Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.

Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.

GIỚI THIỆU

Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam hiện là quốc gia dẫn đầu thế giới về xuất khẩu cà phê vối và đứng thứ hai về tổng sản lượng cà phê nhân, chỉ sau Brazil, với 1.758.000 tấn cà phê nhân xuất khẩu trong năm 2018 Tuy nhiên, mỗi năm, khoảng 460.000 tấn vỏ cà phê khô được thải ra môi trường, chủ yếu được sử dụng làm chất đốt để sấy quả và hạt cà phê Việc sử dụng vỏ cà phê làm chất đốt hiện đang gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Mặc dù một phần vỏ cà phê được người dân ủ và bón lại cho cây cà phê, nhưng hiệu quả không cao do chưa qua xử lý để trở thành phân bón Hiện tại, chỉ một lượng nhỏ vỏ cà phê được sản xuất để làm phân bón và thức ăn gia súc.

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã tận dụng phế thải từ cà phê, chẳng hạn như sử dụng vỏ và lá cà phê làm giá thể để trồng nấm (Leifa et al.).

Vỏ quả cà phê và vỏ trấu cà phê được sử dụng làm nguồn carbon để lên men, tạo ra acid gibberellic và từ đó sản xuất acid citric (Shankaran và Lonsane, 1994) Ngoài ra, vỏ cà phê còn có ứng dụng trong sản xuất than hoạt tính cho ngành công nghiệp xử lý nước thải (Franca et al., 2009) Đặc biệt, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng vỏ quả cà phê có thể được dùng để sản xuất ethanol thông qua phương pháp hóa học (Shenoy et al.).

Nghiên cứu năm 2011 chỉ ra rằng việc sử dụng acid và kiềm mạnh để thủy phân vỏ quả có thể gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, đồng thời yêu cầu trang thiết bị cơ giới hóa tốn kém và khó chế tạo.

Trong bối cảnh nhu cầu năng lượng gia tăng và ô nhiễm môi trường do nhiên liệu hóa thạch, các quốc gia đang chuyển hướng sang nguồn năng lượng tái tạo, đặc biệt là sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose, nguồn nguyên liệu phong phú Các nhà khoa học dự đoán rằng sản lượng ethanol từ sinh khối lignocellulose có thể tăng gấp 16 lần so với hiện tại Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng phế thải vỏ cà phê có tiềm năng lớn trong sản xuất ethanol Việc sử dụng ethanol thay cho xăng có thể giúp giảm hơn 80% lượng khí thải carbon ra môi trường.

Rào cản lớn nhất trong sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu này là sự hiện diện của hemicellulose và lignin, hai chất này liên kết chặt chẽ với cellulose, tạo thành một lớp bảo vệ ngăn cản sự tấn công của hóa chất và enzyme vào phân tử cellulose.

(Ragauskas et al., 2006; Hahn-Họgerdal et al , 2006) Hàm lượng lignin trong vỏ quả cà phê

Khoảng 17,5÷20,07% lignin trong vỏ quả cà phê là một trở ngại lớn cho quá trình tiền xử lý trước khi thủy phân và lên men tạo ethanol Do đó, cần nghiên cứu các phương pháp tiền xử lý để loại bỏ lignin mà vẫn giữ lại cellulose Để sản xuất ethanol, cellulose cần được phân giải thành đường đơn, có thể thực hiện qua hai phương pháp: thủy phân bằng acid và thủy phân bằng enzyme Hiện nay, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào thủy phân bằng enzyme, mặc dù giá thành enzyme còn cao, với cellulase từ A niger có giá 4,5 triệu đồng cho 25g và cellulase từ T reesei giá 3,5 triệu đồng cho 50 mL.

Các nghiên cứu về enzyme cellulase hiện nay chủ yếu tập trung vào việc tách dòng gen, tinh sạch và nghiên cứu đặc điểm hoá sinh, cũng như tối ưu điều kiện nuôi cấy để thu nhận enzyme từ nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn Tuy nhiên, việc khai thác cellulase từ nguồn tự nhiên gặp nhiều khó khăn do năng lực sinh tổng hợp của chủng giống, không chủ động nguồn enzyme, và khó khăn trong việc điều chỉnh tính chất động học, độ bền nhiệt độ, pH, cũng như khả năng hoạt động trong điều kiện nồng độ cao của chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ Do đó, cần thiết phải tiến hành nghiên cứu về ứng dụng cellulase từ các chủng nấm mốc có mặt trên cơ chất thủy phân của enzyme này.

