TỔNG QUAN VỀ GENE, GENOME VÀ DỰ ÁN GENOME NGƯỜI. NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR. NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT ĐIỆN DI. NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GENE. CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI ACID NUCLEIC. CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP. NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA HỆ THỐNG SỬA CHỮA GENECRISPRCAS SYSTEM
GENE, GENOME VÀ DỰ ÁN GENOME NGƯỜI
Khái niệm Gene
Gene là một đoạn ADN mang thông tin mã hoá cho một sản phẩm xác định (chuỗi polipeptit hay ARN).
Cấu trúc genome
Genome (hệ gene, bộ gene) là thuật ngữ được dùng với các nghĩa khác nhau như sau:
Nguyên liệu di truyền của một cơ thể bao gồm nhiễm sắc thể trong tế bào vi khuẩn, có thể là một trong các loại nhiễm sắc thể nếu có nhiều loại, chẳng hạn như các nhiễm sắc thể lớn hoặc nhỏ của Vibrio cholerae Ngoài ra, DNA hoặc RNA trong một virion cũng là phần quan trọng của nguyên liệu di truyền Cuối cùng, nhiễm sắc thể cùng với mọi plasmid được kết hợp, ví dụ như nhiễm sắc thể và hai plasmid nhỏ trong vi khuẩn Buchnera, cũng đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc di truyền.
- Tất cả các gene (khác nhau) trong tế bào hoặc virion.
- Bộ nhiễm sắc thể đơn bội hoặc genome đơn bội trong tế bào.
Chuỗi genome hoàn chỉnh đã được công bố cho nhiều loài vi khuẩn, cũng như cho cây cúc dại (Arabidopsis thaliana) và con người Genome chứa toàn bộ thông tin di truyền và các chương trình cần thiết cho hoạt động của cơ thể Ở sinh vật nhân thực, 99% genome nằm trong nhân tế bào, trong khi phần còn lại nằm trong các cơ quan tử như ty thể và lạp thể Genome vi khuẩn và phần genome trong các cơ quan tử thường nhỏ và có dạng vòng khép kín, trong khi genome trong nhân tế bào thường lớn và phân bố trên các nhiễm sắc thể dạng thẳng.
Dự án genome
Là dự án xác định cấu trúc di truyền chính xác của một genome cơ thể sống, nghĩa hình (model organisms) đã được hoàn thành như sau:
Các genome vi khuẩn đã được nghiên cứu và xác định, trong đó trình tự hoàn chỉnh của genome Escherichia coli được thực hiện thông qua sự hợp tác của nhiều phòng thí nghiệm Năm 1995, hai trình tự genome hoàn chỉnh của vi khuẩn Haemophilus influenzae và Mycoplasma genitalium cũng đã được hoàn thành M genitalium có genome đơn giản với khoảng 580.067 base, phụ thuộc vào vật chủ để thực hiện nhiều chức năng trao đổi chất Trong khi đó, H influenzae có genome phức tạp hơn, với khoảng 1.830.121 base và 1.749 gene.
- Chuỗi genome hoàn chỉnh của nấm men Saccharomyces cerevisiae đã được hoàn chỉnh trong năm 1996, nhờ một consortium của các phòng thí nghiệm Genome của chúng dài 12.146.000 base
Các dự án giải mã genome đã được thực hiện trên nhiều loài động vật như chuột, cừu, lợn, giun tròn (Caenorhabditis elegans) và ruồi giấm (Drosophila melanogaster), cũng như trên các loại thực vật như lúa nước, lúa mì, ngô, táo và cúc dại Trong số đó, dự án giải mã genome người là nổi bật nhất.
Vào ngày 12 tháng 2 năm 2001, bản đồ gen người đã được công bố với khoảng 30.000 gen, ít hơn nhiều so với dự đoán trước đây Hệ gen người có đến 98% sự tương đồng với tinh tinh và 99% giống nhau giữa các dân tộc và cá nhân Điều này cho thấy rằng sự hình thành và phát triển nhân cách cũng như chỉ số thông minh chủ yếu phụ thuộc vào yếu tố xã hội và quá trình rèn luyện cá nhân, nhằm phát triển tiềm năng sinh học của mỗi người.
Trình tự genome của sinh vật mô hình đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu genome học, giúp các nhà sinh học phân tích cấu trúc, hoạt động và chức năng của các gen Qua đó, họ có thể làm rõ vai trò của DNA lặp lại, DNA không mã di truyền và DNA giữa các gen So sánh genome giữa các loài cho phép hiểu rõ hoạt động của genome trong các cơ thể sống, mối quan hệ và sự đa dạng sinh học, cũng như mức độ tiến hóa Kết quả so sánh cho thấy ba đặc điểm nổi bật: 1) sự phân bố không đồng đều của các gen trong genome, 2) kích thước genome không tỷ lệ thuận với độ phức tạp của loài, và 3) sự khác biệt về số lượng nhiễm sắc thể giữa các loài gần gũi.
NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR
Kỹ thuật pcr (Polymerase Chain Reaction)
PCR, viết tắt của Polymerase Chain Reaction, là kỹ thuật sinh học phân tử giúp nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của sinh vật thành nhiều bản sao Kỹ thuật này được phát minh bởi nhà khoa học Kary Mullis và cộng sự vào năm 1985 tại công ty Cetus.
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp tổng hợp DNA, sử dụng mạch khuôn là trình tự đích DNA ban đầu để khuếch đại số lượng bản sao lên đến hàng triệu nhờ enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA.
Primer là các đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của DNA khuôn, giúp DNA polymerase kéo dài chúng để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR dựa trên đặc tính này, cho phép khuếch đại đoạn DNA nằm giữa hai primer thành số lượng lớn bản sao có thể nhìn thấy sau khi nhuộm bằng ethidium bromide Để thực hiện việc khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần có thông tin tối thiểu về trình tự DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA nhằm tạo ra các primer bổ sung chuyên biệt.
- Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau :
Trong bước đầu tiên của quá trình PCR, DNA được tách đôi thông qua giai đoạn biến tính (denaturation) ở nhiệt độ từ 94 đến 95 độ C trong khoảng 30 giây đến 1 phút Nhiệt độ cao này giúp phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, và chính hai mạch đơn này sẽ làm khuôn cho việc tổng hợp hai mạch bổ sung mới.
Bước 2: Trong quá trình bắt cặp và annealing, nhiệt độ được giảm xuống dưới nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, giúp chúng kết hợp với mạch khuôn Nhiệt độ trong thực nghiệm thường dao động từ 55 đến 65 độ C, và thời gian bắt cặp phụ thuộc vào Tm của các primer, kéo dài từ 30 đến 60 giây.
Bước 3: Kéo dài (elongation – extension) diễn ra ở nhiệt độ 72°C, tối ưu cho hoạt động của enzyme DNA polymerase Enzyme này sẽ gắn các nucleotide vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn, đảm bảo quá trình tổng hợp DNA diễn ra hiệu quả.
Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút
Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa n: Là số chu kỳ
Qua một chu kỳ nhiệt, DNA đích được nhân bản thành hai bản sao Nếu chu kỳ này lặp lại liên tục từ 30 đến 40 lần, số lượng bản sao DNA có thể tăng lên đến 230 đến 240 bản, tương đương với hàng tỷ bản sao.
Hình 2.1 Nguyên tắc phản ứng PCR (nguồn Andy Vierstraete, 1999)
Các ứng dụng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm nghiên cứu khoa học, sản xuất và đời sống xã hội Một trong những ứng dụng chính của PCR là vân tay di truyền, một kỹ thuật pháp y giúp xác định danh tính cá nhân bằng cách so sánh DNA của họ với mẫu đã có Ví dụ, mẫu máu từ hiện trường vụ án có thể được so sánh với mẫu máu của nghi phạm Chỉ cần một lượng nhỏ DNA từ máu, tinh dịch, nước bọt hay tóc cũng đủ để thực hiện phân tích, với lý thuyết cho rằng chỉ cần một mạch DNA đơn là đủ.
Kỹ thuật pháp y xác định huyết thống, dấu vân tay được kí hiệu: (1) Bố; (2) Con;
Dấu vân tay là duy nhất cho mỗi cá nhân, ngoại trừ cặp song sinh giống hệt nhau, nhưng mối quan hệ di truyền như cha mẹ và con hoặc anh chị em ruột có thể được xác định thông qua việc phân tích hai hoặc nhiều dấu vân tay Kỹ thuật này không chỉ hữu ích trong việc thử nghiệm quan hệ cha con mà còn có thể được áp dụng để khám phá các mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật và truy tìm dấu vết tội phạm.
Chẩn đoán bệnh di truyền
Kỹ thuật PCR là phương pháp hiệu quả để phát hiện các bệnh di truyền trong gen cụ thể, giúp rút ngắn quá trình phát hiện Bằng cách sử dụng các loại sơn lót thích hợp, mỗi gen có thể được khuếch đại dễ dàng qua PCR và sau đó tiến hành trình tự để xác định các đột biến.
