm các dấu chuẩn SSR Họ đã tìm kiếm và phân tích 500 trình tự DNA của cà chua để thiết kế mồi phản ứng PCR, và trong số đó, 158 cặp mồi SSR đã được sàng lọc và thử nghiệm trên 19 giống cà chua trồng.

Trong nghiên cứu, 65 dòng cà chua được phân tích với tần suất thông tin đa hình PIC từ 0,09 đến 0,67, cho thấy các dấu chuẩn phân tử mới có thể hỗ trợ hiệu quả trong việc định danh và chọn giống Nhằm nâng cao năng suất cà chua, một nhóm nghiên cứu tại trường đại học nông nghiệp Nanjing, Trung Quốc, đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của 39 dòng cà chua từ 4 quốc gia (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Hoa Kỳ), đại diện cho hai châu lục Thông tin về khoảng cách di truyền sẽ hữu ích cho các nhà lai tạo trong việc xác định mối tương quan giữa các dòng bố mẹ.

Nghiên cứu của Pritesh và cộng sự (2008) cho thấy trong 25 giống cà chua, 23 cặp mồi SSR được sử dụng, trong đó có 13% mồi không biểu hiện khuếch đại PCR Kết quả cho thấy 40 alen được thể hiện, với hệ số PIC thấp nhất là 0,08 ở mồi SSR304.

Cà chua là cây trồng quan trọng tại Eritrea, nhưng năng suất trung bình ở đây thấp hơn so với Châu Phi và Ý Samuel Asgedom và cộng sự (2010) đã nghiên cứu đa dạng di truyền của 25 giống cà chua ở Eritrea, sử dụng 15 dấu chuẩn phân tử để so sánh với các giống từ Châu Phi và Ý Kết quả cho thấy giống cà chua ở Eritrea kém đồng đều hơn Nguyên nhân có thể do nông dân trộn lẫn hạt giống để điều chỉnh thời gian thu hoạch, nhằm đạt năng suất ổn định và khả năng chống chịu với stress.

Năm 2011, S Geethanjali và cộng sự đã nghiên cứu và phát triển dấu chuẩn SSR từ nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo trên NST 12 của cà chua, đồng thời đánh giá công dụng của các dấu chuẩn này trong phân tích đa dạng di truyền và thiết lập bản đồ gen Việc phát triển dấu chuẩn SSR rất hữu ích vì nhiều gen liên quan đến các đặc điểm quan trọng như bệnh héo rủ vi khuẩn, khảm virus, đầu bạc lá, và nấm mốc nằm trên NST 12.

Năm 2012, Mohamed A.M El-Awady đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của 10 giống cà chua từ các nguồn gốc khác nhau (Đức, Mỹ, Ai Cập, Mexico) bằng 20 dấu chuẩn SSR, trong đó 2 dấu chuẩn (10%) không có band DNA, 5 dấu chuẩn (25%) có band DNA nhưng thể hiện trạng thái đơn hình, và 13 dấu chuẩn (65%) cho trạng thái đa hình Tại Việt Nam, việc sử dụng dấu chuẩn phân tử trong phân tích đa dạng di truyền ở các loài đã trở nên phổ biến, tuy nhiên, công tác chọn giống cà chua chủ yếu vẫn dựa vào phương pháp truyền thống, dẫn đến thời gian lâu và rủi ro cao Gần đây, Dương Kim Thoa đã sử dụng 6 mồi SSR để phân tích đa dạng di truyền của 34 giống cà chua, và kết quả cho thấy tất cả sản phẩm từ các mồi SSR đều cho sự đa hình.

Ưu thế lai là hiện tượng con lai F1 vượt trội hơn bố mẹ về một hoặc một số tính trạng như năng suất, chất lượng, thời gian sinh trưởng, sinh khối, tính thích ứng và khả năng chống chịu sâu bệnh Mức độ ưu thế lai phụ thuộc vào loại cây trồng, loại tính trạng và thực liệu bố mẹ, với ưu thế lai mạnh nhất ở đời F1 và giảm dần ở các thế hệ sau Thành công trong tạo giống lai phụ thuộc vào việc tìm kiếm cặp bố mẹ có khả năng kết hợp tốt Ứng dụng ưu thế lai đã được áp dụng sớm trong chọn tạo giống cà chua, với nghiên cứu cho thấy nhiều tổ hợp lai mang lại ưu thế lai dương cao hơn bố mẹ tốt nhất về khối lượng quả, số quả trên cây, chiều cao cây và năng suất cá thể, trong khi ưu thế lai âm được ghi nhận về thời gian từ trồng tới ra hoa.

Khi đánh giá ưu thế lai của 21 tổ hợp lai F1 và 7 dòng bố mẹ trong lai diallel, đã xác định được ưu thế lai ở 6 tính trạng khác nhau Cặp lai Fujuki × World Champion cho thấy ưu thế lai cao nhất về năng suất cá thể đạt 124,2% và hàm lượng acid ascorbic tăng 17%.

Kết quả thí nghiệm lai giữa giống Rutgers và 5 giống khác cho thấy giống Rutgers có ưu thế về tổng khối lượng quả, cao hơn từ 2,04 đến 35,56% so với giống bố mẹ tốt nhất Tuy nhiên, số quả trên cây và khối lượng quả chủ yếu nằm ở mức trung gian giữa các giống bố mẹ.

