TÓM TẮT LUẬN VĂNTinh bột trong khoai mỡ chiếm hàm lƣợng khá cao và đặt biệt nồng độ chất khô hòa tan trong khoai sau thủy phân cũng không kém gì các loại nông sản khác. Để có thể bảo quản lâu dịch đƣờng cũng nhƣ các thành phần có lợi khác trong khoai (ví dụ chất kháng oxi hóa, các lợi khuẩn có lợi cho đƣờng ruột probiotit…) tôi ứng dụng lên men lactic vào trong sản phẩm không cần thanh trùng, tiệt trùng hay dùng chất bảo quản.Với đề tài này thì tôi chọn chủng Lactobacillus sp, chủng này lên men mạnh, sinh ra nhiều kháng khuẩn, thuận lợi cho VSV có lợi và ức chế VSV gây hƣ hỏng. Để có thể lên men đƣợc tốt, nguồn gốc đầu tiên là nguyên liệu nhƣng các thông số của quá trình lên men cũng ảnh hƣởng nhiều đến lên men lactic. Chính vậy trong đề tài nghiên cứu này tôi đi khảo sát nhiệt độ (40oC, 45oC, 50oC), hàm lƣợng giống Lactobacillus sp (3%, 5%, 7%) và thời gian (16 giờ, 20 giờ, 24 giờ) thích hợp để lên men tốt nhất. Đồng thời để đánh giá sự lên men tốt chƣa có ức chế đƣợc các VSV gây hƣ hỏng nhƣ những bài nghiên cứu tƣơng tự trên đối tƣợng khác, tôi kiểm tra vi sinh về Salmonella, tổng vi sinh vật hiếu khí, nấm men nấm mốc, Coliforms và E.coli.
TỔNG QUAN
Nguyên liệu khoai mỡ
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Cây khoai mỡ (Dioscorea alata) là một loại cây có nguồn gốc từ Đông Nam Á, thuộc họ Dioscorea với khoảng 600 loài Ngoài khoai mỡ, một số loài khác như D esculenta (khoai từ), D hispida (củ nần), D pierrel (củ từ nước) và D bulbifera (khoai dái) cũng được trồng hoặc khai thác từ tự nhiên để làm lương thực.
– Loài (species): Dioscorea alata ở 3 vùng chính: Tây Phi, khu vực biển
Khoai mỡ, một loại cây trồng phù hợp với khí hậu nhiệt đới của Việt Nam, được trồng rộng rãi từ Bắc vào Nam Đặc biệt, huyện Thạnh Hóa, tỉnh Long An, nổi bật với diện tích trồng khoai mỡ lớn, bao gồm hai loại chính là khoai mỡ tím và khoai mỡ trắng.
Khoai mỡ là một loại cây dây leo, có thân mềm và khả năng sinh trưởng mạnh mẽ Củ khoai mỡ có bề mặt sần sùi và nhiều lông Hình thái cơ bản của khoai mỡ bao gồm các bộ phận chính như thân, lá và củ.
Rễ: rễ của củ khoai mỡ thuộc loại rễ chùm, ăn ngang trong đất Hệ thống sợi rễ nằm gần mặt đất, hầu hết ở độ sâu 30cm.
Thân: cây thân thảo, thuộc dạng dây leo Thân của khoai mỡ không có gai, thỉnh thoảng có những nốt sần con.
Lá khoai mỡ là loại lá đơn, thường có hình trứng hoặc hình tim với đỉnh nhọn Các gân chính của lá bắt nguồn từ gốc lá, trong khi các gân phụ phân bố theo hình mắc lưới Một số giống khoai mỡ cũng có hiện tượng mọc cách.
Hoa: ra hoa vào mùa hè
– thu Cụm hoa đực dạng bông khúc khuỷu có khi dài đến 30cm.
Cụm hoa cái thõng xuống thường nhỏ hơn.
Củ: củ to, thon dài,
Hình 2.2 Đặc điểm hình thái cây khoai mỡ
1: lá; 2: hoa; 3: đoạn thân mang quả; 4: củ và thường đơn độc, có khi xếp 2÷4 củ, mọc sâu hay lộ thiên.
Củ khoai mỡ chủ yếu được sử dụng và chứa khoảng 2/3 khối lượng là nước Tỷ lệ chất khô trong củ dao động từ 20% đến 30%, tùy thuộc vào giống và thời điểm thu hoạch Hydratcacbon là thành phần chính, chiếm phần lớn khối lượng củ, trong đó chủ yếu là các hạt tinh bột amylopectin mạch nhánh, tồn tại dưới dạng các hạt tinh bột hình elip trong các tế bào.
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của củ khoai mỡ
Thành phần Đơn vị Hàm lƣợng
Năng lƣợng Kcal 140 β-carotene àg 5ữ10
(Nguồn: Bài nghiên cứu khoa học “nghiên cứu sản xuất một số sản phẩm từ khoai mỡ” Trường Đại học Lạc Hồng, KS Nguyễn Thái Thanh Trúc tháng 6/2012)
Tinh bột là một polysaccharide quan trọng trong dinh dưỡng con người, chủ yếu có trong ngũ cốc như lúa mì, lúa mạch, lúa gạo và bắp, cũng như trong các loại củ như khoai tây, khoai mì, khoai lang và khoai mỡ Khoai mỡ chứa hàm lượng tinh bột từ 16,7% đến 28%, cung cấp năng lượng dồi dào cho cơ thể Tinh bột không tan trong nước ở nhiệt độ thường, và kích thước, hình dạng cũng như tỷ trọng của hạt tinh bột thay đổi tùy theo nguyên liệu, với kích thước hạt thường từ 1 đến 150 micromet và tỷ trọng dao động từ 1.55 đến 1.64 g/ml, cao hơn nước.
- Hình dạng tồn tại của tinh bột khoai mỡ nhƣ: tròn, tam giác, hình bầu dục và hình elip.
Tinh bột là một polymer lớn được hình thành từ các phân tử glucose liên kết với nhau qua liên kết glucoside, tạo thành sợi dài Cấu trúc chính của tinh bột bao gồm hai thành phần chính là amylose và amylopectin.
Amylose là một polymer nhỏ, mạch thẳng không phân nhánh, chủ yếu liên kết bằng liên kết 1.4-glucoside, với hàm lượng trung bình từ 14% đến 30% trong tinh bột khoai mỡ, tùy thuộc vào loài Đối với Dioscorea alata, hàm lượng amylose chiếm từ 21% đến 30% Ngược lại, amylopectin là một polymer lớn trong tự nhiên, có cấu trúc phức tạp hơn amylose và được liên kết bằng cả liên kết 1.4 và 1.6-glucoside, với trọng lượng phân tử cao gấp 100 lần so với amylose.
Glucose và sucrose là 2 loại đường chính được tìm thấy trong củ khoai mỡ.
Maltose và fructose xuất hiện trong củ khoai mỡ sau khi được lưu trữ vài ngày, cùng với các loại đường tự nhiên khác như pentose và mannose Những loại đường này được tiêu hóa chậm hơn trong cơ thể, giúp tạo cảm giác no lâu, rất phù hợp cho việc sản xuất thực phẩm chức năng dành cho người béo phì, tiểu đường và chế độ ăn kiêng Ngoài ra, sự khác biệt về chủng loại và môi trường tăng trưởng cũng ảnh hưởng đến mức đường trong củ khoai mỡ.