Bệnh virus có thể được phát hiện qua phương pháp PCR, nhờ vào việc khuếch đại DNA của virus Phân tích này có thể thực hiện ngay sau khi nhiễm trùng, từ vài ngày đến vài tháng trước khi các triệu chứng xuất hiện Chẩn đoán sớm như vậy rất quan trọng cho các bác sĩ trong quá trình điều trị.
Nhân bản gen không phải là nhân bản toàn bộ sinh vật, mà là quá trình cô lập và chèn một gen từ sinh vật này vào sinh vật khác Phương pháp PCR thường được sử dụng để khuếch đại gen, sau đó chèn vào một vector như plasmid DNA sau khi được chuyển vào sinh vật khác cho phép nghiên cứu gen và sản phẩm của nó một cách chi tiết hơn Việc thể hiện gen nhân bản giúp sản xuất hàng loạt các protein hoặc thuốc men có giá trị.
Gây đột biến điểm là phương pháp thay đổi trình tự nucleotide trong DNA, quan trọng trong việc nghiên cứu chức năng gen và tiến hóa protein trong ống nghiệm Có hai cách cơ bản để đưa đột biến vào trình tự DNA trong quá trình PCR Đột biến trang web hướng cho phép giới thiệu một đột biến tại vị trí cụ thể trên sợi DNA.
Đột biến mong muốn thường được kết hợp trong các mồi cho chương trình PCR, trong khi đột biến ngẫu nhiên sử dụng polymerase dễ bị lỗi, dẫn đến việc không kiểm soát được vị trí và tính chất của đột biến Một ứng dụng của kỹ thuật PCR với đột biến ngẫu nhiên là phân tích mối quan hệ cấu trúc và chức năng của protein Bằng cách thay đổi ngẫu nhiên một chuỗi DNA, chúng ta có thể so sánh các protein kết quả với protein ban đầu và xác định chức năng của từng phần trong protein.
Phân tích mẫu DNA cổ
Kỹ thuật PCR cho phép phân tích ADN có niên đại hàng ngàn năm, bao gồm cả mẫu ADN của voi ma mút 40.000 năm tuổi Phương pháp này đã được áp dụng thành công trong nhiều lĩnh vực, từ phân tích xác ướp Ai Cập đến việc xác định danh tính các nhân vật lịch sử như Sa hoàng Nga.
Ngoài ra còn một số ứng dụng kỹ thuật PCR có thể kể đến như sau:
Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử
Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu
Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm
Chọn giống vật nuôi, cây trồng
Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn
Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phưng pháp di truyền phân tử Y học – Khoa học hình sự.
Pháp y, quan hệ huyết thống,…
Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus
Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền
Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR…
NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT ĐIỆN DI
Điện di
Điện di là quá trình dịch chuyển của các thành phần tích điện trong dung dịch dưới tác động của điện trường, với các phần tích điện dương di chuyển về cực âm và các phần tích điện âm hướng về cực dương Tốc độ di chuyển này phụ thuộc vào hình dạng và kích thước của phân tử Kỹ thuật điện di được sử dụng để tách và phân tích các phân tử như DNA, RNA và protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng Quá trình này sử dụng dung dịch đệm để dẫn điện và tạo ra điện trường đồng nhất, trong khi bản gel (thường là agarose hoặc polyacrylamide) đóng vai trò là nền tảng để phân tách các phân tử Các chất nhuộm như Ethidium bromide, bạc và xanh Coomassie được sử dụng để phát hiện vị trí của các phân tử trên gel sau khi thực hiện điện di.
Phương pháp điện di
Phương pháp điện di là kỹ thuật phổ biến trong phân tích định tính và thu nhận mẫu axit nucleic hiển thị trực tiếp Nguyên tắc của điện di là phân tích các đại phân tử tích điện, thường được áp dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử để tách ly và phát hiện các phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế, cũng như DNA từ sản phẩm PCR.
Axit nucleic là các đại phân tử mang điện tích âm đồng đều trên bề mặt, do đó khi chịu tác động của điện trường, chúng sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương Tính linh động của các phân tử này phụ thuộc vào khối lượng phân tử, tức là số lượng nucleotic hoặc cặp nucleotic, cùng với nồng độ các chất cấu thành gel.
- Hai loại gel được sử dụng trong axit nucleic là gel polyacrylamide và gel agaroza.