Việt Nam chủ yếu sản xuất cà phê ở các tỉnh Tây Nguyên, giúp giảm chi phí thu gom nguyên liệu Tiềm năng về trữ lượng vỏ cà phê ở đây rất lớn, đồng thời cũng liên quan đến vấn đề ô nhiễm môi trường và việc tìm kiếm nguồn năng lượng thay thế cho hóa thạch đang cạn kiệt Do đó, vỏ cà phê vối (Coffea robusta) đã được chọn làm nguyên liệu cho nghiên cứu nhằm tìm hiểu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải để lên men tạo ethanol.

Mục tiêu nghiên cứu

Sử dụng các tác nhân acid, kiềm, vi sóng và nấm mục trắng để tiền xử lý vỏ quả cà phê vối giúp loại bỏ hemicellulose và lignin hiệu quả Đồng thời, quá trình này cũng thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc để ứng dụng vào thủy phân vỏ quả cà phê Dịch thủy phân sau đó được lên men nhằm so sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme thu nhận và enzyme thương mại.

Khảo sát quá trình khử caffeine và polyphenol từ vỏ quả cà phê, đồng thời tối ưu hóa các thông số liên quan đến quá trình khử này là rất quan trọng Nghiên cứu này nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm cà phê và tăng cường giá trị dinh dưỡng của vỏ quả cà phê.

(2) Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ nấm mốc và tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với dung môi hữu cơ và muối vô cơ.

Bài viết này so sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme tự nhiên và enzyme thương mại, đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân Mục tiêu là tối ưu hóa điều kiện thủy phân để đạt được hàm lượng đường khử cao nhất.

(4) Kiểm tra thành phần dịch thủy phân và đưa ra phương pháp khử độc dịch thủy phân.

(5) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men và các phương pháp lên men dịch thủy phân để tạo ethanol.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) được thu hoạch từ quả cà phê tươi tại xã Pơng Drang, huyện Krông Buk, tỉnh Đăk Lăk Sau khi tách vỏ, vỏ quả được sấy khô ở nhiệt độ 60 độ C trong 12 giờ.

Nguồn phân lập nấm mốc được thu thập từ quả cà phê mốc, cành, thân, lá cây cà phê và đất trồng tại vườn cà phê ở xã Pơng Drang, huyện Krông Buk, tỉnh Đăk Lăk.

Đề tài nghiên cứu tập trung vào các khâu chính như tiền xử lý, nuôi cấy nấm mốc, thu nhận enzyme thô, thủy phân và lên men Tuy nhiên, một số nội dung như tinh sạch enzyme và chưng cất không được khảo sát trong đề tài này.

Phạm vi thời gian của đề tài gặp khó khăn do công đoạn tiền xử lý bằng vi sinh vật có thể kéo dài đến vài tháng; vì vậy, nghiên cứu chỉ tập trung khảo sát trong khoảng thời gian tối đa là 60 ngày.

Ý nghĩa của luận án

Nghiên cứu và phát triển giải pháp hiệu quả để xử lý phụ phẩm trong ngành chế biến đang thu hút sự chú ý cả trong và ngoài nước Việc tận dụng vỏ quả cà phê vối là một lựa chọn thực tiễn quan trọng, đặc biệt khi Việt Nam đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu cà phê nhân, và dẫn đầu về xuất khẩu cà phê Robusta.

Nghiên cứu từ luận án đã chỉ ra thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối, khẳng định tính khả thi của việc tận dụng nguồn phụ phẩm này như một nguồn sinh khối lignocellulose tiềm năng cho sản xuất ethanol.

Nghiên cứu tập trung vào việc áp dụng các giải pháp nhằm hạn chế việc sử dụng hóa chất độc hại với nồng độ cao thông qua việc kết hợp các phương pháp tiền xử lý hiệu quả.

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đặt cơ sở cho việc xây dựng quy trình sản xuất ethanol từ vỏ quả cà phê quy mô công nghiệp Đồng thời, góp phần khai thác triệt để và có hiệu quả nguồn phụ phẩm từ ngành công nghiệp cà phê ở Việt Nam.

