i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -oOo - HỒ THỊ THU MINH NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP VÀ BIẾN ĐỔI CỦA HP CHẤT KỊ NƯỚC QUA MÀNG TẾ BÀO NẤM MEN SINH TỔNG HP LACTONE Yarrowia lipolytica LUẬN VĂN THẠC SĨ Khánh Hòa - 2014 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -oOo - HỒ THỊ THU MINH NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP VÀ BIẾN ĐỔI CỦA HP CHẤT KỊ NƯỚC QUA MÀNG TẾ BÀO NẤM MEN SINH TỔNG HP LACTONE Yarrowia lipolytica Chun ngành Mã số : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH : 60 54 01 04 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TẠ THỊ MINH NGỌC Khánh Hòa – 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Hồ Thị Thu Minh ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Cơng nghệ Thực phẩm kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc xin giành cho cô: TS Tạ Thị Minh Ngọc Giáo viên khoa Công nghệ Thực phẩm tận tình hướng dẫn động viên tơi suốt q trình thực luận văn Xin cám ơn quý thầy cô giáo khoa Công nghệ Thực phẩm cán Trung tâm thí nghiệm thực hành Trường Đại học Nha Trang tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian qua Xin cám ơn thầy cô phản biện cho lời khun q báu để cơng trình nghiên cứu hồn thành có chất lượng Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ gia đình bạn bè luôn chia sẻ trình nghiên cứu iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG BIỂU .vii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1 Giới thiệu nấm men màng tế bào nấm men 1.1.1 Nấm men ưa béo Yarrowia lipolytica 1.1.1.1 Nguồn gốc .3 1.1.1.2 Đặc tính sinh lý .3 1.1.1.3 Ứng dụng 1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng nấm men Y lipolytica 1.1.2.1 Nguồn Cacbon 1.1.2.2 Oxy .8 1.1.2.3 Nguồn Nitơ .8 1.1.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 1.1.2.5 Ảnh hưởng pH 10 1.1.3 Khả sử dụng chất kị nước nấm men Y lipolytica 11 1.1.3.1 Sự xâm nhập chất kị nước vào tế bào 11 1.1.3.2 Sự chuyển hóa chất kị nước nấm men 14 1.1.4 Thành phần cấu tạo màng tế bào nấm men 14 1.1.4.1 Màng sinh học .14 1.1.4.2 Lipid màng 15 1.1.4.3 Protein màng .16 1.1.4.4 Glucide màng 16 1.1.4.5 Vận chuyển chất kị nước qua màng tế bào 16 1.2 Beta Caroten cơng nghệ bao gói BC tế bào nấm men .18 1.2.1 Beta Caroten 18 1.2.2 Cơng nghệ bao gói beta caroten .21 iv CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .24 2.1 Vật liệu .24 2.1.1 Nguồn nấm men .24 2.1.2 Môi trường nuôi cấy .24 2.1.3 Dầu BC 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy chủng nấm men Y lipolytica S cerevisiae điều kiện sinh trưởng khác 25 2.2.1 Thí nghiệm khảo sát khả phát triển nấm men môi trường thạch dinh dưỡng khác nhiệt độ khác 25 2.2.2 Khảo sát sinh trưởng chủng nấm men môi trường tiền tăng sinh YPD…… 26 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng lên phát triển nấm men Khảo sát ảnh hưởng chủng giống nấm men, môi trường nuôi cấy điều kiện nuôi cấy (pH, tốc độ lắc thể tích lắc) lên hiệu suất chuyển chất qua màng tế bào nấm men 28 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng chủng giống nấm men đến hiệu suất chuyển chất BC.28 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến hiệu suất chuyển chất BC 29 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến hiệu suất chuyển chất BC .30 2.2.6 Đánh giá sơ khả nắng biến đối hợp chất kị nước (BC) qua màng tế bào 31 2.3 Phương pháp phân tích 31 2.3.1 Lựa chọn điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng) xây dựng đường cong sinh trưởng nấm men điều kiện lựa chọn 31 2.3.2 Đánh giá tính chất màng tế bào thơng qua hàm lượng sterol tính lỏng màng tế bào .31 2.3.3 Tách chiết chất kị nước phân tích đánh giá biến đổi chúng phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS 32 2.3.4 Nhuộm lipid thuốc nhuộm Nil red 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Khảo sát khả sinh trưởng Y lipolytica S cerevisiae .34 3.1.