Một lượng lớn collagen tái tổ hợp đã được tinh chế từ nguyên liệu thực vật. Dữ liệu cho thấy cây trồng là một sự thay thế có giá trị cho việc sản xuất collagen tái tổ hợp cho các mục đích y khoa và khoa học khác nhau.
Qui trình tách chiết collagen
2.2.1 Quy trình thu nhận Collagen được xây dựng như sau
Nguyên liệu sử dụng cho quá trình này bao gồm lá và cành của cây thuốc lá chuyển gen, được rửa sạch nhiều lần để loại bỏ tạp chất Sau khi rửa, lá và cành sẽ được đông lạnh trong nitơ hóa lỏng và đồng nhất bằng máy làm đá lạnh của Spex Industries, Metuchen, NJ, USA.
Nghiền: Tạo diện tích tiếp xúc lớn giữa nguyên liệu và dung môi chiết, tăng hiệu quả chiết collagen.
Quá trình chiết collagen bắt đầu bằng việc nghiền nhỏ nguyên liệu, sau đó tiến hành khảo sát các phương pháp chiết bằng acid acetic, enzyme pepsin, và sự kết hợp giữa enzyme pepsin và acid acetic Trong suốt quá trình chiết, cần duy trì nhiệt độ từ 3-6 độ C để ngăn chặn hiện tượng biến tính collagen thành gelatin.
Sau khi loại bỏ vật liệu không hòa tan bằng ly tâm, supernatant chứa collagen tái tổ hợp được phân đoạn với muối NaCl ở nồng độ 0,4 M và 0,9 M Các kết tủa ở nồng độ 0,9 M NaCl, giàu collagen tái tổ hợp, đã được phân hủy và thẩm tích bằng acid acetic 0,1 M, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ -20 °C.
C cho đến khi được sử dụng.
Các mẫu được phân tích bằng gel điện di sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) với điều kiện giảm hoặc không giảm (nếu có chỉ định) Sau đó, chúng được chuyển điện vào màng polyvinylidene difluoride (Immobilon-P, Millipore) và để qua đêm.
Màng được xử lý với dung dịch 10 CAPS mM (pH 11) và 5% methanol, sau khi bão hòa, được ủ với kháng thể đa giá chống collagen I do Tiến sĩ D Hartman từ Viện Pasteur, Lyon, Pháp cung cấp Tiếp theo, kháng thể thứ cấp được liên hợp với phosphatase kiềm Các immunoblots sau đó được tiết lộ bằng bộ kit nền phosphatase kiềm từ Bio-Rad.
Phương pháp phân tích và kính hiển vi điện tử
Để xác định trình tự amino acid N-cuối, mẫu đã được điện di SDS-PAGE và truyền điện, sau đó cắt các mảng liên quan từ màng tế bào Trình tự acid amin được xác định bằng phương pháp Edman suy thoái tự động với bộ phân tích protein 473A Applied Biosystems Đối với phân tích thành phần axit amin, chất kết tủa 0,9 M NaCl chứa collagen tái tổ hợp được hòa tan trong 0,1 M axit axetic và nung nóng ở 60 °C trong 15 phút trước khi tinh chế bằng HPLC đảo ngược trên cột thủy ngân C8 RP300 với gradient nước acetonitrile và 0,1% axit trifluoroacetic Các chuỗi α1 (I) tái tổ hợp tinh khiết xuất hiện như một đỉnh duy nhất với khối lượng phân tử dự kiến từ phân tích SDS-PAGE 6% Quy trình sàng lọc tương tự cũng được thực hiện trên các mẫu đồng phân collagen I Thành phần axit amin được xác định sau khi thuỷ phân dưới chân không (6 N HCl, 115 °C, 24 giờ) với sự có mặt của 2-mercaptoethanol trong hệ thống Pico Tag (Waters) và máy phân tích axit amin Beckman Để quay hiệu ứng màn chắn, mẫu được pha loãng đến 10 μg/ml với 0,1.
Maxit axetic được trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1, sau đó phun lên tấm mica tươi đã cắt và ngay lập tức đặt lên thiết bị bay hơi MED 010 (Balzers) Quá trình quay bóng được thực hiện như đã mô tả trước đó Các bản sao được quan sát bằng kính hiển vi Philips CM120 tại Trung tâm Microscopie Electronique Appliquée à Biologie et à la Géologie, Đại học Claude Bernard, Lyon I.
Lưỡng sắc tròn
Hình dạng xoắn ba và ổn định nhiệt của homotrimer tái tổ hợp đã được phân tích bằng kỹ thuật dichroism vòng Quang phổ được ghi ở 10 °C trong 100 mM axit axetic trên quang phổ kế CD6 Jobin Yvon với đơn vị nhiệt độ thay đổi Các mẫu collagen tái tổ hợp và homotrimer bò được hòa tan trong 100 mM axit axetic để so sánh Sự biến màu nhiệt được thực hiện ngay trước khi phân tích Các phép đo được tiến hành với tế bào chiều dài 0,1 cm, tốc độ không đổi 10 nm/phút và độ phân giải 0.2 nm Đường cong chuyển nhiệt được đo ở nồng độ 185 mg/ml bằng cách giám sát [θ] 225 nm theo nhiệt độ với tốc độ làm nóng 10 °C/h.
CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG COLLAGEN TRONG
3.1 Ứng dụng collagen vào các sản phẩm thức uống (trà, cà phê) nhằm bổ sung thêm lượng protein cho cơ thể
Trước đây, nỗ lực nâng cao chất lượng cà phê bằng các nguồn protein thương mại như casein, sữa và đậu nành đã không thành công Độ pH thấp của cà phê mạnh gần với điểm đẳng điện của casein (pH 4,6), khiến casein đông tụ ngay lập tức khi thêm vào cà phê nóng, tạo ra tình trạng không chấp nhận được Mặc dù whey protein không có điểm đẳng điện tại pH đó, nhưng nhiệt độ cao của cà phê cũng làm whey protein biến tính và vón cục, ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm Các acid trong cà phê làm tăng sự đông tụ của whey protein, tương tự như quy trình sản xuất phô mai Ricotta Cuối cùng, việc sử dụng whey protein hay protein đậu nành cũng không mang lại cải thiện đáng kể so với casein trong việc nâng cao chất lượng cà phê.
Vào năm 2010, Connolly và cộng sự đã phát minh ra một sản phẩm thức uống cà phê bổ sung protein, cho phép sản xuất hiệu quả mà không làm mất đi các tính chất cảm quan của cà phê thông thường Mục tiêu của phát minh là tạo ra đồ uống cà phê với hàm lượng protein đáng kể, đồng thời duy trì hương vị đặc trưng Phương pháp bổ sung này cũng có thể áp dụng cho các loại đồ uống pha chế khác như trà Tuy nhiên, việc thêm protein vào đồ uống nóng như cà phê là thách thức lớn do nhiệt độ cao (trên 87-88°C) và độ pH axit cao (khoảng 4,5 đến 4,8) Do đó, việc tìm kiếm loại protein ổn định trong điều kiện này là khó khăn, nhưng collagen thủy phân đã được phát hiện là một giải pháp khả thi cho vấn đề này.
Collagen thủy phân không có mùi vị đặc trưng, dễ hòa tan trong nước và ổn định trong điều kiện pH acid cũng như nhiệt độ cao Nhờ vào đặc tính này, collagen thủy phân có thể được thêm vào cà phê mà không làm ảnh hưởng đến hương vị của sản phẩm Nó cũng không bị tách pha trong môi trường cà phê nóng Tuy nhiên, collagen không phải là một protein đầy đủ, vì thiếu nhiều acid amin thiết yếu như tryptophan và tyrosine Do đó, con người không thể chỉ sử dụng collagen như nguồn protein duy nhất, mặc dù nó có thể nâng cao chất lượng dinh dưỡng của cà phê.
Trong những năm gần đây, công nghệ chế biến whey protein đã có những tiến bộ đáng kể, đặc biệt là trong việc cải thiện sự ổn định nhiệt của whey protein thông qua thủy phân nhẹ Tuy nhiên, việc sử dụng whey protein trong các sản phẩm thức uống pha sẵn (RTD) vẫn còn hạn chế do vấn đề về hương vị và mùi Các sản phẩm whey protein thủy phân thường có mùi khó chịu và vị đắng, khiến cho việc áp dụng trong cà phê gặp khó khăn Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng whey protein thủy phân ở mức độ thấp có thể gây ra hiện tượng chuyển màu và mùi không mong muốn Để khắc phục, tác giả đã thử nghiệm với whey protein thủy phân ở mức độ cao hơn (8% đến 12%), điều này giúp cải thiện màu sắc và loại bỏ mùi lưu huỳnh, nhưng vẫn gây ra sự thay đổi đáng kể về hương vị Kết quả cho thấy whey protein thủy phân ở mức độ cao không phù hợp để nâng cao chất lượng cà phê.
Chất lượng dinh dưỡng của protein có thể được cải thiện bằng cách kết hợp các protein không đầy đủ với protein chất lượng cao Whey protein và collagen được xem là hai loại protein bổ sung cho nhau, cung cấp đầy đủ acid amin để bù đắp cho những thiếu hụt Việc pha trộn whey protein và collagen theo tỷ lệ 50%:50% tạo ra sản phẩm chứa đầy đủ acid amin Một nghiên cứu đã thử nghiệm trộn hỗn hợp whey protein thủy phân và collagen thủy phân vào cà phê, với tổng lượng protein bổ sung là 5 gram cho mỗi 4 ounce cà phê Kết quả là một ly cà phê 8 ounce tiêu chuẩn sẽ chứa 10 gram protein, tương đương 20% giá trị tiêu thụ protein hàng ngày theo khuyến nghị của chính phủ Hoa Kỳ.