Điểm mới của luận án

Đề xuất giải pháp tiền xử lý sử dụng vi sóng giúp giảm đáng kể lượng hóa chất, chỉ cần sử dụng kiềm loãng và acid loãng, từ đó giảm thiểu tác động đến môi trường và nâng cao hiệu suất Cần điều chỉnh thứ tự các bước tiền xử lý dựa trên thành phần nguyên liệu Đồng thời, đánh giá sự hình thành và tác động của một số chất hóa học nguy hại trong quá trình lên men và đề xuất giải pháp loại trừ chúng.

Enzyme cellulase được thu nhận từ dòng nấm mốc Trichoderma asperellum (QT5), được phân lập từ bề mặt vỏ quả cà phê hỏng, đã chứng tỏ hiệu quả trong việc thủy phân vỏ quả cà phê vối.

Kết quả nghiên cứu cung cấp tư liệu khoa học quý giá cho việc phát triển ethanol sinh học từ các nguồn phụ phẩm có hàm lượng lignin cao Thông tin này có thể được sử dụng trong giảng dạy về quản lý và tận dụng phụ phẩm trong sản xuất thực phẩm.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Quá trình thực nghiệm, thu thập và xử lý số liệu được tiến hành tại:

 Bộ môn Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh.

 Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp – Trường Đại học Cần Thơ.

 Phòng thí nghiệm Phân viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch.

 Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 11/2014 đến tháng 11/2018. 3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất

Vỏ quả cà phê vối tươi (Coffea robusta) được thu hoạch tại xã Pơng Drang, huyện Krông Buk, tỉnh Đăk Lăk, từ tháng 11 đến tháng 1 dương lịch Quả cà phê chín có màu đỏ tươi, không bị dập hay mốc Sau khi thu hái, quả cà phê tươi được cho vào thùng xốp có ướp đá và cần được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 12 giờ để đảm bảo chất lượng.

Hình 3.1: Quả và vỏ cà phê vối tươi 3.1.2.2 Hóa chất

Một số hóa chất cơ bản dùng trong nghiên cứu như:

H2SO4: Độ tinh khiết > 98% (Himedia, Ấn Độ)

Chất chuẩn: Caffeine, Tannic acid, D-Glucose (Sigma, Hoa Kỳ) Độ tinh khiết > 99%.

Thuốc thử Folin-Ciaucalteu (Merck, Đức)

Thuốc thử DNS, CTAB, EDTA (Trung Quốc)

Lignin, CMC, ABTS, Ammonium Sulfate, Polyvinylpyrrolidone (Sigma, Hoa Kỳ)

Dichlormethane, Phenol, Sodium hydoxide, Hydrochloric acid (Trung Quốc) Độ tinh khiết > 98,5%.

3.1.2.3 Enzyme thương mại và nấm men

Viscozyme ® Cassava C là một loại enzyme endoglucanase và exoglucanase, có khả năng cắt đứt các liên kết glycosyl trong mạch cellulose, từ đó thủy phân chúng thành glucose, xylobiose và một số polymer glucose khác Enzyme này được chiết xuất và tinh chế từ nấm, mang lại hiệu quả cao trong quá trình xử lý cellulose.

Trichoderma reesei Enzyme có màu nâu, tỷ khối 1,22 g/mL Hoạt lực > 450

EGU/g Enzyme hoạt động tốt ở 50°C trong đệm acetat pH = 4,8.

Celluclast ® 1.5L (Novozyme, Đan Mạch): Enzyme này có tính chất giống với Viscozyme Cellulast có dạng lỏng, màu nâu, tỷ khối 1,2 g/ml, hoạt lực:

Enzyme có hoạt tính 756 EGU/g, có khả năng hòa tan trong nước ở mọi nồng độ và được sản xuất từ nấm mốc A niger tái tổ hợp Enzyme này hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ 50°C trong đệm acetat với pH 4,8.

Novozym 188 là enzyme β-glycosidase, có khả năng thủy phân oligo và cellobiose thành đường đơn Enzyme này thường được kết hợp với Celluclast hoặc Viscozyme để hoàn toàn chuyển hóa cellulose thành glucose Chế phẩm Novozym 188 có dạng lỏng màu nâu, hoạt lực trên 750 CBU/g, dễ hòa tan trong nước và được chiết xuất từ nấm A niger Enzyme hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ 50°C trong môi trường đệm acetat với pH 4,8.

Nấm men Sacharomyces cerevisiae, hay còn gọi là nấm men bánh mì lạt, có dạng bột màu vàng nâu nhạt Nấm men này phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 28 đến 35 độ C và pH thích hợp là từ 4 đến 5 Sản phẩm nấm men được cung cấp từ Bộ sưu tập giống của Viện Công nghệ Sinh học và Ứng dụng vi sinh miền Nam.

Hóa chất được cung cấp bởi công ty Hóa Nam, có địa chỉ tại 239/4 Lý Thường Kiệt, phường 15, quận 11, Hồ Chí Minh, và công ty TNHH Khoa học Hợp Nhất, địa chỉ 83/10 Bạch Đằng, phường 2, quận Tân Bình, Hồ Chí Minh.

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị

Một số dụng cụ cơ bản dùng trong nghiên cứu như:

Buồng đếm hồng cầu (Đức); Cuvette thạch anh (Đức)

Giấy lọc, que cấy vi sinh (Trung Quốc)

Khỳc xạ kế (0-32%, Nhật); Micropipette (10-1000 àL, Đức) Ống ly tâm (1,5 mL, 15 mL, Đức); Ống nghiệm (đường kính 16 cm, Trung Quốc); Phễu Gooch Crucible (100 mL, Đức)

Một số thiết bị cơ bản dùng trong nghiên cứu như:

Microwave (Sharp, R-G272VN-S, Trung Quốc)

Bể siêu âm (ELMA-S60H, Đức)

Kính hiển vi (B-131, Ý); Máy đo pH (DOCU-PH, Đức)

Máy đo quang UV-Vis (Genesis 10S, Hoa Kỳ)

Máy sấy ẩm hồng ngoại (MA 150-Sartoritus, Đức)

Máy đo độ cồn (FermentoFlash, Đức);

Thiết bị lọc hút chân không (Đức)

Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Quả cà phê vối được thu hoạch từ tháng 11 đến tháng 1 hàng năm Sau khi thu hái, nguyên liệu cần được đưa vào máy xát tươi để tách vỏ trong vòng 24 giờ Vỏ quả cà phê sau đó được bảo quản lạnh trong thùng xốp và vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong thời gian không quá 12 giờ.

Vỏ quả cà phê được sấy khô đến độ ẩm từ 5 đến 8% ở nhiệt độ 60 độ C trong vòng 12 giờ Sau khi sấy khô, vỏ cà phê sẽ được nghiền bằng máy nghiền đĩa để đạt được độ mịn mong muốn.

Sau khi nghiền, vỏ quả cà phê được sàng qua hệ thống nhiều tầng với các kích thước lỗ sàng là 0,25; 0,5; 1 và 2 mm Phần còn lại trên lưới sàng 2 mm sẽ được nghiền lại, trong khi phần nguyên liệu lọt qua các lỗ sàng từ 1 đến 2 mm sẽ được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm trong nghiên cứu này.

Kích thước < 0,25 mm Kích thước: 0,25÷0,5 mm

Kích thước: 0,5÷1 mm Kích thước: 1÷2 mm

Hình 3.2: Các kích thước vỏ quả cà phê sau khi nghiền và sàng

3.2.1.2 Quy trình thu nhận và xử lý vi nấm

Để thu nhận mẫu vi sinh vật từ quả cà phê mốc, sử dụng kẹp vô trùng để gắp một vài quả cà phê mốc cho vào túi PE có van một chiều và khóa kín miệng túi Đối với mẫu gỗ mục, dùng dao gọt một phần gỗ có chứa nấm mốc và cho vào túi PE tương tự Khi lấy mẫu đất trồng cà phê, sử dụng muỗng để lấy mẫu đất ở độ sâu 3÷5 cm và cho vào túi PE có van một chiều, sau đó khóa kín miệng túi.

Xử lý mẫu có chứa VSV:

Tất cả các mẫu vi sinh vật (VSV) thu thập được từ vườn trồng cà phê xã Pơng Drang – huyện Krông Buk – tỉnh Đăk Lăk sẽ được vận chuyển về phòng thí nghiệm (PTN) trong vòng 24 giờ Các mẫu VSV được bảo quản kín để cách ly với môi trường bên ngoài, và mọi thao tác xử lý đều diễn ra trong tủ cấy vô trùng Mẫu VSV sẽ được đưa vào ống nghiệm tiệt trùng có nắp đậy, thêm nước muối sinh lý để ngập mẫu, sau đó sử dụng máy vortex để trộn đều trong 20 phút Cuối cùng, mẫu được trộn sẽ được cấy vào môi trường thích hợp để nuôi cấy và phân lập.

3.2.2 Các phương pháp phân tích và đo đạc

Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích và đo đạc được tổng hợp trong Bảng

3.1 Mô tả chi tiết các phương pháp được trình bày trong Phụ lục A.

Bảng 3.1: Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích và đo đạc

STT Chỉ tiêu Phương pháp

4 Caffeine Đo quang ở 265 nm (Amos-Tautua and Diepreye,

5 Polyphenol tổng Phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu (Ayesha et al ,

6 Protein tổng số Phương pháp Bradford (Bradford, 1976)

7 Pectin Phương pháp calcicum pectate (Carré and Haynes,

8 Đường tổng Phương pháp Phenol sulphuric acid (Dubois et al ,

9 Đường khử Phương pháp Dinitrosalicylic Acid (Miller, 1959)

10 Đường glucose Phương pháp Glucose Oxidase (Sadasivam and

11 Cellulose, hemicellulose, lignin Phương pháp crude fiber (Van Soest and Wine, 1967)

12 Ethanol Phương pháp Dichromate oxidation (Sayyad et al ,

14 Phân lập nấm mốc Phụ lục A

15 Định loại dòng nấm mốc Phụ lục A

16 Định danh nấm mốc Phụ lục A

17 Định tính cellulase Phụ lục A

18 Hoạt tính FPase Phụ lục A

19 Hoạt tính CMCase Phụ lục A

20 Tách chiết cellulase Phụ lục A

21 Tinh sạch sơ bộ cellulase Phụ lục A

22 Hiệu quả tinh sạch cellulase Phụ lục A

23 Phương pháp tiền xử lý Phụ lục A

24 Phương pháp thủy phân Phụ lục A

25 Phương pháp lên men Phụ lục A

26 Tính chi phí thủy phân Phụ lục A

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả

Các thí nghiệm được thiết kế ngẫu nhiên và lặp lại ba lần với một hoặc hai yếu tố thay đổi Phân tích phương sai (ANOVA) được áp dụng thông qua kiểm định LSD để xác định sự khác biệt giữa các trung bình nghiệm thức Dữ liệu được thu thập và xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion.

15.2 và phần mềm Excel dùng để tính toán trung bình và độ lệch chuẩn của các phép đo Kết quả của thí nghiệm trước được chọn làm thông số cố định cho các thí nghiệm sau.

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Vỏ quả cà phê (khô) Xay, nghiền, rây

Phân tích thành phần hóa học

Nội dung 1: Khảo sát quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê

Khảo sát một số phương pháp khử caffeine và polyphenol (TN 1)

Tối ưu hóa quá trình khử caffeine và polyphenol (TN 2)

Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng acid (TN 3)

Chọn được các thông số cơ bản của quá trình tiền xử lý

Nội dung 2: Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc

Chọn được điều kiện thích hợp để thu nhận enzyme cellulase có hoạt tính cao

Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Tối ưu hóa các thông số của quá trình thủy phân (TN 23)

Nội dung 4: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Chọn được các thông số cho quá trình lên men

Sơđồ bốtrí thíng hiệ mtổ ngqu

Khảo sát thời gian lên men (TN 27) Khảo sát phương pháp lên men (TN 28) Khảo sát mật độ nấm men (TN 25)

Khảo sát nhiệt độ lên men (TN 26)

3.3.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả cà phê vối

Mục đích của nghiên cứu này là xác định các thành phần cơ bản của nguyên liệu vỏ quả cà phê vối, nhằm đánh giá khả năng sử dụng vỏ quả cà phê như một nguồn sinh khối lignocellulose để sản xuất ethanol sinh học.

Quá trình tiến hành bao gồm việc thu hái quả cà phê vối tươi, sau đó phân loại và làm sạch chúng Tiếp theo, vỏ quả được bóc tách và mẫu được nghiền mịn để phân tích các thành phần cơ bản trong nguyên liệu Cuối cùng, thí nghiệm sẽ được thực hiện để phân tích các yếu tố liên quan.

3 lần lặp lại ở mỗi chỉ tiêu khảo sát cho mỗi đợt lấy mẫu, gồm 12 chỉ tiêu đánh giá.

Khối lượng nguyên liệu sử dụng: 12 chỉ tiêu x 3 x 0,02 kg/mẫu = 0,72 kg (tính cho 1 đợt lấy mẫu).

Chỉ tiêu đánh giá: Độ ẩm (%), protein tổng số (%), chất béo (%), pectin

(%), đường khử (%), đường tổng số (%), cellulose (%), helicellulose (%), lignin (%), caffeine (%), polyphenol (%) và tro (%).

Kết quả thu nhận cho thấy đã xác định được một số thành phần cơ bản trong nguyên liệu vỏ quả cà phê vối, tạo nền tảng vững chắc cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.3.2 Nội dung 1: Khảo sát quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê

3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất quá trình khử caffeine và polyphenol

Mục đích: Khảo sát sự thay đổi hiệu suất khử caffeine và polyphenol trong nguyên liệu theo các phương pháp trích ly khác nhau.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành với 1 nhân tố

Nhân tố A: Phương pháp trích ly

A1: Trích ly thông thường (chỉ sử dụng nước nóng)

A2: Trích ly bằng nước có hỗ trợ siêu âm

A3: Trích ly bằng nước có hỗ trợ vi sóng

Số nghiệm thức thí nghiệm: 3 x 2 = 6 nghiệm thức (3 cho caffeine và 3 cho polyphenol)

Số mẫu thí nghiệm: 6 x 3 lần lặp lại = 18 mẫu.

Khối lượng nguyên liệu sử dụng: 18 x 0,01 kg/mẫu = 0,18 kg.

Kích thước nguyên liệu 1÷2 mm

Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: 30/1

Thời gian trích ly 120 phút và trích ly 1 lần

Công suất bề siêu âm: 150 W; tần số siêu âm: 37 kHz; thời gian siêu âm 20 phút.

Công suất lò vi sóng: 327 W; thời gian vi sóng 10 phút.

Lấy 9 mẫu nguyên liệu có kích thước 1÷2 mm (mỗi mẫu có khối lượng 10 g) tiến hành trích ly để khử loại caffeine và polyphenol bằng ba phương pháp khác nhau: phương pháp trích ly thông thường, phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm, phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng Sau quá trình trích ly, tất cả các mẫu đem lọc chân không, loại bỏ phần bã và thu dịch chiết, sử dụng để phân tích hàm lượng caffeine và polyphenol theo phương pháp so màu.

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất khử caffeine và polyphenol.

Kết quả thu nhận: Phương pháp trích ly nào thu được hiệu suất khử caffeine và polyphenol cao nhất.

3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Tối ưu hóa quá trình khử caffeine và polyphenol

Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát mối quan hệ giữa các yếu tố trích ly và hiệu suất khử caffeine cùng polyphenol Nghiên cứu sẽ xác định phương pháp trích ly hiệu quả nhất và tìm ra các thông số tối ưu cho quá trình khử.

Bố trí thí nghiệm bao gồm ba yếu tố ảnh hưởng chính Mô hình thí nghiệm kết hợp với các thí nghiệm tại điểm trung tâm giúp xác định các thông số tối ưu, dựa trên kết quả thu được từ các thí nghiệm trước đó và các thí nghiệm cánh tay đòn xoay quanh điểm trung tâm.

Tổng số nghiệm thức dự kiến: 20 (6 thí nghiệm ở tâm).

Số mẫu thí nghiệm: 20 × 3 lần lặp lại = 60 mẫu.

Khối lượng nguyên liệu sử dụng: 60 × 0,02 kg/mẫu = 1,2 kg.

Thí nghiệm được thực hiện bằng cách lựa chọn phương pháp trích ly phù hợp từ thí nghiệm 1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bao gồm tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian trích ly.

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất khử caffeine và polyphenol, với mô hình phương trình hồi quy bậc hai tổng quát như sau:

Với xi: các yếu tố ảnh hưởng. n: số yếu tố ảnh hưởng. a và b: hệ số trong mô hình

Kết quả thu nhận cho thấy phương trình hồi quy đa biến đã xác định sự phụ thuộc và tương tác của các yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu, từ đó ước tính đạt được hiệu suất cao nhất trong việc khử caffeine và polyphenol theo các thông số tối ưu Thí nghiệm 3 tập trung vào việc khảo sát quá trình tiền xử lý bằng acid loãng, đặc biệt là ảnh hưởng của nồng độ H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ trong vỏ quả cà phê.

Mục đích: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong quá trình tiền xử lý bằng H2SO4 khi thay đổi nồng độ acid.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố (Hình 3.4)

Nhân tố B: Nồng độ H2SO4 % (w/w)

Mẫu đối chứng: Không bổ sung acid

Số mẫu thí nghiệm: 6 x 3 lần lặp lại = 18 mẫu.