Khả năng kết hợp và phương pháp đánh giá khả năng kết hợp

Mục đích chính của chương trình tạo giống lai là xác định các dòng mới có khả năng tạo ra con lai với năng suất vượt trội khi kết hợp với các dòng khác Để chọn dòng làm bố mẹ cho giống lai, ngoài năng suất bản thân, khả năng kết hợp cũng là một tính trạng quan trọng Khả năng kết hợp được chia thành khả năng kết hợp chung (GCA) và khả năng kết hợp riêng (SCA) Khả năng kết hợp chung phản ánh ưu thế lai của dòng tự phối với các dòng khác, trong khi khả năng kết hợp riêng thể hiện ưu thế lai của một dòng khi lai với một dòng cụ thể, được tính bằng độ lệch so với giá trị trung bình của cặp lai đó.

1.11.2 Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp

Sau giai đoạn phát triển và thu thập, có thể xuất hiện nhiều dòng thuần có vẻ hứa hẹn cho lai tạo, nhưng không phải tất cả đều có khả năng kết hợp cao Các dòng thuần, dù được tạo ra từ nguồn hay phương pháp nào, cần được đánh giá tiềm năng để phục vụ cho công tác lai tạo sau này Quá trình này được gọi là thử khả năng kết hợp của dòng thuần Thông qua phép lai thử, phần lớn các dòng thuần sẽ bị loại bỏ do ít triển vọng trong các cặp lai sau này Theo Hayes (1955), chỉ khoảng 0,06% số dòng tự phối có khả năng kết hợp tốt.

Phép lai thử giúp đánh giá khả năng kết hợp các tính trạng trên tổ hợp lai của bố mẹ, từ đó hỗ trợ nhà tạo giống trong việc lựa chọn dòng có khả năng kết hợp cao cho các mục tiêu tạo giống khác nhau và loại bỏ dòng có khả năng kết hợp thấp Hai phương pháp phổ biến để thử khả năng kết hợp của dòng thuần là lai đỉnh (top cross) và lai luân giao (diallel cross).

Lai đỉnh, phương pháp xác định khả năng kết hợp chung, được Devis đề xuất năm 1927 và phát triển bởi Jenkins và Bruce năm 1932 Thành công của lai đỉnh phụ thuộc vào việc lựa chọn cây thử phù hợp, với cây thử có khả năng kết hợp cao sẽ cho kết quả giống tốt hơn so với cây có khả năng kết hợp trung bình hoặc thấp Cây thử có thể có nền di truyền rộng hoặc hẹp, trong đó các nhà tạo giống thương mại thường chọn dòng ưu tú với khả năng kết hợp cao để phát hiện lai đỉnh phục vụ cho mục đích kinh doanh Xu hướng hiện nay là sử dụng cây có nền di truyền hẹp, đặc biệt là các dòng thuần có khả năng kết hợp tốt, nhằm tìm kiếm cặp lai tiềm năng ngay trong phép thử để giảm thiểu chi phí và thời gian tạo giống mới.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu

3.1 Đánh giá các dòng/giống cà chua về năng suất và phẩm chất quả

Trong công tác chọn tạo giống, đặc biệt là giống cà chua, nguồn gen đa dạng đóng vai trò quan trọng đối với các nhà chọn giống Thành công trong việc chọn giống phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó việc đánh giá và sử dụng nguồn vật liệu khởi đầu là yếu tố then chốt.

Nguồn gen đa dạng và phong phú là yếu tố quan trọng trong việc chọn tạo giống cà chua, giúp phát triển các giống mới phù hợp với môi trường và nhu cầu người tiêu dùng Tại Việt Nam, các nghiên cứu về nguồn gen cà chua được thực hiện thường xuyên tại các đơn vị nghiên cứu giống Từ năm 1975, các tác giả như Vũ Tuyên Hoàng, Mai Phương Anh và Trần Khắc Thi đã đánh giá và phân loại 289 giống trồng cùng với 6 giống hoang dại, 17 giống địa phương và 3 dạng hoang dại thu thập trong nước Kết quả cho thấy có những giống có tính chín sớm, khả năng chống chịu sâu bệnh và tiềm năng năng suất cao, đồng thời các giống nhập nội thường có phẩm chất vượt trội hơn so với giống địa phương Các giống nghiên cứu trong đề tài đều là giống nhập từ Đài Loan vào năm 2006 và 2007, từ đó, thông qua phương pháp chọn lọc kết hợp công nghệ sinh học, sẽ tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho công tác chọn giống.

3.1.1 Đánh giá về năng suất các giống cà chua nhập nội

Năng suất cây cà chua là yếu tố quan trọng mà các nhà chọn giống và sản xuất quan tâm, được ảnh hưởng bởi đặc trưng di truyền, điều kiện ngoại cảnh, chế độ dinh dưỡng và kỹ thuật canh tác Để đạt năng suất cao, cần có nhiều chùm quả và tỷ lệ đậu quả cao Chúng tôi đã tiến hành đánh giá số chùm hoa trên thân chính của các cây cà chua sinh trưởng hữu hạn và thu được kết quả đáng chú ý.