Collagen thủy phân tan trong nước và ổn định nhiệt có nguồn gốc từ bò, lợn hoặc cá, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe Whey protein, có thể là whey protein isolate hoặc concentrate, được thủy phân với mức độ từ 8% đến 12% để đảm bảo tính chất cảm quan tốt cho sản phẩm.
Hương cà phê, dù tự nhiên hay nhân tạo, có thể được sử dụng để tăng cường hương vị cho thức uống Mặc dù việc thêm hương vị không bắt buộc, nhưng nó thường được áp dụng để nâng cao sự chấp nhận của người tiêu dùng.
Lấy ví như trong sáng chế này, bổ sung vào 115 gram cà phê nóng, 2,75 g collagen thủy phân, và 3,3 g whey protein thủy phân Khối lượng sản phẩm cuối là
Cà phê bổ sung protein chứa 113,4 g và 5 g protein, giữ màu tối mà không có mùi lưu huỳnh hay hương vị lạ Tuy nhiên, người thử nhận thấy sự khác biệt giữa mẫu đối chứng và mẫu bổ sung protein, với cà phê đối chứng có hương vị và mùi mạnh hơn Khi thêm 0,5 g hương cà phê tự nhiên, tất cả người thử đồng ý rằng cà phê bổ sung protein gần giống với mẫu đối chứng Việc bổ sung collagen thủy phân, whey protein thủy phân và một lượng nhỏ hương cà phê tự nhiên tạo ra sản phẩm cà phê bổ sung protein với giá trị dinh dưỡng cao, đồng thời vẫn giữ được các thuộc tính mong muốn của cà phê.
Trong phát minh này, một loại thức uống cà phê đặc biệt đã được phát triển, bổ sung protein với thành phần chính là collagen thủy phân và whey protein thủy phân Sản phẩm này chứa khoảng 2% collagen thủy phân và 3% whey protein thủy phân, cùng với một lượng rất nhỏ hương cà phê tự nhiên để tăng cường hương vị Phương pháp bổ sung protein này cũng được áp dụng cho sản phẩm trà.
Collagen được ứng dụng trong các sản phẩm đồ uống có cồn không chưng cất từ nho, táo, lê, mạch nha và hoa bia, giúp làm trong sản phẩm Đồ uống này thường bị đục do sự hiện diện của các hạt nhỏ như bã nho, nấm men, peptide, pectins, dextrans, tannin, nhựa hop và polyphenol Để tạo ra một sản phẩm ngon miệng và trong suốt, việc loại bỏ các vật liệu gây đục thông qua quá trình làm trong là rất cần thiết.
Theo quy định tại Hoa Kỳ và nhiều quốc gia khác, các tác nhân làm trong rượu không được phép thay đổi tính cách cơ bản của rượu vang Đối với đồ uống có cồn không chưng cất, nhiều nước yêu cầu không được giữ lại các tác nhân làm trong trong sản phẩm cuối cùng.
Việc làm trong thường được thực hiện bằng cách tạo phức giữa các tác nhân như bentonit, carbon, gelatin, casein, polyvinylpyrrolidone và thạch, chủ yếu là collagen từ bóng cá Quá trình này bao gồm việc bổ sung các tác nhân làm trong vào đồ uống có cồn và ủ trong nhiều ngày, với bia thường kéo dài khoảng năm ngày để đạt độ trong mong muốn Tuy nhiên, các phức hợp này có kích thước hạt nhỏ, dễ gây tắc nghẽn bộ lọc, đòi hỏi phải thay đổi phương tiện lọc thường xuyên Thạch, mặc dù đắt tiền, thường được sử dụng vì khả năng tủa các tác nhân gây đục trong rượu và bia, và nó là một dạng collagen tương đối tinh khiết, nguồn gốc từ bong bóng của các loài cá lớn như Beluga Sturgeon.
Theo sáng chế năm 1984 của Cioca và cộng sự, một phương pháp làm trong sản phẩm đồ uống có cồn đã được nghiên cứu, bao gồm việc phối trộn hạt collagen tự nhiên với thức uống có cồn và tiến hành ủ Hỗn hợp này được ủ đủ lâu để hạt collagen tạo phức chất với các thành phần gây đục, sau đó các phức chất được tách ra bằng phương pháp lọc, nhằm sản xuất đồ uống có cồn đạt độ trong yêu cầu.
Sáng chế này mang đến một tác nhân làm trong hiệu quả và luôn sẵn có cho các sản phẩm đồ uống lên men có cồn Phức chất giữa tác nhân làm trong và vật gây đục có thể dễ dàng loại bỏ qua quá trình lọc nhờ kích thước lớn của vật liệu Hơn nữa, phức chất này còn có khả năng hòa tan trở lại trong sản phẩm, giúp việc tách loại trở nên thuận tiện hơn Tác nhân làm trong được đề cập ở đây là collagen.