Việc chọn loại gel và nồng độ các thành phần gel phụ thuộc vào kích thước trung bình của axit nucleic Trong một bảng gel với cùng dòng điện, các phân tử DNA có trọng lượng khác nhau sẽ có điện tích khác nhau, dẫn đến việc chúng di chuyển khác nhau sau cùng một khoảng thời gian Để phát hiện DNA sau khi điện di, người ta sử dụng phương pháp nhuộm Với gel agarose, ethidi bromua (C21H20BrN3) được sử dụng để gắn vào các bazơ của DNA và phát quang dưới tia cực tím, giúp xác định vị trí các đoạn DNA Đối với gel polyacrylamid, các phân tử thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và phát hiện qua kỹ thuật phóng xạ tự ghi Trong quá trình điện di, DNA chuẩn, thường là DNA người, được chạy cùng mẫu nghiên cứu để so sánh và xác định trọng lượng phân tử Hệ thống điện di bao gồm nguồn điện, buồng điện di, khuôn đổ gel và hệ thống chụp ảnh Các bước thực hiện bắt đầu bằng việc cân 1g agarose hòa vào 100ml đệm TBE hoặc TAE ở nhiệt độ phòng, khuấy đều, để yên 1 phút và sau đó làm nóng chảy trong lò vi ba.
Làm nguội gel xuống 50-55 độ C, thêm 1 ml ethidium bromide vào gel và lắp lược Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2-5 mm Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng, đậy nắp và cắm điện cực Thực hiện điện di trong khoảng 30 phút với điện thế thích hợp.
100 -120 V Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả.
Khi chọn loại gel cho điện di DNA, cần lưu ý kích thước mẫu DNA, bao gồm gel agarose hay polyacrylamide, nồng độ gel và loại đệm sử dụng (TBE hoặc TAE) Đệm TAE mang lại độ phân giải cao cho các phân đoạn lớn hơn 4 kb, trong khi đệm TBE có độ phân giải tốt nhất cho các phân đoạn từ 0,1 đến 3 kb Độ phân giải của các phân đoạn DNA cũng phụ thuộc vào phương pháp điện di, điện thế tối ưu, lượng DNA nạp và đệm nạp.
Thuốc nhuộm ethidi bromua (EtBr) là một chất huỳnh quang có khả năng nhận biết cả DNA sợi đơn và sợi kép, mặc dù ái lực với DNA sợi đơn thấp hơn DNA nhuộm EtBr có thể được phát hiện bằng tia cực tím, với ánh sáng UV ở bước sóng 254 nm được hấp thụ bởi DNA và chuyển sang thuốc nhuộm Ánh sáng UV ở 302 nm và 366 nm cũng được hấp thụ bởi EtBr, phát xạ năng lượng tại bước sóng 590 nm trong vùng vàng đỏ của quang phổ thấy được EtBr là một chất gây đột biến mạnh, do đó cần sử dụng găng tay khi thao tác với dung dịch và gel nhuộm Để đạt được độ phân giải cao, gel nên được nhuộm với EtBr ngay sau khi điện di.
Điện di DNA trên gel
Sản phẩm cắt của DNA được điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide, tạo thành các giải băng khác nhau Agarose, một polymer chiết xuất từ rong biển, được sử dụng rộng rãi trong quy trình điện di để phân tách DNA.
2 monomer là D-galactose và 3,6 anhydro-L-galactose DNA mang điện tích âm, di chuyển từ (-)đến (+) Tốc độ di chuyển phụ thuộc:.
Dạng cấu trúc DNA.Nồng độ agarose trong gel. Điện thế.
Gel agarose là loại gel phổ biến nhất trong điện di, đơn giản và hiệu quả để phân tích các đoạn có kích thước từ 0,5-20 kb Sau khi đun nóng và để nguội trên giá thể nằm ngang, lược được rút ra khi gel đông lại, sau đó đặt gel trong buồng điện di chứa dung dịch đệm Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang, và các axit nucleic được hiện hình dưới tia UV nhờ ethidium bromide Sau khi điện di, gel được chiếu sáng bằng UV (λ00 nm), cho phép quan sát các vạch đỏ da cam của axit nucleic, từ đó ước lượng kích thước các trình tự bằng cách sử dụng yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử Ngoài ra, điện di trên gel polyacrylamide cũng được sử dụng để tách RNA và protein dựa vào trọng lượng phân tử của chúng.
Vào năm 1970, Daniel Nathans dùng điện di trên gel polyacrylamide như công cụ đơn giản và nhanh chóng để tách các đoạn DNA bị cắt.
Gel polyacrylamide được sử dụng để tách các đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn 1000 bp, mặc dù quy trình thao tác phức tạp hơn so với gel agarose Vì vậy, gel này thường chỉ được sử dụng cho các mục đích đặc hiệu.
- Tinh sạch các oligonucleotid tổng hợp.-Xác định trình tự đoạn DNA nhỏ.
- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài