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm men .34 3.1.1.1 Đặc điểm hình thái Y lipolytica mơi trường YPDA 34 3.1.1.2 Đặc điểm hình thái S cerevisiae môi trường YPDA .35 v 3.1.2 Khảo sát khả sinh trưởng Y lipolytica S cerevisiae môi trường thạch dinh dưỡng 37 3.1.2.1 Chủng Y lipolytica 37 3.1.2.2 Chủng S cerevisiae .41 3.1.3 Xây dựng đường cong sinh trưởng Y lipolytica S cerevisiae môi trường nuôi cấy khác 45 3.2 Ảnh hưởng chủng giống tới khả thẩm thấu BC qua màng tế bào 47 3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy tới khả thẩm thấu BC qua màng tế bào Y lipolytica W29 .49 3.3.1 Hàm lượng Sterol theo môi trường nuôi cấy 49 3.3.2 Tính lỏng màng tế bào theo môi trường nuôi cấy .51 3.3.3 Khả thấm BC qua màng tế bào theo môi trường nuôi cấy 52 3.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới khả thẩm thấu BC qua màng tế bào Y lipolytica W29 nuôi môi trường YNBD 55 3.5 Đánh giá sơ khả biến đổi hợp chất kị nước (BC) qua màng tế bào nấm men 63 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC vi DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v/p Vòng/phút C Cacbon N Nitơ BC Beta Caroten YPD Yeast Pepton D-glucose YPDA Yeast Pepton D-glucose Agar YNBD Yeast nitrogen base D-glucose YNBDA Yeast nitrogen base D-glucose Agar YPO Yeast Pepton Oil YPOA Yeast Pepton Oil Agar YNBO Yeast nitrogen base Oil/ YNBOA Yeast nitrogen base Oil Agar YP Yeast Pepton YPA Yeast Pepton Agar YNB Yeast nitrogen base YNBA Yeast nitrogen base Agar PD Potato D-glucose PDA Potato D-glucose Agar R Rice RA Rice Agar vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Nguồn C vi sinh vật sử dụng Bảng 1.2: Nguồn N vi sinh vật sử dụng Bảng 1.3: Phạm vi nhiệt độ sinh trưởng vi sinh vật 10 Bảng 1.4: Ảnh hưởng pH số vi sinh vật 11 Bảng 1.5: Một số phổ UV-Vis BC chiết dung môi khác 19 Bảng 2.1: Các nguồn nấm men sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2: Thành phần môi trường sử dụng (g/1L môi trường) 25 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào Y lipolytica 34 Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào S cerevisiae 35 Bảng 3.3: Hàm lượng BC với yếu tố ảnh hưởng trình tăng sinh .56 Bảng 3.4: So sánh hàm lượng BC theo thực nghiệm theo mơ hình 56 Bảng 3.5: Các thông số mơ hình hồi quy cấp .57 Bảng 3.6: Kết thí nghiệm tâm 57 Bảng 3.7: Giá trị ti 58 Bảng 3.8: Phương sai tương thích 59 Bảng 3.9: Kết thực nghiệm kiểm chứng theo quy hoạch thực nghiệm 63 viii DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Mơ hình cấu trúc màng tế bào 15 Hình 1.2: Khuếch tán qua lớp kép photpholipid 17 Hình 1.3: Khuếch tán qua kênh protein .17 Hình 1.4: Sự vận chuyển chất qua màng tế bào theo chế chủ động 18 Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo BC 19 Hình 1.6: Phổ UV-VIS BC 20 Hình 2.1 Khảo sát khả phát triển nấm men mơi thạch dinh dưỡng 26 Hình 2.2: Khảo sát ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng lên phát triển nấm men 27 Hình 2.3: Khảo sát ảnh hưởng chủng giống nấm men lên hiệu suất chuyển chất BC 28 Hình 2.4: Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên hiệu suất chuyển chất BC 29 Hình 2.5 : Cơng thức cấu tạo phổ hấp thụ phát xạ Nil red 33 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc Y lipolytica W29 mơi trường YPDA 27 °C 34 Hình 3.2: Hình thái tế bào Y lipolytica W29 YPDA 27 °C 34 Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc Y