Phi tinh bột trong khoai mỡ bao gồm cellulose, hemixenlulose và pectin, là những thành phần quan trọng có trong thành tế bào của loại củ này Các hợp chất phi tinh bột này không chỉ cấu tạo nên thành tế bào khoai mỡ mà còn mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.
Cellulose được sử dụng làm chất độn trong thực phẩm nhờ vào khả năng hấp thụ nước và độ hòa tan thấp Các carbohydrate phức tạp và chất xơ trong cellulose giúp làm chậm quá trình chuyển hóa thành đường đơn giản, từ đó giảm tốc độ hấp thụ vào máu.
Cả hai hemicelluloses hòa tan và không hòa tan đóng vai trò quan trọng trong các sản phẩm thực phẩm chức năng.
Pectin là một thành phần khó tiêu, đóng vai trò quan trọng nhờ vào đặc tính trao đổi ion, được hình thành từ các đơn vị acid galacturonic và khả năng tạo gel.
Protein của khoai mỡ có hạn chế về lƣợng các axit amin không thay thế nhƣ isoleucine và axit amin có chứa lưu huỳnh.
Bảng 2.2 Thành phần acid amin của khoai mỡ Dioscorea alata (g/100g protein)
Nguồn: Bài nghiên cứu khoa học “nghiên cứu sản xuất một số sản phẩm từ khoai mỡ” Trường Đại học Lạc Hồng, KS Nguyễn Thái Thanh Trúc tháng 6/2012.
Chất lượng protein trong khoai mỡ thường thấp do thiếu hụt các acid amin thiết yếu Điều này đã thu hút sự chú ý từ nhiều khu vực trồng khoai mỡ trên toàn cầu, đặc biệt là về tác động của lượng protein thấp đối với chế độ ăn kiêng.
Khoáng chất là những hợp chất vô cơ thiết yếu cho việc hấp thu vitamin và cấu tạo xương, răng, tế bào mềm, cơ bắp, máu và tế bào thần kinh Trong khoai mỡ, khoáng chiếm từ 0.7 đến 2.1%, với lượng kali đáng kể giúp duy trì huyết áp ổn định Kali đóng vai trò quan trọng trong việc cân bằng dịch chuyển ion qua màng tế bào; sự thiếu hụt hoặc dư thừa ion K+ có thể dẫn đến rối loạn nhịp tim Ngoài ra, khoai mỡ còn là nguồn cung cấp magiê, tham gia vào quá trình chuyển hóa và ổn định tỷ lệ acid-bazơ trong cơ thể, đồng thời hỗ trợ caxi và photpho trong việc cố định xương Magiê được ứng dụng trong ngành thực phẩm và phòng chống bệnh ung thư, cũng như trong việc ngăn ngừa một số bệnh tim mạch và lão hóa.
Hoạt động chuyển hóa chất: vận chuyển photpho để tạo năng lƣợng cung cấp cho cơ thể.
Đối với hoạt động não
Ổn định nồng độ Na + và K + ở hai bên màng tế bào
Tính chống viêm và chống dị ứng
Photpho là nguyên tố quan trọng thứ hai trong cơ thể, chỉ sau canxi, với hàm lượng từ 28 đến 52mg có trong khoai mỡ Nguyên tố này cùng với canxi đóng vai trò thiết yếu trong việc cấu tạo bộ xương Nghiên cứu cho thấy hàm lượng photpho trong Dioscorea alata cao hơn so với Dioscorea rotundata và Dioscorea cayenensis (asemota et al., 1992).
Vitamin trong khoai mỡ chủ yếu là vitamin nhóm B Vitamin B6 chứa trong khoai mỡ có thể giúp cơ thể phá vỡ homocysteine, ngăn ngừa bệnh tim và đột quỵ [15].
Lên men lactic
Axit lactic (C3H6O3) đã được sử dụng lâu đời trong bảo quản và chế biến thực phẩm Đến thế kỷ XIX, con người mới hiểu rõ về axit lactic và các tác nhân gây ra quá trình lên men lactic.
Năm 1780 nhà bác học Sheele (Thụy Điển) đã tách đƣợc axit lactic từ sữa bò lên men bị chua và đƣợc gọi là “axit sữa”.
Năm 1857, Louis Pasteur đã phát hiện rằng quá trình lên men sữa do vi khuẩn lactic gây ra Kể từ đó, vi khuẩn lactic đã được nghiên cứu sâu rộng và được ứng dụng phổ biến trong ngành công nghệ thực phẩm cũng như trong đời sống hàng ngày.
Axit lactic tồn tại dưới hai dạng đồng phân quang học là D-lactic và L-lactic, trong đó cơ thể chỉ hấp thụ được L-lactic Dạng L-lactic thường được sử dụng trong chế biến thực phẩm như sản xuất phomat, nem chua, và mắm chua, cũng như trong việc bảo quản thức ăn cho gia súc Hơn nữa, axit lactic và các muối của nó còn được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm, mỹ phẩm, và làm chất tạo nhũ.
Axit lactic được sản xuất bằng 2 phương pháp:
Tổng hợp hóa cho sản phẩm chủ yếu là hỗn hợp hai dạng D và L
Lên men nhờ các nguồn vi khuẩn đường, vi khuẩn lactic.
Axit lactic ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, chăn nuôi và môi trường thủy sản Lactobacillus là nhóm vi khuẩn phổ biến nhất trong sản xuất probiotics, chất bổ sung thực phẩm chứa vi khuẩn sống giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, từ đó mang lại lợi ích cho động vật Lên men lactic, một quá trình công nghiệp quan trọng, diễn ra trong điều kiện kỵ khí, phân hủy hợp chất hữu cơ và tạo ra khí sinh học, chủ yếu là metan và CO2.
2.2.2 Phân loại lên men lactic [7]
Có hai kiểu lên men lactic: điển hình (đồng hình) và dị hình.
Trong quá trình lên men lactic, sản phẩm chính là axit lactic, chiếm từ 80 đến 90% tổng sản phẩm Ngoài ra, trong quá trình lên men dị hình, còn có các sản phẩm phụ như etanol, axit axetic và CO2.
Axit lactic, sản phẩm của quá trình lên men lactic điển hình, được tạo ra bởi vi sinh vật với khối lượng lớn Chất này không chỉ được bổ sung vào thực phẩm và đồ uống mà còn được sử dụng làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp hóa học Trong lĩnh vực dược phẩm, axit lactic thường được sử dụng dưới dạng muối canxi lactat như một tá dược quan trọng.
CH3CHOHCOOH + CaCO3 = Ca(CH3CHOHCOO) + CO2 + H2O [8]
Lên men lactic dị hình không có ứng dụng công nghiệp do quá trình này tạo ra nhiều sản phẩm cuối cùng, khiến việc tách biệt các sản phẩm trở nên tốn kém và phức tạp.
Vi khuẩn lactic chủ yếu có hình dạng cầu hoặc hơi oval, với đường kính từ 0.5 đến 1.5µm, thường xuất hiện riêng lẻ, theo cặp hoặc thành chuỗi như Streptococcus Kích thước của vi khuẩn hình que dao động từ 1 đến 8µm, và các tế bào này có thể đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi Tất cả các tế bào vi khuẩn lactic đều không di chuyển, không tạo bào tử, thuộc loại Gram dương (+) và có khả năng kỵ khí tùy tiện.
Vi khuẩn lactic có khả năng lên men mono và disaccaride, nhưng không phải tất cả disaccaride đều được lên men, ví dụ như saccarose và maltose không thể lên men Hầu hết các vi khuẩn lactic không có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide Các chủng vi khuẩn khác nhau sản sinh ra lượng axit lactic khác nhau, trong đó các chủng Lactobacillus thường tạo ra axit lactic nhiều hơn so với Streptococcus, với khả năng sản xuất từ 2% đến 3.5% axit lactic.
Streptococcus là một loại vi khuẩn có khoảng 1% axit lactic, với mỗi loài có nhiệt độ và pH phát triển khác nhau Chẳng hạn, loài trực khuẩn có khả năng phát triển ở pH từ 3.8 đến 4, trong khi cầu khuẩn không thể tồn tại trong điều kiện này pH tối ưu cho quá trình lên men của trực khuẩn là từ 5.5 đến 6 Vi khuẩn lactic xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, thường được tìm thấy ở thực vật, đất, thực phẩm như rau quả, thịt, sữa, cũng như trong đường ruột của con người (như Streptococcus faecalis) và động vật.
Vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn gây thối và bệnh nhờ vào việc tạo ra axit, làm giảm pH xuống dưới 4.5, cùng với khả năng sinh ra kháng khuẩn bacteriocin Hầu hết các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ tối ưu từ 25 đến 35 độ C, trong khi một số loại khác thích nhiệt độ tối ưu từ 40 đến 45 độ C.
2.2.3.2 Các chủng lên men lactic đồng hình [7]
Streptococcus lactic là loại cầu khuẩn ưa ấm, thường xuất hiện dưới dạng đôi hoặc chuỗi ngắn Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của chúng là từ 30 đến 35 độ C, trong khoảng thời gian này, chúng có khả năng làm đông tụ sữa sau 10 đến 12 giờ và tạo ra 1% axit lactic trong môi trường Nhiệt độ tối thiểu để chúng tồn tại là 10 độ C.
40†45 o C Nguồn nitơ cho vi khuẩn này cần cung cấp là pepton [8] Thường được sử dụng rộng rãi trong chế biến các sản phẩm sữa chua, bơ chua, phomat.
Streptococcus cremoris hình cầu, kết thành chuỗi dài, ƣa ấm, tạo thành axit ít.
Khoảng nhiệt độ sinh trưởng là 10 o C÷38 o C , tối ưu là 25 o C Lên men glucose và glactose[8].
Streptococcus termophilus chuỗi hình cầu dài, phát triển mạnh ở 40÷45 o C. Tích tụ trong môi trường khoảng 1% axit, được sử dụng cùng với Lactobacillus trong chế biến sữa chua và phomat.
Lactobacillus bulgaricus hình que lớn, thường kết chuỗi dài Không lên men saccarose Vi khuẩn ƣa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 40÷50 o C, tối thích
15÷20 o C Tạo nhiều axit, tích tụ trong sữa tới 2.5÷3.5% axit lactic, đƣợc dùng trong sản xuất sữa chua Địa Trung Hải.
Lactobacillus casei hay gặp ở dạng chuỗi dài ngắn khác nhau, tích tụ đƣợc
1.5% axit trong môi trường Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 30÷50 o C trực khuẩn này đƣợc dùng trong việc làm phomat.
Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn ưa nhiệt, hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ từ 30 đến 40 độ C, với mức tối thiểu là 20 độ C Trong sữa, vi khuẩn này có thể tích tụ lên đến 2.2% axit và sinh ra bacteriocin, giúp ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột Một số chủng L acidophilus còn được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm acidophin.
Lactobacillus delbrueckii trực khuẩn ƣa nhiệt, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi dài, ngắn Không lên men lactose, vì vậy nó không thấy có mặt trong sữa.
Nhiệt độ cho phát triển: tối thiểu 20 o C, thích hợp 45÷50 o C Trong cơ chất, nó tạo đƣợc 2.5% axit Đƣợc sử dụng trong sản xuất bánh mì và sản xuất axit lactic.
Lactobacillus plantarium là một loại vi khuẩn có khả năng kết đôi hoặc tạo thành chuỗi, với nhiệt độ tối ưu để phát triển là 30°C và có khả năng tích tụ 1,3% axit Vi khuẩn này thường được sử dụng trong quá trình muối chua rau quả và ủ chua thức ăn xanh cho gia súc.
2.2.3.3 Các chủng lên men lactic dị hình
Lactobacillus brevis, formerly known as L brassica fermenti, is primarily found in fermented cabbage and cucumber pickles This bacterium ferments sucrose, resulting in the production of 1.2% lactic acid, along with acetic acid, ethanol, and carbon dioxide It is commonly used in pickling vegetables, contributing to a pleasant flavor profile.
Chủng giống Lactobacillus sp
Là trực khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, hình que hay hình cầu, là vi khuẩn hiếu khí và ƣa acid Chúng kết thành chuỗi hoặc đứng riêng rẽ.
Lactobacillus sp là một nhóm vi khuẩn đa dạng, xuất hiện trong nhiều sản phẩm lên men từ cả động vật lẫn thực vật, đặc biệt là trong sản phẩm sữa Mỗi loài trong nhóm này có khả năng phát triển ở các mức nhiệt độ và pH khác nhau Đáng chú ý, hầu hết các loài không thể chuyển hóa nitrate, ngoại trừ L plantarum dưới những điều kiện nhất định Một số loài còn có khả năng sinh trưởng trong môi trường thiếu hụt dinh dưỡng và có khả năng chịu nhiệt tốt.
Các loài thuộc giống Lactobacillus sp: Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L.plantarum, L casei…
Một số vsv gây hƣ hỏng
Giống vi khuẩn Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, có đặc điểm Gram âm và hình dạng gậy với kích thước từ 0.7 đến 1.5 micromet chiều rộng và 2.0 đến 5.2 micromet chiều dài Tất cả các loài trong giống Salmonella, ngoại trừ Salmonella gallinarum, đều có lông roi, cho phép chúng di chuyển Chúng thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy tiện.
Bảng 2.3 Các tính chất sinh hóa cơ bản của Samonella
Tính chất Kết quả Ghi chú
Lên men glucid (+) Kèm theo sự tổng hợp acid
Lên men glucose sinh khí (+) Trừ một số chủng thuộc loài S. typhi và S gallinarum
Sử dụng citrate (+) Trừ S.typhi và S paratyphi A
Sinh H2S (+) Trừ một số chủng thuộc loài S. paratyphi A và S choleraesuis
Sử dụng lactose (-) Trừ S anizonae
Decarboxylase lysine (-) Trừ một số loài phụ
(Nguồn giáo trình thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm-Lê Văn Việt Mẫn)
Lưu ý: (+) dương tính, (-) âm tính, (+/-) có thể là dương tính hoặc âm tính tùy theo chủng.
2.4.2 Vi khuẩn hiếu khí (TPC) [4]
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn phát triển trong môi trường có oxy, và số lượng vi sinh vật này trong mẫu thực phẩm phản ánh mức độ vệ sinh, chế biến, độ tươi mới và nguy cơ hư hỏng Chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí chủ yếu được sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh của thực phẩm, không phải độ an toàn Để xác định chỉ số này, người ta đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một mẫu nhất định, với mỗi khuẩn lạc đại diện cho một tế bào vi khuẩn, được tính bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trong một đơn vị thể tích thực phẩm.
Men mốc là nhóm sinh vật nhân thực có vách tế bào bằng chitin, chứa nhân và các bào quan khác Tất cả các loài men mốc đều thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, cần nguồn cacbon hữu cơ từ môi trường bên ngoài để cung cấp năng lượng.
Có thể phân biệt nấm men và nấm mốc theo khái niệm sau:
Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty.
Nấm men là các tế bào đơn bào phát triển theo hình thức nảy chồi, đôi khi tồn tại dưới dạng khuẩn ty giả với các tế bào kết nối thành chuỗi Một số loại nấm men, như khuẩn lạc TPC buộc, có khả năng phát triển trong điều kiện vi hiếu khí.
Nấm mốc và nấm men trong thực phẩm có thể phát triển, dẫn đến việc thay đổi màu sắc, mùi vị và cấu trúc của sản phẩm Sự hiện diện của chúng không chỉ làm hư hỏng thực phẩm mà còn có thể sinh ra độc tố, gây nguy cơ ngộ độc thực phẩm.
Coliforms là các vi khuẩn Gram âm không sinh bào tử, có thể sống trong môi trường hiếu khí hoặc kỵ khí, với khả năng lên men lactose, tạo acid và sinh hơi ở nhiệt độ 37°C trong khoảng thời gian 24 đến 48 giờ Trong phân tích vi sinh, Coliforms được xác định là những vi khuẩn có khả năng sinh hơi khi được ủ trong môi trường canh Lauryl Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt ở 37°C trong 48 giờ.
Nhóm Coliforms là vi sinh vật phổ biến trong tự nhiên, có mặt trong ruột người và động vật Chúng được coi là chỉ thị cho sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác; số lượng Coliforms trong thực phẩm, nước hoặc mẫu môi trường có thể phản ánh nguy cơ nhiễm khuẩn Khi nồng độ Coliforms cao, khả năng xuất hiện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng tăng lên.
Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: Escherichia với 1 loài duy nhất là E coli,
Citrobacter, Klebsiella, and Enterobacter are distinguished by their unique biochemical properties, which are evaluated through specific tests known collectively as IMViC These tests include Indole, Methyl Red, Voges-Proskauer, and Citrate, providing essential insights into the characteristics of this group.
Coliforms chịu nhiệt là loại vi khuẩn có khả năng lên men lactose sinh hơi trong 24 giờ khi ủ ở 44°C trong môi trường canh EC Trong khi đó, Coliforms phân là nhóm Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indol khi được ủ trong 24 giờ ở 44,5°C trong canh Trypton Chúng là thành phần quan trọng của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và động vật máu nóng, đồng thời được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản và vận chuyển thực phẩm, nước uống, cũng như để phát hiện sự ô nhiễm phân trong các mẫu môi trường.
E coli là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++ (Indol (+),
Citrate (-)) Với (+) là dương tính, (-) là âm tính.
Escherichia coli Đƣợc phát hiện là vi sinh vật gây bệnh từ năm 1970 E coli thuộc họ
Enterobacteriaceae, đặc biệt là các loài E coli, thường hiện diện trong môi trường ô nhiễm phân và chất thải hữu cơ, cho phép chúng phát triển và tồn tại lâu dài Chúng sống chủ yếu trong ruột già của người và động vật, và có thể lây nhiễm vào thực phẩm qua phân hoặc nguồn nước trong quá trình sản xuất và chế biến E coli có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi và khử nitrat thành nitrit, gây ra tình trạng nhầy nhớt và hư hỏng thực phẩm.
E coli có khả năng gây bệnh đa dạng, bao gồm nhiễm khuẩn đường tiểu, nhiễm khuẩn máu ở người có sức đề kháng yếu, viêm màng não ở trẻ sơ sinh và tiêu chảy Để đánh giá sự hiện diện của Coliforms và E coli, các phương pháp định lượng được áp dụng một cách hiệu quả.
- Định lƣợng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E coli bằng phương pháp MPN.
- Định lượng Coliforms, Coliforms phân và E Coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Khoai mỡ tím, đặc biệt là khoai mỡ tím Thạnh Hóa, nổi bật với độ dẻo, củ to và đẹp Trong hai loại khoai mỡ tím là khoai mỡ tím than và khoai mỡ tím bông lau, loại khoai tím này có hình dáng suông, dài, mặc dù kích thước nhỏ hơn khoai mỡ ruột trắng nhưng lại mang đến hương vị ngon hơn Khi chế biến, khoai mỡ tím không chỉ tạo ra món ăn hấp dẫn mà còn có màu sắc đẹp mắt, vì vậy rất được thị trường ưa chuộng.
Khoai thường được bán dọc theo hai bên đường, bỏ ở các chợ đầu mối Giá khoai tại vườn thường dao động từ 5 ÷ 6 ngàn/kg , ngoài thị trường mắc hơn 12 ÷
Hình 3.1 Cánh đồng khoai mỡ Hình 3.2 Khoai mỡ khi thu hoạch
Nguồn Ảnh chụp thực tế tại Thạnh Hóa-Long An
3.2.2 Enzyme amylase và chủng giống Lactobacillus sp
Enzyme amylase được mua từ công ty TNHH thương mại & dịch vụ Nam
Giang Địa chỉ 133/11 Hồ Văn Huê, P 9, Q Phú Nhuận,Tp Hồ Chí Minh (TPHCM) Điện thoại: (08) 38453596, 38453177, 38458579 Fax: (08) 38476879
Mail: phamvn@namgiang.com.vn
Chủng giống Lactobacillus sp đƣợc phân lập chủ yếu từ những mẻ cơm lên men do Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp.
3.2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu
Hóa chất, dụng cụ, thiết bị dùng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê trong phần phụ lục A.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Sau khi tìm hiểu các tài liệu cũng như những bài nghiên cứu tương tự tôi đưa ra quy trình nghiên cứu dự kiến nhƣ sau
3.3.1.1 Sơ đồ quy trình lên men lactic dịch đường thủy phân từ tinh bột dự kiến
Nước Tán nhuyễn α-amylase Dịch hóa Nhiệt độ 85 o C, 45 phút Glucoamylase Đường hóa Nhiệt độ 60 o C, 3 giờ
Samonella TPC YM Coliforms E Coli
Hình 3.4 Sơ đồ quy trình lên men lactic dịch đường thủy phân từ tinh bột dự kiến 3.3.1.2 Giải thích quy trình
• Mục đích: chọn giống chất lƣợng tốt sẽ hạn chế đƣợc tổn thất, tăng hiệu suất và giảm đƣợc chi phí.
• Yêu cầu: để nâng cao hiệu suất sản xuất, giảm thiểu tỉ lệ phần loại bỏ thì nguyên liệu đầu vào nên chọn củ lớn, dài, trọng lƣợng lớn.
Gọt vỏ nhằm loại bỏ lớp vỏ bên ngoài của khoai, chủ yếu là cellulose không có giá trị nhiều về dinh dƣỡng.
• Mục đích: hồ hóa sơ bộ, chuẩn bị cho thủy phân.
• Yêu cầu: khoai chín đều, càng chín càng tốt.
Tán nhuyễn phá vỡ cấu trúc tế bào, làm cho cấu trúc trở nên lỏng lẽo hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân.
• Mục đích: thủy phân tinh bột thành các dextrin phân tử thấp và một ít đường maltose, chuẩn bị cho quá trình đường hóa.
• Cách tiến hành: sau khi bổ sung nước tiến hành nâng nhiệt độ lên 85 o C cho 0.05% α-amylase vào dịch hóa trong vòng 45 phút. Đường hóa
• Mục đích: phân cắt tạo ra các phân tử đường đơn, thích hợp lên men lactic.
Sau khi thực hiện quá trình dịch hóa trong 45 phút, hạ dần nhiệt độ xuống 60°C và bổ sung 0.09% glucoseamylase, đường hóa diễn ra trong 3 giờ Quá trình này được kiểm tra bằng cách thử iod đến khi màu xanh của tinh bột mất hoàn toàn, cho thấy thủy phân đã hoàn tất.
• Mục đích: bảo quản thành phần có lợi trong dịch đường được lâu hơn, ức chế VSV gây hƣ hỏng.
• Cách tiến hành: sau khi thủy phân tạo được dịch đường, tiến hành bổ sung giống Lactobacillus sp vào và lên men.
• Mục đích: kiểm tra xem sản phẩm có an toàn không và đánh giá đƣợc quá trình lên men lactic có đạt không.
• Cách tiến hành đƣợc thể hiện cụ thể ở mục 3.3.2.4
Xác định mật độ và nhuộm
Khảo sát quá trình lên men Khảo Thời gian sát
Hàm lƣợng giống Định tính samonella Định lƣợng TPC Phân tích vi sinh Định lƣợng nấm men, nấm mốc Định lƣợng coliforms, E coli
Hình 3.5 Sơ đồ bố trí nội dung ngiên cứu 3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Tăng sinh Lactobacillus sp
Mục đích: tăng sinh khối và tăng hoạt lực giống.
Nguyên tắc: giữ giống sau đó tăng sinh nhân giống cấp 1 và nhân giống cấp 2. Cách tiến hành:
Trong nghiên cứu vi khuẩn lactic, các môi trường thường được sử dụng bao gồm MRS, môi trường cà chua, môi trường cao nấm men, môi trường rau cải và môi trường sữa để tăng sinh Lactobacillus sp Trong bài nghiên cứu này, tôi đã chọn môi trường cà chua làm môi trường tăng sinh do nó giàu dinh dưỡng, tiết kiệm và có tính kinh tế cao.
Để giữ giống và chuẩn bị nhân giống, cần tính toán và pha chế 20ml môi trường MRS cùng với 100ml môi trường cà chua Cà chua phải được rửa sạch, hấp chín, xay nhuyễn và lọc để thu được dịch cà chua Đồng thời, pha 10ml nước muối sinh lý với nồng độ 8,5g/l Sau khi hoàn tất, kiểm tra lại pH của môi trường đạt từ 5.5 đến 6 và nồng độ chất khô trong khoảng 5÷20%.
Rót môi trường MRS đã hòa tan agar vào 2 ống nghiệm (10ml/ống) và thêm 10ml dung dịch nước muối vào 1 ống nghiệm khác Phân phối 90ml môi trường cà chua vào bình Erlen và 9ml vào ống nghiệm Sau đó, làm nút bông, bao gói và hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 phút với áp suất 1atm.
Sau khi hấp làm nguội môi trường về nhiệt độ phòng, riêng 2 ống nghiệm môi trường MRS tạo thạch nghiêng 45 o
Khử trùng que cấy vòng bằng cồn 70 o , cấy chuyền từ ống giống qua ống thạch nghiêng ủ tủ ấm 37 o C, trong 24 giờ.
Để thực hiện nhân giống cấp 1, sử dụng pipet và đầu típ vô trùng để hút 1ml nước muối vô trùng, sau đó cho vào ống giống đã được giữ trong 24 giờ Tiến hành khử trùng que cấy và hòa tan đều giống với nước muối Cuối cùng, rót toàn bộ dịch vào ống nghiệm chứa 9ml môi trường dịch cà chua đã được hấp khử trùng và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ.
Nhân giống cấp 2 được thực hiện sau 24 giờ từ quá trình nhân giống cấp 1, bằng cách cấy chuyền ống giống vào 90ml dịch lọc cà chua trong bình erlen đã được hấp khử trùng với tỉ lệ 1:10 Quá trình tăng sinh sẽ diễn ra trong tủ lắc và sau 24 giờ, mật độ giống sẽ được kiểm tra.
Lưu ý: cách pha thành phần môi trường MRS nằm ở phụ lục A Nhớ làm tan agar trong lò vi ba.
3.3.2.2 Thí nhiệm 2: Xác định mật độ Lactobacillus sp và nhuộm Gram quan sát hình thái.
Thí nghiệm 2a: Xác định mật độ Lactobacillus sp
Mục đích: giúp ta bổ sung lƣợng giống cho phù hợp lên men.
Nguyên tắc: xác định mật độ Lactobacillus sp bao nhiêu CFU/ml bằng kỹ thật hộp trãi
Chuẩn bị 70ml nước muối sinh lý để pha loãng giống và phân phối vào ống nghiệm với 9ml mỗi ống Đồng thời, chuẩn bị 90ml môi trường MRS để làm tan agar và cho vào erlen Sau đó, làm nút bông, bao gói và hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút với áp suất 1atm.
Làm nguội môi trường MRS về nhiệt độ phòng, tiến hành đổ đĩa chờ đến khi thạch đông.
Để tiến hành pha loãng, trước tiên cần làm nguội môi trường pha loãng Sử dụng pipet man và đầu típ vô trùng, hút 1ml mẫu sau khi tăng sinh cấp 2 cho vào 9ml nước muối sinh lý, tạo ra dung dịch 10^-1 (tỉ lệ pha loãng 1:10) Tiếp theo, hút 1ml từ dung dịch 10^-1 sang 9ml ống nghiệm nước muối khác để tạo ra dung dịch 10^-2, và tiếp tục quá trình này cho đến dung dịch 10^-7.
Sau khi đông, hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng 10^-5, 10^-6, 10^-7 và cấy sang đĩa mới Tiến hành khử trùng que cấy và trang đều trên bề mặt thạch cho đến khi khô Mỗi nồng độ sẽ sử dụng hai đĩa Cuối cùng, úp ngược các đĩa và ủ trong tủ ấm ở 37°C trong 48 giờ.
Đếm và tính kết quả theo công thức tổng quát định lƣợng VSV bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc [3].
C: Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên 6 đĩa của ba độ pha loãng liên tiếp
V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa (ml) d: Hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất n1: Số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất n2: Số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ hai n3: Số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ ba
Hấp triệt trùng áp suất 1atm Tăng sinh Lactobacillus sp 24giờ
Pha loãng 10 -1 ÷10 -7 Cấy 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 sang MRS Ủ 37 o C (24 giờ) đếm khuẩn lạc và tính kết quả
Hình 3.6 Sơ đồ xác định mật độ Lactobacillus sp
Thí nghiệm 2b: Nhuộm Gram Lactobacillus sp trên kính hiển vi
Phương pháp nhuộm Gram do nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans Christan Gram (1853 -1983) phát minh ra từ năm 1884.
Mục đích việc nhuộm Gram giúp ta biết đƣợc hình thái và Gram âm hay Gram dương.
Nguyên tắc phân loại vi khuẩn theo phương pháp Gram dựa trên khả năng bắt màu của chúng: vi khuẩn Gram âm sẽ cho kết quả màu hồng, trong khi vi khuẩn Gram dương sẽ cho kết quả màu tím Phương pháp này được phát triển bởi nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans Christian Gram.
Cho giọt nước lên phiến kính
Dùng que cấy cấy giống lên phiến kính hòa tan đều
Hơ khô Cho giọt tím tinh thể để 30 giây
Dùng nước cất rửa và hơ khô Cho 1 giọt lugol để 30 giây Rửa và hơ khô bằng cồn
Cho 1 giọt safarin để 30 giây sau đó rửa và hơ khô Cho 1 giọt dầu soi kính Quan sát vật kính 100X
Hình 3.7 Sơ đồ quy trình nhuộm gram (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1975) [12] 3.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát quá trình lên men lactic
Nhiệt độ, thời gian và hàm lượng giống Lactobacillus sp là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic, có thể dẫn đến sự giảm chất lượng sản phẩm.
Dịch đường sau thủy phân
Chọn nhiệt độ và hàm lƣợng giống phù hợp lên men ở 16, 20, 24 giờ
Xác định % acid lactic sau lên men
Hình 3.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ, thời gian và hàm lượng giống lên men lactic
Thí nghiệm 3a: Khảo sát nhiệt độ và hàm lƣợng giống Lactobacillus sp lên men lactic
Mục đích: xác định thông số nhiệt độ, hàm lƣợng giống thích hợp cho lên men lactic.
Yếu tố cố định: thời gian lên men 24 giờ
Yếu tố thay đổi: nhiệt độ và hàm lƣợng giống Lactobacillus sp
Nhiệt độ quá trình lên men là một yếu tố quan trọng, với các chủng Lactobacillus sp thường hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ 45÷50 o C Ngược lại, nhiệt độ từ 30÷37 o C lại tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các vi sinh vật gây hư hỏng Dựa trên nghiên cứu trước đó, tôi đã tiến hành khảo sát ở các nhiệt độ này để đánh giá ảnh hưởng đến quá trình lên men.
Hàm lượng giống Lactobacillus sp là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu, được tham khảo từ luận văn thạc sĩ của Trương Thị Như Hiếu tại trường Đại học Sư phạm TP.HCM và các nghiên cứu về lên men lactic từ mật rỉ đường.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm 3a
Chỉ tiêu đánh giá: (%) acid lactic sinh ra sau lên men
Thí nghiệm 3b: xác định thời gian lên men lactic
Mục đích thí nghiệm: xác định thời gian thích hợp lên men lactic Phương pháp thí nghiệm
Yếu tố cố định: giá trị nhiệt độ và hàm lƣợng giống đã khảo sát ở thí nghiệm 2a.
Yếu tố thay đổi: thời gian lên men
- Nhân tố C: thời gian thay đổi ở 3 mức độ dựa bài nghiên cứu trước[18] nên tôi chọn khảo sát tại:
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 3b
Chỉ tiêu đánh giá: xác định (%) acid lactic tạo thành.
Lưu ý: (%) acid lactic tạo thành được xác định theo phương pháp chuẩn độ bằng
NaOH 0,1N với chỉ thị Phenolphtalein 1% Kiểm tra thêm độ Bx và pH sau lên men.
3.3.2.4 Thí nghiệm 4: Phân tích chỉ tiêu vi sinh Định tính Samonella (TCVN 4829:2005, ISO 6579:2002)
Phương pháp này dùng để định tính và phát hiện có hay không có Samonella. Quy trình phát hiện trải qua bốn giai đoạn kế tiếp nhau.
- Tiền tăng sinh: mẫu được tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc Cấy mẫu thử trong dung dịch đệm pepton ủ ở 37 o C ± 1 o C trong 18giờ ± 2giờ.
- Tăng sinh: mẫu sau khi tiền tăng sinh cấy sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV ủ ở 41,5 o C ± 1 o C trong 24giờ ± 3giờ.
- Phân lập: cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang môi trường rắn chọn lọc XLD và HE ủ ở 37 o C ± 1 o C trong 24giờ ± 3giờ.
- Khẳng định: cấy chuyền các khuẩn lạc giả định Samonella sang môi trường dinh dưỡng và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa.
Quy trình phân tích Samonella
Tăng sinh trên môi trường BPW
Phân lập trên XLD và HE
KIA LDC MR-VP Indol Ure
Hình 3.9 Quy trình phân tích Samonella[4]
Để tiến hành, lấy 25ml mẫu sau lên men, cho vào 225ml môi trường BPW đã được hấp khử trùng Ủ hỗn hợp này ở 37°C trong 24 giờ Sau đó, khử trùng que cấy vòng và cấy chuyền từ môi trường BPW sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ ở 41,5°C.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thí nghiệm 2: Xác định mật độ Lactobacillus sp và nhuộm gram quan sát hình thái
4.2.1 Thí nghiệm 2a: Mật độ Lactobacillus sp
Hình 4.3 Khuẩn lạc Lactobacillus sp trên môi trường MRS
Khuẩn Lactosebacillus sp được quan sát trong hình 4.3, xuất hiện trên môi trường MRS với màu trắng đục và hình dạng riêng lẻ, dễ dàng nhận biết Số lượng khuẩn lạc giảm dần khi nồng độ pha loãng đạt mức 10^-7.
Bảng 4.1 Số khuẩn lạc Lactobacillus sp đếm đƣợc Độ pha loãng 10 -5 10 -6 10 -7 Đĩa 1 230 63 31 Đĩa 2 243 71 29
Dựa vào bảng 4.1 cho tôi thấy đƣợc số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25÷250 khuẩn lạc/đĩa và cao nhất ở nồng độ pha loãng 10 -5 , thấp dần về nồng độ 10 -7
Số khuẩn lạc Lactobacillus sp đếm đƣợc trên 3 độ pha loãng liên tiếp là:
Dựa vào hình 4.3 và bảng 4.1, ta nhận thấy rằng nồng độ pha loãng cao sẽ dẫn đến sự phát triển dày đặc của khuẩn lạc Lactobacillus sp, trong khi nồng độ pha loãng thấp lại cho số lượng khuẩn lạc thưa hơn Điều này xảy ra do hàm lượng mẫu cao ở nồng độ pha loãng lớn, từ đó tạo ra nhiều khuẩn lạc hơn Tuy nhiên, để thuận tiện cho quá trình đếm, nên pha loãng đến mức có từ 25 đến 250 khuẩn lạc trên mỗi đĩa.
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự (2003) đã sử dụng hai chủng
Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus được sử dụng để sản xuất chế phẩm probiotic, với số lượng tế bào vi khuẩn sống đạt 10^6 CFU/g sau 6 tháng Chế phẩm này có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella, với kết quả cho thấy nồng độ 10^8 CFU/ml cao hơn so với 10^6 CFU/ml, chứng tỏ khả năng ức chế Salmonella của chủng vi khuẩn này.
Lactobacillus sp sau khi lên men dịch đường sẽ khá tốt.
4.2.2 Thí nghiệm 2b: Kết quả nhuộm Gram
Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc Lactobacillus sp khi nhuộm Gram
Khi quan sát dưới kính hiển vi, khuẩn lạc Lactobacillus sp có hình dạng que đứng riêng lẻ, kết chuỗi hoặc chùm Sau khi nhuộm Gram, khuẩn lạc này hiện lên màu tím, cho thấy chúng thuộc nhóm Gram (+).
Thí nghiệm 3: Khảo sát quá trình lên men lactic
4.3.1 Thí nghiệm 3a: Khảo sát nhiệt độ và hàm lƣợng giống Lactobacillus sp lên men lactic
Bảng 4.2 Phần trăm acid lactic sinh ra tương ứng với nhiệt độ và hàm lƣợng giố ng khác nhau
Nhiệt độ ( o C) Hàm lƣợng giống Lactobacillus sp
Lưu ý cố định lên men 24 giờ.
Dựa vào số liệu trong bảng 4.2, tỷ lệ (%) acid lactic sinh ra tăng dần theo hàm lượng giống Đặc biệt, ở nhiệt độ 45 o C, tỷ lệ (%) acid lactic được tạo ra cao hơn so với các nhiệt độ khác.
40 o C và 50 o C Đồng thời cũng tại nhiệt độ 45 o C hàm lƣợng giống 5% (%) acid lactic sinh ra cao hơn 3% và 7%.
Sử dụng phần mềm Excel để kiểm định phương sai ANOVA nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến phần trăm acid lactic sinh ra, chúng tôi đã thu được bảng số liệu chi tiết.
Bảng 4.3 Sự tương tác giữa nhiệt độ và thời gian lên phần trăm acid lactic ANOVA
Variation SS Df MS F P-value F crit
a: yếu tố nhiệt độ (sample)
b: yếu tố hàm lƣợng giống (Columns)
c: tương tác nhiệt độ và hàm lượng giống (interaction)
Theo bảng 4.3, giá trị p của yếu tố nhiệt độ và hàm lượng giống đều nhỏ hơn α = 0.05, cho thấy rằng cả hai yếu tố này đều có ảnh hưởng đáng kể đến phần trăm acid lactic sinh ra sau quá trình lên men lactic Hơn nữa, có sự tương tác giữa nhiệt độ và hàm lượng giống ở mức ý nghĩa α = 0.05 với chỉ số p = 0.039 < α Thêm vào đó, bảng kiểm định sự khác biệt giữa các giá trị nhiệt độ và hàm lượng giống (phụ lục C) chỉ ra sự khác biệt rõ rệt giữa các mức nhiệt độ (40 o C).
45 o C, 50 o C) có sự khác biệt với nhau ở mức ý nghĩa, đồng thời hàm lƣợng giống (3%, 5% và 7%) cũng có sự khác biệt ở mức ý nghĩa.
Bảng 4.4 Số liệu trung bình phần trăm acid lactic sinh ra của 3 lần lặp
Hàm lƣợng giống Lactobacillus sp %
Dựa vào bảng số liệu 4.4 cho tôi thấy đƣợc (%) acid lactic sinh trung bình 3 lần lặp tại 45 o C và hàm lƣợng giống 5% là cao nhất.
Dựa vào bảng số liệu 4.4 vẽ đồ thị nhƣ sau:
Hình 4.5 Đồ thị (%) acid lactic sinh ra tương ứng với nhiệt độ và hàm lượng giống
Dựa vào đồ thị hình 4.5, tại nhiệt độ 45°C, phần trăm acid lactic cao hơn so với 40°C và 50°C Khi sử dụng hàm lượng giống 5%, phần trăm acid lactic tạo ra cũng cao hơn so với mức 3% và 7%.
Theo đồ thị và bảng số liệu 4.5, phần trăm acid lactic sinh ra ở nhiệt độ 45°C với hàm lượng 5% là điều kiện tối ưu cho quá trình lên men lactic.
Tại nhiệt độ 45 o C, hàm lượng giống 3% không đủ để tiêu thụ hết 9÷10 o Bx trong 24 giờ, trong khi hàm lượng giống 7% lại lên men nhanh nhưng thiếu cơ chất Do đó, cần lựa chọn nhiệt độ phù hợp để tối ưu hóa quá trình lên men.
45 o C và hàm lƣợng giống là 5% là thích hợp.
4.3.2 Thí nghiệm 3b: Khảo sát thời gian lên men lactic
Bảng 4.5 Phần trăm acid lactic sinh ra tương ứng với các thời gian lên men
Số lần lặp Thời gian lên men (giờ)
Theo bảng số liệu 4.5, phần trăm acid lactic sinh ra tăng dần theo thời gian, đạt mức cao nhất sau 24 giờ.
Xử lý số liệu bằng phần mềm excel có đƣợc bảng số liệu sau
Bảng 4.6 Bảng anova thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian lên phần trăm acid lactic sinh ra
Variation SS df MS F P-value F crit
Theo bảng 4.6, giá trị p < α cho thấy thời gian có ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ (%) acid lactic sinh ra với mức ý nghĩa α Bảng thời gian (phụ lục C) cũng chỉ ra rằng các giá trị thời gian 16 giờ, 20 giờ và 24 giờ có sự khác biệt rõ rệt ở mức ý nghĩa α=0.05.
Bảng 4.7 Số liệu trung bình %acid lactic sinh ra tương ứng với thời gian
Thời gian lên men 16 giờ 20 giờ 24 giờ
Bảng số liệu 4.7 cho tôi thấy (%) acid lactic sinh ra ở 24 giờ là cao nhất.
Từ bảng số liệu 4.7 vẽ đƣợc đồ thị sau:
% acid lactic sinh ra g/100ml
Hình 4.6 Đồ thị tương quan giữa thời gian và phần trăm acid lactic sinh ra
Theo đồ thị hình 4.6, sau 24 giờ, phần trăm acid sinh ra đạt 0.336 g/100ml, cao hơn so với 16 giờ và 20 giờ, cho thấy thời gian 24 giờ là thời điểm thích hợp nhất cho quá trình lên men Trong khi đó, ở 16 giờ và 20 giờ, thời gian chưa đủ để Lactobacillus sp tiêu thụ hết lượng đường có trong nguyên liệu.
Kết quả thí nghiệm cho thấy phần trăm acid lactic sinh ra ở thí nghiệm 3a và 3b không đạt mức lý thuyết 2÷3.5%, mặc dù độ chua sản phẩm cảm quan vừa phải và vẫn giữ được vị ngọt Kiểm tra vi sinh cho thấy không có sự hiện diện của Samonella, Coliforms và E coli Do đó, tôi quyết định chọn nhiệt độ khảo sát là 45 oC, thời gian 24 giờ và hàm lượng giống là 5%.
Thí nghiệm 4: Phân tích chỉ tiêu vi sinh
Kết quả: Không xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng trên hai môi trường HE và XLD suy ra không có Samonella trong mẫu.
Hình 4.7 Môi trường HE (trái) và XLD (phải) trước khi cấy chuyền từ RV qua
Hình 4.8 Môi trường HE (trái) và XLD (phải) sau khi cấy chuyền từ RV qua
Dựa vào hình 4.7 trước khi cấy và hình 4.8 sau khi cấy quan sát không có khuẩn lạc nào trên hai môi trường HE và XLD.
Chủng Lactobacillus sp có khả năng sản sinh bacteriocin, giúp ức chế sự phát triển của Samonella Hơn nữa, quá trình lên men ở nhiệt độ 45 oC khiến Samonella không thể sống sót sau 24 giờ Những yếu tố này giải thích lý do không phát hiện Samonella trong sản phẩm.
Theo quyết định 46-BYT mục 6.5, vi sinh vật trong ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc phải tuân thủ giới hạn cho phép Đối với các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ, bánh và bột mà không qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng, yêu cầu không được phát hiện Samonella Việc kiểm tra sản phẩm không phát hiện Samonella chứng tỏ rằng sản phẩm hoàn toàn an toàn và không chứa vi khuẩn này.
Hình 4.9 Môi trường PCA sau khi cấy mẫu
Dựa vào hình 4.9, khuẩn lạc tổng vi sinh vật hiếu khí xuất hiện riêng lẻ, dễ dàng quan sát với màu trắng đục trên môi trường PCA và có xu hướng giảm dần theo nồng độ pha loãng.
10 -3 , 10 -4 , 10 -5 Ở nồng độ 10 -3 số khuẩn lạc mọc nhiều hơn so với 10 -4 và 10 -5
Bảng 4.8 Số khuẩn lạc TPC đếm đƣợc Độ pha loãng 10 -3 10 -4 10 -5 Đĩa 1 133 39 30 Đĩa 2 188 45 38
Dựa vào bảng 4.8 cũng cho thấy số khuẩn lạc ở độ pha loãng 10 -3 cao hơn 10 -4 và 10 -5 Đồng thời số khuẩn lạc ở 2 đĩa vẫn nằm trong 25÷250 khuẩn lạc/đĩa.
Số khuẩn lạc TPC đếm đƣợc trên đĩa ở 3 độ pha loãng liên tiếp là:
Dựa vào hình 4.9 và bảng số liệu 4.8, có thể thấy rằng mật độ TPC tăng cao ở nồng độ lớn Do đó, để dễ dàng nhận diện khuẩn lạc và thuận tiện cho quá trình đếm, việc pha loãng mẫu nhiều lần là cần thiết.
Theo quy định 46-BYT, hàm lượng TPC trong sản phẩm ngũ cốc dùng trực tiếp không qua xử lý nhiệt phải đạt 10^4 CFU/ml Kết quả phân tích sản phẩm sau lên men lactic cho thấy giá trị lên tới 2.1 x 10^6 CFU/ml, vượt ngưỡng cho phép Tuy nhiên, điều này không đồng nghĩa với việc sản phẩm không an toàn hay kém chất lượng, vì TPC có mặt rộng rãi trong môi trường và dễ dàng sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí Sản phẩm có thể bị nhiễm khuẩn do các yếu tố như điều kiện xung quanh, phòng thí nghiệm không đảm bảo vô trùng, hoặc quy trình khử trùng không hiệu quả Để khắc phục tình trạng này, cần vệ sinh kỹ tay, dụng cụ và tủ cấy bằng cồn 70°C, sau đó bật tia UV trong 15 phút trước khi tiến hành cấy.
4.4.3 Định lƣợng nấm men, nấm mốc
Hình 4.10 Môi trường DRBC sau khi cấy mẫu
Hình 4.10 cho thấy sự phát triển của khuẩn lạc nấm men và nấm mốc, với màu hồng và hơi đục trên môi trường DRBC Số lượng khuẩn lạc giảm dần theo nồng độ pha loãng từ 10^-3 đến 10^-5, trong đó ở nồng độ 10^-3, số khuẩn lạc mọc nhiều hơn so với các nồng độ pha loãng khác.
Bảng 4.9 Số khuẩn lạc YM đếm đƣợc Độ pha loãng 10 -3 10 -4 10 -5 Đĩa 1 86 27 25 Đĩa 2 110 28 9
Dựa vào số liệu từ bảng 4.9, số lượng khuẩn lạc nấm men và nấm mốc ở độ pha loãng 10^-3 cao hơn so với 10^-5 Tuy nhiên, tổng số khuẩn lạc ở mỗi độ pha loãng vẫn thấp hơn 250 khuẩn lạc trên mỗi đĩa.
Số khuẩn lạc YM đếm đƣợc trên đĩa ở 3 độ pha loãng liên tiếp là:
Dựa trên hình 4.10 và bảng 4.9, có thể thấy rằng số lượng khuẩn lạc tăng cao ở nồng độ pha loãng cao và giảm dần ở nồng độ pha loãng thấp Điều này chứng minh rằng mật độ nấm men và nấm mốc dày đặc hơn ở nồng độ pha loãng cao Do đó, để dễ dàng nhận diện khuẩn lạc và thuận lợi cho quá trình đếm, cần thực hiện việc pha loãng mẫu nhiều lần.
Theo quy định 46-BYT, hàm lượng nấm men và nấm mốc trong sản phẩm ngũ cốc chưa qua xử lý nhiệt không được vượt quá 10^2 CFU/ml Tuy nhiên, kết quả phân tích cho thấy sản phẩm sau lên men lactic có mức nấm men là 1.2 x 10^6 CFU/ml, vượt ngưỡng cho phép Điều này không nhất thiết đồng nghĩa với việc sản phẩm không an toàn hay kém chất lượng, vì nguyên nhân vượt ngưỡng có thể do yếu tố từ dụng cụ, môi trường, hoặc nhiễm từ các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Để giảm thiểu rủi ro nhiễm nấm men và nấm mốc, cần thực hiện vệ sinh tay và dụng cụ khi cấy, sử dụng tủ cấy đã được khử trùng bằng cồn 70°C, bật tia UV trong 15 phút trước khi tiến hành cấy, và hạn chế làm việc chung với những người nghiên cứu về nấm men, nấm mốc.
4.4.4 Định lượng Coliforms, E coli bằng phương pháp MPN
Kết quả: Không có Coliforms và E coli do không làm đục canh trường và sinh khí hai môi trường LSB và BGBL.
Hình 4.11 Môi trường LSB (trái) và BGBL (phải) trước khi cấy mẫu
Hình 4.12 Môi trường LSB (trái) và BGBL (phải) sau khi cấy mẫu
Hình 4.13 Môi trường LSB (trái) và BGBL (phải) sau khi cấy mẫu có Coliforms
Dựa vào hình 4.11 và 4.12 môi trường LSB và BGBL trước và sau khi cấy không đục canh trường, không sinh khí so với hình 4.13 (đối chứng)
Khi mẫu nước có Coliforms, chúng có khả năng lên men lactose, tạo ra CO2 và đẩy các ống Durham lên trên, đồng thời làm đục môi trường bằng các sản phẩm phụ E coli là một thành viên trong nhóm Coliforms, vì vậy nếu phân tích không phát hiện Coliforms, điều này chứng tỏ không có E coli, từ đó không cần thực hiện các bước kiểm tra tiếp theo.
Theo quy định 46-BYT, hàm lượng Coliforms và E coli trong sản phẩm ngũ cốc chưa qua xử lý nhiệt không được vượt quá 10 và 3 MPN/ml Kết quả phân tích sản phẩm sau lên men lactic cho thấy Coliforms và E coli đạt 0 MPN/ml, chứng tỏ sản phẩm an toàn Nguyên nhân không có sự hiện diện của Coliforms và E coli là nhờ vào quá trình lên men lactic từ chủng Lactobacillus sp, chủng này có khả năng sản sinh ra bacteriocin với tác dụng ức chế Coliforms và E coli.