Khối lượng nguyên liệu sử dụng: 18 x 0,03 kg/mẫu = 0,54 kg.

Quá trình tiến hành tiền xử lý nguyên liệu khử caffeine và polyphenol bao gồm việc sử dụng acid với nồng độ H2SO4 từ 1÷3% (w/w) Tỷ lệ nguyên liệu và nước được cố định là 1:10, với thời gian tiền xử lý 30 phút ở nhiệt độ 140 o C Sau khi hoàn tất, dịch tiền xử lý sẽ được xác định hàm lượng đường khử, trong khi phần bã được rửa trung tính và sấy khô ở 60 o C trong 12 giờ Cuối cùng, phần bã sẽ được phân tích để xác định hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin.

Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin.

Kết quả thu nhận: Nồng độ acid phù hợp để loại bỏ càng nhiều hemicellulose và lignin càng tốt.

� b) Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H 2 SO 4 đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ có trong vỏ quả cà phê

Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát sự biến đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong quá trình tiền xử lý bằng H2SO4, khi thay đổi nhiệt độ và thời gian xử lý.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 2 nhân tố (Hình 3.4)

Nhân tố C: Nhiệt độ tiền xử lý ( o C)

C1: 110 C2: 120 C3: 130 C4 : 140 C5 : 150 Nhân tố D : Thời gian tiền xử lý (phút)

Mẫu đối chứng: Xử lý bằng nước ở 140 o C, 30 phút

Số mẫu thí nghiệm: 21 x 3 lần lặp lại = 63 mẫu.

Khối lượng nguyên liệu sử dụng: 63 x 0,03 kg/mẫu = 1,98 kg.

Khử caffeine và polyphenol Tiền xử lý bằng H2SO4 ĐC

Xác định hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin Đánh giá chọn nồng độ, nhiệt độ và thời gian tiền xử lý phù hợp

Sơ đồ thí nghiệm trong Hình 3.4 minh họa cách xác định ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ.

3.3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng kiềm NaOH a) Ảnh hưởng của tỷ lệ NaOH đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ có trong vỏ quả cà phê

Mục đích: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong quá trình tiền xử lý bằng NaOH khi thay đổi của tỷ lệ kiềm.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố (Hình 3.5)

Nhân tố E: Tỷ lệ NaOH (g/g NL)

Mẫu đối chứng: Không bổ sung kiềm

Số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 lần lặp lại = 15 mẫu.

Khối lượng nguyên liệu sử dụng: 15 x 0,03 kg/mẫu = 0,45 kg.

Quá trình tiến hành bao gồm việc tiền xử lý nguyên liệu đã khử caffeine và polyphenol trước khi thực hiện thủy phân và lên men Tiền xử lý bằng kiềm được thực hiện với tỷ lệ NaOH từ 0,1 đến 0,4 (g/g nguyên liệu), trong khi tỷ lệ nguyên liệu và nước được cố định là 1:10 Thời gian tiền xử lý là 20 phút ở nhiệt độ 120 độ C Sau khi hoàn thành, dịch tiền xử lý được phân tích hàm lượng đường khử, trong khi bã được rửa để đạt độ pH trung tính và sấy khô ở 60 độ C trong 12 giờ Cuối cùng, bã được phân tích để xác định hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin.

Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin.

Nồng độ kiềm tối ưu đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ hiệu quả hemicellulose và lignin Bên cạnh đó, nhiệt độ và thời gian của quá trình tiền xử lý kiềm cũng có ảnh hưởng lớn đến sự biến đổi hàm lượng chất xơ trong vỏ quả cà phê.

Mục đích của nghiên cứu là khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong quá trình tiền xử lý bằng NaOH, khi thay đổi nhiệt độ và thời gian xử lý.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành với 2 nhân tố (Hình 3.5)

Nhân tố F: Nhiệt độ tiền xử lý ( o C)

F1: 100 F2: 110 F3: 120 F4 : 130 F5 : 140 Nhân tố G: Thời gian tiền xử lý (phút)

Mẫu đối chứng: Xử lý bằng nước ở 120 o C, 20 phút

Số mẫu thí nghiệm: 21 x 3 lần lặp lại = 63 mẫu.

Khối lượng nguyên liệu sử dụng: 63 x 0,03 kg/mẫu = 1,98 kg.