lipolytica 0544 môi trường YPDA 27 °C 35 Hình 3.4: Hình thái tế bào Y lipolytica 0544 môi trường YPDA 27 °C 35 Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc S cerevisiae TNS.c môi trường YPDA 27 °C 36 Hình 3.6: Hình thái tế bào S cerevisiae TNS.c môi trường YPDA 27 °C 36 Hình 3.7: Hình thái khuẩn lạc S cerevisiae TBS môi trường YPDA 27 °C 36 Hình 3.8: Hình thái tế bào S cerevisiae TBS mơi trườngYPDA 27 °C 36 Hình 3.9: Khả sinh trưởng Y lipolytica W29 môi trường khác nhiệt độ khác .38 Hình 3.10: Khả sinh trưởng Y lipolytica 0544 môi trường khác nhiệt độ khác 40 Hình 3.11: Khả sinh trưởng phát triển S cerevisiae TNS.c môi trường khác nhiệt độ khác 42 68 Hình 3.30: Phổ UV-Vis BC sau tiếp xúc điều kiện nuôi cấy khác Y lipolytica W29 môi trường YNBD Qua đánh giá sơ dựa phổ BC thu sau tế bào nấm men tiếp xúc với dầu BC phổ BC chuẩn bước đầu cho thấy BC sau xâm nhập màng tế bào nấm men S cerevisiae TNS.c môi trường YPD, YNBD Y lipolytica W29 môi trường khảo sát điều kiện khác thay đổi cầu trúc biểu thơng qua phổ hấp thụ quang học giống với phổ BC chuẩn.Vì vậy, BC sau xâm nhập qua màng tế bào nấm men sinh tổng hợp lactone Y lipolytica nấm men truyền thống S cerevisiae giữ nguyên cấu trúc, chưa có biến đổi hay chuyển hóa chất Về hàm lượng BC, tế bào nấm men tiếp xúc trực tiếp với dầu BC theo tỉ lệ tất mẫu thí nghiệm: 1ml dầu BC : 5g sinh khối tế bào ướt Như vậy, với nồng độ dầu BC ban đầu trước tiếp xúc nồng độ BC thẩm thấu qua màng tế bào sau tiếp xúc có khác phụ thuộc vào chủng giống, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy (kết Hình 3.17, 3.21 Bảng 3.3), BC thẩm thấu qua màng tế bào cao đồng nghĩa với việc hàm lượng BC cịn lại mơi trường sau tiếp xúc giảm Chủng nấm men Y lipolytica W29 thẩu thấu BC cao gấp gần 1,5 lần S cerevisiae TNS.c hai môi trường YPD; YNBD nên hàm lượng BC cịn lại mơi trường sau tiếp xúc với chủng nấm men S cerevisiae TNS.c cao chủng Y lipolytica W29 Còn chủng Y lipolytica W29 điều kiện pH 4,59; thể tích lắc 106 tốc độ lắc 212 v/p môi trường YNBD hàm lượng BC thẩm thấu qua màng tế bào cao (gần 42,9 µg/g) nên hàm lượng BC môi trường thay đổi nhiều 69 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Kết luận 1.1 Khả sinh trưởng chủng Y lipolytica S cerevisiae môi trường thạch dinh dưỡng khác phụ thuộc vào điều kiện ni cấy: Y lipolytica hình thành khuẩn lạc tốt mơi trường YPDA, YPOA 27°C; S cerevisiae hình thành khuẩn lạc tốt môi trường YPDA 2737°C 1.2 Đã xây dựng đường cong sinh trưởng chủng Y lipolytica S cerevisiae môi trường nuôi cấy khác nhau, xác định thời gian để chủng nấm men vào pha cân môi trường có nguồn C lipid khoảng 24 giờ, mơi trường có nguồn C đường khoảng 19 1.3 Khả sinh trưởng thấm BC chủng Y lipolytica W29 môi trường YPD YNBD 2,252 µg/g 6,667 µg/g so với S cerevisiae TNS.c cao gấp 1,55 1,95 lần nên chọn chủng Y lipolytica W29 1.4 Môi trường YNBD môi trường tốt cho trình thẩm thấu BC qua màng tế bào chủng Y lipolytica W29 với hàm lượng sterol tự 0,0231 (g/g) tính lỏng màng tế bào nhỏ thông qua kết đánh giá tính dị hướng huỳnh quang (r) 0,15 Hiệu suất suất chuyển chất BC Y lipolytica W29 môi trường YNBD 6,6667 µg/g 1.5 Tối ưu hóa q trình thấm BC chủng Y lipolytica W29 môi trường YNBD, kết tối ưu thu từ phần mềm Minitab 16.0 để đạt hàm lượng BC cao 42,9047 (µg/g)  pH: 4,5859  V: 106,0606 ml  Rpm: 212v/p 1.6 Bước đầu đánh giá sơ khả biến đổi BC sau xâm nhập qua màng tế bào nấm men sinh tổng hợp lactone Y lipolytica nấm men truyền thồng S cerevisiae cho thấy BC giữ nguyên cấu trúc sau xâm nhập qua màng tế bào nấm men có thay đổi hàm lượng BC BC thẩm thấu qua màng tế bào cao đồng nghĩa với việc hàm lượng BC lại sau tiếp xúc giảm 70 Kiến nghị 2.1 Tiếp tục nghiên cứu chế độ sấy bảo quản sinh khối nấm men sau tiếp xúc với BC 2.2 Có thể mở rộng nghiên cứu với chất kị nước khác 2.3 Nghiên cứu thêm điều kiện nuôi cấy bổ sung khoáng, oxy … trước tiến hành tiếp xúc với BC 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Đức Lượng (1996), Công nghệ vi sinh vật Tập 1: Cơ sở vi sinh vật công nghiệp, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Bùi Việt Hà (2009), Vi sinh vật học, Đại học Quốc Gia Hà Nội Trần Hải Đăng cộng (2013), “Nghiên cứu tạo vi nang dầu gấc phương pháp sấy phun”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, 655, tr 51-55 Lương Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Tài liệu tiếng anh Aguedo M, Waché Y, Mazoyer V, le Grand AS, Belin J-M (2003), "Increased Electron Donor and Electron Acceptor Characters Enhance the Adhesion between Oil Droplets and Cells of Yarrowia lipolytica As Evaluated by a New Cytometric Assay", J Agric Food Chem,51, tr.3007-3011 Amaral PFF, Ferreira TF, Fontes GC, Coelho MAZ (2009), "Glycerol valorization: New biotechnological routes", Food and Bioproducts Processing,87, tr.179-186 Amaral PFF, Lehocky M, Timmons AMB, Rocha-Leão MHM, Coelho MAZ, Coutinho JAP (2006a), "Cell surface charaterization of Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682", Yeast 23, tr.867-877 Amaral PFF, Rocha-Leão MHN, Marrucho IM, Coutinho JAP, Coelho MAZ (2006c), "Cell surface characterizationn of Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682", Yeast 23, tr 867-877 Amaral PFF, Rocha-Leão MHN, Marrucho IM, Coutinho JAP, Coelho MAZ (2006c), "Improving lipase production using a perfluorocarbon as oxygen carrier", Journal of Chemical technology and biotechnology 81, tr 1368-1374 10 Amaral PFF, Silva JM, Lehocky M, Timmons AMB, Marucho IM, Coelho MAZ, Coutinho JAP(2000), "Production and characterization of a bioemulsifier from Yarrowia lipolytica", Process Biotechnol 10, tr.333-337 11 Bankar, A., Kumar, A and Zinjarde, S (2009), "Environmental and industrial applications of Yarrowia lipolytica", Appl Microbiol Biotechnol 61, tr 847-865 72 12 Barth, G and Gaillardin, C (1997), "Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica", FEMS Microbiol Rev 19, tr 219-237 13 Barth G, Kunkel W Alcohol dehydrogenase (ADH) in yeast II (1979), "NAD+ and NADP+-dependent alcohol dehydrogenases in Saccharomyccopsis lipolytica" Z Allg Mikrobiol 19, tr.381-390 14 Beopoulos, A., Cescut, J., Haddouche, R., Uribelarrea, J and Nicaud, J (2009), "Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production", Progress in Lipid Research, tr 375-387 15 Bennedsen, M., Wang, X., Willen, R., Wadstrom, T and Andersen, L P (1999), "Treatment of H pylori infected mice with antioxidant astaxanthin reduces gastric inflammation, bacterial load and modulates cytokine release by splenocytes", Immunol Lett 70(3), tr 185-9 16 Berk, P D and Stump, D D (1999), "Mechanisms of cellular uptake of long chain free fatty acids", Mol Cell Biochem, tr 17-31 17 Biryukova EN, Medentsev AG, Arinbasarova AY, Akimebko VK (2006), "Tolerance ofthe yeast Yarrowia lipolytica to oxidative stress", Microbiology 75, tr.243-247 18 Black, P N and DiRusso, C C (2007), "Yeast acyl-CoA synthetases at the crossroads of fatty acid metabolism and regulation", Biochim Biophys Acta, tr 286298 19 Casalone E, Barberio C, Cappellini L, Polsinelli M (2005), “Characterization of Saccharomyces cerevisiae natural populations for pseudohyphal growth and colony morphology”, Res Microbiol 156, tr 191–200 20 Choe, E., and Min, D B (2006), “Mechanisms and factors for edible oil oxidation”, Compr Rev Food Sci Food Saf 5, tr 169–186 21 Ciriglicano MC, Carman GM (1984), "Isolation of a bioemulsisier from Candida lipolytica", Appl Environ Microbiol, 48, tr 747-750 22 Delia B Rodriguez-Amaya (2001), A guide to carotenoid analysis in foods, USA, 23 Does AL, Bisson, LF (1989) "Comparison of glucose uptake kinetics in different yeast", Journal of bacteriology,171, tr 1303-1308 73 24 Domínguez, A., Costas, M., Longo, M A and Sanromán, A (2003), "A novel application of solid state culture: production of lipases by Yarrowia lipolytica", Biotechnol Lett, tr 1225-1229 25 Dufourc, E J (2008), "Sterols and membrane dynamics", J Chem Biol, tr 63-77 26 Fickers, P., Benetti, P., Wache, Y., Marty, A., Mauersberger, S and Nicaud, J (2005), "Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications.", tr 527-543 27 Finogenova, T V., Morgunov, I G., Kamzolova, S.V and Cherniavskaia, O G (2005), "Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects", Prikl Biokhim Mikrobiol 41, tr 478-486 28 Flores CL, Rodriguez C, Petit T, Gancedo C (2000), "Carbohydrate and energy yielding metabolism in non-conventional yeast" FEMS Microbiology Re views, 24, tr 507-529 29 Fraser, D and Bramley, P (2004), "The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids", Prog Lipid Res, tr 228-265 30 Goodwin TW (1980), The Biochemistry of the Carotenoids, Ed 2, Vol Chapman and Hall, London 31 Gutierrez JR, Erickson LE (1997), ‘‘Hydrocarbon Uptake in Hydrocarbon Fermentations’’, Biotechnol Bioeng19, tr 1331-1341 32 Hamilton, A (1998), "Fatty acid transport: difficult or easy", J Lipid Res pp 467481 33 Hettema, H and Tabak, F (2000), "Transport of fatty acids and metabolites across the peroxisomal membrane", Biochim Biophys Acta, tr 18-27 34 Holzschu, L., Chandler, F , Ajello, L and Ahearn, G (1979), "Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity", Sabouraudia, tr 71-78 35 Jamileh M Lakkis (2007), Encapsulation and Controlled Release Technologies in Food Systems, tr 71-72 36 Jermini, M, F, G and Schmidt-Lorenz (1987), “Growth of osmotolerant yeast at different water activity values”, J Food Protect, 50, tr 404-440 37 Jung, M Y, and Min, D B.(1991), “Effects of Quenching Mechanisms of Carotenoids on the Photosensitized Oxidation of Soybean Oil”, J Am Oil Chem Soc 68(9), tr 653–658 74 38 Kamzolova SV, Shishkanova NV, Morgunov IG, Finogenova TV (2003), "Oxygen requirements for growth and citric acid production of Yarrowia lipolytica", FEMS Yeast Research1528, tr 1-6 39 Kim, T and Kim Sang, Jin (2000), "The Possible Involvement of the Cell Surface in Aliphatic Hydrocarbon Utilization by an Oil Degrading Yeast Yarrowia lipolytica" J Microbiol Biotechnol, tr 333-337 40 Krinsky, N I (1998), “The antioxidant and biological properties of the carotenoids”, Ann NY Acad Sci 854, tr 443–447 41 Kurtzman, Jack W Fell (2011), “Methods for isolation, phenotypic characterization and maintenance of yeast”, Elsevier B.V 42 Lopes M, Gomes N, Mota M, Belo I (2009a) "Yarrowia lipolytica growth under increased air pressure: influence on enzyme production", Appl Biochem Biotechnol 159, tr 4-53 43 Mlickova, K., Roux, E., Athenstaedt, K., d'Andrea, S., Daum, G., Chardot, T and Nicaud, J M (2004), "Lipid accumulation, lipid body formation, and acyl coenzyme A oxidases of the yeast Yarrowia lipolytica", Appl Environ Microbiol 70, tr 39183924 44 Mukhopadhyay K, Kohli A, Prasad R (2002), "Drug susceptibilities of yeast cells are affected by membrane lipid composition", Antimicrob Agents Chemother 46, tr 3695-3705 45 Ngoc, Ta Thi Minh (2010) Thèse: Mécanismes physiologique et biochimique induits chez Yarrowia lipolytica en réponse des modifications de l’environnement physico-chimique des cellules 46 Normand, V., Dardeel, G., Bouquerand, P.E, Nicolas, L., and Jonhson, D.J (2005), "Flavour encapsulation in yeast: Limonene used as a model system for characterization of the release mechanism", Food Chem, 53(19), tr 7532-7543 47 Osumi, M., Fukuzumi, F., Yamada, N., Nagatani, T., Teranishi, Y., Tanaka, A and Fukui, S (1975), "Surface tructure of som Candida yeast cells grown on nalkanes", J Ferment Technol 53, tr 244-248 48 Ozcelik B, Karadag A, Ersen S (2009), “Bioencapsulation of Beta-Carotene in three diffirent methods”, International Conference on Bioencapsulation, Groningen, Netherlands 75 49 Papanikolaou S, Aggelis G (2002), "Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial gycerol in a single-stage continuous culture", Bioresource Technology 82, tr 43-49 50 Papanikolaou S, Chevalot I, Komaitis M, Marc I, Aggelis G (2002), "Single cell oil production by Yarrowia lipolytica growing on an industrial derivative of animal fat in batch cultures", Appl Microbiol Biotechnol 58, tr 308-312.50 52 Rabenhorst, J and Gatfield, I L (2000), "Process for the production of gammadecalactone", European Patent 0997533 53 Rabenhorst, J and Gatfield, I L (2001), "Method of producing gamma- decalactone", Patent WO 0024920 54 Rodrigues G, Pais C (1997), "The influence of acetic and other weak carboxylic acids ongrowth and cellular death of the yeast Yarrowia lipolytica", Food Technology and Biotechnology 38, tr 27-32 55 Roostita, R and Fleet, G H (1996), "Growth of yeasts in milk and associated changes to milk composition", Int J Food Microbiol 31, tr 205-219 56 Shobayashi M, Mitsueda S, Ago M, Fujii T, Iefuji H (2005), "Effects of culture conditions on ergosterol biosynthesis by Saccharomyces cerevisiae", Biosci Biotechol Biochem 69 (12), tr 2381-8 57 Sinigaglia, M., Lanciotti, R and Guerzoni, M E (1994), "Biochemical and physiological characteristics of Yarrowia lipolytica strains in relation to isolation source", Can J Microbiol 40, tr 54-59 58 Stahl, W., and Sies, H (1996), “Lycopene: A biologically important carotenoid for humans”, Arch Biochem Biophys 336(1), tr 1–9 59 Subczynski, W K and Wisniewska, A (2000), "Physical properties of lipid bilayer membranes: relevance to membrane biological functions", Acta Biochim Pol 47, tr 613-625 60 Trotter, P J (2001), "The genetics of fatty acid metabolism in Saccharomyces cerevisiae", Annu Rev Nutr 21, tr 97-119 61 Vanpoppel, G., and Goldbohm, R A (1995), “Epidemiologic evidence for betacarotene and cancer prevention”, Am J Clin Nutr 62(6), tr S1393–S1402 76 62 Wache, Y., Aguedo, M., Nicaud, J M and Belin, J M (2003), "Catabolism of hydroxyacids and biotechnological production of lactones by Yarrowia lipolytica", Appl Microbiol Biotechnol 61, tr 393-404 63 Wang, HJ., Le Dall, M T., Wach, Y., Laroche, C., Belin, J M., Gaillardin, C and Nicaud, J M (1999b), "Evaluation of acyl coenzyme A oxidase (Aox) isozyme function in the n-alkane-assimilating yeast Yarrowia lipolytica", J Bacteriol 181, tr 5140-5148 64 Wang, HJ, Le Clainche, A., Le Dall, M T., Wache, Y., Pagot, Y., Belin, J M., Gaillardin, C and Nicaud, J M (1998), "Cloning and characterization of the peroxisomal acyl CoA oxidase ACO3 gene from the alkaneutilizing yeast Yarrowia lipolytica", Yeast 14, tr 1373-1386 65 Wang, H., Le Dall, M T., Wache, Y., Laroche, C., Belin, J M and Nicaud, J M (1999a), "Cloning, sequencing, and characterization of five genes coding for acyl-CoA oxidase isozymes in the yeast Yarrowia lipolytica", Cell Biochem Biophys 31, tr 165174 66 Wang ZX, Zhuge J, Fang H, Prior BA (2001), "Glycerol production by microbial fermentation : a review", Biotechnol Adv 19, tr 201-223 67 Zinjarde, S , Pant, A and Deshpande, M V (1998), "Dimorphic transition in Yarrowia lipolytica isolated from oil-polluted sea water", Mycological Research 102, tr 553-558 Website 68 http://www.jpboseret.eu/index.php?page=membrane-plasmatique 69 http://giangduongykhoa.net/component/content/article/5240.html 70 http://www.thuoc360.vn/threads/van-chuyen-thu-dong-qua-mang-bao-tuong.2001/ 71.http://mon.univmontp2.fr/claroline/backends/download.php?url=L2Nhcm90ZW1c18w NSYwOC0wNC0yMDExLnBkZg%3D%3D&cidReset=true&cidReq=FLBI456_001 PHỤ LỤC I Phụ lục phương pháp phân tích Phụ lục 1: Phân tích sterol Các tế bào sau nuôi cấy môi trường khác thu hoạch để tách ergosterol Sterol tổng số tế bào tách theo báo cáo (Arthington-Skaggs cộng 1999) với thay đổi 50 ml dung dịch tế bào nuôi cấy thu hoạch (8000xg, phút), rửa hai lần với nước cất tuyệt trùng cân khối lượng ẩm Sau đó, 3ml KOH 25% (25g KOH 35ml nước cất tuyệt trùng định mức đến 100 ml với ethanol tuyệt đối) thêm vào vortex phút Sau đó, tế bào chuyển đến a sterile borosilicate screw-cap tube ủ 85 °C 1h Sau hấp, tube làm lạnh đến nhiệt độ phịng Sau đó, sterol tách cách thêm hỗn hợp 1ml nước cất tuyệt trùng 3ml n-heptane, vortex hỗn hợp phút Lớp heptan chuyển đến a clean sterile borosilicate screw-cap tube bảo quản -20 °C 24h trước phân tích Sterol tự tách mô tả (Shobayshi cộng 2005) với thay đổi Tế bào nấm men thu nhận, rửa lần với nước cất tuyệt trùng cân Tế bào rửa (< 60mg tế bào khơ 1g tế bào ướt) hịa lại 3ml ethanol 80% (v/v) ủ 80 °C 15 phút để vô hoạt enzyme lipolytic Tách ethanol phân riêng cách li tâm tế bào làm đơng qua đêm Sau tế bào đông lạnh cho vào 3ml dung dịch đệm PBS (20mM, pH 7) tube thủy tinh chứa g hạt thủy tinh (đường kính 0.425 – 0.6 mm, Sigma) vortex phút Sau đó, 3ml n-heptan thêm vào tube vortex phút để chiết tách sterol Lớp heptan chuyển vào a sterile borosilicate screw-cap tube bảo quản -20 °C 24h trước phân tích Trước phân tích phép đo phổ, 200µl ước số sterol chiết tách pha loãng gấp năm lần ethanol tuyệt đối scan ảnh phổ 220 320 nm với Uvmini-1240 cat.no.206-24000-38, Nhật Bản Đường chuẩn thiết lập với ergosterol tinh khiết dựa hấp thụ bước sóng 282 nm Sau đó, hàm lượng ergosterol tính phần trăm khối lượng ẩm tế bào: % sterol (g/g) = [esgosterol]*f*v*100/(m*1000) Trong đó: [esgosterol] nồng độ esgosterol, f hệ số pha lỗng, v tích heptandùng để tách chiết, m khối lượng sinh khối mang tách chiết Phụ lục Phương pháp xác định mật độ tế bào phương pháp đo độ đục  Nguyên tắc Khi pha lỏng có chứa cấu tử khơng tan tạo thành hệ huyền phù có độ đục phần tử diện môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới Tế bào vi sinh vật thực thể nên diện môi trường làm môi trường trở nên đục Độ đục huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Mật độ tế bào định lượng gián tiếp thông qua máy đo màu bước sóng 550 - 610nm  Cách tiến hành Lấy 0,1ml dịch nuôi cấy môi trường khác cho vào cuvet chứa 0,9 ml nước cất (hệ số pha loãng 10) Đem đo OD600 máy quang phổ kế với mẫu chuẩn mẫu không chứa tế bào nấm men Nếu kết OD600 lớn phải tiến hành pha lỗng lần hai (hệ số pha loãng lúc 100) Phụ lục Phương pháp phân tích beta caroten Chuẩn bị dầu BC Lấy khoảng 50 ml dầu ăn, đun nóng tới 80oC Cân xác 25 mg BC tinh thể hịa tan vào 25 ml dầu ăn nóng (thêm dầu ăn nóng cần để hịa tan hồn toàn) Định mức (với dầu ăn) sau để nguội nhiệt độ phịng Tính hàm lượng BC có dầu (mg/ml)  Xác định lại hàm lượng đo quang  Hút xác 50µl dầu BC vào bình định mức 10 ml  Định mức với n-hexane  Quét phổ hấp thụ UV-VIS  Tính lại nồng độ BC dầu Chuẩn bị tế bào Các tế bào nuôi môi trường khác ly tâm, rửa thu tế bào Xác định khối lượng tế bào thu (khối lượng ướt) Ngâm tế bào dầu BC  Cân 5g sinh khối ướt cốc đong  Bổ sung 1ml dầu BC  Khuấy nhiệt độ phòng, qua đêm  Chú ý: đậy kín cốc đong, tránh ánh sáng khơng khí Xác định lượng BC thẩm thấu qua màng tế bào Sinh khối sau ngâm qua đêm với dầu BC đem rửa với đệm phosphat 50mM, pH 8,0 Sinh khối mang tách chiết ướt sấy chân không đến khô  Tách chiết ướt:  Cân xác khoảng 1g sinh khối ướt vào ống ly tâm 15ml  Để lạnh đông tủ -20oC qua đêm tủ -80oC 2h  Thêm vào 2ml cồn 80o, trộn  Thêm 100µl BHT 10% cồn  Thêm 1ml nước cất  Rã đông từ từ 4oC  Chiết với n-hexane sinh khối màu  Thu pha hexane, định mức để xác định phổ hấp thụ UV-VIS tính hàm lượng BC có mẫu  Tách chiết khơ:  Cân xác khoảng 0.2 g sinh khối khơ nghiền mịn vào ống  Thêm vào 2ml cồn 80o, trộn  Thêm 100µl BHT 10% cồn  Thêm 1ml nước cất  Chiết với n-hexane sinh khối màu  Thu pha hexane, định mức để xác định phổ hấp thụ UV-VIS tính hàm lượng BC có mẫu II Phụ lục Bảng số liệu Phụ lục 4: Nồng độ BC dầu Cân 25mg BC tinh thể hịa vào 25ml dầu ăn nóng (80°C) Hút 50µl dầu BC vào bình định mức 10ml, định mức hexan, quét phổ thu OD450 = 0,4567 Từ suy nồng độ BC dầu (0,4567*10*10000)/(2592*0,05*1000) = 0,352392 mg/ml Phụ lục 5: Bảng kết hàm lượng BC (µg/g) mơi trường khác W29 YPD Hàm lượng BC (µg/g) W29 YNBD TNS.c YPD 2,252±0,132494 6,667± 0,048704 1,447± 0,05 TNS.c YNBD 3,41±0,05 Phụ lục 6: Bảng kết hàm lượng BC (µg/g) môi trường khác Y lipolytica W29 MT No m V OD 450 Hàm lượng BC (µg/g) Hàm lượng BC (µg/g) trung bình YPD 1,0082 10 0,0564 2,158228 2,251916 ± 0,132494 1,0576 10 0,0643 2,345603 1,0127 10 0,1759 6,701161 YNBD 1,0174 10 0,1749 6,632283 1,0135 10 0,1178 4,484216 YPO 0,8 10 0,0956 4,61034 1,0149 10 0,13039 4,956625 YNBO 6,666722 ± 0,048704 1,0453 10 0,1458 5,38123 Phụ lục 7: Bảng kết xây dựng đường chuẩn sterol Nồng độ Sterol (µg/ml) OD 0,01 0,08297 0,02 0,117995 0,03 0,166521 0,04 0,214378 0,05 0,248494 0,06 0,299806 4,547278 ± 0,089183 5,168927 ± 0,300241 Đường chuẩn sterol Phụ lục 8: Bảng kết hàm lượng sterol tổng số môi trường khác Y lipolytica W29 Môi trường YPD YNBD YPO YNBO % Sterol TS (g/g) 0,065375603 0,098228402 0,1017643 0,10571527 E 0,000409352 0,000171997 0,000175437 0,000243662 Phụ lục 9: Bảng kết hàm lượng sterol tự môi trường khác Y lipolytica W29 Môi trường YPD YNBD YPO YNBO % Sterol tự (g/g) 0,026877505 0,023125215 0,016083067 0,018386815 E 0,0014432 5,3301E-05 0,000101993 2,02061E-05 Phụ lục 10: Tỉ lệ % sterol tự sterol tổng số môi trường khác Y lipolytica W29 Môi trường YPD YNBD YPO YNBO STE Td/STE TS (%) 41,1124386 23,54229003 15,80423288 17,39277095 Phụ lục 11: Bảng kết sinh khối Y lipolytica W29 môi trường YNBD điều kiện nuôi cấy khác pH V rpm Sinh khối (g/l) 125 150 0,5064 125 150 10,9724 125 250 0,87 125 250 20,72 50 200 1,3584 50 200 27,16 200 200 0,871125 200 200 12,0045 50 150 23,032 50 250 29,993 200 150 8,38625 200 250 10,9965 125 200 17,65 125 200 18,6 125 200 19,51 ... BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -oOo - HỒ THỊ THU MINH NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP VÀ BIẾN ĐỔI CỦA HP CHẤT KỊ NƯỚC QUA MÀNG TẾ BÀO NẤM MEN SINH TỔNG HP LACTONE Yarrowia. .. phần vào việc phát triển cơng nghệ bao gói vi nang sử dụng tế bào nấm men, thực đề tài ? ?Nghiên cứu trình xâm nhập biến đổi hợp chất kị nước qua màng tế bào sinh tổng hợp lactone Yarrowia lipolytica? ??... dụng chất kị nước nấm men Y lipolytica 11 1.1.3.1 Sự xâm nhập chất kị nước vào tế bào 11 1.1.3.2 Sự chuyển hóa chất kị nước nấm men 14 1.1.4 Thành phần cấu tạo màng tế bào nấm men